專利名稱：在發酵過程中加入單丙二醇的制作方法
技術領域：
這項發明涉及在發酵過程中增加相關多肽的溶解性。
工藝背景在發酵過程中經常可以見到多肽的結晶或無定形沉淀的形成，這是由于發酵產量越來越高，發酵配方的優化，和/或由于更多的有效生產有機體的鑒別/發展或形成。
在這種情況下，多肽在發酵過程中的產量高于它的溶解度，即意味著在發酵肉湯中會有部分以沉淀物的形式存在著。這種沉淀是結晶形式或是無定形狀態。
這樣就帶來了問題在發酵恢復時去掉細胞和其它固型成分之前，必須要采取一些措施以增加結晶/無定型沉淀物的溶解度，這種措施的實施常常會導致產量的下降。
這項發明的目的在于提供一種簡便易行的方法來解決上述問題。
發明概要我們很驚奇的發現，在發酵之前和/或發酵過程的中間，往發酵肉湯中加入一些碳水化合物和/或多羥基化合物(polyols)和/或其衍生物和/或聚合物，可以有效的阻止多肽結晶或沉淀的形成，其中微生物不會，或僅僅在很低的程度上，可以代謝產生以上所說的碳水化合物和/或多羥基化合物和/或其衍生物等等，而我們這項發明主要是與以下一些方法有關一種微生物的發酵方法，在至少50升的培養基中產生相關多肽，包括添加一種或多種下面所列出的化合物包括1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、乙二醇、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、己六醇、甘露醇、赤藻糖醇、纖維二糖、山梨(糖)醇和平均分子量不到1000的多(聚)醚。在發酵之前和/或發酵中間加入到培養基中，其中這些化合物基本上是低代謝的，在此通過測量菌液的OD值，以(ODIII-ODII)/(ODI-ODII)＜25％來確定。
發明詳述這項發明是一種新的和非常高效的方法，可以有效阻止在發酵過程中的多肽結晶或沉淀的形成。
我們驚奇的發現，如果發酵過程中存在小量的例如5％(w/w)的單丙二醇(MPG)，即可避免，顯著延遲或顯著降低結晶或無定型沉淀的形成。MPG對大多數微生物來說是一種非常差的碳源化合物或者很少被代謝的代謝物，或者根本不產生代謝變化，因此它可以在發酵之前和/或在發酵的過程中間加入，而不會顯著影響到細胞的生長繁殖和多肽的產生。
通過在發酵過程中避免多肽結晶/無定型沉淀的形成，更為簡單的分離過程能夠獲得更高的產量。
微生物這項發明中所提到的微生物(微生物菌株)可以是任何種類的微生物。
其中首選的相關多肽來源于細菌源或真菌源。
例如來源于革蘭氏陽性細菌的相關多肽，如芽孢桿菌，如Bacillusalkalophilus，解淀粉芽孢桿菌，短乳桿菌，環狀芽孢桿菌，凝結牙孢桿菌，Bacillus lautus，，緩慢芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬菌株，例如淺青紫鏈霉菌，鼠灰鏈霉菌；或者來源于革蘭氏陰性桿菌，如埃希氏大腸桿菌或假單胞菌屬。
相關多肽也可以是真菌來源，如來源于酵母菌株例如假絲酵母，克魯維酵母，畢赤酵母，糖酵母，裂殖酵母菌屬，歐蓍草(Yarrowia)酵母菌株，如卡爾斯伯酵母菌，釀酒酵母菌，糖化酵母，Saccharomyces douglasii，克魯維氏糖酵母(Saccharomyces kluyveri)，Saccharomyces norbensis，或Saccharomyces oviformis。
相關多肽也可以是絲狀真菌來源，例如Acremonium，曲霉菌，短梗霉菌，隱球酵母菌屬，Filibasidium，鐮刀霉，腐質霉菌，稻瘟霉菌，毛霉菌，黃毀絲霉菌，Neocallimastix菌，脈孢菌，擬青霉菌，青霉菌，瘤胃真菌，裂褶菌，Talaromyces菌，Thermoascus菌，果腐霉菌，中國彎頸霉菌，或木霉屬菌株，特別的相關多肽來源于Aspergillus aculeatus，泡盛曲霉，黑曲霉，臭曲霉，日本曲霉，構巢曲霉，黑曲霉，稻曲霉，鐮刀霉bactridioides，cerealis鐮刀霉，crookwellense鐮刀霉，黃色鐮孢菌，禾谷鐮刀霉，禾谷鐮刀霉變種，異孢鐮孢，negundi鐮刀霉，尖孢鐮孢菌，reticulatum鐮刀霉，粉紅鐮孢菌，接骨木鐮孢菌，sarcochroum鐮刀霉，擬枝孢鐮刀霉，硫色鐮刀霉，金黃殼鐮刀霉，trichothecioides鐮刀霉，鐮孢霉，insolens腐質霉菌，lanuginosa腐質霉菌，miehei毛霉菌，嗜溫微生物Myceliophthorathermophila，脈孢菌，青霉屬產紫青霉系，哈茨木霉，康寧木霉，長枝木霉，瑞氏木霉，或者綠色木霉株。
