具有降低的血凝活性的藥物載體組合物或基因載體組合物的制作方法

專利名稱：具有降低的血凝活性的藥物載體組合物或基因載體組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于藥物或基因遞送進(jìn)入細(xì)胞的載體，其血凝活性通過修飾一種負(fù)鏈RNA病毒的包膜蛋白降低。
背景技術(shù)：
仙臺病毒(SeV)包括兩種類型的外包膜蛋白血凝素-唾液酸苷酶(HN)和融合蛋白(F)。HN與細(xì)胞表面的唾液酸結(jié)合，緊跟著通過F蛋白的介導(dǎo)與所述細(xì)胞發(fā)生融合，從而使SeV能直接、快速、高效地感染進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。而且，因為唾液酸存在與幾乎所有細(xì)胞表面，SeV能夠感染很大范圍的細(xì)胞。為了將這些極具感染性的SeV種類應(yīng)用于基因治療，已開發(fā)出一種攜帶各種基因的重組SeV載體(Shiotani等，Gene Therapy，2001，8，1043-1050)，同時對一種藥物遞送系統(tǒng)的研究也在進(jìn)行之中，該系統(tǒng)中基因和各種藥物包裹在含SeV包膜蛋白的脂質(zhì)體的水相核心中(Ramani等，F(xiàn)EBS Letters，1997，404，164-168；Isaka等等，Experimental Nephrology，1998，6，144-147)。
SeV載體有很多這樣的優(yōu)點，但其廣泛的感染力也是一個不利的因素。SeV載體也可與包含大量唾液酸的紅細(xì)胞融合，從而引發(fā)高溶血活性。因此，從安全性角度來看要求進(jìn)一步改進(jìn)。此外，SeV載體與紅細(xì)胞融合意味著該載體不能遞送需要量的藥物到達(dá)靶細(xì)胞，表明SeV載體可能在血液中極不穩(wěn)定。因此，預(yù)測SeV載體在體內(nèi)的施用方法將限制于那些不以血液為介導(dǎo)的方法，例如暫時停止血流或灌注的方法，或是對那些幾乎不受血成分影響的位點進(jìn)行局部施用的方法。
為了解決這些與安全和穩(wěn)定性相關(guān)的問題，HN蛋白的血凝活性一定要被去除或降低以減少其與紅細(xì)胞的結(jié)合。但是，降低血凝活性導(dǎo)致SeV與將要導(dǎo)入藥物的靶細(xì)胞的結(jié)合力降低，這樣可以很容易地推斷出藥物運輸效力將明顯降低。因此，必須要求有一些竅門(ingenuity)。
至今為止，已有很多研究報道通過用二硫蘇糖醇(DTT)特異性地還原SeV的HN蛋白從而降低血凝活性的方法。然而，這些研究中大多數(shù)是用對紅細(xì)胞的溶血活性作為指標(biāo)。例如，Tomasi等在FEBS Letters，1982，143(2)，252-256中報道用DTT還原SeV從而消除其血凝活性。不過，他們僅報道了新將識別紅細(xì)胞的抗體分子導(dǎo)入HN蛋白分子的SH基團(由DTT還原形成的)，能互補SeV結(jié)合紅細(xì)胞的能力，表現(xiàn)出恢復(fù)的溶血活性。此外，由于融合活性大大降低，存在對此方法可能性的懷疑。Gitman等在Biochemistry，1985，24，2762-2768中報道了對SeV外包膜蛋白的化學(xué)修飾。他們成功地消除了血凝活性，但與此同時也完全去除了融合能力。他們報道說，要想獲得融合能力必須重新?lián)饺胛唇?jīng)修飾的包膜蛋白，而這樣又導(dǎo)致血凝活性的恢復(fù)。
還有幾個對靶細(xì)胞研究的報道。舉例來說，Bagai等在Journal of Virology，1993，67(6)，3312-3318，提出了F蛋白的糖鏈特異性感染的藥物遞送系統(tǒng)，其中包括如下步驟溶解其HN已被表面活性劑還原的SeV；然后重構(gòu)僅含有F蛋白的病毒粒子。Ramani等在FEBS Letters，1997，404，164-168，也報道了使用相似系統(tǒng)在體外進(jìn)行基因?qū)氲慕Y(jié)果。這些方法確實可以去掉血凝活性并使SeV僅與靶細(xì)胞融合，可同時還有一些有待解決的問題。例如，F(xiàn)蛋白也伴隨著HN蛋白有相當(dāng)?shù)臏p少。而且，在重構(gòu)過程中(Ponimaskin等，Virology，2000，269，391-403)并不是所有的包膜蛋白都摻入了病毒粒子，因而削弱了重構(gòu)載體的融合能力，導(dǎo)致劑量的增加。還有，在生產(chǎn)過程中，對大量病毒的需求、去除表面活性劑的繁瑣、重構(gòu)病毒粒子的異質(zhì)性等，都為進(jìn)一步改進(jìn)提供了的大量空間。
因此，至今還沒有已知的基于負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白、其血凝活性顯著降低而遞送藥物進(jìn)入細(xì)胞能力保持不變的藥物傳輸系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種載體，通過修飾負(fù)鏈RNA病毒的包膜蛋白，使其僅血凝活性顯著降低而仍保持將藥物或基因?qū)爰?xì)胞的能力。
在藥物和藥物配制劑的開發(fā)中，藥物遞送系統(tǒng)(DDS)作為減少不希望的作用并顯示所需功能的一種方法，是很重要的技術(shù)。本發(fā)明者們認(rèn)為，作為DDS技術(shù)中的一種，化學(xué)修飾的負(fù)鏈RNA病毒的包膜蛋白可以降低作用于紅細(xì)胞的活性并保持導(dǎo)入細(xì)胞的能力。就此而言，優(yōu)選選擇性地修飾負(fù)責(zé)血凝活性的包膜蛋白，從而在降低該活性的同時盡可能使對融合起關(guān)鍵作用的包膜蛋白的影響最小化。
本發(fā)明者們進(jìn)行了詳盡地研究并發(fā)現(xiàn)，用聚合體如聚乙二醇(PEG)修飾時可有效降低血凝作用。例如，在一個通過將活化PEG共價結(jié)合于仙臺病毒(SeV)包膜蛋白氨基基團上而獲得的PEG修飾的SeV載體(

圖1)中，對于反應(yīng)的PEG的量而言，血凝反應(yīng)(HAU)顯著降低是顯而易見的。盡管也擔(dān)心隨著HAU的降低載體對靶細(xì)胞的感染力也可能降低，但與HAU的降低相比，修飾載體將基因?qū)爰?xì)胞能力的降低程度是比較小的，確保其保持了足夠的載體感染能力(表1和2)。在這種情況下，顯示了較大分子量的PEG可增強將基因?qū)爰?xì)胞的能力。而且，制備PEG修飾載體的方法非常快速便宜。
在對經(jīng)PEG修飾的SeV載體的組成型蛋白進(jìn)行的電泳圖中，HN蛋白大量減少而作為替代觀察到了新大分子的出現(xiàn)。另一方面，F(xiàn)蛋白的減少相對較小，表明PEG優(yōu)選修飾HN蛋白而不是與F蛋白結(jié)合。由此可認(rèn)為這是在HAU大幅度降低的同時仍保持融合能力的原因之一(圖4、15和16)。
作為HAU減少的一個反映，PEG修飾的SeV載體對大鼠血的溶血活性顯著下降，表明該載體在安全性方面是非常出色的(圖2)。此外，盡管SeV載體的基因?qū)肽芰υ谂c血液接觸的過程中顯著降低，但修飾后的載體即使在血液處理之后仍可保持足夠水平的基因?qū)肽芰?圖3和20)。這些結(jié)果說明，修飾不僅具有降低與紅細(xì)胞結(jié)合的作用，同時還能夠給那些例如血液中補體等很可能破壞載體活性的因子施加穩(wěn)定化作用。此外，由于PEG修飾的載體實際上即使在中和抗體存在下也可穩(wěn)定地導(dǎo)入基因(圖5和17)，因此認(rèn)為PEG修飾可以對各種活體成分施加穩(wěn)定化作用。
