用于同源重組的方法和組合物的制作方法

專利名稱：用于同源重組的方法和組合物的制作方法
對相關申請的交叉引用按照35 U.S.C.§119(e)的規定，本申請要求以下專利申請的優先權申請日為2002年4月30日的美國臨時專利申請號60/377,026，申請日為2002年7月18日的美國臨時專利申請號60/396,992，以上專利申請的內容被收作本文參考介紹發明領域本發明的領域是核酸整合，更具體地講是同源重組。
背景技術：
促進在多細胞生物中進行定向基因組修飾的試劑和方法構成了用于實驗遺傳學，人類治療和農業的有效工具。可以使用的進行基因組修飾的一種方法是通過基因導向而直接改變細胞基因組，其中，外源DNA在靶細胞中與它的相應的染色體位點發生了同源重組。基因導向技術的優點是，所導入的基因停留在它的正常染色體基因座上，并且，正因為如此，避免了與將基因導入細胞的其他方法相關的某些主要問題，例如，基因沉默，插入誘變，易位基因表達和缺乏穩定性。
不過，在哺乳動物細胞中，只獲得了非常低頻率的同源導向事件，通常在每個細胞10-6次范圍內。另外，同源導向與非同源事件的背景相比，更常見100-1000倍(Capecchi 1989 Science 2441288-1292)。業已設計了多種方法，以便選擇和篩選成功導向產物的比例，不過，有利事件的低的絕對頻率仍然是一個嚴重限制。因此，現有的基因導向技術，至少對于哺乳動物細胞而言取決于將線性化的載體用于分離生長在組織培養物中的細胞。可將所述細胞用于生產轉基因動物，并且有可能用于移植治療。對特殊細胞類型的需要，極大地限制了這種基因導向方法的應用。
更有效的轉化載體被不斷地生產出來，但是這些載體主要是用于細胞施用的，這主要是因為在細胞與整體動物中的操作中在復雜性方面存在巨大差異。
因此，一直對開發新的轉化載體存在興趣。特別感興趣的是開發能提供通過同源重組將外源DNA穩定地定點整合入完整多細胞生物的細胞基因組中的載體。
相關文獻感興趣的參考文獻包括美國專利6,291,243；5,719,055和4,670,388；以及Rong和Golic(Science，2882013-2018 2000)；Rouet等(Proc.Natl.Acad.Sci.916064-6068，1994)；Segal等(Proc.Natl.Acad.Sci.92806-810，1995)。
發明概述提供了用于將外源核酸同源重組到諸如動物的多細胞生物的靶細胞基因組中的方法。在本發明方法中，讓包括諸如重組酶識別位點和同源重組整合因子的線性化內切核酸酶位點的導向載體與多細胞生物接觸，例如，通過系統性或局部施用，以便所述多細胞生物的靶細胞攝取所述導向載體。通過線性化內切核酸酶，例如重組酶，將原先是環狀導向載體的導向載體線性化，所述線性化是在施用之前(例如，用內切核酸酶進行體外處理)或在進入所述多細胞生物時通過細胞外或細胞內流體中的內切核酸酶進行，所述內切核酸酶可以是導入的或者業已存在于所述多細胞生物中。所述整合因子通過同源重組從所述線性化導向載體進入所述靶細胞基因組。還提供了用于實施本發明方法的導向載體，系統和試劑盒。
附圖簡述

圖1是用于下面的實驗部分的線性化ODC載體和正常的基因組ODC基因的示意圖。
定義“載體”是雙鏈的染色體外核酸，它包括克隆和表達載體，以及病毒載體。“載體”能夠將基因序列轉入靶細胞。通常“載體構建體”，“表達載體”，以及“基因轉移載體”表示能夠將基因序列轉入靶細胞的任何核酸構建體。因此，該術語包括克隆和表達載體，以及整合載體。“環狀”載體表示由環狀核酸組成的載體，并且可以是超螺旋或松弛形式的。環狀載體不是線性的或線性化的載體。
″外源核酸″是這樣的核酸，在實施本發明的方法之前，存在于靶細胞外。在某些實施方案中，所述外源核酸是這樣的，它具有不存在于所述靶細胞基因組中的連續序列。在其他實施方案中，所述外源核酸具有存在于所述靶細胞中的連續序列。
″靶位點″是希望將外源核酸整合到它里面的基因組內的預定位點。
″同源序列″是與用于整合的“靶位點”具有序列同一性的序列。
″同源重組″是包括外源核酸的整合因子的整合，所述外源核酸的側翼序列提供了通過同源重組進入靶基因組，這是通過以下機制實現的在所述整合因子同源側翼序列和所述靶基因組的靶位點之間存在足夠高水平的序列同一性，例如，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％，包括100％的序列同一性。同源重組導致了插入所述整合因子的靶基因組位點，所述因子包括所述整合因子的同源側翼序列。
“基因導向”表示通過同源重組使外源核酸定點整合到靶基因組的特定靶位點。
“感興趣的核酸片段”表示適合插入基因組的任何核酸片段。感興趣的核酸片段的合適的例子包括啟動子基因，治療基因，標記基因，控制區，性狀生產片段，和實現基因破壞的核酸因子等。感興趣的核酸片段還可以是“表達盒”，其中，“表達盒”包括能夠指導感興趣的基因/編碼序列表達的任何核酸構建體。感興趣的核酸片段還可以是“破壞”核酸，其中，所述破壞核酸一旦整合到靶位點，就會破壞所述靶位點附近的基因的表達，例如所述破壞核酸可以改變所述基因的編碼序列，可以干擾所述基因的轉錄，剪接或翻譯，或由它本身表達破壞性的，例如反義核酸。
轉化細胞的方法為本領域所公知。“轉化過的”表示由于外源核酸，通常是DNA的攝取而導致的細胞改變。術語“轉化”的使用并非將要所述外源核酸的導入局限于任何特定的方法。合適的方法包括病毒感染，轉染，偶聯，原生質體融合，電穿孔，粒子槍技術，磷酸鈣沉淀，和直接顯微注射等。所述方法的選擇通常取決于要轉化的細胞的類型，以及進行所述轉化的環境(即體外，離體，或體內)。有關這些方法的一般性討論可以參見Ausubel，等，Short Protocols in MolecularBiology，3rd ed.，Wiley & Sons，1995。
術語“核酸分子”和“多核苷酸”被可互換用于表示具有任何長度的聚合形式的核苷酸，可以是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它們的類似物。多核苷酸可以具有任何三維結構，并且可以發揮任何已知或未知功能。多核苷酸的非限定性例子包括基因，基因片段，外顯子，內含子，信使RNA(mRNA)，轉運RNA，核糖體RNA，核酶，cDNA，重組多核苷酸，分支的多核苷酸，質粒，載體，具有任何序列的分離的DNA，具有任何序列的分離的RNA，核酸探針，和引物。所述核酸分子可以是線性的或環狀的。
多核苷酸通常由四個核苷酸堿基的特定序列組成腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(當多核苷酸是RNA時，尿嘧啶(U)取代了胸腺嘧啶(T))。因此，術語多核苷酸是多核苷酸分子的按字母順序的表述。這種按字母順序的表述可以輸入具有中央處理單元的計算機中的數據庫中，并且用于生物信息學應用，如功能性基因組學和同源檢索。
“編碼序列”或“編碼”特定多肽的序列是被轉錄(對于DNA來說)和翻譯(對于mRNA來說)成多肽的核酸分子，例如，當它受合適的調控序列(或“控制因子”)的控制時是在體內進行的。所述編碼序列的邊界通常是由位于5′(氨基)末端的起始密碼子和位于3′(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定的。編碼序列可以包括，但不局限于來自病毒，原核或真核mRNA的cDNA，來自病毒或原核DNA的基因組DNA序列，甚至是合成的DNA序列。轉錄終止序列可位于所述編碼序列的3′末端。其他″控制因子″也可以與編碼序列結合。可以對編碼多肽的DNA序列進行優化，以便通過使用特定細胞優選的密碼子在特定細胞中表達，以便提供所述理想多肽編碼序列的DNA拷貝。
“由...編碼的”表示編碼多肽序列的核酸序列，其中，所述多肽序列或它的一部分包括來自由所述核酸序列編碼的多肽的具有至少3-5個氨基酸的氨基酸序列，更優選至少8-10個氨基酸，更優選至少15-20個氨基酸。還包括可以在免疫學上通過由所述序列編碼的多肽識別的多肽序列。