以上這些菌株在許多大的收集機構中都可以很方便的查找到，例如美國典型培養物保藏中心(ATCC)，德國菌種保存中心(DSM)，荷蘭菌種保存中心(CBS)，和農業研究服務專利收集中心，北方區域研究中心(NRRL)等等。
這項發明的目的在于，即這里所說的“得自”一詞，與給定來源的菌株相聯系，即從給定來源的菌株或細胞中插入一段給定來源的目的基因，使其表達所需要的相關肽段。
對目的微生物的修飾根據這項發明，所選用的微生物需要經過一定的修飾，使它不能夠，或只能進行低限度的對所選的碳水化合物和/或多羥基化合物和/或其衍生物的代謝，例如，原始的微生物能夠對甘油或環式糊精進行代謝，但是改良修飾以后的微生物則不能或是只能低限度的對其進行代謝反應。
相關多肽所需要的相關多肽可以是肽，也可以是蛋白質。
這項發明適用的優選相關肽的長度為2-100個氨基酸；更適宜的長度是10-80個氨基酸；更適宜的長度是15-60個氨基酸；最適宜的長度是15-40個氨基酸。
一個首選的典型例子，這種蛋白質是一種酶，是水解酶(根據國際生物化學分類規則委員會的建議，根據酶的命名法歸類為EC3)。
除水解酶之外，另一個特殊的例子是蛋白酶適宜的蛋白酶包括動物來源的蛋白酶，植物來源的蛋白酶或微生物來源的蛋白酶。其中，微生物來源的蛋白酶最好。包括經過化學修飾的蛋白酶或蛋白質重組工程突變形成的蛋白酶。蛋白酶可以是一種酸性蛋白酶，例如絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，但是，適宜的蛋白酶是堿性的微生物來源的蛋白酶或胰島素樣的蛋白酶。一個堿性蛋白酶的例子是枯草桿菌蛋白酶，尤其是桿菌屬細菌來源的蛋白酶，如合成的枯草桿菌堿性蛋白酶、枯草菌溶素、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶168(具體描述見WO 89/06279)。胰島素樣蛋白酶的例子是胰島素(例如豬胰島素或牛胰島素)和鐮刀霉蛋白酶(具體描述見WO 89/06270and WO 94/25583)。
各種不同的有用的蛋白酶例子的描述可以在WO 92/19729、WO98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中找到，尤其是在下列的一個或多個位點發生氨基酸替換的多肽或蛋白質變異體27，36，57，76，87，97，101，104，120，123，167，170，194，206，218，222，224，235和274。
首選的已有商品化的蛋白酶包括ALCALASETM、SAVINASETM、PRIMASETM、DURALASETM、ESPERASETM、RELASETM和KANNASETM(諾維信公司，A/S)，MAXATASETM、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM、PURAFECTTM、PURAFECT OXPTM、FN2TM和FN3TM(杰能科國際有限公司)。
脂肪酶適宜的脂肪酶包括那些細菌來源的脂肪酶或真菌來源的脂肪酶，也包括化學修飾后的或蛋白重組突變獲得的脂肪酶。有用的脂肪酶的例子包括來源于腐質霉菌的脂肪酶(與嗜熱真菌同義)，例如來源于H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶，如EP 258 068和EP 305 216中所描述，或來源于腐質霉菌，具體描述見WO 96/13580，來源于假單胞菌的脂肪酶，例如產堿假單胞菌，或類產堿假單胞菌(EP 218 272)，洋蔥假單胞菌(EP331 376)，斯氏假單胞菌(GB 1,372,034)，熒光假單胞菌，假單胞菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)，P.wisconsinensis(WO 96/12012)，來源于芽孢桿菌的脂肪酶，例如來源于枯草芽孢桿菌(Dartois et al.(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)，來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(WO 91/16422)。