另外，當(dāng)檢測PEG修飾載體在體內(nèi)施用的作用時，多次給藥后該載體的基因?qū)胄拭黠@高于未經(jīng)修飾的載體，確證了PEG修飾載體在體內(nèi)有高基因?qū)肽芰?圖19)。
如前所述，已發(fā)現(xiàn)適宜地選擇PEG修飾條件可降低SeV載體與紅細(xì)胞的相互作用，并仍保持高水平的將基因?qū)爰?xì)胞的能力。
此外，本發(fā)明者們還檢測了純化后抗-HN蛋白單克隆抗體(MAb)的用途，該抗體選擇性地與負(fù)責(zé)血凝活性的包膜蛋白結(jié)合，并降低此活性(Miura等，Exp.Cell Res.，1982，141，409-420)。用MAb處理后的仙臺病毒載體根本表現(xiàn)不出任何血凝活性。其血凝活性完全被封閉，而且也觀察不到經(jīng)處理后的載體將基因?qū)爰?xì)胞的現(xiàn)象。當(dāng)將靶細(xì)胞結(jié)合的配體分子重新結(jié)合到MAb分子上后，經(jīng)此配體偶聯(lián)的MAb處理后的仙臺病毒(圖5)顯示即沒有血凝活性也沒有溶血活性(圖7、10和11)，但盡管如此，該處理后的病毒卻能夠高效將基因?qū)霛撛诘呐潴w偶聯(lián)的靶細(xì)胞(圖8和9)?；蛑荒鼙粚?dǎo)入靶細(xì)胞中，而且當(dāng)存在過量競爭性物質(zhì)時基因?qū)肽芰幌?表4)。這些結(jié)果證明，盡管完全喪失了修飾載體的血凝活性，高效地將基因?qū)Ｒ坏貙?dǎo)入靶細(xì)胞仍是有可能的。
通過將用來連接的配體分子，改變成可與在某靶細(xì)胞中高度表達(dá)受體產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)的分子，認(rèn)為該系統(tǒng)可變得適用于對任何細(xì)胞進(jìn)行導(dǎo)入。
而且，由于該系統(tǒng)可方便地通過在即將使用前混合各成分來制備，因此其非常容易應(yīng)用。
這種技術(shù)也可應(yīng)用于由SeV外膜組成型蛋白重構(gòu)的病毒粒子制劑。在這種情況下，可能沒有必要如上所述還原HN蛋白。如果在沒有預(yù)先還原就將SeV溶解并重構(gòu)包裹有所需藥物的病毒粒子之后應(yīng)用本技術(shù)，所形成的載體能夠有更大的融合能力并且不會對F蛋白造成任何由于還原作用帶來的影響。
本發(fā)明涉及其血凝活性降低了的藥物載體組合物或基因載體組合物。更明確地說，本發(fā)明提供[1]一種藥物-載體組合物或基因-載體組合物，其包含細(xì)胞膜，該細(xì)胞膜含有具血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白，其中(a)一種化合物加入所述蛋白；(b)血凝活性比沒有加所述化合物的組合物降低；而且(c)該組合物具有將藥物或基因?qū)氚屑?xì)胞的能力；[2][1]中的組合物，其中(d)對紅細(xì)胞的溶血活性比沒有附著該化合物的組合物降低；[3][1]或[2]中的組合物，其包含負(fù)鏈RNA病毒的感染型病毒粒子；[4][1]或[2]中的組合物，其包含滅活的負(fù)鏈RNA病毒或該病毒的包膜部分；[5][1]-[4]之一的組合物，其中所述負(fù)鏈RNA病毒是副粘病毒科的病毒；[6][5]中的組合物，其中所述副粘病毒科的病毒是仙臺病毒；[7][1]-[6]之一的組合物，其中所述附著于蛋白的化合物的分子量為1,800或更高； [7]中的組合物，其中所述附著于蛋白的化合物的分子量為4,500或更高；[9][8]中的組合物，其中所述附著于蛋白的化合物的分子量為16,000或更高；[10][1]-[9]之一的組合物，其中所述附著于蛋白的化合物是聚乙二醇；[11][1]-[10]之一的組合物，其中所述蛋白進(jìn)一步與聚乙烯亞胺形成復(fù)合物；[12][1]-[11]之一的組合物，其中所述蛋白與細(xì)胞結(jié)合化合物形成復(fù)合物；[13][12]中的組合物，其中所述細(xì)胞結(jié)合化合物與所述附著于所述蛋白的化合物相結(jié)合；[14][12]或[13]中的組合物，其中所述附著于所述蛋白的化合物是與該蛋白相結(jié)合的抗體或其片段；[15][12]-[14]之一的組合物，其中所述細(xì)胞結(jié)合化合物是細(xì)胞表面受體的配體；[16][15]中的組合物，其中所述配體是葉酸；[17]與細(xì)胞結(jié)合化合物結(jié)合的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與具血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白相結(jié)合；[18][17]中的抗體或其片段，其是F(ab′)2；[19][17]或[18]中的抗體或其片段，其中所述細(xì)胞結(jié)合化合物是某細(xì)胞表面受體的配體；[20][19]中的抗體或其片段，其中所述配體是葉酸；還有[21]一種藥物或基因-載體試劑盒其包括(a)一種抗體或其片段，其與具有血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白相結(jié)合，并且與細(xì)胞結(jié)合化合物相結(jié)合；和(b)含有所述包膜蛋白的藥物-載體組合物或基因-載體組合物。
本發(fā)明提供了藥物-載體組合物或基因-載體組合物，包括含有具血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白的細(xì)胞膜，其中(a)一種化合物附著于所述蛋白上；(b)與該化合物沒有附著的組合物相比，其血凝活性降低；而且(c)該組合物具有將藥物或基因?qū)氚屑?xì)胞的能力。本發(fā)明中的組合物是復(fù)合物，包括含有具血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白的細(xì)胞膜。舉例來說，這類復(fù)合物可以是感染性病毒粒子、滅活的負(fù)鏈RNA病毒、或含有分解后負(fù)鏈RNA病毒的包膜成分如重構(gòu)的脂質(zhì)體。
感染性病毒粒子感染細(xì)胞并因此將包裹在該病毒中的藥物或基因載入細(xì)胞。詳細(xì)來說，通過將外源基因并入病毒基因組，該基因可以從被該感染性病毒粒子感染的細(xì)胞中的病毒基因組表達(dá)。該感染性病毒可以是有復(fù)制能力的病毒或復(fù)制缺陷型病毒。術(shù)語“有復(fù)制能力的病毒”是指當(dāng)病毒感染宿主細(xì)胞后，其可在那些宿主細(xì)胞中復(fù)制來產(chǎn)生感染性病毒粒子。
在該基因組RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的蛋白存在時，負(fù)鏈RNA病毒可通過在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA來重構(gòu)。重組負(fù)鏈RNA病毒的重構(gòu)可采用本領(lǐng)域內(nèi)熟知方法(WO 97/16539；WO 97/16538；WO 00/70055；WO00/70070；Durbin，A.P.等，1997，Virology 235323-332；Whelan，S.P.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928388-8392；Schnell.M.J.等，1994，EMBO J.134195-4203；Radecke，F(xiàn).等，1995，EMBO J.145773-5784；Lawson，N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924477-4481；Garcin，D.等，1995，EMBO J.146087-6094；Kato，A.等，1996，Genes Cells 1569-579；Baron，M.D.and Barrett，T.，1997，J.Virol.711265-1271；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9315400-15404；Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.782813-2820，1997；Kato，A.等，1997，EMBO J.16578-587；Yu，D.等，1997，Genes Cells 2457-466)。采用這些方法，負(fù)鏈RNA病毒載體，包括如副流感病毒、水泡性口炎病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、仙臺病毒等，可從DNA重構(gòu)。