“可操作地連接”表示因子的排列，其中，對所述描述的成分進行構造，以便發揮它們的常見功能。因此，與編碼序列(例如報道表達盒)可操作地連接的特定啟動子能夠在存在合適的酶時，實現所述編碼序列的表達。所述啟動子或其他控制因子不一定是與所述編碼序列連續的，只要能夠起到指導它們的表達的作用就行。例如，間插的未翻譯的仍然轉錄的序列可存在于所述啟動子序列和編碼序列之間，而所述啟動子序列仍然被認為是與所述編碼序列“可操作地”連接的。
“核酸構建體”表示業已被構建成包括一個或多個不能在天然狀態下同時存在的功能單位的核酸序列。其例子包括環狀，線性，雙鏈，染色體外DNA分子(質粒)，粘粒(含有來自λ噬菌體的COS序列的質粒)，和包括非天然核酸序列的病毒基因組等。
用于確定核酸和氨基酸“序列同一性”的技術同樣為本領域所公知。通常，所述技術包括確定基因的mRNA的核苷酸序列和/或確定由它所編碼的氨基酸序列，并且將這些序列與第二種核苷酸或氨基酸序列進行比較。一般，“同一性”分別表示兩種多核苷酸或多肽序列的確切核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸相關性。通過確定它們的“百分同一性”。可以比較兩種或兩種以上序列(多核苷酸或氨基酸)。兩種序列，無論是核酸或氨基酸序列的百分同一性是兩種比對序列之間的確切匹配的數目除以較短序列的長度，并且乘以100。對核酸序列的合適的比對是由Smith和Waterman的局部同源性算法提供的，Advances inApplied Mathematics 2482-489(1981)。可以將這種算法應用于氨基酸序列，包括使用由Dayhoff開發的評分矩陣，Atlas of ProteinSequences and Structure，M.O.Dayhoff ed.，5 suppl.3353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.，USA，并且由Gribskov標準化，Nucl.Acids Res.14(6)6745-6763(1986)。將這種算法用于確定序列的百分同一性的典型的實施方案是由GeneticsComputer Group(Madison，WI)在″BestFit″應用用途中提供的。該方法的默認參數披露于Wisconsin Sequence Analysis Package ProgramManual，Version 8(1995)(由Genetics Computer Group提供，Madison，WI)。在本發明中建立百分同一性的優選方法是使用愛丁堡大學擁有版權的MPSRCH程序包，該程序包是由John F.Collins和Sbane S.Sturrok開發的，并且由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)銷售。通過該軟件包，可以采用所述Smith-Waterman算法，其中，將默認參數用于評分表(例如，空位開放罰分為12，空位延伸罰分為1，并且空位為6)。從所產生的數據，“匹配”值表示“序列同一性”，用于計算序列之間的百分同一性或相似性的其他合適的程序為本領域所普遍公知，例如，另一種比對程序是BLAST，是以默認參數使用的。例如，BLASTN和BLASTP能夠以以下默認參數使用遺傳密碼＝標準；過濾值＝無；鏈＝雙；截斷值＝60；預期值＝10；矩陣＝BLOSUM62；描述＝50序列；分選參數＝HIGH SCORE；數據庫＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻譯+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。有關這些程序的細節可以查閱以下互聯網地址http//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
另外，可以通過在可以在同源區之間形成穩定的雙鏈體的條件下進行多核苷酸雜交測定同源性，然后用單鏈特異性核酸酶消化，并且對消化的片段進行大小測定。在用上述方法測定時，當兩種DNA或兩種多肽序列在所述分子的確定長度上具有至少大約80％-85％，優選至少大約85％-90％，更優選至少大約90％-95％，最優選至少大約95％-98％序列同一性時，它們彼此“基本同源”。在本文中，基本同源還表示與特定DNA或多肽序列具有完全同一性的序列。基本同源的DNA序列可以通過Southern雜交實驗鑒定，例如，在特定系統所確定的嚴格條件下進行雜交。確定的合適雜交條件為本領域技術人員所公知。例如，參見Sambrook等，同上；DNA cloning，同上；核酸雜交，同上。
正如本文所披露的，兩個核酸片段被認為“能選擇性地雜交”。兩個核酸分子之間的序列同一性程度影響這兩個分子之間雜交事件的效率和強度。部分相同的核酸序列至少能部分抑制完全相同的序列與靶分子的雜交。完全相同的序列的雜交的抑制可以采用雜交測定方法評估，該方法為本領域所熟知(例如Southern印跡，Northern印跡，或溶液雜交等，參見Sambrook，等，Molecular CloningA LaboratoryManual，Second Edition，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。所述測定方法可以采用不同的選擇性程度進行，例如，使用從低到高嚴格性變化的條件。如果采用低嚴格性條件，非特異性結合的缺乏可以采用第二探針評估，這種探針甚至缺乏部分程度的序列同一性(例如，與靶分子的序列同一性低于大約30％的探針)，以便在缺乏非特異性結合事件時，所述第二探針能夠與所述靶分子雜交。
在采用基于雜交的檢測系統時，選擇互補于靶核酸序列的核酸探針，然后通過選擇合適的條件，使所述探針和所述靶序列彼此“選擇性地雜交”或結合，以便形成雜交分子。能夠在“中等嚴格”條件下與靶序列選擇性地雜交的核酸分子通常能夠在允許檢測與所選擇的核酸探針序列具有至少大約70％序列同一性的長度至少大約為10-14個核苷酸的靶核酸序列的條件下雜交。嚴格的雜交條件，通常允許檢測與選擇的核酸探針的序列的序列同一性超過大約90-95％的長度至少大約為10-14個核苷酸的靶核酸序列。當探針和靶分子具有特定程度的序列同一性時，用于探針/靶分子雜交的雜交條件可以通過本領域已知方法確定(例如，參見Nucleic Acid HybridizationA Practical Approach，editors B.D.Hames and S.J.Higgins，(1985)Oxford；Washington，DC；IRLPress)。
就雜交的嚴格條件而言，本領域眾所周知的是可以采用多種等同的條件建立特定的嚴格性，例如，包括以下因素探針和靶序列的長度和性質，各種序列的堿基組成，鹽和其他雜交溶液成分的濃度，阻斷劑在所述雜交溶液中的存在或缺乏(例如，甲酰胺，硫酸葡聚糖，和聚乙二醇)，雜交反應溫度和時間參數，以及各種洗滌條件。特定類型雜交條件的選擇，是選自現有技術中的以下標準方法(例如，參見，Sambrook，等，Molecular CloningA Laboratory Manual，SecondEdition，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。嚴格的雜交條件的例子是在50℃或更高溫度下，在0.1×SSC(15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉)中雜交。嚴格的雜交條件的另一個例子是42℃下，在以下溶液中孵育過夜50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20mg/ml變性的，剪切的鮭魚精子DNA，然后在大約65℃下，在0.1×SSC中洗滌所述濾膜。嚴格的雜交條件是這樣的雜交條件，它至少與上述典型的條件一樣嚴格，其中，如果這些條件與上述特定的嚴格條件相比至少占大約80％，通常至少大約90％的嚴格性，就至少被認為是嚴格的。其他嚴格的雜交條件為本領域所公知，并且還可將這種條件用于鑒定本發明的該特定實施方案的核酸。