另外一些脂肪酶變異體的描述見于WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079以及WO 97/07202。
首選的商品化的脂肪酶包括LIPOLASETM、LIPOLASE ULTRATM和LIPEXTM(諾維信公司A/S)。
淀粉酶適當的淀粉酶(α和/或β淀粉酶)包括細菌源或真菌源的淀粉酶，也包括化學修飾后的或蛋白重組突變形成的淀粉酶。淀粉酶包括，例如來源于芽孢桿菌的α-淀粉酶，例如來源于地衣芽孢桿菌株的淀粉酶，更多的細節描述見于GB 1,296,839。
有用的淀粉酶的例子有變異體，如WO 94/02597、WO 94/18314、WO96/23873、WO 97/43424和WO 01/66712中所描述的，尤其是在下列這些位點發生一個或多個氨基酸替換的15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408和444。
目前已經商品化的淀粉酶有DURAMYLTM、TERMAMYLTM、FUNGAMYLTM、NATALASETM、TERMAMYLLCTM、TERMAMYLSCTM、LIQUIZYME-XTM和BANTM(諾維信公司，A/S)，RAPIDASETM和PURASTARTM(杰能科國際有限公司)。
纖維素酶適宜的纖維素酶包括細菌源的或真菌源的，也包括化學修飾后的或蛋白重組突變形成的。適宜的纖維素酶包括來源于芽孢桿菌、假單胞菌、腐質霉菌、鐮刀霉、果腐霉、頂胞霉，例如來源于insolens腐質霉菌，Myceliophthora thermophila和尖鐮孢菌的真菌纖維素酶，具體描述見US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259.。
特別適宜的纖維素酶是堿性或中性的纖維素酶，具有顏色的偏好。這些纖維素酶的例子如EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO96/29397、WO 98/08940中所描述的。另外一些纖維素酶變異體的例子如WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中所描述。
可買到的商品化的纖維素酶有CELLUZYMETM、CAREZYMETM和CAREZYME CORETM(諾維信公司A/S)，CLAZINASETM和PURADAXHATM(杰能科國際有限公司)，和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
氧化還原酶根據這項發明，氧化還原酶包括過氧化物酶和氧化酶例如漆酶和過氧化氫酶。
其他的首選的水解酶有碳水化合物水解酶包括MANNAWAYTM.。其他首選的酶還包括轉移酶，裂解酶，異構酶和連接酶。
發酵這項發明對于工廠中的大規模的發酵都是適用的，例如對于任何至少有50升培養基的發酵都適用，更適用于至少100升的，更更適用于至少500升的，尤適用于至少1000升的，最適用于至少5000升培養基的發酵。
微生物發酵可以采用任何傳統的方法。培養基可以是氮源和/或碳源化合物的混合物，例如大豆粉、大豆蛋白、大豆蛋白水解產物、棉花籽粗粉、玉米漿、酵母提取物、干酪素、干酪素水解產物、馬鈴薯蛋白、馬鈴薯蛋白水解產物、糖蜜及其它類似的東西。培養基可以經過化學的方法精練，如WO 98/37179中所描述。
發酵的過程可以是分批進行，也可以補料分批進行，重復補料分批或連續發酵進行。
在補料分批發酵過程中，在發酵開始之前，培養基中沒有加入或者只有一部分含有一或多種結構性成分和/或結晶成分的化合物加入，而全部或剩下的部分是在發酵過程中加入的。選擇性加入的化合物可以同時加進去，也可以在發酵過程中分別單獨加入。
在重復補料分批或連續發酵過程中，完全成分的初始培養基是在發酵進行的過程中加入的。完全成分的初始培養基可以和其他結構成分進料同時加入，也可以與他們分開而單獨加入。在重復補料分批發酵過程中，在固定的時間間隔內，要從培養基中每次去除含固定生物量的培養基而在連續進行的發酵過程中，除去一部分含固定生物量培養基的過程則是連續進行的。因此，整個發酵過程是一個不斷去除一部分舊的培養基同時又在不斷添加一部分等量的新培養基的過程。