含有外源基因的重組病毒載體可通過將外源基因插入病毒載體基因組來獲得。任何將要在細(xì)胞中表達(dá)的基因都可用作為外源基因。外源基因可以是編碼天然蛋白的基因、或是編碼通過缺失、取代或插入核苷酸對天然蛋白進(jìn)行修飾所得蛋白的基因，只要該基因編碼功能與天然蛋白相同的蛋白即可?？蛇x地，該外源基因可編碼天然蛋白或合成蛋白的缺失衍生物。舉例來說，對于基因治療或類似情況，病毒的重構(gòu)是通過將一個用于治療靶疾病的基因插入作為病毒載體模版(病毒載體DNA)的DNA中，然后轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的重組DNA來完成的。將外源基因?qū)氩《据d體DNA中，如導(dǎo)入仙臺病毒載體DNA中時，由6的倍數(shù)個核苷酸組成的序列優(yōu)選插入在如轉(zhuǎn)錄終止(E)序列和轉(zhuǎn)錄起始(S)序列之間(Journal of Virology，Vol.67，No.8，1993，p.4822-4830)。在副粘病毒中，外源基因可插入在各個病毒蛋白開放讀碼框架(ORF)的上游和/或下游(例如NP、P、M、F、HN和L蛋白的ORF)。為了避免抑制該外源基因上游和下游基因的表達(dá)，E-I-S(轉(zhuǎn)錄終止序列-插入序列-轉(zhuǎn)錄起始序列)序列恰當(dāng)?shù)夭迦朐谕庠椿虻纳嫌位蛳掠?，以便將該E-I-S序列單元安置在各個基因之間。
回收的病毒可以純化到基本純。純化可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的純化/分離方法來完成，包括過濾、離心、以及柱純化或任何這些方法的聯(lián)合使用?！盎炯儭笔侵覆《驹谄渥鳛橐环N成分的樣品中占主要部分。通常，基本純病毒載體的認(rèn)定可通過以下方式確定病毒載體產(chǎn)生的蛋白為該樣品所含總蛋白的50％或更多，優(yōu)選70％或更多，更優(yōu)選80％或更多，而且還更優(yōu)選90％或更多。特異性純化負(fù)鏈RNA病毒方法的實例是那些使用纖維素硫酸酯或交聯(lián)多糖硫酸酯的方法(Examined Published Japanese PatentApplcations No.(JP-B)Sho 62-30752，JP-B No.62-33879，還有JP-B No.62-30753)，以及那些將蛋白吸附于含硫酸海藻糖和/或其降解產(chǎn)物的多糖上(WO 97/32010)的方法等。
無活性的病毒或由分解病毒重構(gòu)的產(chǎn)物，用作將藥物或基因?qū)爰?xì)胞的轉(zhuǎn)染劑。負(fù)鏈RNA病毒可以通過如UV照射的方法來滅活。另外，脂質(zhì)體是利用滅活病毒如日本血凝病毒(HVJ)-脂質(zhì)體可通過振蕩和超聲的方法來制備(見，“Liposome in Life Science/Laboratory Manual”，Springer-VerlagTokyo(1992)，pp.282-287)。此外，一種通過將滅活仙臺病毒粒子或脂質(zhì)體和核酸混合形成的組合物(膜融合脂質(zhì)體)也見諸報道(Yasushi KanedaBIOTHERAPY，8，1265(1994))?？蛇x地，分解后的病毒可通過如下例的方法來重構(gòu)，從溶解后的病毒重新形成脂質(zhì)體來制備所謂的“病毒體”(Bagai等，(1993)Biochem.Biophys.Acta 1152，15-25)。明確地說，在用如TritonX-100等表面活性劑溶解負(fù)鏈RNA病毒后，不溶性的RNP可通過離心來除去。病毒體可通過從含有包膜和包膜蛋白的溶解液中去除表面活性劑由重構(gòu)的病毒粒子來制備。相同顆粒大小的病毒體可通過離心方法來收集(例如，在12,000rpm下離心10分鐘)。
在含有感染性病毒粒子的組合物中，該感染性病毒粒子既可以是負(fù)鏈RNA病毒，也可以是其它含有具有血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白的病毒。用另一種病毒包膜蛋白重構(gòu)的假型病毒是本領(lǐng)域已知的(WO 01/92508)。含有負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白的假型病毒可通過如下步驟來制備例如制備含有滅活負(fù)鏈RNA病毒或其包膜蛋白的病毒顆粒；然后將該病毒顆粒與另一病毒相融合。作為另一選擇，假型病毒可通過在另一病毒的包裝細(xì)胞中表達(dá)一種可表達(dá)具有血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白的表達(dá)載體來制備。其包裝細(xì)胞可用來表達(dá)該載體的病毒實例有逆轉(zhuǎn)錄病毒，尤其是屬于腫瘤病毒亞科的病毒，包括莫洛尼氏(Moloney)鼠白血病毒(MoMLV)、鼠干細(xì)胞病毒(MSCV)、以及諸如此類(本發(fā)明中稱為癌病毒的病毒)；還有那些屬于慢病毒屬亞科的病毒，包括人類免疫缺陷病毒(HIV)(例如HIV1或HIV2)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、麥西維斯那病病毒(meadi visna virus)、馬感染性貧血病毒(EIAV)、caraparu關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(caraparu arthritis encephalitis virus)(CAEV)、以及諸如此類(本發(fā)明中稱為慢病毒的病毒)。HIV-1包括所有主要(M)亞型(包括A-J)、N和outlier(O)(Hu，D.J.等，JAMA 1996，275210-216；Zhu，T.等，Nature 1998，5391(6667)594-7；Simon，F(xiàn).等，Nat.Med.1998，4(9)1032-7)。SIV分離株的例子有SIVagm、SIVcpz、SIVmac，SIVmnd，SIVsnm和SIVsyk。也可以使用源自泡沫病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括泡沫病毒(Spuma virus)(DE 4318387；WO 9607749；Virology(1995)210，1，167-178；J.Virol.(1996)70，1，217-22)。由泡沫病毒(foamy virus)得來的病毒載體可用于將外源基因?qū)肴梭w細(xì)胞，特別是在基因治療中用于給藥重組疫苗等。
