水解氮源的制作方法

專利名稱：水解氮源的制作方法
技術領域：
此項發明是通過向發酵培養基中加入一種或幾種部分預水解復合氮源的方法，以更經濟的方式發酵生產所需酶。
背景技術：
用于工業化發酵生產有用化合物的培養基，其中通常含有如大豆、玉米漿、酵母提取物等傳統氮源。但使用這些傳統氮源有許多缺點，如在加熱滅菌時粘度高、原材料改變、酶難于復性回收、產生有色副產物等。而且這些傳統氮源的成本昂貴，或消耗得過快。
可以最低培養基代替傳統氮源，例如WO 98/37179中所述方法就是一例，但這一方法的缺點是菌體生長緩慢且酶產量低。
而在WO 01/05997中描述了用含有水解大豆蛋白的培養基生產破傷風毒素，發明者在67頁中所述，將葡萄糖與剩余的培養基一起高壓滅菌將有利于菌體的生長和毒素的產生。
發明概要發明者發現，為了確保氨基酸/肽利于微生物菌株的快速生長和/或保證所需產物的高產量，就需要在發酵培養基中加入部分預水解的復合氮源，所以我們希望保護一種工業化生產酶的方法，包括a)利用微生物發酵生產相關酶時，發酵培養基中含有一種或幾種預水解的復合氮源，其中這些部分預水解的氮源應該與任何其它碳水化合物源分開滅菌，復合氮源的預水解可通過向其加入酸和/或水解酶的方式來達到。以及
b)從發酵培養基中回收所需酶。
發明詳述微生物菌種此發明中所用的微生物菌種可以是任何種屬的微生物。
優選可以用細菌或真菌來生產相關酶。
例如，可以用某些革蘭氏陽性菌，如芽孢桿菌，如嗜堿芽胞桿菌、如解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽胞桿菌、凝結芽胞桿菌、緩慢芽胞桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬，如淺青紫鏈霉菌、鼠灰鏈霉菌等；此外也可利用諸如大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌。
同樣也可以通過真菌獲得相關酶，如假絲酵母屬、卡氏酵母(Kluyveromyces)屬、畢赤酵母屬、糖酵母屬、裂殖酵母屬、Yarrowia屬，例如卡爾酵母、啤酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克魯維氏酵母、諾地酵母或Saccharomyces oviformis等利用一些絲狀真菌也可以產生所需要的酶。這些絲狀真菌包括頂孢霉屬(Acremonium)，曲霉菌屬，桃木屬(Aureobasidium)，隱球菌屬，鐮刀菌屬，腐質霉屬，Magnaporthe，毛霉菌屬，毀絲霉屬，Neocallimastix，脈孢菌屬，擬青霉菌屬，青霉菌屬，瘤胃真菌屬(Piromyces)，裂褶菌屬，Talaromyce嗜熱子囊菌屬，梭孢殼屬，Tolypocladium屬，木霉屬等，具體地，酶可得自棘孢曲霉，泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，構巢曲霉，黑曲霉，米曲霉，黍鐮刀菌，黃色鐮刀菌，禾谷鐮刀菌，穗枯鐮刀菌，尖孢鐮刀菌，粉紅鐮刀菌，接骨木鐮刀菌，硫色鐮刀菌，香蕉鐮刀菌，鐮孢菌，脈孢菌，米赫根毛霉、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脈孢菌、產紫青霉菌，木素木霉菌，康寧木霉菌，長枝木霉菌，里氏木霉菌，綠色木霉菌等。
以上所涉及的所有菌種都可以在公共的微生物收集中心獲得，例如美國典型培養物保藏中心(ATCC)、德國微生物和細胞培植中心(DSM)、荷蘭真菌酵母收集中心(CBS)和農業研究服務培育和收集中心，美國農業研究菌種保藏中心北部地區研究服務中心(NRRL)。
總之，為了應用此發明生產所需的酶，在這里所用的術語“從……獲取”是與所給源相關聯的，這就表示相關酶是插入了源的基因的細胞所產生的。