如果第一種多核苷酸與第二種多核苷酸，它的cDNA，它的互補體的一個區域具有相同或基本上相同的核苷酸序列，或者它具有如上文所述的序列同一性，所述第一種多核苷酸就是“源于”所述第二種多核苷酸。
如果第一種多肽是(i)由源于第二種多核苷酸的第一種多核苷酸編碼的，或(ii)與上述第二種多肽具有序列同一性，就認為第一種多肽是“源于”第二種多肽。
“基本上純化的”一般表示分離物質(化合物，多核苷酸，蛋白，多肽，多肽組合物)，以便所述物質構成它所存在的樣品中的主要百分比。通常，在一種樣品中，基本上純化的成分占該樣品的50％，優選80％-85％，更優選90-95％。用于純化感興趣的多核苷酸和多肽的技術為本領域所熟知，例如，離子交換層析，親和層析和根據密度沉淀。
″內切核酸酶″表示能夠剪切核苷酸的DNA鏈的內部(例如，不是位于該DNA鏈的5′或3′末端)共價鍵的任何分子，導致在雙鏈核酸底物的特定序列上的雙鏈斷裂，其中，所述特定序列被稱為“內切核酸酶位點”。“內切核酸酶”可以是DNA酶，例如，限制性內切核酸酶，切口酶等，或重組酶，例如，轉座酶，解離酶，整合酶，轉化酶等。
″限制性內切核酸酶″是酶家族的一員，它能介導雙鏈核酸分子的定點切割(即切割特定的DNA序列)。感興趣的限制性內切核酸酶是所謂的“罕見切割”限制性內切核酸酶，它能識別并且介導對長度為至少8個堿基對的特定DNA序列的切割。罕見切割性限制性內切核酸酶披露于Lamber等的文章中(Mutat Res.1999；433159-68)；Belford等(Nucleic Acids Res 1997；253379-88)和Jasin，1996(Trends Genet.12244-228)。特別感興趣的是I-SceI內切核酸酶(Dujon，Gene 198992-119)，它能識別18bp的非回文序列，以及嵌合的I-SceI核酸酶(Bibikova等，Mol.Cell.Bio.2001 21289-287)，和釀酒酵母的HO內切核酸酶(由NCBI保藏號X90957編碼)。
″重組酶″是酶家族的一員，它能介導由所述重組酶識別的特定DNA序列之間的定點重組(Esposito，D.，和Scocca，J.J.，Nucleic AcidsResearch 25，3605-3614(1997)；Nunes-Duby，S.E.，等，Nucleic AcidsResearch 26，391-406(1998)；Stark，W.M.，等，Trends in Genetics8，432-439(1992)；Sadowski，1993 FASEB J 7760-767)。重組酶可以是解離酶，整合酶，轉化酶和轉座酶。
具體實施方案的說明提供了用于將外源核酸同源重組到諸如動物的多細胞生物的靶細胞基因組中的方法。在本發明方法中，讓包括諸如重組酶識別位點和同源重組整合因子的線性化內切核酸酶位點的導向載體與所述多細胞生物接觸，例如，通過系統性或局部施用，以便所述多細胞生物的靶細胞攝取所述導向載體。所述導向載體是這樣的，它最初是環狀導向載體，它被線性化內切核酸酶線性化，例如，業已提供給所述靶細胞的重組酶。所述整合因子通過同源重組從所述線性化導向載體進入所述靶細胞基因組。還提供了用于實施本發明方法的導向載體，系統和試劑盒。
在對本發明作進一步的說明之前，應當理解的是，本發明不局限于本發明下面所披露的特定實施方案，因為可以對所述具體實施方案加以改變，而仍然屬于所附權利要求書的范圍。還應當理解的是，所使用的術語是用于說明特定實施方案的，而不是用于限定目的。相反，本發明的范圍是由所附權利要求書確定的。另外，可以進行多種改進，以便使特定的場合，材料，物質組成，工藝，工藝步驟適應本發明的目的，構思和范圍。所有這樣的改進都被認為屬于本文所提出的權利要求的范圍。
在本說明書以及所附權利要求書中，單數形式的“一種”、″一個″和″該″包括復數的情形，除非上下文清楚地確定了其他的含義。相反，預定權利要求書可以這樣撰寫來排除任何任選的要素。此一聲明旨在用作先決條件，作為在描述權利要求的要素時使用“唯一的”、“僅有的”等這類排他性的術語或使用“否定性”限定時的前提。
在給出一個范圍的值時，應當理解為在所述范圍的上限和下限之間的每一個值其變化幅度在下限整體的1/10，除非上下文清楚地確定了其他的含義，和處在該所述范圍內的任何其他所述值或其間的值，均包括在本發明的范圍內。這些更小范圍的上限和下限可獨立地包含在所述更小的范圍內，并且包括在本發明的范圍內，即使在所述范圍內具體排除了任何上限或下限。當所述范圍包括所述上下限中的一個或兩個時，排除了那些所包括的上下限中的一個或兩個的范圍也包括在本發明范圍內。同樣，預定的是，本說明書所披露的本發明的變化形式的任何選擇性特征均可獨立地提出和要求保護，或可與本說明書所披露的任何一種或多種特征組合在一起提出和要求保護。
除非另有說明，本文所使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域普通技術人員所普遍了解的相同的含義。盡管與本文所披露的類似或等同的任何方法，裝置和材料都可用于實施或檢驗本發明，下面將披露優選方法，裝置和材料。
本文所提到的所有現有的主題(例如，出版物，專利，專利申請和硬件)都以它的整體形式收作本文參考。提供這些參考文獻僅僅是因為它們的
公開日期早于本申請的申請日。本說明書中，沒有任何內容可以理解為承認本發明不能享受因發明在先而先于這些材料的權利。
綜上所述，本發明提供了將外源核酸同源重組到多細胞生物的靶細胞基因組中的方法，以及用于實施本發明方法的試劑盒和系統。在對本發明作進一步的說明時，首先將更詳細地披露所述方法，然后對用于實施本發明方法的本發明的系統和試劑盒，以及試劑盒的成分進行綜述。
使用本發明基因導向載體的方法上述本發明載體可用于多種用途，其中，希望將外源核酸導入并且穩定地整合到靶細胞的基因組中，例如，存在于多細胞生物中的靶細胞，如植物，動物，例如，脊椎動物，包括哺乳動物等。本發明載體特別適用于通過將外源核酸同源重組進入動物的靶細胞基因組而進行定點整合，所述動物包括昆蟲，脊椎動物等。在某些實施方案中，可以使用本發明載體的動物是脊椎動物，其中，在很多實施方案中，所述動物是哺乳動物。因此，在很多實施方案中，特別感興趣的是用本發明的載體導向脊椎動物，特別是禽類和海洋動物，例如，雞，和斑馬魚等；哺乳動物，包括鼠類，有蹄動物，豬，綿羊，馬，大鼠，狗，貓，猴和人等。
在本發明的方法中，讓本發明的導向載體在足以使所述導向載體被所述細胞攝取或內化的條件下與所述靶細胞接觸。將在同源重組事件之前最初是環狀的導向載體線性化，并且通過同源重組將所述載體的所述整合因子插入所述靶細胞的基因組。
導向載體如上文所述，在本發明方法中使用的導向載體是環狀載體，更具體地講，是環狀的，雙鏈的DNA載體，即質粒。所述環狀導向載體的大小可以改變，其中，總體大小可以為至少大約100個堿基對，有時候為至少大約1000個堿基對，以及有時候為至少大約3kb，其中，在某些實施方案中，所述大小可以大到300kb或更大，不過，一般不會超過大約30kb，并且通常不會超過大約15kb。本發明的導向載體是包括以下兩種因子的載體(a)線性化內切核酸酶位點和(b)同源重組整合因子。在某些實施方案中，所述導向載體可以包括一個或多個其他因子，如線性化內切核酸酶編碼序列等。