除了具有血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白外，假型病毒載體還可以包括，如該病毒的其它包膜蛋白。舉例來說，本發(fā)明包括的組合物，其包括一種含有副粘病毒HN和F蛋白的假型化病毒載體，其中有一個化合物附著在HN蛋白上。包括具有血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白的病毒載體，還可包括來自另一病毒的包膜蛋白。作為這樣一種蛋白，舉例來說，可感染人類細(xì)胞的病毒的包膜蛋白是優(yōu)選的。這類蛋白沒有特殊限制，而且還包括如，逆轉(zhuǎn)錄病毒的兼嗜性包膜蛋白、水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白等。此外，皰疹病毒蛋白的實例有單純皰疹病毒的gB、gD、gH和gp85蛋白；還有EB病毒的gp350和gp220蛋白。嗜肝DNA病毒(hepdonaviridea)蛋白的實施例有乙型肝炎病毒的S蛋白。至于逆轉(zhuǎn)錄病毒的兼嗜性包膜蛋白，舉例來說，可使用來自鼠白血病毒(MuLV)4070A株的包膜蛋白。此外，來自MuMLV 10A1的包膜蛋白也可使用(例如，pCL-10A1(Imgenex)，Naviaux，R.K.等，J.Virol.705701-5705(1996))。至于嗜親性包膜蛋白，舉例來說，可使用來自莫洛尼氏鼠白血病毒(MoMLV)的包膜蛋白。至于水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)，舉例來說，可使用來自其印第安納血清型毒株(J.Virology 39519-528(1981))的蛋白。除此之外，也可使用來自任何優(yōu)選毒株的蛋白。
本發(fā)明中，負(fù)鏈RNA病毒是含有負(fù)鏈(相對于編碼其病毒基因的有義鏈的反義鏈)RNA作為基因組的病毒，并且包膜蛋白含有血凝活性。負(fù)鏈RNA也可指負(fù)鏈。負(fù)鏈RNA病毒實例有副粘病毒科仙臺病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、以及麻疹病毒；正粘病毒科流感病毒；以及彈狀病毒科水泡性口炎病毒和狂犬病毒。
本發(fā)明中，具血凝活性的病毒包膜蛋白優(yōu)選單負(fù)鏈RNA病毒的包膜蛋白。單鏈負(fù)鏈RNA病毒也可指為非節(jié)段型負(fù)鏈RNA病毒，包括屬于以下病毒科的病毒副粘病毒科(包括副粘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、肺病毒等)；彈狀病毒科(包括水泡性口炎病毒、狂犬病病毒、彈狀病毒等)；Firoviridae；正粘病毒科(包括流感病毒A、B和C、瑟高特樣病毒(thogoto-likeviruses)等)；布尼病毒科(包括布尼病毒(bunyaviruses)、漢灘病毒(hantaviruses)、內(nèi)羅病毒(nairoviruses)、白蛉熱病毒(phleboviruses)等)以及沙粒病毒科(Arenaviridae)的病毒。具有血凝活性包膜蛋白的具體實例有，副粘病毒科病毒的HN蛋白、正粘病毒科病毒的HN蛋白、流感病毒病毒的HN蛋白、布尼病毒科病毒的G1蛋白、彈狀病毒科病毒的G蛋白、Firoviridae的VP1蛋白等。
本發(fā)明中，具血凝活性的病毒包膜蛋白更優(yōu)選來自副粘病毒。“副粘病毒”是指屬于副粘病毒科的病毒。副粘病毒包括，如副粘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、肺病毒屬以及聯(lián)肺病毒(metapneumoviruses)等；具體的例子有仙臺病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒、瘟熱病毒、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒1、2、3型等。具有血凝活性的副粘病毒包膜蛋白中一個具體例子是HN蛋白(也指H蛋白)。本發(fā)明中，具血凝活性的病毒包膜蛋白更優(yōu)選那些屬于副粘病毒亞科的病毒，包括副粘病毒、麻疹病毒以及風(fēng)疹病毒的包膜蛋白，并且更加優(yōu)選副粘病毒包膜蛋白。具血凝活性的病毒包膜蛋白最優(yōu)選仙臺病毒HN蛋白。這些病毒可來自野生株、突變株、實驗室傳代株以及人工構(gòu)建株。舉例來說，來自仙臺病毒Z株的HN蛋白可優(yōu)選使用。仙臺病毒HN基因的核苷酸序列登記在GenBank，登錄號為No.D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808，X56131等。
另外，作為具病毒血凝活性的包膜蛋白，正粘病毒科病毒的HA蛋白也可優(yōu)選使用。例如，利用流感病毒的包膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒制備的假型病毒可以感染包括人類細(xì)胞在內(nèi)的很大范圍的哺乳動物細(xì)胞。可以使用來自優(yōu)選分離株的流感病毒包膜蛋白。在流感病毒的出芽(budding)過程中，唾液酸苷酶在裂解HA蛋白和唾液酸之間的鍵中起重要作用。因此，在制備HA假型病毒過程中，感染性病毒可通過在將化合物附著于HA之前、同時或之后，用唾液酸苷酶處理病毒來獲得。另一種方案，通過制備與具唾液酸苷酶活性蛋白共存的病毒載體，連接唾液酸的鍵可以自動裂解。在這種情況下，具有唾液酸苷酶活性的病毒包膜蛋白，例如副粘病毒的HN蛋白，是優(yōu)選使用的。因此，本發(fā)明提供具有降低的病毒血凝活性的組合物，其包含同時含有正粘病毒科病毒HA蛋白和副粘病毒科病毒HN蛋白的假型病毒載體，其中有化合物附著在一種或全部兩種蛋白上。
病毒包膜蛋白可以是來自野生型病毒的完整蛋白、或者是天然或人工突變后的蛋白。例如，有可能通過分析抗原呈遞表位等作為這些包膜蛋白中潛在的細(xì)胞表面抗原分子，然后利用這些表位用抗原呈遞能力降低了的蛋白構(gòu)建病毒。此外，還有可能使用來自經(jīng)滅活的致病性病毒減毒株的包膜蛋白等。
例如，使用其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域已經(jīng)通過缺失、取代、和/或增加氨基酸殘基進(jìn)行修飾的具血凝活性的病毒包膜蛋白以及其它包膜蛋白，可以構(gòu)建成具有更高基因?qū)肽芰Φ妮d體。本發(fā)明涉及含有病毒載體的組合物，該載體包括具血凝活性的天然病毒包膜蛋白(其部分或全部細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是經(jīng)取代、缺失、和/或增加氨基酸殘基修飾的)，其中在具血凝活性的病毒包膜蛋白上附著了一種化合物。具體舉例來說，通過缺失負(fù)粘病毒HN蛋白的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、或通過在其它膜蛋白(如包括慢病毒在內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行取代或加合所獲得的修飾蛋白，優(yōu)選用于制備具有高感染效率的假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