相關酶相關的酶可能是某個肽段或某種酶。
對本文來說首選含有5到100個氨基酸的肽段(peptide)；含有10到80個氨基酸、15到60個氨基酸、15到40個氨基酸的肽段則依次更佳。
具體來說，這種方法需要應用到酶，特別是水解酶(酶命名法即EC3類；根據國際生物化學聯盟命名委員會推薦)。
更為具體的說推薦以下水解酶蛋白酶適合的蛋白酶來源于包括動物、植物或者微生物。微生物來源的蛋白酶更佳，包括經化學修飾過或經蛋白工程突變的蛋白酶。蛋白酶可以是酸性蛋白酶、絲氨酸蛋白酶或金屬酶，最好是微生物來源的堿性蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶(類胰蛋白酶trypsin-like protease)。
蛋白酶和肽酶分別根據在細胞中的酶活性＞＝或＜10％被定義為自我破壞性和非破壞性，細胞培養在無細胞肉湯培養物中，培養時間為24小時，發酵過程中無細胞肉湯培養物酸堿度和溫度值的選擇按照一定數值，這些值是發酵過程中從收獲前24小時到收獲時有代表性的酸堿度和溫度范圍。
無細胞肉湯培養物由肉湯經過過濾、離心或類似程序分離而由肉湯溶液中的非溶質(包括細胞)得到。
堿性蛋白酶的例子是枯草桿菌蛋白酶，特別是那些起源于芽孢桿狀菌的酶，例如枯草桿菌蛋白酶Novo，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg，枯草桿菌蛋白酶309，枯草桿菌蛋白酶147以及枯草桿菌蛋白酶168(在WO 89/06279中述及)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子有胰蛋白酶(例如豬或牛起源的)和鐮刀霉蛋白酶，在WO 89/06270和WO 94/25583中述及。
可用的蛋白酶的例子是WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中述及的變體，尤其是替換了以下一個或多個位點的27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
可用的較好的商品蛋白酶包括ALCALASETM、SAVINASETM、PRIMASETM、DURALASETM、ESPERASETM、RELASETM和KANNASETM(諾維信A/S)，MAXATASETM、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM、PURAFECTTM、PURAFECTOXPTM、FN2TM和FN3TM(Genencor國際公司)。
肽酶適合的肽酶例如FLAVOURZYMETM(諾維信A/S)。
脂肪酶脂肪酶包括來源于細菌或真菌，亦包括來源于經化學修飾的突變體及經蛋白質工程改造的突變體。脂肪酶可產自腐質菌屬(又名嗜熱真菌屬)如棉狀嗜熱絲孢菌或腐質霉(EP 258 068 and EP 305 216)；假單孢菌屬如產堿假單孢菌(WO 96/13580)；類產堿假單孢菌如洋蔥假單孢菌(EP331 376)、斯氏假單孢菌(GB 1,372,034)、熒光假單孢菌、假單孢菌屬(WO95/06720和WO 96/27002)以及芽孢桿菌屬如枯草芽孢桿菌(Dartois et al.(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(WO 91/16422)等。
其它例子是脂肪酶變異物，例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中所描述的。
可用的較好的商品脂肪酶有LIPOLASETM、LIPOLASE ULTRATM和LIPEXTM(諾維信A/S)。