線性化內切核酸酶位點本發明的導向載體包括線性化內切核酸酶位點。所述線性化內切核酸酶位點是由內切核酸酶識別的位點或核苷酸殘基的結構域，即，由內切核酸酶切割，以便所述內切核酸酶能通過酶促在所述位點上產生雙鏈切割，并因此使所述環狀導向載體線性化。所述線性化內切核酸酶位點可以回文的或非回文的，并且長度通常為至少大約4個核苷酸，有時候長度為至少大約16個核苷酸，有時候長度為至少大約24個核苷酸，其中，所述長度可以為至少大約50個核苷酸或更長，不過，長度通常不超過大約600個核苷酸。所述線性化內切核酸酶位點通常是不存在于所述靶細胞基因組中的位點，以少數幾個拷貝存在，以便在切割之后，它們在所述細胞中修復，以便不會產生不利后果，或者所述細胞位點是受到保護的，例如，DNA結構(甲基化等)，結合蛋白等，以便本發明的實施不會導致所述靶細胞基因組的顯著切割。
在某些實施方案中，本發明載體的特征是所述線性化內切核酸酶位點不是由所述靶細胞的內源性內切核酸酶選擇性識別的。換句話說，所述靶細胞在它的基因組內部本身不包括編碼線性化內切核酸酶的編碼序列。因此，所述線性化內切核酸酶位點是由一種線性化內切核酸酶識別的，這種酶對于不同于所述靶細胞的物種的物種來說是內源的。任何兩種特定的生物如果使用標準分類學標準分類屬于不同的類型，就認為它們是不同的物種，所述分類學標準如由國家衛生部提供的用于開發所述分類表的分類標準。盡管所述線性化內切核酸酶不是被為它所針對的靶細胞來說內源的線性化內切核酸酶識別的，在某些實施方案中，可以對靶細胞進行工程改造，以便表達所述線性化內切核酸酶，正如在下面所更詳細地披露的。觀察本發明該特征的另一種方式是，識別存在于所述導向載體中的它的靶位點的線性化內切核酸酶是不存在于所述靶細胞的野生型生物體中的酶。
根據所述導向載體是否用于″ends-out″或″ends-in″導向方案，所述線性化內切核酸酶位點可存在于所述整合因子的內部或外部，下面將對它作更詳細地說明。″ends-out″和″ends-in″導向方法為本領域技術人員所公知，并且在以下文獻中進行過綜述Rong和Golic，Science(2000)2882013-2018。這樣，在某些實施方案中，所述線性化內切核酸酶位點存在于所述整合因子內部。在其他實施方案中，所述線性化內切核酸酶位點存在于所述整合因子外部。在不希望將所述線性化內切核酸酶位點摻入所述靶基因組上的實施方案中，采用所述ends-out方法，以便所述線性化內切核酸酶位點位于整合因子的載體外面，即，位于所述載體上的整合因子的5′或3′。
所述線性化內切核酸酶位點可以是由限制性內切核酸酶識別的位點，其中，特別感興趣的內切核酸酶是上文所披露的罕見切割酶，例如，I-Sce-1，I-SsP-1等，其中，在某些實施方案中，所述位點是由重組酶識別的，其中，重組酶可以是解離酶，整合酶，轉化酶或轉座酶。感興趣的重組酶和轉座酶系統的例子是，例如，來自噬菌體P1的Cre-lox系統，釀酒酵母的FLB-FRT系統，Zygosaccharomyces rouxii的R-RS系統，噬菌體μ的Gin-gix系統，果蠅的P因子轉座酶/P足系統，φC31 att位點/整合酶系統。當所述內切核酸酶是重組酶，而所述內切核酸酶位點是標記轉座子邊界的末端重復時，所述內切核酸酶和內切核酸酶位點可以是來自若干種已知可轉座的因子中的任意一個，例如，果蠅屬的hobo，copia，gypsy因子，植物的Ac/Dc，En/Spm，Tam系統，秀麗新桿線蟲的任一種Tc因子，釀酒酵母的TY因子，多種高等真核生物水手和水手樣(例如Sleeping Beauty)因子，以及大腸桿菌的任何Tn和ISS可轉座的因子。當所述內切核酸酶是重組酶，而所述內切核酸酶位點是由所述內切核酸酶識別的重組位點(例如，att位點，識別序列等)時，所述內切核酸酶和內切核酸酶位點可以源于若干種噬菌體中的一種，如λ，φC31，γδ噬菌體att系統等，可轉座的因子，病毒(例如，腺伴隨病毒，逆轉錄病毒等)或其他系統。根據內切核酸酶的這些例子，和定義，本領域技術人員能方便地鑒定用于本發明的其他限制性內切核酸酶，重組酶，以及轉座酶。所述內切核酸酶的切割位點，例如I-SceI和loxP位點，P足，LTRs，att位點等，在以下文獻中有詳細描述(Marshall等TIG 1992 8432-439；Hallet and Sherratt等，FEMS Mic.Reviews 21 1999 157-178；Sadowski等FASEB J，1993 7760-767)。
在任何事件中，所述載體是通過上述方法中的任意一種等線性化的，在給所述多細胞生物施用之前或使用之后線性化。所述線性化的載體是所述細胞開始同源重組的關鍵信號傳遞事件。
整合因子除了所述線性化內切核酸酶位點之外，本發明的導向載體還包括同源重組整合因子，它是由外源核苷酸或核酸(即，希望整合到靶細胞基因組中的核酸)組成的，其側翼是提供與所述靶細胞基因組進行同源重組的序列，所述載體就是為了用于所述靶細胞基因組而設計的。如上文所述，同源側翼序列與所述靶基因組上的靶位點具有序列同一性，并且促進載體的整合因子和靶位點之間的同源重組，以便導致所述整合因子插入所述靶細胞基因組。所述側翼同源序列的長度可以改變，其中，所述長度通常為至少大約500個堿基對，一般至少大約500個堿基對，更優選至少大約1kb，其中，在某些實施方案中，所述長度至少大約30kb或更長，不過有時候不超過大約10kb，并且有時候不超過大約3kb。
在提供同源重組的序列的側翼是要插入基因組的外源核酸，其中，所述外源核酸的長度為至少大約1nt，其中，在很多實施方案中，所述外源核酸的長度為至少兩個或兩個以上nt，其中，在某些實施方案中，所述外源核酸的長度為至少大約100nt，有時候長度為至少大約1,000nt，其中，所述外源核酸的長度可以為30kb或更長，不過，有時候其長度不超過大約3,000nt。在某些實施方案中，所述外源核酸包括表達盒，表達調控核酸，治療基因，和表達破壞核酸等，其中，所述感興趣的核酸片段可以是性狀產生核酸。
任選成分如上文所述，根據所述導向載體設計用于的特定用途或方法，本發明載體還可以包括多種任選成分。正如在下面更詳細地披露的，在實施本發明時，除了所述導向載體，本發明系統的所述內切核酸酶成分(例如，蛋白或編碼所述蛋白的核酸)也被導入所述靶細胞，以便存在所述內切核酸酶，通過同源重組介導所述導向載體整合到所述靶基因組中。所述線性化內切核酸酶可以作為多肽或編碼具有需要的內切核酸酶活性產物的核酸導入所述靶細胞。在后面這些實施方案中，所述核酸可以在獨立于所述導向載體的載體中導入所述靶細胞，或者編碼需要的內切核酸酶活性的核酸可以存在于所述導向載體本身上。這樣，在后面這些實施方案中，所述導向載體還包括編碼能識別載體上的線性化內切核酸酶位點的內切核酸酶的結構域。內切核酸酶-編碼核酸可以是化學合成的，或者通過常規重組DNA技術(例如，聚合酶鏈式反應，文庫篩選等)從攜帶所述核酸的宿主中分離，并且克隆到導向載體上以便表達。應當理解的是，可以在使用之前修飾所述核苷酸(例如，去除限制位點，改變密碼子使用，改變調控區，添加/去除內含子等)。
如上文所述，線性化內切核酸酶可以是限制性內切核酸酶或重組酶，其中，重組酶可以是解離酶，整合酶，轉化酶或轉座酶。感興趣的重組酶和轉座酶系統的例子是，例如，來自噬菌體P1的Cre-lox系統，釀酒酵母的FLB-FRT系統，Zygosaccharomyces rouxii的R-RS系統，噬菌體μ的Gin-gix系統，果蠅的P因子轉座酶/P足系統，φC31att位點/整合酶系統。當所述內切核酸酶是重組酶，而所述內切核酸酶位點是標記轉座子邊界的末端重復時，所述內切核酸酶和內切核酸酶位點可以是來自若干種已知可轉座的因子中的任意一個，例如，果蠅屬的hobo，copia，gypsy因子，植物的Ac/Dc，En/Spm，Tam系統，秀麗新桿線蟲的任一種Tc因子，釀酒酵母的TY因子，多種高等真核生物水手和水手樣(例如Sleeping Beauty)因子，以及大腸桿菌的任何Tn和ISS可轉座的因子。當所述內切核酸酶是重組酶，而所述內切核酸酶位點是由所述內切核酸酶識別的重組位點(例如，att位點，識別序列等)時，所述內切核酸酶和內切核酸酶位點可以源于若干種噬菌體中的一種，如λ，φC31，γδ噬菌體att系統等，可轉座的因子，病毒(例如，腺伴隨病毒，逆轉錄病毒等)或其他系統。因此，如上文所述，在某些實施方案中所述導向載體包括編碼線性化內切核酸酶的核酸。另外，某些實施方案可以采用這樣的系統，其中，所述內切核酸酶已經存在于所述多細胞生物的基因組中，它是作為天然基因存在的，或是遺傳工程的生物。