在這項發明中，首選的代表是補料分批發酵過程，重復補料分批發酵過程或連續發酵過程。
碳水化合物在這項發明中，代謝比較緩慢的碳水化合物如支鏈淀粉、限制性糊精和海藻糖等都可以使用。
碳水化合物在這項發明中的具體應用體現在，在微生物接種之前或接種之后在培養基中加入一定量的低代謝率的碳水化合物，如至少0.1％(w/w)，更適宜的量是至少0.5％(w/w)。低代謝率的碳水化合物在接種之前或接種之后加入到培養基中的總量最多在10％(w/w)，更適宜的是最多到8％(w/w)，然后依次的更為適宜的量為6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)以及1％(w/w)。
多羥基化合物根據這項發明可以應用一種非常有用的碳水化合物亞類——多羥基化合物，任何一種多羥基化合物都可以使用。然而，首選的多羥基化合物有以下幾類1，2-丙二醇(單丙二醇)、1，3-丙二醇、丙三醇、乙二醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、衛矛醇、甘露醇、赤藻糖醇、纖維二糖、山梨糖醇。
值得注意的是有一些多羥基化合物，例如甘油，很容易被許多細胞代謝，但是在其攝入可以被阻斷，就意味著在這項發明中甘油也是可以使用的。
在這項發明中，多羥基化合物在微生物接種之前或者在微生物接種之后加入到培養基中，其加入的量至少為0.1％(w/w)，更適宜的量為最少0.5％(w/w)。多羥基化合物在接種之前或者在接種之后加入到培養基中的總量最多在10％(w/w)，更適宜的是最多到8％(w/w)，然后依次的更為適宜的量為6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)以及1％(w/w)。
在某些更適宜的條件下，可以添加兩種或多種多羥基化合物，例如甘油和單丙二醇，或者多羥基化合物和低代謝率的碳水化合物的混合物等等。
衍生物另一類非常有用的碳水化合物亞類是其衍生物，在這項發明中也可以使用。可以使用的碳水化合物衍生物有梅拉德產物、甲基糖苷類、葡萄糖苷酸(glucoronic acid)、氨基糖類、或N-乙酰基葡糖胺。
在這項發明中，碳水化合物衍生物在微生物接種之前或者在微生物接種之后加入到培養基中，其加入的量至少為0.1％(w/w)，更適宜的量為最少0.5％(w/w)。碳水化合物衍生物在接種之前或者在接種之后加入到培養基中的總量最多在10％(w/w)，更適宜的是最多到8％(w/w)，然后依次的更為適宜的量為6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)以及1％(w/w)。
聚合物聚合物例如多(聚)醚，其平均分子量不超過1000；適宜的平均分子量不超過900，更適宜的平均分子量不超過800，更更適宜的平均分子量不超過700(例如聚乙烯乙二醇200(PEG 200)，聚乙烯乙二醇400(PEG 400))，或者他們的衍生物包括聚乙烯氧化物和聚丙烯氧化物的嵌段聚合物和嵌段共聚物，在這些聚合物的末端有保護性的酰基集團或烷基集團。以上這些聚合體在這項發明中都可以使用。
在這項發明中，聚合體在微生物接種之前或者在微生物接種之后加入到培養基中，其加入的量至少為0.1％(w/w)，更適宜的量為最少0.5％(w/w)。聚合體在接種之前或者在接種之后加入到培養基中的總量最多在10％(w/w)，更適宜的是最多到8％(w/w)，然后依次的更為適宜的量為6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)以及1％(w/w)。
鹽除了在培養基中添加低代謝率的碳水化合物之外，再加入適量的鹽會更有利。(見例子4)。
可選用的鹽類有如下幾種氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、銨鹽，例如NaCl、KCl、Na2SO4、K2SO4。
代謝程度用下面的實驗來檢測產生所需要的相關肽的微生物是否沒有代謝或是最低限度的代謝了所加入的化合物。
選擇合適的適宜微生物生長的培養基。
所選擇的微生物的培養基應當滿足以下這些參數要求a僅以葡萄糖作為碳水化合物的唯一來源，b；當去掉葡萄糖時，培養基應當只能夠支持顯著降低的微生物生長(不多于50％)。