淀粉酶適合的淀粉酶(α和/或β)包括來源于細菌或真菌的。亦包括經化學修飾過或經蛋白工程突變的。例如淀粉酶有從芽孢桿菌中取得的α-淀粉酶，還有一種特殊種類的地衣芽孢桿菌，詳見GB 1,296,839。
可用的淀粉酶的例子見于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424所描述的變體，尤其是那些替換了以下一個或多個位點的15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
可用的商品淀粉酶包括DURAMYLTM、TERMAMYLTM、FUNGAMYLTM、NATALASETM、TERMAMYLLCTM、TERMAMYLSCTM、LIQUIZYME-XTM、BANTM(產自諾維信A/S公司)，RAPIDASETM和PURASTARTM(產自Genencor國際有限公司)。
纖維素酶適用于該用途的纖維素酶包括細菌或真菌來源，包括野生型的和經化學誘變或蛋白質工程突體，如細菌、假單胞菌、腐質霉(Humicola)、鐮刀菌、梭孢菌(Thielavia)、直枝頂孢霉菌等。例如US4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259的Humicola insolens、Myceliophthora thermophila、Fusarium oxysporum制備的纖維素酶。
尤為適用的纖維素酶是那些顯色優勢的堿性或中性纖維素酶，包括專利號為EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO98/08940的纖維素酶。其它包括WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299等纖維素酶變體也很適用。
可用的商品纖維素酶包括了諾維信A/S公司的CELLUZYMETM和CAREZYMETM，Genencor國際有限公司的CLAZINASETM和PURADAXHATM以及Kao公司的KAC-500(B)TM等產品。
氧化還原酶本發明可用的氧化還原酶包括過氧化物酶，氧化酶，如漆酶、過氧化氫酶。
其它優選的水解酶是碳水化合物水解酶，包括諾維信A/S公司的MANNAWAYTM和果膠酸裂解酶(例如BIOPREPARATION 3000TM)。此外首選的酶類還有轉移酶、裂解酶、異構酶、連接酶。
復合氮源按照本發明要求，合適的復合氮源是動植物來源的蛋白質，尤其是那些碳水化合物含量在10％以內的蛋白質，如果碳水化合物含量在5％甚至是3％以內將更好。
碳水化合物含量低的好處就在于可以避免梅拉德氏反應(Maillardreactions)。通常在對含有伯胺基化合物和還原性碳水化合物的培養基經行加熱滅菌時，顏色的形成(梅拉德氏反應)極度不利于回收和/或可能抑制生長。因此在加熱滅菌時將梅拉德氏反應“參與物”分開控制在一定的范圍內將顯得十分重要。這就是說將諸如葡萄糖、蔗糖等簡單的碳水化合物與復合氮源分開滅菌是很有必要的，而且復合氮源最好是那些碳水化合物含量較低的蛋白質，如馬鈴薯蛋白質、豆角蛋白質、血液蛋白質、魚類蛋白質和其它動物蛋白質。
然而，精通此領域的人必然知道在復合氮源滅菌時，少量碳水化合物對酶類的回收和生長沒有大的影響。因此，在將碳水化合物和復合氮源分開滅菌時，在復合氮源中可以加入少于10％的碳水化合物。
熟悉此領域的人們知道加熱滅菌對有可能發生梅拉德氏反應的培養基中的還原性碳水化合物數量的影響隨規模而不同。所以，是否選擇了合適的復合氮源以及合適的氮源預水解條件應當按照生產規模進行評價。
通常加入發酵培養基中預水解的復合氮源至少應該是凱氏定氮法(N-Kjeldahl)氮量的5％(質量比)，具體應該是10-75％(質量比)。