其他任選的成分在某些實施方案中，作為感興趣的核酸片段，在所述基因導向載體中還包括選擇標記。所述選擇標記允許相對不具備整合載體的細胞選擇含有整合基因導向載體的細胞。
載體構建本發明的載體可以通過限制酶切割，連接和分子克隆的標準方法生產。用于構建本發明載體的一種方法包括以下步驟首先，利用限制性內切核酸酶從原始來源上切割含有所需成分核苷酸序列以及外來序列的純化的核酸片段。然后利用常規分離方法，例如，通過瓊脂糖凝膠電泳將含有所需核苷酸序列的片段與具有不同大小的不需要的片段分離開。將所需片段從所述凝膠上切除，并且以合適的構型連接在一起，以便生產如上文所述的含有所需序列的環狀核酸或質粒，例如，所需的序列是與本發明載體的各種因子相應的序列。如果需要，然后在原核宿主，例如大腸桿菌中擴增如此構建的環狀分子。與所述步驟相關的切割，質粒構建、細胞轉化，和質粒生產的方法為本領域技術人員所熟知，并且進行限制消化和連接的酶可以通過商業渠道獲得。(例如，參見，R.Wu，Ed.，Methods in Enzymology，Vol.68，Academic Press，N.Y.(1979)；T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1982)；Catalog 1982-83，New England Biolabs，Inc.；Catalog 1982-83，Bethesda Research Laboratories，Inc.)。
導向載體與靶細胞接觸綜上所述，在實施本發明方法時，讓本發明的導向載體與基因組需要修飾的靶細胞接觸，以便所述導向載體被所述細胞內化。在所述導向載體內化時(其中，所述導向載體的某些點通過合適的線性化內切核酸酶線性化)，所述整合因子可以通過同源重組進入所述靶細胞基因組。
導向載體與靶細胞的接觸可以通過任何常規方法實現。在這些實施方案中，其中，所述靶細胞是作為諸如動物的多細胞生物的一部分存在的，所述導向載體通常被施用于(例如，注射，喂食等)諸如完整動物的所述多細胞生物，其中，施用可以是系統性的或局部的，例如，直接應用于多細胞生物的特定組織和/或器官。
可以用任何常規方法將所述導向載體導入動物細胞，其中，所述方法可以提供所述載體的體內，體外，或離體的導入。在可用于送遞本發明載體的體內方法中，包括通過基于脂質的，例如，脂質體載體進行送遞，其中所述基于脂質的載體可以導向于特定細胞類型，以便進行所述載體的細胞或組織特異性送遞。披露所述方法的專利包括美國專利號5,877,302；5,840,710；5,830,430；和5,827,703，這些專利的內容被收作本文參考。還可以采用其他體內送遞系統，包括使用可以有或沒有用導向部分修飾過的基于聚賴氨酸的肽作為載體，顯微注射和電沖孔等(Brooks，A.I.，等1998，J.neurosci.Methods V.80 p137-47；Muramatsu，T.，Nakamura，A.，和H.M.Park 1998，Int.J.Mol.Med.V.1 p55-62)。在某些感興趣的實施方案中，沒有采用基于病毒的核酸導入載體，因為由于可以使用多種不同類型的載體和送遞載體，施用可以通過多種不同的途徑進行，其中，典型的施用途徑包括口服，局部，動脈內，靜脈內，腹膜內，肌內，鼻內，結膜內等。具體的施用方式至少部分取決于用于送遞所述載體的媒介物的性質。在很多實施方案中，所述載體是通過血管內途徑施用的，例如動脈內或靜脈內，其中采用水基送遞媒介物，例如，鹽溶液。
導入動物體內的載體核酸的量足以提供需要的所述外源核酸向所述基因組中的整合。因此，所導入的導向載體核酸的量應當提供所述外源核酸的足夠的拷貝數量。被導入所述動物體內的載體核酸的數量根據所采用的特定導入或轉染方法的效力而改變。
如上文所述，所述導向載體是在足以提供在內切核酸酶位點上切割載體的條件，以便使最初是環狀的導向載體線性化，即載體線性化條件下導入靶細胞的，其中，所述條件是以多種方式提供的，其中，所述條件包括在給所述多細胞生物施用之前將最初環狀的導向載體線性化的狀況，以及將最初環狀的導向載體以它的原始環狀形狀給所述多細胞生物施用，然后在體內線性化的狀況，例如，通過采用業已經過工程改造能夠在所述靶細胞內表達所述線性化內切核酸酶的宿主，或者給所述細胞或含有所述細胞的宿主共同施用所述線性化內切核酸酶或它的編碼序列，其中，共同施用可以在施用所述載體之前或同時進行。
因此，在后面這些實施方案中，其中，所述最初是環狀的導向載體的線性化是在體內進行的，本發明系統的所述內切核酸酶成分(例如，蛋白或編碼蛋白的核酸)存在于所述靶細胞中，以便介導所述導向載體的線性化，并且通過同源重組將其整合因子整合到所述靶細胞基因組中。如上文所述，所述宿主可以是預先工程改造過的，以便表達所述線性化內切核酸酶，或者可以給所述靶細胞施用所述線性化內切核酸酶。其中，所述線性化內切核酸酶活性是作為多肽提供的，可以采用任何常規的多肽/蛋白導入方法。將功能性蛋白導入細胞的方法為本領域所熟知。另外，在用于轉化所述細胞的表達載體中可以包括編碼內切核酸酶的核酸。內切核酸酶編碼核酸可以是化學合成的，或者通過常規重組DNA技術從攜帶所述核酸的宿主中分離(例如，聚合酶鏈式反應，文庫篩選等)，并且克隆到用于表達的合適載體上。應當理解的是，所述核苷酸可以在使用之前進行修飾(例如，去除限制性位點，改變密碼子使用，改變調控區，添加/去除內含子等)。
如上文所述，所述方法導致了所述同源重組整合因子整合到所述靶細胞基因組中。
上述整合方法可用于將多種外源核酸穩定地整合到靶細胞中。在很多實施方案中，存在于所述外源核酸中的核苷酸的序列可以是不存在于所述靶細胞基因組中的序列，即，對所述靶細胞來說它是外源的。在其他實施方案中，所述外源核酸的序列實際上可以是存在于所述靶細胞中的序列。
如上文所述，本發明的系統可用于多種靶細胞，其中，在很多實施方案中，靶細胞是非細菌靶細胞，并且通常是真核靶細胞，包括植物和動物靶細胞，例如昆蟲細胞，脊椎動物細胞，特別是禽類細胞，例如，雞細胞；哺乳動物細胞，包括，鼠，豬，有蹄動物，綿羊，馬，大鼠，狗，貓，猴和人類細胞等。
用途本發明方法可應用于多種用途中，其中，需要將外源核酸以定點方式整合到靶細胞中。可以采用本發明載體和方法的用途包括研究用途，多肽合成用途和治療用途。下面將更詳細地分別披露上述每一種典型類型的用途。
研究用途可以采用本發明方法的研究用途的例子包括為了表征特定基因而設計的用途。在所述用途中，將所述載體用于1)將感興趣的基因或編碼序列插入靶細胞；2)部分或完全去除一個基因；或3)用不同的核苷酸取代基因上的一個或多個特定核苷酸，并且觀察對所述動物表型產生的影響。這樣，可以推測有關所述基因活性以及由它所編碼的產物性質的信息。
還可以將本發明的載體用于生產模型，其中，在細胞中產生感興趣的基因的表達，包括超量表達和/或錯誤表達，并且觀察這種突變型表達形式的作用。因此，人們可以將本發明方法和組合物用于有效和快速地生產專門設計的轉基因，敲除或敲入動物，可以將這種動物用作多種不同條件的模型，正如本領域所已知的。
多肽合成用途除了上述研究用途之外，本發明方法和載體還可用于多肽的合成，例如，感興趣的蛋白的合成。在這些用途中，將包括與必要的和/或需要的表達調控序列，例如，啟動子等結合的編碼感興趣多肽的基因的載體(即表達組件)導入靶細胞，將所述細胞用作表達所述多肽的表達宿主。在導入并且隨后穩定整合到所述靶細胞基因組中之后，在足以表達所述整合基因的條件下維持所述靶宿主細胞。一旦制備了能表達所述蛋白的轉化宿主，就對所述蛋白進行純化，以便生產含有所需蛋白的組合物。任何常見的蛋白純化方法都可以采用，其中，合適的蛋白純化方法披露于以下文獻中(Deuthser ed.)(Academic Press，1990)。例如，可以用表達所述蛋白的表達宿主制備裂解物，并且通過HPLC，排阻層析，凝膠電泳，和親和層析等純化。