微生物在以下三種培養基中生長的比較I 通用培養基(以葡萄糖作為作為唯一的碳水化合物的來源)II 沒有葡萄糖的培養基IIII 沒有葡萄糖的培養基I，但是添加了相同C-摩爾數的待檢測化合物然后在三種培養基中進行8小時的微生物生長跟蹤監測。接種濃度選用單位劑量的菌種以保證在通用培養基中的微生物在75％的時間范圍內生長出來。生物量通過在650nm處的光密度的測量來確定。測定在不同培養基中的所得OD。
待檢測的化合物被定義為低代謝率，如果(ODIII-ODII)/(ODI-ODII)＜25％；優選(ODIII-ODII)/(ODI-ODII)＜20％；優選(ODIII-ODII)/(ODI-ODII)＜15％；優選(ODIII-ODII)/(ODI-ODII)＜10％；優選(ODIII-ODII)/(ODI-ODII)＜5％；優選(ODIII-ODII)/(ODI-ODII)＝0％根據這種檢測方法，檢測例子1中的各種化合物的代謝率。
所需的相關多肽的得自這項發明的更進一步的方面就涉及到了，下游的對培養基的處理工藝。在發酵過程結束后，需要應用標準的技術方法得自培養基中的所需要的相關多肽片段，相關的下游得自技術與所需要得自的相關多肽的特性有關。
一個典型的得自培養基中的相關多肽的程序包括以下這些部分或全部的步驟1)培養基的前處理(例如絮凝)2)從培養基中分離去除細菌和其他固型物質(初級分離)3)過濾4)濃縮5)過濾6)穩定化和標準化。
除了上述提到的這些程序之外，還需要有其他的一些得自程序，例如pH值的調整、溫度的調節、結晶化處理、帶有活性碳成分的水溶性多肽的處理，以及應用各種吸附劑等等。
通過應用這項發明的方法，例如在發酵過程中加入MPG，在得自時，所需要的相關多肽的產量大大提高了，結晶形成降低或消失了。
這項發明會在以下通過一些例子得到進一步的闡明，而不是說對這項發明的應用領域有任何的限制，特此聲明。
例子1對不同的多羥基化合物和碳水化合物作為碳源對微生物生長的適宜性的評估。
搖菌培養基Med-F18搖菌培養基(最終混合之后的濃度)A部分細菌蛋白胨0.5；酵母提取物0.5g/l；硫酸鎂，7H2O0.5g/l；硫酸銨2g/l；氯化鈣，2H2O0.1g/l；檸檬酸50mg/l；痕量金屬(MnSO4，H2O2.5mg/l；FeSO4，7H2O9.9mg/l；CuSO4，5H2O 1.0mg/l；ZnCl21.0mg/l)；PLURONICTM0.1g/l；pH調節到6.7。
B部分5g/l磷酸二氫鉀，pH用NaOH調節到6.7。
C部分相當于每升含0.08摩爾碳元素的碳源等價物(例如2.5g/l葡萄糖)所有培養基用的水都是去礦物質水。
A，B和C部分在121℃蒸餾滅菌20分鐘后混合。
菌株地衣芽孢桿菌通過搖菌過程，監測細菌的生長情況，以此來評估不同的多羥基化合物和碳水化合物作為碳源對細菌生長的適宜性。
首先菌株在培養前經過一段時間的生長，以保證菌株處于良好的生長狀態。
然后每一個搖菌瓶中接種相同量的菌株，通過在650nm處檢測其吸光度值來判斷。
每一個瓶中的接種體密度以OD×ml細菌懸液＝80作為選擇依據，結果是在0時間每瓶中的OD＝0.8。
每一型菌株分別接種三個培養瓶。
搖菌瓶的類型IMed-F18加入C部分，C部分中是葡萄糖(葡萄糖的終濃度是2.5g/l(相當于每升含0.08摩爾的碳)。
IIMed-F18不加C部分，培養基中沒有任何葡萄糖IIIMed-F18加入C部分，用以下的任何一種碳水化合物來代替葡萄糖-2.1g/l MPG(相當于每升含0.08摩爾的碳)-2.1g/l PEG 200(相當于每升含0.08摩爾的碳)或者-2.4g/l蔗糖(相當于每升含0.08摩爾的碳)最后培養基中的終濃度分別為2.1g/l MPG；2.1g/l PEG 200或2.4g/l蔗糖。
由于錯誤，準備的培養基的上述物質的終濃度分別為2.5g/l MPG；量105cfu)通過劃線法進行接種。并在厭氧工作站(グンゼ產業)中于35℃培養18小時后，通過肉眼觀察有沒有生長。確認有生長時，判定為(+)。結果如表14所示。
表14赤竹提取物對氣性壞疽菌群梭菌的抗菌作用
考察可知赤竹提取物可抑制諾氏梭菌和生孢梭菌生長的濃度為3％，可抑制敗毒梭菌生長的濃度為3-5％，可抑制雙酶梭菌、索氏梭菌生長的濃度為5-7％。即，雖然赤竹提取物對與氣性壞疽相關的梭菌的抗菌作用因菌種不同而存在差異，但只要具有7％的濃度，則可抑制所用全部菌株的增殖。為預防氣性壞疽而對傷口部位使用本提取物時，最好在pH7的條件下，設定為7％的濃度。