預水解復合氮源的酶預水解是首選的技術，但是這項發明也可以用酸水解這樣的技術來完成。
舉例說明預水解過程的最優方案的表現。
預水解的需要程度能夠盡可能地通過正確地調整水解作用溫度，加入的蛋白酶和/或者肽酶的數量，考慮預水解發生的時間，在預水解過程中水解酶的選擇以及預水解發生時在選擇了水解酶的前提下選擇適當pH值間隔來實現。
需要的預水解程度將取決于幾個因素根據從得到高濃度和高體積產品生產能力的觀點來看，高度濃縮的進料培養基有著潛在的優勢。因此，為了刺激生物量的形成和/或者產品的形成，如果有足夠數量的易利用的復合氮源——逐漸在整個發酵期間——可由接種前存在于發酵罐中的現成培養基中的不易于獲得的復合N-源制備得到，要避免加入經過分別消毒的復合氮源到這種進料培養基中。達到易利用復合氮源的持續可獲得性是進行預水解的目標，它能根據達到的水解程度和在培養過程中菌株所產生蛋白酶和/或者肽酶數量來進行調節。
根據取得高特定產品的生產能力——即，單個的活細胞的高產品生產速度也能應用類似的討論。
從取得高效產品的生產能力來看，當產品是一種在單分子或者雙分子反應中使自己失活的酶，添加培養基成分以免使產品自身失活是非常有利的。當加入這樣的培養基成分到發酵肉湯中時復合氮源可以是這樣的培養基成分。因此，可以發現，添加這樣的培養基成分到培養基中是非常有利的——尤其是當該培養基成分水解到一定程度，可以用大型泵抽送，同時仍然保持高度的保護作用時。
術語“可以用泵抽送的”是用來描述某種固體顆粒的懸浮態。這些固體顆粒在泵、閥門和管道系統中卻很少成塊狀——團塊的存在能改變供料速度超過5％。
如果相關的酶是一種淀粉酶，一種纖維素酶，脂肪酶，一種氧化還原酶，一種碳水解酶或者是一種無破壞性的蛋白酶或肽酶，預水解優選引起肽鍵10-70％的破壞，更優選的來說是在肽鍵的15-40％之間。
如果相關的酶是一種具有自我破壞能力的蛋白酶或者肽酶，預水解優選破壞肽鍵含量的1-20％，更易破壞的是肽鍵的2-10％。
如果相關的酶是一種具有自我破壞能力的蛋白酶或者肽酶，作為一種復合氮源，它在利用高度水解蛋白和僅僅輕微水解蛋白的混合物時具有特殊優勢。預水解的程度對產生相關的酶，加入復合氮源的數量在以上都得以表述，可以按照下列式子進行計算[DPH(高度水解)×W(高度水解)+DPH(輕微水解)×W(輕微水解)]/[W(高度水解)+W(輕微水解)]；其中DPH(高度水解)是指高度水解蛋白的預水解的程度DPH(輕微水解)是指輕微水解蛋白的預水解程度W(輕微水解)是指在介質中輕微水解蛋白的重量W(高度水解)是指在介質中高度水解蛋白的重量發酵此項發明可以用于任何符合工業生產標準的發酵過程。例如可以滿足發酵培養基體積至少是50升、100升、500升、1000升甚至是5000升的不同要求。
這些微生物菌種都可以按照現有的任何方法來發酵。發酵培養基可以是由復合氮源和復合碳源混合而成的培養基。發酵過程可以是分批式發酵、重復分批式發酵、流加分批式發酵、重復流加式發酵或者是連續式發酵過程。
在流加分批式發酵過程中，發酵前通常不向培養基中加入或只部分加入那些包含結構和/或催化元件。在發酵反應的過程中才加入全部或其他的包含結構和/或催化元件。選擇進料的化合物可以一起或分開加入。
在重復流加分批式發酵或連續式發酵過程中，在發酵過程中另外加入全部的起始培養基成分。起始培養基可以與結構單元進料一起或分開加入。不同的是，在重復流加分批式發酵過程中，每隔一段時間，定期地去除含有生物量的培養物。而在連續式發酵過程中，以一定速度向生物反應器連續添加新鮮培養基的同時，含有生物量的培養物也以相同的速度連續從反應器流出。這兩種方式都是通過在加入一定量新鮮培養基的同時從中取出同等量的培養物，來保持培養體積的恒定。