體內蛋白生產本發明的重組細胞可以用作重組細胞系群體，用作重組原代或繼代細胞的群體，重組克隆細胞株或系，重組異源細胞株或系，以及用作細胞混合物，其中，存在上述四種類型的重組細胞之一的至少一種代表性細胞。可以將所述細胞用于送遞系統，用于治療具有異常或不希望狀況的個體，所述狀況對治療性產品的送遞有反應，所述產品是1)治療蛋白(例如，缺乏的，相對個體的生理學需要而言是產量不足的，在所述個體內是缺乏的或無效或不適當利用的；具有新功能的蛋白，如酶促或轉運功能)或2)治療核酸(例如，能抑制基因表達或具有內在的酶促活性的RNA)。在本發明的提供治療蛋白或核酸的方法中，給需要治療或預防所述異常或不希望的狀況的個體施用重組原代細胞，克隆細胞株或異源細胞株，通過合適的途徑以足夠的數量施用，以便在生理學相關的水平上表達或提供所述蛋白或外源DNA。感興趣的代表性治療蛋白包括，但不局限于因子VIII，因子IX，β-球蛋白，低密度脂蛋白受體，腺苷脫氨酶，嘌呤核苷磷酸化酶，鞘磷脂酶，葡糖腦苷脂酶，囊性纖維化跨膜傳導調節劑，α1-抗胰蛋白酶，CD-18，鳥氨酸轉氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，苯丙氨酸羥化酶，支鏈α-酮酸脫氫酶，延胡索酰乙酰乙酸水解酶，葡萄糖6-磷酸，α-L-巖藻糖苷酶，β-葡糖醛酸酶，α-L-iduronidase，半乳糖1-磷酸尿苷酰轉移酶，白介素，細胞因子，和小肽等(其中，上述蛋白是人類蛋白)。另外，給生物直接施用上述載體系統，例如，通過合適的系統或局部施用途徑，其中，所述載體成分進入一個或多個靶細胞，并且調節被導向的基因組結構域的轉錄，例如，獲得治療作用，例如，表達治療蛋白，而這種蛋白在實施本發明方法之前是不能表達的。生理學上相關的水平是這樣的水平，它是接近所述產物在體內正常生產的水平，或導致所述異常或不希望的狀況的改善。例如，hGH，hEPO，人胰島素調理素，hGM-CSF，hG-CSF，人α-干擾素，或人FSHβ可以系統性地送遞到人體內，以便獲得治療作用。因此，本發明的載體系統可用于治療用途，其中，將所述方法和載體用于調節靶細胞的基因組結構域，例如，編碼治療蛋白的結構域的轉錄，例如，可用于進行基因治療用途。本發明載體可用于調節多種治療蛋白的轉錄。
體外蛋白生產還可將本發明的源于人或非人物種的重組細胞用于體外蛋白生產。所述細胞是在本領域所公知的能導致蛋白表達的條件下維持的。利用所述方法表達的蛋白可以從細胞裂解物或細胞上清液中純化，以便純化所需要的蛋白。按照該方法生產的蛋白包括治療蛋白，可以通過本領域所公知的常規藥用途徑(例如，口服，靜脈內，肌內，鼻內或皮下)將它送遞到人或非人動物體內。所述蛋白包括hGH，hEPO，和人胰島素調理素，hGM-CSF，hG-CSF，FSHβ或α-干擾素。所述細胞可以是永生化的，原代，或繼代細胞。當非人細胞用于蛋白生產目的(其中，所述非人蛋白具有治療性或商業用途)有利的時候，可能需要使用來自其他物種的細胞，例如，利用源于鮭魚的細胞生產鮭魚降血鈣素，利用源于豬的細胞生產豬胰島素，并且利用牛細胞生產牛生長激素。
因此，本發明方法可用于合成多肽，例如感興趣的蛋白。在所述用途中，將包括感興趣的多肽的轉錄調控單位的載體導入所述靶細胞，所述細胞用作表達所述多肽的表達宿主。在導入以及隨后穩定整合到所述靶細胞基因組中之后，在足以表達現在可操作地與新整合的轉錄調控單位連接的基因的條件下維持所述被導向的宿主細胞。一旦制備了表達所述蛋白的轉化宿主，然后可以純化所述蛋白，以便生產包括所需蛋白的組合物。任何常規的蛋白純化方法都可以使用，其中，合適的蛋白純化方法披露于以下文獻中(Deuthser ed.)(Academic Press，1990)。例如，可以用能表達所述蛋白的表達宿主制備裂解液，并且通過HPLC，排阻層析，凝膠電泳，和親和層析等純化。
治療用途本發明載體還可用于治療用途，其中，將所述方法和載體用于將治療核酸，例如，基因或其蛋白/因子編碼序列穩定地整合到靶細胞的基因組中，即基因治療用途。可將本發明載體用于送遞多種治療核酸。用于治療基于遺傳缺陷的疾病狀況的特定的治療基因包括編碼以下產物的基因因子VIII，因子IX，β-球蛋白，低密度脂蛋白受體，腺苷脫氨酶，嘌呤核苷磷酸化酶，鞘磷脂酶，葡糖腦苷脂酶，囊性纖維化跨膜傳導調節劑，α1-抗胰蛋白酶，CD-18，鳥氨酸轉氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，苯丙氨酸羥化酶，支鏈α-酮酸脫氫酶，延胡索酰乙酰乙酸水解酶，葡萄糖6-磷酸，α-L-巖藻糖苷酶，β-葡糖醛酸酶，α-L-iduronidase，半乳糖1-磷酸尿苷酰轉移酶，白介素，細胞因子，和小肽等。
上面所列舉的蛋白是哺乳動物蛋白，而在很多實施方案中，是人類蛋白，其中，上述蛋白的核苷酸和氨基酸序列為本領域技術人員所普遍公知。可以通過本發明載體送遞的癌癥治療基因包括能夠增強淋巴細胞的抗腫瘤活性的基因，它的表達產物能夠增強腫瘤細胞的免疫原性的基因，腫瘤抑制基因，毒素基因，自殺基因，多藥物抗性基因，和反義序列等。
給動物直接施用本發明的基因導向載體具有多種治療用途，包括糾正與疾病或狀況相關的突變基因的序列，激活內源基因，破壞毒性內源基因，導入外源基因等。本領域技術人員應當了解該基因導向系統的多種用途。
系統還提供了用于實施本發明方法的系統。本發明的系統至少包括由上文所述的導向載體。當所述導向載體不能提供線性化內切核酸酶活性時，本發明的系統通常還包括線性化內切核酸酶活性的來源，例如，具有所需活性的多肽或編碼具有所述所需內切核酸酶活性的產物的核酸。
試劑盒還提供了用于實施本發明方法的試劑盒。本發明的試劑盒至少包括如上文所述的導向載體，以及相應的內切核酸酶或內切核酸酶-編碼序列，其中，后面這些成分可以是或不是獨立于所述導向載體的成分。本發明的試劑盒還包括可用于本發明的其他成分，例如緩沖液，送遞載體等。
所述試劑盒的各種成分可以存在于獨立的容器中，或者可以根據需要將某些相容的成分預先組合在一個容器中。
除了上述成分之外，本發明的試劑盒還包括用于指導實施本發明的說明書。所述說明書能夠以各種形式出現在本發明的試劑盒中，在所述試劑盒中可以存在一種或多種形式。提供所述說明書的一種形式是印刷在合適的介質或基質上的信息，所述介質或基質例如，在它上面印刷有所述信息的紙張，存在于所述試劑盒的包裝中的信息，存在于包裝插件等中的信息。另一種裝置是計算機可讀的介質，例如，軟盤，CD等，在這些介質上業已記錄了所述信息。可以提供的另一種形式是網站地址，可以利用該地址通過互聯網從遠處獲得所述信息。任何常見的方式都可存在于所述試劑盒中。以下實施例是以說明形式而不是以限定形式提供的。
實驗提供以下實施例是為了給本領域普通技術人員提供如何實施并且使用本發明的完整的說明和介紹，而不是要限定本發明人所認為的本發明的范圍，也不是要將下面的實驗作為所進行的所有或僅有的實驗。為了確保所使用的數字(例如，數量，溫度等)的精確性，業已做出了努力，但是，某些實驗誤差和偏差也是存在的。除非另有說明，份數是重量份數，分子量是重量平均分子量，溫度是攝氏度，而壓力是大氣壓或接近大氣壓。
載體構建用于下文所述DNA載體的原始材料是本領域技術人員能方便地獲得的(例如，Casper4和P因子轉座酶質粒(Flybase)，鳥氨酸脫羧酶(ODC)大鼠基因組DNA(可以從ATCC以及它的網站獲得，該網站是在″atcc″的前面添加″www.″，在它的后面添加″.org″構成的)乳清相關蛋白(WAP)小鼠基因組DNA(同樣可以從ATCC(www.atcc.org)獲得，Sleeping Beauty DNA(Minnesota大學)(例如，相關序列的信息參見美國專利號6,489,458，該專利的內容被收作本文參考)，以及具有單一PI-SCEI切割位點的質粒(New England Biolabs))。由于Casper4不能整合到非果蠅物種的基因組中，可以將它用于檢測同源整合，或通過標準限制性消化和克隆方法將一個P足從所述載體上去除(留下單個P足切割位點)。對于Sleeping Beauty因子來說，它不能整合到多種物種上，必須去掉一個足。由于每一個足(轉座酶識別序列是相同的)，可以將任一個足去掉。然后P因子載體，Sleeping Beauty載體，或含有PI-SCEI單一切割位點的質粒具有按下文所述通過標準分子生物學方法克隆到其中的需要的WAP或ODC DNA。本發明的載體可以通過標準限制酶切割，連接和分子克隆方法生產。