試驗例9(對16株瘡皰丙酸桿菌的抗菌作用)所用菌株使用瘡皰丙酸桿菌ATCC11827和15株臨床分離菌株(GAI-10341、GAI-10342、GAI-10343、GAI-10344、GAI-10345、<p>
從以上結果可以很容易的看到蔗糖在這個例子中被很容易的代謝掉了。
例子2在發酵過程中在培養基中加入MPG，使酶的溶解性提高了。
菌株地衣芽孢桿菌所需要的相關多肽α-淀粉酶變異體，具體描述見WO 01/66712。
培養基除非另有說明，這里所用的水全部為自來水。所有培養基的滅菌都是用已知的常規方法，以保證整個發酵過程都是在統一的培養基中進行的。
第一個接種培養基LB瓊脂10g/l酪蛋白胨；5g/l酵母浸出物；10g/l氯化鈉；12g/l Bacto瓊脂，調整pH為6.8到7.2，應用Merck的預混合料混合。
轉移緩沖液M-9緩沖液(應用去離子水)磷酸氫二鈉，2H2O 8.8g/l；磷酸二氫鉀3g/l；氯化鈉4g/l；硫酸鎂，7H2O 0.2g/l。
接種震蕩培養瓶培養基(接種前濃度)PRK-50110g/l大豆粗粉；磷酸氫二鈉，2H2O 5g/l；滅菌前用NaOH/H3PO4將pH調節到8.0。
組成(make-up)培養基(濃度是接種前濃度)胰蛋白胨(Difco公司的酪蛋白水解產物)30g/l；硫酸鎂，7H2O 4g/l；磷酸氫二鉀7g/l；磷酸氫二鈉，2H2O 7g/l；硫酸二銨4g/l；檸檬酸0.78g/l；維生素(二氯硫胺素34.2mg/l；核黃素2.9mg/l；尼克酸23mg/l；D-泛酸鈣28.5mg/l；鹽酸吡哆醛5.7mg/l；D-生物素1.1mg/l；葉酸2.9mg/l)；痕量金屬(MnSO4，H2O 39.2mg/l；FeSO4，7H2O 157mg/l；CuSO4，5H2O15.6mg/l；ZnCl215.6mg/l)；抗沫劑(SB2121)1.25ml/l；滅菌之前用NaOH/H3PO4將pH調整到6.0。
添加成分葡萄糖，1H2O 820g/l；接種的步驟程序首先菌株在LB瓊脂斜面上，在37℃條件下生長一天，然后用M-9緩沖液沖洗瓊脂斜面，測量所得自菌液在650nm下的光密度值。
震蕩接種瓶(PRK-50)中接種的菌液的光密度值OD(650nm)×ml細菌懸液＝0.1。
這個震蕩接種瓶在37℃條件下，300rpm震蕩培養20個小時。
在主要發酵發酵罐中的發酵過程從由震蕩培養瓶中的生長菌液接種以后就開始了，接種菌液的體積大約占到組成培養基的10％(即800ml的總培養基中加入80ml的接種菌液)。
發酵設備標準的發酵實驗室設備有溫度控制系統，氨水和磷酸調控的pH控制系統，以及在整個發酵過程中保證氧飽和度在20％以上的溶解氧電極測量系統。
發酵參數溫度41℃應用氨水和磷酸調節使pH保持在6.8到7.2之間對照6.8(氨水)；7.2(磷酸)通風1.5升/分鐘/公斤培養基重量轉速1500rpm添加策略0hr.0.05g/min/kg接種后最初的肉湯8hr.0.156g/min/kg接種后最初的肉湯結束時0.156g/min/kg接種后最初的肉湯實驗計劃用相同的物質接種三個平行的接種罐進行平行的發酵過程，發酵A如上所述進行發酵過程。
發酵B如上所述進行發酵過程，但是在接種前加入50g/L MPG(單丙二醇)發酵C如上所述進行發酵過程，但是在接種后24小時加入50g/LMPG。
(在發酵B和發酵C，加入的MPG的濃度取決于接種前接種罐中整個培養基的體積)發酵進行三天后取樣檢測。將所取樣本平行分成兩等份(樣本I和樣本II).樣本II在38℃條件下，以離心力為15000gav離心20分鐘。離心后的上清液用0.2μm的過濾器(Sartorius Minisart，order no.16534)過濾(sample IIsup)。
然后用常規方法檢測樣本I和樣本IIsup中的α-淀粉酶活性(例如可以應用WO 95/26397中描述的α-淀粉酶活性的檢測方法)。然而，如果待檢樣品中的酶有部分是以固體形式存在的話，則樣品在分析前需要用尿素處理。以1∶50(w/v)的比例將樣本溶解在含40％(w/w)尿素，25.5mg/L硬脂醇醚35和4.4g/L CaCl2，2H2O的溶液中，則結晶和沉淀的α-淀粉酶都可以以活性形式溶解，而溶解的α-淀粉酶則可以進行活性分析了。
用于分析的樣本I和樣本IIsub都要溶解在如上所述的尿素緩沖液中，然后才可以進行分析。