在此項發明中，可以采用流加分批式發酵、重復流加分批式發酵或連續式發酵三種方式是優選的。
有用化合物的回收該發明進一步涉及到發酵肉湯的處理。發酵反應結束后，相關酶應當根據各自不同的特點采用不同的標準技術從發酵肉湯中回收。
以下是幾個產物回收的例子，但該發明并不僅僅局限于下面所舉例子。
例一馬鈴薯蛋白的水解OPA＝51％向3.2千克馬鈴薯中加自來水至12.5升，攪拌使馬鈴薯蛋白充分懸浮。
在混勻的同時對其加熱，溫度設定在54攝氏度。
當溫度達到45攝氏度時，用4N的氫氧化鈉溶液將pH值調至6.0。
當溫度到達50攝氏度時，向其中加入80毫升的ALCALASETM2.4L FG(購自諾維信A/S公司)，但在此之前一定要確保用4N的NaOH將pH值維持在6.0。
大約5分種后，溫度升至54攝氏度。
在加入ALCALASETM大約10分種后設定pH值由6.0至8.0。在ALCALASETM加入又26分種后，停止滴加4N的氫氧化鈉溶液，向其加入1.6千克的馬鈴薯蛋白。
充分混勻，將馬鈴薯蛋白充分懸浮3分種，加入150毫升FLAVOURZYMETM(購自諾維信A/S公司)。
在加入ALCALASE 20小時后，加水至總體積為16升，將這16升含有預水解蛋白的懸浮液分裝為份，每份4升，立即放置于-18攝氏度保存，此時蛋白預水解過程已停止。
怎樣定義蛋白預水解程度(OPA)將在例四中解釋。該例假設馬鈴薯蛋白質中干物質含量為93％，其中蛋白質的％含量為干物質的80％。
例二馬鈴薯蛋白質的水解(OPA＝2.9％)稱取2.09千克馬鈴薯蛋白加自來水至10.5升，將其攪拌使馬鈴薯蛋白能夠充分懸浮。
混勻的同時對其加熱(溫度設定在55攝氏度)。
當溫度到達30攝氏度時，向其加入4N的氫氧化鈉溶液將pH值調到6.2。
在溫度達到55攝氏度時，向其加入58.5毫升ALCALASETM2.4LFG，并通過加入4N的氫氧化鈉溶液保持pH值在6.2不變。
從加入ALCALASE時起，5分種后其pH設定值由6.2變為8.0。
再經過30分種后加入15％的磷酸溶液(H3PO4)在5分種內將pH值由8.0降低到5.6，在加入1.575千克的馬鈴薯蛋白。
然后立即加自來水至15升，將這些含有水解蛋白的懸浮液按每份2升分裝，儲存于-18攝氏度保存待用，此時水解過程已停止。
蛋白預水解程度(OPA)將在例四中解釋。假設馬鈴薯蛋白質中干物質含量為93％，其中蛋白質的％含量為干物質的80％。
例三馬鈴薯蛋白質的水解(OPA＝19.5％)稱取1.2千克馬鈴著蛋白加自來水至13升，將其混勻使馬鈴薯蛋白能夠充分懸浮。
混勻的同時對其加熱(設定55攝氏度)。
當溫度到達55攝氏度時，通過向其加入4N的氫氧化鈉溶液使其pH值調至7.0，加入116.6克ALCALASETM2.4L FG并不斷的向其滴加4N的氫氧化鈉溶液保持pH值在7.0不變。
從加入ALCALASE時算起，4小時后加自來水至16升，將這些含有與水解蛋白的懸浮液按每份4升分裝，儲存于-18攝氏度保存待用，此時水解過程已停止。
蛋白水解的程度(OPA)是怎樣定義的將在例四中解釋。假設馬鈴薯蛋白質中干物質含量為93％，其中蛋白質的％含量為干物質的80％。
例四OPA的解析，蛋白水解程度將大約1克樣品(樣品重量W1)與4毫升0.1N的氫氧化鈉溶液混合。
離心混合物至上清液澄清，用適當量的去離子水稀釋上清液至V1毫升。
時間起點加入3毫升OPA反應試劑(見下)，劇烈混勻。兩分鐘后(這一時間要相當精確)，測340納米下的吸光值(1cm cuvette)。
將每個樣品都按同樣的方式平行處理兩次。
平均吸光值應該在對照吸光值和標準吸光值之間，否則就要根據結果重新將樣品稀釋。