本發(fā)明中，血凝活性是指引起血凝作用(HA)的活性，也就是使紅細(xì)胞聚集的活性。血凝活性可通過本領(lǐng)域已知的方法來檢測(Kokuritsu YobouEisei Kenkyujo Gakuyukai，ed. Second edition，“Virus Experiments”，Introduction，pp.214-225，Maruzen Co.，Ltd.)。例如，來自雞(包括雛雞和成年雞)、鵝、大鼠、豚鼠、恒河猴、綠猴、或人的紅細(xì)胞都可以使用。根據(jù)這些蛋白在適宜的條件下進(jìn)行反應(yīng)，如在0℃、4℃、室溫或37℃。具體來說，血凝活性可以通過如“終點稀釋法”(Kato，A.等，1996，Genes Cells 1569-579；Yonemitsu，Y. and Kaneda，Y.，Hemaggulutinating virus ofJapan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular MedicineHumana Presspp.295-306，1999)來測定。
在本發(fā)明中具血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白上附著有化合物，與沒有附著化合物時相比其血凝活性降低。本發(fā)明中，術(shù)語“降低了的血凝活性”是指顯著降低了的血凝活性，還包括如在統(tǒng)計學(xué)上顯著降低了的活性(例如，5％或更高的顯著水平)，也包括完全消除了的活性(或者說低于可檢測水平的活性)。本發(fā)明組合物的血凝活性，優(yōu)選降至其中沒有附著化合物的對照組合物活性的1/2或更低，更優(yōu)選降至其1/3或更低，更優(yōu)選降至其1/5或更低，更優(yōu)選降至其1/10或更低，更優(yōu)選降至其1/20或更低，更優(yōu)選降至其1/50或更低，更優(yōu)選降至其1/100或更低，更優(yōu)選降至其1/200或更低，更優(yōu)選降至其1/500或更低，還更優(yōu)選降至其1/1000或更低。相反，與血凝活性的降低相比，本發(fā)明的組合物將藥物或基因?qū)爰?xì)胞的能力保持不變。也就是說，與其中沒有附著化合物的對照組合物相比，本發(fā)明組合物將藥物或基因?qū)爰?xì)胞的能力僅有較小程度的降低，或更優(yōu)選不但沒降反而增加的。
而且，本發(fā)明中組合物的溶血活性也優(yōu)選顯著降低的。溶血活性可通過如下方法來檢測，將受試組合物與血液混合；靜置該混合物；離心除去血細(xì)胞成分；然后測量洗脫下來血色素的吸收值(見實施例)。本發(fā)明中組合物的溶血活性優(yōu)選降至其中沒有附著化合物的對照組合物的活性的70％或更低，更優(yōu)選降至其60％或更低，更優(yōu)選降至其1/2或更低，更優(yōu)選降至其1/3或更低，更優(yōu)選降至其1/5或更低，更優(yōu)選降至其1/10或更低，更優(yōu)選降至其1/20或更低，還更優(yōu)選降至其1/50或更低。
本發(fā)明中組合物的血凝活性降低了，并且在優(yōu)選實施例中，其溶血活性也降低了；但它們將藥物或基因?qū)爰?xì)胞的能力則得到保留。例如含有負(fù)鏈RNA病毒或該病毒包膜蛋白成分的組合物，可與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜融合，將藥物或基因帶入細(xì)胞。細(xì)胞膜融合能力是指，當(dāng)本發(fā)明中組合物所含有的復(fù)合物(載體)粘附于細(xì)胞膜后，利用該復(fù)合物的融合活性將組成成分并入細(xì)胞的能力。這種活性是由于融合蛋白(F)的功能而產(chǎn)生的，該蛋白可引起細(xì)胞融合并包含在負(fù)鏈RNA病毒的包膜中。本發(fā)明中組合物所含的細(xì)胞膜除包含具有血凝活性且其上附有化合物的包膜蛋白以外，優(yōu)選含有負(fù)鏈RNA病毒的F蛋白。
與細(xì)胞融合的能力可以通過如下方法來檢測(1)用紅細(xì)胞溶血作用作為指示物；(2)將熒光物質(zhì)摻入膜中，然后利用由于融合過程中發(fā)生膜流通(membrane flux)造成的稀釋作用而產(chǎn)生的熒光強度的變化來檢測；或(3)將藥物包入作為細(xì)胞膜模型的脂質(zhì)體的水性核心中，然后利用該藥物的滲漏作為指示劑來檢測。
此外，在本發(fā)明中組合物是作為假型病毒從其它病毒如前述逆轉(zhuǎn)錄病毒制備而來的情況下，由于各自病毒包膜蛋白的作用，組合物仍能夠?qū)⒃摬《局兴械乃幬锘蚧驅(qū)爰?xì)胞。將藥物或基因?qū)爰?xì)胞的能力可通過檢測該藥物或基因來確定。藥物可通過如下方法來檢測，舉例來說，通過檢測攝取進(jìn)入細(xì)胞的標(biāo)記藥物，或通過將某種生物活性物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞，然后檢查由于該物質(zhì)造成的細(xì)胞特性的變化。另外，細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)可通過如RT-PCR、Northern印跡雜交、免疫沉淀反應(yīng)、Western印跡等方法，在RNA或蛋白水平進(jìn)行檢測。另外，可將編碼某種生物活性蛋白的基因插入細(xì)胞，然后可檢測由該蛋白造成的細(xì)胞特性的改變。
此外，本發(fā)明中組合物在血中的穩(wěn)定性優(yōu)選明顯提高。在血中穩(wěn)定性的提高意味著當(dāng)本發(fā)明中組合物置于血液中時，其運輸藥物或基因的能力僅會有較小程度的降低。該組合物運輸能力的降低越少，其在血液中的穩(wěn)定性越高。血液中穩(wěn)定性的提高可以這樣來檢測，通過將本發(fā)明中組合物與血液一起溫育；測量該組合物遞送的藥物或基因在溫育后的水平；然后將此水平與其上沒有化合物附著的對照組合物(見實施例)所得的水平相比。遞送能力在遞送的是藥物的情況下可以參考藥物的活性，在遞送基因的情況下可以參考該基因的表達(dá)水平。基因表達(dá)可通過如直接或間接檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)或翻譯產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的方法來測定。生物活性蛋白可通過測定該蛋白的活性來檢測。本發(fā)明中組合物遞送藥物或基因能力的降低程度，優(yōu)選降為其中沒有附著化合物的對照組合物該能力降低程度的70％或更低，更優(yōu)選為60％或更低，更優(yōu)為1/2或更低，更優(yōu)為1/3或更低，更優(yōu)選為1/5或更低，更優(yōu)為1/10或更低。與未經(jīng)修飾的對照組合物相比，理想的結(jié)果是，相對于其血凝活性降低的變化，本發(fā)明中組合物遞送藥物或基因的能力提高。
本發(fā)明中，術(shù)語“一種化合物附著于具血凝活性的包膜蛋白上”是指所述蛋白與所述化合物相結(jié)合。這種結(jié)合可以是共價或非共價鍵結(jié)合。非共價鍵的例子有氫鍵、配位鍵、離子鍵、疏水相互作用(疏水鍵)以及分子間作用力(范德華力)。該蛋白和該化合物開始時可能是分離存在的，然后該化合物可能通過成鍵作用附著于該蛋白。通過如交聯(lián)作用形成的共價鍵，化合物可附著于具血凝活性的包膜蛋白上。交聯(lián)可與任何優(yōu)選的功能團形成。所述功能團包括，如羥基、氨基、醛基、羧基、巰基、硅烷醇基、酰氨基、環(huán)氧基團、琥珀酰亞胺基、苯酚基等，但不僅限于這里所說的這些。共價鍵的實例有，酯鍵、醚鍵、氨基鍵、酰胺鍵、硫醚鍵、亞氨基鍵、二硫鍵、等。蛋白和化合物優(yōu)選用非肽鍵結(jié)合。形成共價鍵的方法包括溴化氰激活(cyanogen bromide activation)法、酸性疊氮化物衍生(acid azide derivative)法、縮合劑(condensing agent)法、重氮化(diazotization)法、烷基化(alkylation)法等。