用于構建本發明載體的一種方法包括以下步驟首先，用限制性內切核酸酶將含有需要的成分核苷酸序列以及外來序列的純化核酸片段從它的原始來源上切割下來。然后利用常規分離方法，例如，通過瓊脂糖凝膠電泳將含有所需核苷酸序列的片段從具有不同大小的不需要的片段中分離出來。將所需片段從所述凝膠上切除，并且以合適的構型連接在一起，以便生產如上文所述的含有所需序列的環狀核酸或質粒，例如相當于本發明的各種因子的序列。如果需要，可以利用原核宿主，例如大腸桿菌擴增由此構建的環狀分子。在這些步驟中所涉及到的切割方法，質粒構建，細胞轉化和質粒生產為本領域技術人員所熟知，并且，進行限制和連接所需要的酶可以通過商業渠道獲得(例如，參見，R.Wu，Ed.，Methods in Enzymology，Vol.68，Academic Press，N.Y.(1979)；T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1982)；Catalog 1982-83，New England Biolabs，Inc.；Catalog 1982-83，Bethesda Research Laboratories，Inc)。
實施例1利用環狀基因導向載體對大鼠的鳥氨酸脫羧酶基因進行基因導向為了證實這種方法是成功的，構建了環狀基因導向載體。所述環狀載體包括單個果蠅屬P因子轉座酶切割位點(P足)以及改變了的大鼠基因組DNA的片段。選擇所述大鼠鳥氨酸脫羧酶基因(odc)是因為它的完整序列是已知的，并且可以通過商業渠道獲得。為了分析所述載體的整合，在所述載體的odc基因上形成三個小的缺失。所述小的缺失位于該基因的5′末端，3′末端和中間部分。也制備了取代修飾過的odc基因的含有大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因的對照載體。該對照載體不含有與所述大鼠基因組具有顯著同源性的已知序列。用50μg所述環狀odc/P足基因導向載體和10μg編碼P因子轉座酶的質粒DNA，以及環狀陰性對照質粒共同注射大鼠。三周之后，處死所述大鼠，并且從多種組織中制備所述大鼠的基因組DNA，其中的某些組織包括肝臟和腸。對所述DNA進行PCR分析，使用能擴增P足和odc中間缺陷的引物，以及對照。
使用P足或β-半乳糖苷酶-特異性引物對施用對照的大鼠的各種基因組DNA樣品進行PCR，沒有得到產物，因此，沒有發生所述對照載體的可檢測的基因組整合。對來自施用了具有所述修飾過的odc基因的基因導向載體的大鼠的基因組DNA的各種樣品進行PCR，發現所述修飾過的odc基因業已整合到了所述大鼠基因組中。另外，在所述樣品中，用P足特異性引物不能檢測到擴增，這表明所述odc基因業已通過同源重組機制整合。如圖1所示，還獲得了有關同源重組的其他證據。
在圖1中示出了線性化的ODC載體和正常基因組ODC基因的示意圖。在將它克隆到ODC載體上之前，通過工程改造使ODC基因具有三個小的缺失，并且這些缺失在基因組ODC基因上通過垂直線條表示。從用上述ODC載體注射過的大鼠組織中分離基因組DNA。使用PCR方法，同時使用引物2和3，在各種組織中檢驗基因組DNA的ODC載體整合。所述PCR反應檢測到了長度為500bp的強的正常基因組ODC基因帶。不過，在很多只來自注射過的動物，包括它們的一些后代的組織(例如，腦，睪丸，卵巢，尾，肝臟，肺，心臟，腸道，脾臟)中檢測到了長度為200bp的另一條帶(ODC載體帶的大小)。然后用能特異性檢測P足DNA的PCR引物檢測出現了表明存在ODC載體的帶的DNA樣品。PCR分析沒有檢測到P足DNA的存在。這一發現表明，所述ODC載體不是隨機整合到大鼠基因組DNA中的，否則，所述PCR足序列也將是可檢測的。最后，用引物1和3對所述樣品進行的PCR證實，在來自注射過的大鼠的樣品中，同時存在正常(基因組)和缺失(ODC載體)形式的ODC基因。對所述基因的缺失形式進行PCR擴增的唯一途徑是，如果所述ODC載體以同源方式整合到ODC基因組基因中。
實施例2利用環狀基因導向載體對小鼠的乳清相關蛋白(WAP)基因進行基因導向為了證實該方法在小鼠中同樣是成功的，構建了環狀基因導向載體。該環狀載體包括單個果蠅屬P因子轉座酶切割位點(P足)和改變了的小鼠基因組DNA的一個片段。選擇所述小鼠乳清相關蛋白基因(WAP)是因為它的完整序列是已知的。為了分析所述載體的整合，在所述載體的WAP基因上形成兩個小的缺失。這些小的缺失位于該基因的5′末端和3′末端。將具有組成型活性小鼠啟動子的大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因克隆到修飾過的WAP基因的中間。用10μg的環狀WAP基因導向載體和2μg的編碼P因子轉座酶的質粒DNA，以及環狀陰性對照質粒同時注射小鼠。三個月之后，從所述注射動物以及它們的后代的多種組織(例如，血液，肝臟，肺，腎臟)中制備基因組DNA。對所述DNA進行PCR分析，使用能擴增P足，β-半乳糖苷酶基因，以及WAP基因和β-半乳糖苷酶基因這兩者的引物。
利用P足或β-半乳糖苷酶PCR-特異性引物對來自施用對照的小鼠的基因組DNA的各種樣品進行PCR沒有得到產物，這表明沒有發生所述對照載體的可檢測的基因組整合。對來自施用所述WAP基因導向載體和對照的小鼠的基因組DNA的各種樣品進行的PCR，證實了所述β-半乳糖苷酶基因整合到所述基因組上，并且位于小鼠基因組中的WAP基因組基因上。最后，檢查了所述β-半乳糖苷酶基因的表達，并且在所有組織中都發現了它的表達。
實施例3按以下方法修飾所述WAP載體去除β-半乳糖苷酶基因，在WAP基因的中間形成一個小的缺失，并且去除P足DNA序列。通過用限制性內切核酸酶SspI處理所述DNA，將該載體線性化。將這種線性DNA注射到小鼠體內，并且利用與實施例2所述類似的方法分析。所述DNA同源整合到了所述注射過的動物的所有檢測的組織中的WAP基因上，并且產生了具有遺傳學改變的WAP基因的后代。
實施例4用10μg含有相應于突變基因的正常形式的整合載體和1μg轉座酶DNA共同注射肥胖的小鼠突變體。一共進行了10次注射，每周注射1次。另外，同樣將不含基因的對照載體注射到所述突變小鼠體內。在5周時間末，對照小鼠表現出體重平均增加了15％(每只小鼠的體重增加了大約8克)。用含有正常肥胖基因序列的整合載體注射的小鼠，表現出體重下降了10％(每只小鼠的體重下降了大約5克)。由于所述整合載體具有相當于所述肥胖基因的外顯子14-17(和該區的內含子)的基因組DNA，只有同源重組是治愈所述小鼠出現肥胖的原因。就是說，如果是隨機整合的，所述正常的肥胖基因片段不能挽救所述表型，因為它只含有所述基因的一小部分，并且沒有啟動子，并且沒有翻譯的起始位點等。已知所述肥胖小鼠的突變發生在15和16外顯子之間，這表明不僅發生了同源重組，而且它的發生足以產生生理學反應。另外，這種特殊的肥胖基因需要在大腦中產生，因此它表明了這種技術能夠通過血腦屏障。