對照吸光值(blind)去離子水的吸光值標準吸光值向50毫克L-亮氨酸加入500毫升去離子水后的吸光值OPA反應試劑稱取7.62克四硼酸二鈉，200毫克十二烷基磺酸鈉加入去離子水大約至175毫升。向4毫升96％乙醇中加入160毫克OPA，并使OPA充分溶解。然后將上述兩種溶液混合，再加入176毫克的二硫蘇糖醇(99％)并加水將最終體積調至200毫升。放置4小時后將OPA反應試劑棄去。
OPA(蛋白水解程度)由下面的公式計算得來((A×(ODav.，樣品-ODav.，對照)/(ODav.，標準-ODav.，對照)×(V1(ml)×100)/(W1(mg)×P))-B)×100％/(C×D)A＝0.9516＝亮氨酸濃度ODav.，樣品，在340納米下樣品吸光值的平均值。
ODav.，標準，亮氨酸標準在340納米下吸光值的平均值ODav.，對照，去離子水在340納米下吸光值的平均值。
V1(ml)＝稀釋體積，單位為毫升W1(mg)＝樣品重量，單位為毫克P＝水解樣品中馬鈴薯蛋白質含量百分數B＝0.4，對于馬鈴薯蛋白質，此數值不變C＝1.0，對于馬鈴薯蛋白質，此數值不變D＝9.1對于馬鈴薯蛋白質，此數值不變B、C、D對應于不同蛋白質的不同數值

因此，OPA值可以很好的反應被分析樣品中已水解肽鍵的百分含量。
例五微生物菌種在例六、例七和例八中被用來制造蛋白酶的Af50-34是從NCIB 10309分離得到，并按照EP 0 506 780 B1中所述方法進行遺傳學改造后的菌種。而在例六、例九和例十中被用來制造α淀粉酶的SJ5262則是來源于SJ4671，得自US 6,100,063。首先，挑選抗利福平的自發突變菌種，其中RpoB蛋白的第478的氨基酸由纈氨酸取代了原來的丙氨酸，這一菌種即SJ4671rif10，且在丹麥申請了專利，PA 2001 01972。然后，通過WO 02/00907中所述的雙同源重組的方法，將編碼一個細胞外蛋白酶的基因(其蛋白質序列和基因序列在GeneSeqP的編號為AAE00011；WO 01/16285；EP482 879)缺失。
例六增殖程序Af50-34菌株B3-瓊脂培養基蛋白胨6克胃蛋白酶 4克酵母提取物3克肉類提取物1.5克一水合葡萄糖 1克瓊脂 20克加去離子水至一升，然后用氫氧化鈉溶液或氯化氫溶液將pH值調至7.35，121攝氏度高溫滅菌40分鐘待用。
等滅菌完畢，溫度降至40-50攝氏度，加入經過濾滅菌的1摩爾每升碳酸氫鈉溶液(pH值為9，體積比為10％)和經過121攝氏度40分鐘高溫滅菌的由去離子水配置的脫脂奶粉(質量體積比為10％)。
M9-緩沖溶液二水合磷酸氫二鈉8.8克磷酸二氫鉀3克氯化納4克七水合硫酸鎂0.2克加入去離子水至1升121攝氏度高溫滅菌20分鐘種子搖瓶培養基PRK-1大豆50克二水合磷酸氫二鈉20克加去離子水至1升，然后用氫氧化鈉溶液或氯化氫溶液將pH值調至9.0，將其按每份100毫升分裝到具有兩個擋板的500毫升錐形瓶中。
121攝氏度高溫滅菌20分鐘待用。
將Af50-34菌種在B3瓊脂培養基上37攝氏度培養24小時后。
用M9緩沖液充分懸浮菌體并用吸光光度計測量650納米下吸光值，取y毫升(y值由OD(650nm)×y＝0.1計算得出)細胞懸浮液接種到PRK-1搖瓶中，將培養基放置于HT Infors Unitson旋轉式搖床以37攝氏度300轉每分鐘的速度培養22小時待用。
向每個發酵罐中接種80毫升搖瓶培養液即可進行發酵反應。
SJ 5262菌種LB瓊脂培養基蛋白胨(來自酪蛋白)10克酵母提取物5克氯化鈉10克瓊脂12克添加去離子水到1升，并用氫氧化鈉或鹽酸溶液將pH值調至7(+/-0.2)。
121攝氏度高溫滅菌20分鐘M9-緩沖溶液二水合磷酸氫二鈉8.8克磷酸二氫鉀3克氯化納4克七水合硫酸鎂0.2克加入去離子水至1升121攝氏度高溫滅菌20分鐘種子搖瓶培養基PRK-50大豆片(soy flakes)44克二水合磷酸氫二鈉2克加1升自來水，然后用氫氧化鈉溶液或氯化氫溶液將pH值調至8.0，將其按每份100毫升分裝到具有兩個擋板的500毫升錐形瓶中。