本發(fā)明中的藥物-載體組合物或基因-載體組合物可通過包括如下步驟的方法來制備將一個化合物與具血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白相接觸；并使該蛋白與該化合物結(jié)合?；衔锝Y(jié)合在包膜蛋白暴露在病毒表面的結(jié)構(gòu)域上。因此，具體來說，將化合物與蛋白相接觸的步驟優(yōu)選通過將該化合物與含有該蛋白的病毒粒子接觸來完成。這樣，通過暴露于病毒表面的結(jié)構(gòu)域，化合物可特異性地附著于參與血凝活性的蛋白。具體地，本發(fā)明揭示即使在其它包膜蛋白存在時，該化合物也將優(yōu)選通過化合物交聯(lián)與病毒表面具血凝活性的包膜蛋白結(jié)合，從而顯著降低血凝活性。因此，通過例如下面的步驟，有可能容易地制備出這樣的病毒，其中有化合物附著于具血凝活性的包膜蛋白上將通過常規(guī)方法產(chǎn)生的化合物與其上沒有化合物附著的病毒結(jié)合；然后將所述化合物與所述病毒結(jié)合。
用于附著于具血凝活性包膜蛋白上的化合物沒有限制，只要它們能夠顯著地抑制該蛋白的血凝活性。優(yōu)選這些化合物沒有明顯的生物毒性，并且與蛋白連接后在化學(xué)上是穩(wěn)定的。而且，該化合物沒有抗原性或僅有低的抗原性。此外，用于附著的化合物優(yōu)選水溶的。為了有效地抑制血凝活性，化合物的分子量為優(yōu)選1600道爾頓(Da)或更高、更優(yōu)選1800或更高、更優(yōu)選1900道爾頓或更高、而且更優(yōu)選2000道爾頓或更高。特別優(yōu)選的化合物的分子量為2800 Da或更高、更優(yōu)選為3800Da或更高、更優(yōu)選為4300Da或更高、更優(yōu)選為4500Da或更高、并且更加優(yōu)選為5000Da或更高。尤其是，分子量為12000 Da或更高、更優(yōu)選14000或更高、更優(yōu)選15000或更高、更優(yōu)選16000或更高、更優(yōu)選18000或更高、而且更優(yōu)選20000或更高的化合物可以顯著抑制血凝活性。
用來附著的化合物可以是各種聚合體如有機化合物聚合體。它們也可以有不均一的分子量分布，在這種情況下此處所用的術(shù)語“附著化合物的分子量”是指平均分子量。分子量分布(MW/Mn)值優(yōu)選小的，例如5或更小、優(yōu)選3或更小、更優(yōu)選2或更小、更優(yōu)選1.6或更小、而且更優(yōu)選1.4或更小。
具體地，舉例來說天然聚合體可以是蛋白如抗體、白蛋白、膠原、明膠、纖維蛋白、外源外源凝集素、以及肝素，或其片段；多糖如葡聚糖、環(huán)糊精、硫酸葡聚糖、纖維素、幾丁質(zhì)、脫乙酰殼多糖、以及褐藻酸；和脂類。作為合成聚合體，多聚乳酸、聚賴氨酸、聚苯乙烯、吡喃聚合物、聚谷氨酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙二醇、苯乙烯馬來酸共聚物、賴氨酸-谷氨酸共聚物、聚羥乙基異丁烯酸、Ficoll等都可以使用。
特別地使用聚乙二醇(PEG)作為例子來說明用來附著的化合物(J.M.Harris，″Polyethylene Glycol Chemistry.Biotechnical and BiomedicalApplications″，Plenum，New York，NY，1992；J.M.Harris and S.Zalipsky，″Chemistry and Biological Applications of Polyethylene Glycol″，ACS Books，Washington，D.C.，1997)。由于其水溶性以及低或無毒性，優(yōu)選使用PEG?！癙EG”代表含有如下結(jié)構(gòu)的化合物-(CH2CH2O)n-[化合物1]，其中n是2或2以上的自然數(shù)。舉例來說，典型的PEG是以含有如下結(jié)構(gòu)的化合物為例的HO-(CH2CH2O)n-H[化合物2]，其中n是2或2以上的自然數(shù)。
PEG可包括任何想要的修飾衍生物，例如其中在上述結(jié)構(gòu)的末端有羥基或類似基團被取代的情況。舉例來說如單甲基醚(monomethylether)(mPEG)是本發(fā)明優(yōu)選使用的，其中主鏈一端的羥基被取代。PEG可以是線狀或分支狀。例如，可以使用含有一個、兩個、三個或更多側(cè)鏈的PEG。這些側(cè)鏈可能含有乙二醇結(jié)構(gòu)。各種分子量的PEG都可以使用。舉例來說，PEG2000(平均分子量2000)、PEG3000(平均分子量3000)、PEG4000(平均分子量4000)、PEG5000(平均分子量5000)、PEG8000(平均分子量8000)、PEG10000(平均分子量10000)、或PEG20000(平均分子量20000)可以優(yōu)選使用。利用含有用于交聯(lián)的功能團的PEG，可將該PEG附著于具血凝活性的包膜蛋白。
舉例來說，在末端含有伯氨的PEG可與?；噭┙宦?lián)(Buckmann，A.等(1981)Makromol.Chem.1821379；Zalipsky，S.等(1983)Eur.Polym.J.191177；Eidelman，O.等(1991)Am.J.Physiol.260(Cell Physiol 29)C 1094；Pillai，V.N.R.等(1980)J.Org.Chem.455364)。另外，PEG可方便地通過利用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)-活化的脂、活化的羧酸、活性的醛等來進(jìn)行交聯(lián)。PEG·羧酸NHS酯的具體例子有PEG-琥珀酰亞胺琥珀酸酯(PEG-succinimidylsuccinate)、PEG-琥珀酰亞胺碳酸酯、PEG-琥珀酰亞胺丙酸酯、以及PEG-琥珀酰亞胺丁酸酯(Olson，K.等，(1997)J.M.Harris & S.Zalipsky Eds.，Poly(ethylene glycol)，Chemistry & Biological Applications，pp 170-181，ACS，Washington，DC.；Harris，J.M.and Kozlowski，A.，US Patent No.5,672,662)。此外，PEG的苯并三唑碳酸鹽衍生物與蛋白的氨基形成穩(wěn)定的氨基甲酸乙酯鍵(Dolence，Eric K.，US Patent No.5,650,234)。也可以使用在其末端含有醛基的PEG。醛基可在比用于形成NHS酯更溫和的條件下與胺反應(yīng)。例如，PEG-丙醛可優(yōu)選使用(Harris，J.M.等(1984)J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22341；Kinstler，OlafB.等，U.S.Patent 5,824,784；Wirth，P.等(1991)Bioorg.Chem.19133)。此外，PEG的馬來酰亞胺衍生物可與巰基交聯(lián)(Goodson，R.J.&Katre，N.V.(1990)Bio/Technology 8343；Kogan，T.P.(1992)Synthetic Comm.22，2417)。也可以使用羧甲基-NHS衍生物、正亮氨酸-NHS衍生物、三乙磺酸鹽(酯)(tresylate)衍生物、環(huán)氧化物衍生物、羰基咪唑衍生物、以及PEG的PNP碳酸鹽衍生物。尤其是，PEG三乙磺酸酯以及PEG琥珀酰丙酸酯可以優(yōu)選使用。