樣本IIsup中測定的是酶的溶解活性，而樣本I則測定的是酶的總活性(包括溶解的酶的活性和結晶和沉淀的酶的活性)。
結果以下這些活性是在發酵三天后所測得的活性。發酵A中測得的總活性作為活性的100％，溶解活性(例如樣本IIsup的活性)給出與樣本I活性的相對值。
表4。
從表4中的結果很明顯可以看出來在培養基中添加了MPG以后，在培養基中溶解的酶活性顯著升高了。
例子3對產量提高和過程的評價在應用桿菌菌株進行大規模發酵(大于50升)生產低溶解度的α-淀粉酶的過程中，應用兩個發酵進行對比。其中一個發酵中在接種24小時后加入2％(w/w)MPG，這一例中的發酵液在顯微鏡(40X)下也看不到酶的結晶。另一例發酵罐中的發酵過程最為對照，不添加任何MPG，這一例中的發酵液在顯微鏡T(40X)可看到酶的結晶出現。
兩批發酵同時平行進行，經過一系列的絮凝過程，pH調整到4個不同的設定點，所有加入物的量都由體積比％w/w來計算。絮凝過程由以下成分組成200％水；2％CaCl2；1.2％Al2(OH)5Cl；pH調整到設定的數值(見下表)；0.5％Superfloc C591和0.2 to 0.3％的Superfloc A130的用量取決于pH的大小。所有的絮結產物都是基于100g的培養基的，所有的添加物也是攪拌中加入的。絮凝過程在室溫下進行(大約20℃)。樣本離心后收集上清液測其中的α-淀粉酶的活性。
表5在不同pH點絮結表明在發酵過程中加入MPG對上清(過濾液)產量的影響在工廠大規模的生產中，第一次離心后的大量的沉淀還要進行第二次離心以提高總的分離率。絮結產物中的沉淀的pH調整到7.5(上面所提到的)，重懸于150％的水中，加入1％CaCl2，最后用0.1 to 0.2％Superfloc A130再次絮結。最初，基于沒有加入MPG的發酵肉湯的絮結產物中的沉淀所獲取的酶的活性是加入了MPG的發酵肉湯的絮結產物中的沉淀所獲取的酶的活性的三倍。而且，在沒有加入MPG的發酵肉湯中的沉淀在顯微鏡(40X)下可以看到結晶，而在加入了MPG的發酵肉湯中的沉淀則在顯微鏡(40X)下沒有任何可見的結晶。
樣本再次被離心，然后檢測沉淀中離心分離出來的上清液中的α-淀粉酶的活性。
表6在不同的pH值下從第一次絮結產物進行第二次絮結表明在發酵中加入MPG對產量的影響從上面的例子可以看出，在發酵過程中加入MPG可以減少或完全避免結晶產物的形成，從而顯著提高酶的回收。
例子4在發酵中同時添加MPG和礦物鹽的影響材料和方法發酵方法與例子2中所描述的相似(發酵A)，作為這些實驗的基礎。
表7.實驗設計
1)這表明在接種一天之后添加MPG。加入MPG的量取決于接種前組成培養基的總體積。
2)在接種前是否在主要培養基中加入了額外的礦物質或是已有礦物質又加入了額外的量。
3)鹽濃度，總量取決于接種前組成培養基的總體積。
實驗設計發酵D在這個研究中用做對照，而發酵E，F，G，H，I則依據表7在總量中加入不同的額外的礦物鹽。
發酵三天后取樣。樣本平行分成兩等份(樣本I和樣本II).樣本II在38℃條件下，離心力為15000gav離心20分鐘。上清液在0.2μm的過濾器中過濾(Sartorius Minisart，order no.16534)(sample IIsup).。
然后用常規方法檢測樣本I和樣本IIsup中的α-淀粉酶活性(例如可以應用WO 95/26397中描述的α-淀粉酶活性的檢測方法)。然而，如果待檢樣品中的酶有部分是以固體形式存在的話，則樣品在分析前需要用尿素處理。以1∶50(w/v)的比例將樣本溶解在含40％(w/w)尿素，25.5mg/L硬脂醇醚35和4.4g/L CaCl2，2H2O的溶液中，則結晶和沉淀的α-淀粉酶都可以以活性形式溶解，而溶解的α-淀粉酶則可以進行活性分析了。
用于分析的樣本I和樣本IIsub都要溶解在如上所述的尿素緩沖液中，然后才可以進行分析。
樣本IIsup中測定的是酶的溶解活性，而樣本I則測定的是酶的總活性(包括溶解的酶的活性和結晶和沉淀的酶的活性)。
結果表8以下這些活性是在發酵三天后所測得的活性。發酵D中測得的總活性作為活性的100％，溶解活性(例如樣本IIsup的活性)給出樣本I活性對于特定的發酵的相對值。
在有些例子中，樣本II中的酶活性高于樣本I中的酶活性，這是由于在這些例子中，所有的酶都是可溶性的，去掉一部分菌體以后反而增加了樣本中的酶的濃度，這是由于菌體體積較大，而其中酶含量又較低的緣故。