121攝氏度高溫滅菌60分鐘待用。
將SJ 5262菌種在LB瓊脂斜面上37攝氏度培養24小時后。
用M9緩沖液懸浮所得菌體并用吸光光度計測量650納米下吸光值，取y毫升(y值由OD(650nm)×y＝0.1計算得出)細胞懸浮液接種到PRK-50培養基中，將培養基放置于HT Infors Unitson旋轉式搖床以37攝氏度300轉每分鐘的速度培養20小時待用。
向每個發酵罐中接種80毫升，剛剛培養好的菌體即可進行發酵反應。
例七用Af50-34菌種和OPA＝2.9％的馬鈴薯蛋白在培養基中的發酵反應發酵反應在有4個擋板容量為2升的發酵罐中進行，必須保證足夠的通風率使得整個發酵罐中溶解氧的濃度保持在大約20％以上，但通風率也不能超過2l/l/min。
溫度控制在37攝氏度，為了防止泡沫的產生，一開始就要在培養基中加入足夠量的防沫油。通過不斷的添加15％的磷酸溶液或10％的氨水保持反應物的pH值在8.0和7.7之間。
生長培養基在接種后0.1小時即被添加，并保持下面的速度。
距進料開始的時間(小時) 0 10 200培養基添加速率(克每分鐘) 0 0.2 0.2組成(make-up)培養基水解的馬鈴薯蛋白(OPA＝2.9％)100克磷酸二氫鉀5克二水合磷酸氫二鈉5克七水合硫酸鎂2.5克一水合硫酸錳0.02克七水合硫酸亞鐵0.08克五水合硫酸銅0.008克氯化鋅0.008克檸檬酸0.39克氯化硫銨0.05克核黃素0.004克煙酸0.03克泛酸酯鈣0.04克鹽酸吡哆醛0.008克生物素0.0015克葉酸0.004克用磷酸溶液或氨水調節pH值到8.0后，加自來水至1升向每個發酵罐中添加720毫升，121攝氏度高溫滅菌1小時。
進料培養基水解的馬鈴薯蛋白(OPA＝2.9％)135克蔗糖300克加自來水至1升121攝氏度高溫滅菌1小時分別在接種后49小時、71小時從發酵罐中取少量反應物按照例11的方法分析其中蛋白酶的活性。
例八用Af50-34菌種和OPA＝為51％的馬鈴薯蛋白在生長培養基中的發酵反應。
此發酵反應，除了進料培養基中使用的是水解度為51％的馬鈴薯蛋白外，其余與例七中完全一致，當基于得自水解物中的馬鈴薯蛋白干物質(110g水解物/l)，該數量對應實施例7中所用的蛋白水解物的量。
例九用SJ 5262菌種和水解度為19.5％的馬鈴薯蛋白在發酵培養基中的發酵反應發酵反應在有4個擋板容量為2升的發酵罐中進行，轉速和通風必須保證足夠的通風率使得整個發酵罐中溶解氧的濃度保持在大約20％飽和度以上，但通風任何時候也不能超過2l/l/min。
溫度控制在37攝氏度，為了防止泡沫的產生，一開始就要在培養基中加入足夠量的防沫油。通過不斷的添加15％的磷酸溶液或10％的氨水保持反應物的pH值在7.5和7.0之間。
生長培養基在接種后0.1小時即被添加，隨后速度保持不變。
距起始培養的時間(小時) 05200培養基添加速率(克每分鐘) 00.15 0.15組成培養基馬鈴薯蛋白水解物(OPA＝19.5％)187.5克磷酸二氫鉀5克磷酸氫二鉀5克二水合磷酸氫二鈉2.5克七水合硫酸鎂2.5克硫酸銨2.5克一水合硫酸錳0.02克七水合硫酸亞鐵0.08克五水合硫酸銅0.008克氯化鋅0.008克檸檬酸0.39克加自來水至1升，向每個發酵罐中添力720毫升配制好的發酵培養基，121攝氏度高溫滅菌1小時。
進料培養基1水合葡萄糖400克加自來水至1升121攝氏度高溫滅菌1小時分別在發酵后95小時、116小時從發酵罐中取少量反應物按照例11的方法分析其中蛋白酶的活性。