化合物的結(jié)合可通過如下步驟來完成，通過以1mg蛋白/ml的濃度制備含有具血凝活性的包膜蛋白的病毒粒子，然后將優(yōu)選用來附著的化合物以大約0.1-100mg(優(yōu)選約1-50mg)附于該病毒粒子。舉例來說，通過在緩沖液(pH 8.5)中將SPA-PEG5K(1-5mg)或SPA-PEG20K(約10-20mg)與病毒(1mg蛋白)反應(yīng)，有可能顯著地降低病毒的血凝活性而仍然保持該病毒將藥物或基因?qū)爰?xì)胞的能力。由于化合物與蛋白的附著可受如反應(yīng)中使用化合物的量等反應(yīng)條件的影響，因此條件經(jīng)過適當(dāng)調(diào)整以便能夠顯著降低血凝活性并保持將藥物或基因?qū)爰?xì)胞的能力。
舉例說明，將化合物附著于負(fù)鏈RNA病毒時，化合物與病毒的量比表示為化合物的摩爾數(shù)量和病毒中該蛋白的重量，可設(shè)定為1-10μmol/mg蛋白(化合物病毒的比率)，更優(yōu)選2-8μmol/mg蛋白、而且更優(yōu)選3-8μmol/mg蛋白，例如約4μmol/mg。
為避免喪失將藥物或基因?qū)爰?xì)胞的能力，用于附著的化合物的分子量優(yōu)選100000Da或更低、更優(yōu)選80000Da或更低、更優(yōu)選60000Da或更低、而且更優(yōu)選50000Da或更低。特別是，分子量為40000Da或更低、更優(yōu)選35000Da或更低、更優(yōu)選30000Da或更低、更優(yōu)選25000Da或更低、更優(yōu)選20000Da或更低的化合物，是優(yōu)選用來保持導(dǎo)入能力并特異性降低血凝活性。
如實施例28中所示，在修飾血凝蛋白時，通過用脂肪族多胺如聚乙烯亞胺(PEI)進(jìn)一步修飾該蛋白，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入藥物或基因的能力甚至更加增強了?！癙EI”代表含有如下結(jié)構(gòu)的化合物-(CH2CH2NH)n[化合物3]其中n是2或更大的自然數(shù)。
例如，將PEI附著于負(fù)鏈RNA病毒的PEG-修飾衍生物上，能夠顯著增強其基因?qū)肽芰Α＿@種情況下，PEI對病毒的量比表示為化合物重量和病毒中該蛋白的重量，可設(shè)定為0.001比1(化合物/病毒比)，更優(yōu)選0.01-0.2、而且更優(yōu)選0.01-0.1。平均分子量為如25kDa-750kDa的PEI可優(yōu)選使用，但不僅限于此。
此外，在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，即使在由于化合物附著于血凝蛋白時藥物或基因?qū)胄Я档突騿适?，通過將具有細(xì)胞結(jié)合活性的化合物附著于含有該蛋白的復(fù)合物，能夠繼續(xù)保持導(dǎo)入效率。因此，已有可能在不限制將要附著于包膜蛋白的化合物分子量情況下，制備本發(fā)明中的藥物-載體組合物或基因-載體組合物。本發(fā)明提供藥物-載體組合物或基因-載體組合物，其中包括含有具血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白的細(xì)胞膜，其中(a)一種化合物附著于該蛋白；(b)與沒有該化合物附著的組合物相比，其血凝活性降低；(c)該組合物含有一個由該蛋白與含細(xì)胞結(jié)合活性的化合物一起形成的復(fù)合物；而且(d)該組合物具有將藥物或基因?qū)氚屑?xì)胞的能力。即使當(dāng)一種化合物結(jié)合于包膜蛋白來抑制血凝活性和基因?qū)?，通過再將配體摻入該化合物，仍有可能來抑制血凝活性同時仍保持基因?qū)肽芰Α！芭潴w”是一種結(jié)合于細(xì)胞表面受體的化合物，能夠活化受體功能。舉例來說，在使用抗體F(ab′)2片段(MW約50kDa)時，縮減結(jié)合抗體片段的量相對于殘余的血凝活性來說，仍能夠保持該病毒載體的基因?qū)肽芰?。然而，即使在血凝活性完全被抑制時，通過將該抗體與有細(xì)胞結(jié)合活性的配體(葉酸)結(jié)合，載體的基因?qū)肽芰纱蠓仍鰪?見實施例)。
在有細(xì)胞結(jié)合活性的化合物和具血凝活性包膜蛋白之間形成復(fù)合物，是指該化合物和該蛋白彼此之間通過共價或非共價鍵直接或間接地(例如通過另一個化合物)結(jié)合。鍵即可以是共價也可以是非共價的。舉例來說，組合物可包括含有具血凝活性的包膜蛋白的細(xì)胞膜，和具細(xì)胞結(jié)合活性的化合物。有細(xì)胞結(jié)合活性的化合物必須暴露于該復(fù)合物的表面。例如，當(dāng)該復(fù)合物是病毒粒子時，該蛋白和該化合物可存在于該病毒包膜表面。另外，當(dāng)復(fù)合物是脂質(zhì)體時，該蛋白和該化合物可存在于該脂質(zhì)體的表面。為了將有細(xì)胞結(jié)合活性的化合物與復(fù)合物相結(jié)合，舉例來說，該化合物可與該復(fù)合物中包括的所需包膜蛋白交聯(lián)，或優(yōu)選與具血凝活性的包膜蛋白交聯(lián)。交聯(lián)可通過使用所需的功能基團，以與上述相似的方法來形成。另外，如果化合物是蛋白質(zhì)，它可以作為包膜蛋白在包膜中表達(dá)，或作為與該復(fù)合物所含包膜蛋白的融合蛋白的形式表達(dá)。在一個優(yōu)選的實施例中，有細(xì)胞結(jié)合活性的化合物，通過共價或非共價鍵直接與附著于具血凝活性的包膜蛋白的化合物結(jié)合。該有細(xì)胞結(jié)合活性的化合物也可以是與附著于具血凝活性的包膜蛋白相同的化合物。本發(fā)明涉及用于制備藥物-載體組合物或基因-載體組合物的方法，其包括含有血凝活性降低了的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白的細(xì)胞膜，其中的方法包括下列步驟(a)將化合物與該蛋白相接觸；和(b)將該蛋白和該化合物相結(jié)合；而且進(jìn)一步(i)將有細(xì)胞結(jié)合活性的化合物附著于該化合物。步驟(i)可在步驟(a)之前進(jìn)行，或與步驟(a)或步驟(b)同時進(jìn)行，或在步驟(a)或步驟(b)之間進(jìn)行，或在步驟(b)之后進(jìn)行。步驟(i)優(yōu)選在步驟(a)之前進(jìn)行。另外，已經(jīng)經(jīng)過步驟(i)的化合物可以附著于具血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白。
任何優(yōu)選的化合物可用作有細(xì)胞結(jié)合活性的化合物，只要它們能夠與細(xì)胞表面結(jié)合，并因此能協(xié)助本發(fā)明中的組合物將藥物或基因?qū)爰?xì)胞。例如，結(jié)合于細(xì)胞表面蛋白或細(xì)胞表面糖鏈的化合物可用作為此類化合物。具體的例子有病毒包膜蛋白、天然或合成配體、激素或細(xì)胞粘附因子。特別地，葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、促紅細(xì)胞生成素、抗體、外源凝集素、半乳糖、甘露糖等也可使用。
它們之中，本發(fā)明的葉酸經(jīng)證實在保持本發(fā)明中組合物所含復(fù)合物的藥物或基因?qū)肽芰ι鲜欠浅Ｓ行У?。本發(fā)明提供了藥物-載體組合物或基因-載體組合物，其中包括含有具血凝活性負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白的細(xì)胞膜，其中(a)一種化合物附著于該蛋白；(b)與沒有該化合物附著的組合物相比，其血凝活性降低；(c)該組合物含有由該蛋白與葉酸形成的復(fù)合物；而且(d)該組合物具有將藥物或基因?qū)氚屑?xì)胞的能力。特別地，葉酸優(yōu)選直接與附著于該蛋白的化合物相結(jié)合。