實施例5基于P因子的載體的替代物構建了具有與實施例3所述相同的缺失的WAP基因的載體(參見上文)。此時所述載體主鏈包括單個切割位點，該切割位點用于a)Sleeping Beauty或b)其他罕見的DNA切割酶(例如，PI-SCEI)。將10微克的這些DNAs與編碼所述切割酶的DNA(1微克Sleeping Beauty酶的DNA和大約5個單位的PI-SCEI，購自New England Biolabs)注射到小鼠體內。進行10次注射，每次注射時間間隔1周，然后用一個月時間不對這些小鼠作進一步的處理。然后處死所述小鼠，并且采集各個組織/器官，并且用每一種分離的樣品制備基因組DNA。利用所述方法觀察同源重組，不過，它的整合頻率遠遠低于用基于P因子的載體觀察到的整合頻率。這可能是由于Sleeping Beauty的不太有效的切割。同樣，對于PI-SCEI來說，所述切割可能在注射期間發生或所述蛋白進入細胞的能力減弱或可能沒有使用足夠的酶。
實施例6利用環狀基因導向載體對人進行治療為了證實該方法在人體上是成功的，構建了環狀基因導向載體。該環狀載體包括單個果蠅屬P因子轉座酶切割位點(P足)和正常人β-球蛋白基因組基因的一個片段。選擇所述人β球蛋白基因是因為它的完整序列是已知的，并且它是鐮狀細胞性貧血的發病原因。
給患有通過所述選擇的β球蛋白基因上的突變導致的鐮狀細胞性貧血的患者施用20毫克所述環狀基因導向載體和4毫克的P因子轉座酶-表達質粒。在經過3周時間的每周使用1次所述β球蛋白定向構建體之后，檢驗血液形態學，以便確定形態學正常的血細胞的存在。另外，對從定期采集的血樣中分離的基因組DNA進行DNA分析，以便確定所述β球蛋白基因正在被所述基因導向載體修復。最后，記錄鐮狀細胞性貧血的癥狀的減輕。
通過以上結果和討論證實，本發明提供了有效和高效的試劑和方法，可以實現外源核酸向多細胞生物的靶細胞基因組中的定點整合。由于所述機制是同源重組，避免了與隨機整合相關的問題。此外，本發明提供了同源重組效率的顯著提高。因此，本發明對本領域作出了突出的貢獻。
在本說明書中所引用的所有出版物和專利申請都被收作本文參考，就如同每一份出版物或專利申請被專門和分別指明被收作參考文獻一樣。對任何出版物的引用都是因為它的公開早于本申請的申請日，而不是認為承認本發明不能享受因發明在先而先于這些材料的權利。
盡管為了清楚理解而通過說明和舉例形式對上述發明進行了披露，通過本發明的介紹，本領域普通技術人員可以理解的是，在不超出所附權利要求書的構思和范圍的前提下，可以對它進行某些改變和改進。
權利要求
1.一種通過同源重組使外源核酸進入多細胞生物的靶基因組的方法，所述方法包括給所述多細胞生物施用有效量的整合載體，包括(a)包括所述外源核酸的同源重組整合因子，所述外源核酸側翼為提供與所述靶基因組的同源重組的序列；和(b)線性化內切核酸酶識別位點，在存在用于所述線性化內切核酸酶位點的內切核酸酶的情況下，該識別位點能夠被所述內切核酸酶切割，以便產生線性化載體；該方法的使用條件使得所述整合載體被所述內切核酸酶切割，以便產生線性化載體，通過這種載體使所述整合因子同源重組進入所述靶基因組。
2.如權利要求1的方法，其中，所述整合載體是在施用于所述多細胞生物之前，通過所述內切核酸酶線性化的。
3.如權利要求1的方法，其中，所述整合載體是在施用于所述多細胞生物之后，通過所述內切核酸酶線性化的。
4.如權利要求1的方法，其中，所述內切核酸酶是限制酶。
5.如權利要求4的方法，其中，所述限制酶是SspI。
6.如權利要求1的方法，其中，所述內切核酸酶是重組酶。
7.如權利要求6的方法，其中，所述重組酶是轉座酶。
8.如權利要求1的方法，其中，所述方法還包括給所述多細胞生物施用所述內切核酸酶或包括其編碼序列的核酸。
9.如權利要求8的方法，其中，所述方法還包括給所述多細胞生物施用包括所述內切核酸酶的編碼序列的核酸。
10.如權利要求9的方法，其中，所述編碼序列不存在于所述整合載體上。
11.如權利要求9的方法，其中，所述編碼序列存在于所述整合載體上。
12.如權利要求1的方法，其中，所述整合載體是通過血管內途徑施用的。
13.如權利要求1的方法，其中，所述多細胞生物是動物。
14.如權利要求13的方法，其中，所述動物是昆蟲。
15.如權利要求1的方法，其中，所述動物是脊椎動物。
16.如權利要求15的方法，其中，所述脊椎動物是哺乳動物。
17.一種通過同源重組使外源核酸進入脊椎動物的靶基因組的方法，所述方法包括給所述脊椎動物施用有效量的環狀整合載體，包括(a)同源重組整合因子，它包括所述外源核酸，其側翼為提供與所述靶基因組的同源重組的序列；和(b)線性化內切核酸酶識別位點，當它與能識別所述線性化內切核酸酶識別位點的線性化內切核酸酶接觸時，被所述內切核酸酶切割，以便產生線性化的整合載體，其中，所述線性化內切核酸酶是對所述脊椎動物而言，不是內源的內切核酸酶；以便所述環狀整合載體被所述內切核酸酶切割，以產生線性化整合載體，通過這種載體使所述整合因子同源重組進入所述靶基因組。
18.如權利要求17的方法，其中，所述脊椎動物在所述施用步驟之前表達所述線性化內切核酸酶。
19.如權利要求17的方法，其中，所述方法還包括給所述脊椎動物施用所述內切核酸酶，或包括其編碼序列的核酸。
20.如權利要求19的方法，其中，所述方法還包括給所述脊椎動物施用包括所述線性化內切核酸酶的編碼序列的核酸。
21.如權利要求20的方法，其中，所述編碼序列不存在于所述環狀整合載體上。
22.如權利要求20的方法，其中，所述編碼序列存在于所述環狀整合載體上。
23.如權利要求17的方法，其中，所述脊椎動物是哺乳動物。
24.如權利要求17的方法，其中，所述整合載體是通過血管內途徑施用的。
25.一種環狀核酸整合載體，包括(a)能夠被重組酶切割的單個重組酶識別位點；和(b)同源重組整合因子，它包括外源核酸，其側翼為提供同源重組的序列。
26.如權利要求25的載體，其中，所述重組酶是轉座酶。
27.如權利要求25的載體，其中，所述轉座酶是果蠅屬P-因子轉座酶。
28.如權利要求25的載體，其中，所述載體還包括所述重組酶的編碼序列。
29.如權利要求28的載體，其中，所述編碼序列不存在于所述整合因子上。
30.如權利要求25的載體，其中，所述整合因子包括表達盒。
31.一種用于將外源核酸同源重組到多細胞生物的靶細胞基因組中的系統，所述系統包括(a)導向載體，包括(i)能夠被重組酶切割的單個重組酶識別位點；和(ii)整合因子，它包括外源核酸，其側翼為提供同源重組的序列；和(b)所述重組酶或包括其編碼序列的核酸。
32.如權利要求31的系統，其中，所述系統包括所述重組酶。
33.如權利要求31的系統，其中，所述系統包括編碼所述重組酶的核酸。
34.如權利要求33的系統，其中，所述核酸存在于所述導向載體上。
35.如權利要求33的系統，其中，所述核酸存在于獨立于所述導向載體的載體上。
36.一種用于將外源核酸同源重組到多細胞生物的靶細胞基因組中的試劑盒，所述試劑盒包括(a)導向載體，包括(i)能夠被重組酶切割的重組酶識別位點；和(ii)同源重組整合因子，它包括外源核酸，其側翼為提供同源重組的序列；和(b)所述重組酶或包括其編碼序列的核酸。
37.如權利要求36的試劑盒，其中，所述試劑盒包括所述重組酶。
38.如權利要求36的試劑盒，其中，所述試劑盒包括編碼所述重組酶的核酸。
39.如權利要求38的試劑盒，其中，所述存在于所述導向載體上。
40.如權利要求38的試劑盒，其中，所述核酸存在于獨立于所述導向載體的載體上。
全文摘要
提供了用于將外源核酸同源重組到諸如動物的多細胞生物的靶細胞基因組中的方法。在本發明方法中，讓包括線性化內切核酸酶位點，例如，重組酶識別位點，和同源重組整合因子的導向載體與多核細胞生物接觸，例如，通過系統性或局部施用，以便所述多細胞生物的靶細胞攝取所述導向載體。所述導向載體是在同源重組事件之前，例如，在與所述多細胞生物接觸之前或之后通過諸如重組酶的線性化內切核酸酶在某些點上線性化的載體。在被所述靶細胞攝取之后，所述整合因子通過同源重組從所述線性化導向載體進入所述靶細胞基因組。還提供了用于實施本發明方法的導向載體，系統和試劑盒。
文檔編號C12N15/87GK1774506SQ03815573
公開日2006年5月17日 申請日期2003年4月29日 優先權日2002年4月30日
發明者P·福加蒂 申請人:托斯克公司