例十用SJ 5262菌種的發酵反應，在組成培養基中使用非水解的馬鈴薯蛋白此發酵反應，除了在組成培養基中使用的是非水解的馬鈴薯蛋白外，其余與例九中完全一致。，當基于得自水解物/未水解物中的馬鈴薯蛋白干物質(15g水解物/l)，該數量對應實施例9中所用的蛋白水解物的量。
例十一通過分析計算得出發酵液中酶的活性蛋白酶滴度的測定(例七和例八)采用的是發酵學中最常用的方法，即測定反應產物中酶的活力，WO 89/06279中29-31頁所述的就可以用來測定蛋白酶的活性。
α淀粉酶滴度的測定(例九和例十)也采用的是發酵學中最常用的方法，即測定反應產物中酶的活力，WO 95/26397中9-10頁所述的就可以用來測定α淀粉酶的活性。
例十二比較分析例七例八例九例十中酶活性Af50-34菌種/蛋白酶馬鈴薯蛋白水解產物；進料中OPA＝2.9％(例七)在49、71小時取樣相關滴度139、130馬鈴薯蛋白水解產物；進料中OPA＝51％(例八)在49、71小時相對滴度100、68(所有滴度值都以例八中49小時樣品的滴度值作為標準。)SJ 5262/α淀粉酶馬鈴薯蛋白水解產物；組成中OPA＝19.5％(例九)在95、116小時取樣相對滴度111、130馬鈴薯蛋白非水解產物(例十)在95、116小時取樣相對滴度100、117(所有滴度值都以例十中95小時樣品的滴度值作為標準)根據上述分析可以得出在用預水解的復合氮源(馬鈴薯)來發酵生產蛋白酶時，較低的預水解度有利于蛋白酶的形成。在用預水解的復合氮源(馬鈴薯)來發酵生產α淀粉酶時，充分預水解的復合氮源也很有利于α淀粉酶活性的增加，其主要原因是預水解的復合氮源程度可以更好的被微生物吸收利用。
權利要求
1.一種以工業規模生產酶的方法，包括a)用含有一或多種預水解復合氮源的發酵培養基通過微生物發酵的方式生產所需要的酶，這些復合氮源要與含碳水化合物的其他營養源分開滅菌。向復合氮源中添加酸類物質或水解酶以達到所述預水解的目的；b)從發酵培養液中回收所需酶。
2.權利要求1中所述方法，其中的酶包括淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、氧化還原酶、carbohydrolase，和非破壞性蛋白酶或肽酶。
3.權利要求1中所述方法，其中的酶是能自我破壞性蛋白酶或肽酶。
4.權利要求1中所述方法，其中的微生物可選用細菌或真菌。
5.權利要求4中所述方法，其中的細菌是芽孢桿菌。
6.權利要求1中所述方法，其中的復合氮源是含有少于10％碳水化合物的植物來源蛋白。
7.權利要求1中所述方法，其中的復合氮源選自馬鈴薯蛋白或豌豆蛋白。
8.權利要求1中所述方法，其中的復合氮源是含有少于10％碳水化合物的動物來源蛋白。
9.權利要求1中所述方法，其中的復合氮源選自血液蛋白，魚肌肉蛋白和動物肌肉蛋白。
10.權利要求2中所述方法，其中的復合氮源預水解破壞10％-70％的肽鍵。
11.權利要求3中所述方法，其中的復合氮源預水解破壞1-20％的肽鍵。
12.權利要求1中所述方法，其中的預水解復合氮源的含量按重量計算達到加入培養基的全部凱氏氮總量的至少5％。
13.權利要求1中所述方法，其中的發酵培養基的量至少是50升。
14.權利要求1中所述方法，其中的發酵是重復分批式發酵、流加式發酵、重復流加式發酵或連續式發酵反應。
全文摘要
本發明涉及一種以工業規模生產目的酶的方法，包括a)用含有一或多種部分預水解復合氮源的發酵培養基通過微生物發酵的方式生產所需要的酶，這些部分預水解復合氮源與其他含有碳水化合物的其他營養源分開滅菌，所述預水解通過加入酸和/或水解酶完成；和b)從發酵培養液回收酶。
文檔編號C12N9/00GK1665924SQ03815585
公開日2005年9月7日 申請日期2003年6月26日 優先權日2002年7月1日
發明者莫根斯·沃普爾曼, 尼爾斯·班克, 索倫·邁克爾森 申請人:諾維信公司