表8中的數據清楚的顯示加入了MPG以后，酶的溶解度顯著的提高了(D對I是39％對15％；而E對I是156％對15％)。通過上表還可以清楚的看到加入MPG可以顯著提高酶的可溶性的作用可以通過另外的加入各種礦物質而得到加強。
表8顯示了一個協同作用(見發酵罐D(加入MPG)；發酵罐I(加入NaCl)；和發酵罐E(同時加入MPG和NaCl))。
例子5α-淀粉酶溶液(例如從例子2中通過傳統方法獲取的肉湯)在40℃，pH值10.5-11條件下濃縮，在40℃通過0.2μm的過濾器過濾，25ml分裝入7個小瓶中，然后加入下列的多羥基化合物小瓶編號.多羥基化合物1.對照2.5％(w/w)PEG 2003.5％(w/w)PEG 4004.5％(w/w)山梨醇5.5％(w/w)纖維二糖6.5％(w/w)木糖醇7.5％(w/w)單丙二醇(MPG)在每個小瓶中插入一個磁力棒，并且將pH調節到7.5，然后將小瓶在室溫下放置兩天，緩慢攪拌。
通過過濾器(0.2μm過濾器)將結晶去除，然后檢測濾液(＝母液)和過濾之前的液體的酶活性。結果顯示在下表中，以母液中的活性值與過濾之前的液體中的總活性值之比給出(％)。
表9
表中的數據清楚的顯示了多羥基化合物的加入顯著的增加了淀粉酶的溶解度。
權利要求
1.一種通過細菌發酵，產生所需要的酶的方法，培養基至少要有50升，包括加入一種或多種從下列組成中選擇的化合物1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、乙二醇、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、衛矛醇、甘露醇、赤藻糖醇、纖維二糖、山梨醇，和平均分子量不超過1000的多(聚)醚，在發酵之前或發酵過程中加入到培養基中，并且通過測定其光密度值以(ODIII-ODII)/(ODI-ODII)＜25％來判定其代謝率低而滿足本發明工藝的要求。
2.根據權利要求1所述的方法，其中微生物是細菌或真菌。
3.根據權利要求2所述的方法，其中的細菌是芽孢桿菌。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述多肽是蛋白或肽。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述多肽是酶，具體是水解酶(依據酶命名法歸類于EC 3)。
6.根據權利要求4所述的方法，其中所述肽含有2到100個氨基酸。
7.根據權利要求1所述的方法，其中的化合物添加到培養基中的量至少為0.1％(w/w)。
8.根據權利要求1所述的方法，其中的化合物是1，2-丙二醇。
9.根據權利要求1所述的方法，發酵培養基中除了化合物還需要添加鹽。
10.根據權利要求6所述的方法，其中加入的鹽類選自下列幾種氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽以及銨鹽。
11.根據權利要求1所述的方法，其中回收所述目的多肽。
12.根據權利要求1所述的方法，其中酶回收是在細菌菌體被去除之后。
13.生產目的多肽的微生物發酵方法，培養基至少50升，包含添加一或多種從下列組成中選擇的化合物1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、乙二醇、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、衛矛醇、甘露醇、赤藻糖醇、纖維二糖、山梨醇，和平均分子量不超過1000的多(聚)醚。
全文摘要
本發明涉及一種發酵微生物，產生所需要的相關多肽的方法，所需要的培養基至少要有50升，包括以下的組成加入一種或多種下面列出的化合物1，2－丙二醇、1，3－丙二醇、乙二醇、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、衛矛醇、甘露醇、赤藻糖醇、纖維二糖、山梨醇和平均分子量不超過1000的多(聚)醚，在發酵之前或發酵過程中加入到培養基中，并且這些化合物要求是低代謝率的。
文檔編號C12N1/38GK1665923SQ03815578
公開日2005年9月7日 申請日期2003年7月1日 優先權日2002年7月1日
發明者斯文德·卡斯加德, 尼爾斯·班克, 金·U·漢森 申請人:諾維信公司