當(dāng)使用有細(xì)胞結(jié)合活性的化合物制備本發(fā)明中的組合物時，一種特別優(yōu)選待附著于具血凝活性包膜蛋白的化合物是與該蛋白結(jié)合的抗體。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的組合物是含有與抗體或其片段相結(jié)合的具血凝活性包膜蛋白的組合物，其中包膜蛋白與有細(xì)胞結(jié)合活性的化合物形成復(fù)合物。也就是說，本發(fā)明涉及藥物-載體組合物或基因-載體組合物，其中包括含有具血凝活性負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白的細(xì)胞膜，其中(a)能與該蛋白結(jié)合的抗體或其片段結(jié)合于該蛋白；(b)與沒有化合物附著的組合物相比，其血凝活性降低；(c)該組合物含有由該蛋白與有細(xì)胞結(jié)合活性的化合物形成的復(fù)合物；而且(d)該組合物具有將藥物或基因?qū)氚屑?xì)胞的能力。有細(xì)胞結(jié)合活性的化合物更優(yōu)選直接與該抗體或其片段相結(jié)合。
本發(fā)明中，抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。它們還包括用本發(fā)明中蛋白對實驗動物如家兔進(jìn)行免疫所獲得的抗血清、所有種類的多克隆抗體和單克隆抗體、而且還有人抗體、以及通過基因重組得到的人源化抗體。多克隆抗體的制備是通過，舉例來說，制備具血凝活性的包膜蛋白或其部分肽段；然后用該蛋白或多肽作為抗原免疫家兔、山羊、綿羊等來制備的。具血凝活性的包膜蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其片段可用作抗原多肽。為了用于免疫，抗原多肽可適當(dāng)?shù)嘏c其它蛋白相結(jié)合，如載體蛋白如匙孔血藍(lán)蛋白、白蛋白。單克隆抗體的制備可通過使用免疫后小鼠或大鼠的脾細(xì)胞，獲得可制備單克隆抗體的雜交瘤來完成。抗體可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法來制備(Harlow，E.and Lane，D.(eds.)，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1988；Shepherd，P.and Dean，C.(eds.)，Monoclonal AntibodiesA Practical Approach(Practical Approach Series，227)，Oxford Univ Press，1999)。多克隆抗體可以從血清中純化，單克隆抗體可從雜交瘤培養(yǎng)上清液或用雜交瘤接種的動物的腹水中純化，所述純化可使用普通的生化技術(shù)如硫酸銨分級、蛋白G瓊脂糖柱、有固定抗原的親合柱等。本發(fā)明中，與具血凝活性包膜蛋白的外部區(qū)域(細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)結(jié)合的抗體優(yōu)選是單克隆抗體，且可更優(yōu)選可使用實施例12中所述的HN-1(Miura等，Exp.Cell Res.，1982，141，409-420)。本發(fā)明中的抗體可以是抗體片段，只要它們可與具血凝活性的包膜蛋白(抗原蛋白)相結(jié)合，且包括例如，F(xiàn)ab、Fab(t)、Fab′、F(ab′)2、抗體可變區(qū)片段(Fv)、單鏈Fv(scFv)、或其修飾衍生物。Fab是復(fù)合物，由一條含有抗體H鏈可變區(qū)的多肽鏈和一條含有L鏈可變區(qū)的多肽鏈組成。這些多肽彼此結(jié)合形成抗原結(jié)合位點(單價的)。盡管Fab常規(guī)是通過用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白而獲得，在本發(fā)明中，含有與之等同結(jié)構(gòu)的片段也為Fab。具體地說，F(xiàn)ab包括一個二聚體蛋白，其中免疫球蛋白L鏈和含有一個H鏈可變區(qū)(Vh)和CH1的多肽鏈結(jié)合在一起。Fab’(通過用胃蛋白酶消化免疫球蛋白然后裂解H鏈間的二硫鍵而獲得)、Fab(t)(通過用胰蛋白酶消化免疫球蛋白獲得)等也含有與Fab的結(jié)構(gòu)等同的結(jié)構(gòu)。此外，F(xiàn)(ab′)2是指恒定區(qū)被刪除的抗體，或含有其等同結(jié)構(gòu)的蛋白復(fù)合物，而且具體是指由兩種復(fù)合物組成的蛋白復(fù)合物，其由一條含有抗體H鏈可變區(qū)的多肽鏈和一條含有L鏈可變區(qū)的多肽鏈組成。F(ab′)2是一個含有兩個抗原結(jié)合位點的二價抗體。F(ab′)2常規(guī)是通過用胃蛋白酶在pH4左右消化抗體獲得，并且含有H鏈鉸鏈區(qū)。不過，F(xiàn)(ab′)2可用用其它蛋白酶消化、或用藥物裂解，或人工設(shè)計。scFv代表一種多肽，其中抗體H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)包含在一條多肽鏈里。H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)經(jīng)一個適當(dāng)長度的間隔物連接，彼此結(jié)合以形成抗原結(jié)合位點。這種抗體片段可通過如“NewBiochemistry Experiments(Shin Seikagaku Jikken Kouza)12，Japanese Societyof Biochemistry，ed.Molecular Immunology III pp 185-195(Tokyo KagakuDojin)”和/或“Current Protocols in Immunology，Volume 1，(John Wiley&Sons，Inc.)”所述的方法制備?？贵w片段可通過用蛋白水解酶如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、或胰蛋白酶消化抗體來獲得。另外，抗體片段可通過鑒定可變區(qū)的氨基酸序列，然后以重組蛋白形式表達(dá)這些序列來制備。此外，抗體也可包括人源化抗體或人抗體。抗體可通過用蛋白A柱、蛋白G柱等親合層析來純化。
本發(fā)明中，特別優(yōu)選將含有抗體可變區(qū)(抗原結(jié)合區(qū))的片段附著于具血凝活性的包膜蛋白上。任何含有抗體H鏈和/或L鏈可變區(qū)的優(yōu)選片段都可用作這種片段，包括如Fab、Fab(t)、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv或它們的修飾衍生物。
本發(fā)明中，將要轉(zhuǎn)入細(xì)胞的藥物可以是任何優(yōu)選的化合物，如天然存在的化合物、合成化合物、無機或有機化合物、以及小分子或大分子化合物。此外，通過本發(fā)明中組合物遞送的基因可以是任何優(yōu)選的核酸，具體例子為諸如DNA或RNA的核酸，以及它們的衍生物。核酸可以是環(huán)狀和線狀的單或雙鏈的脫氧核糖核酸或核糖核酸。核酸衍生物的實例有硫代磷酸酯(phosphothioate)和二硫代磷酸酯(phosphodithioate)。本發(fā)明中組合物遞送的特殊藥物或基因?qū)嵗蟹戳x核酸(Drug Delivery System，10，91-97，1995)、誘殺物(decoy)(Journal of Biological Chemistry，267，12403-12406，1994)、核酶(Drug Delivery System，10，91-97，1995)、三鏈DNA(Saibokogaku，vol.13，No.4，277-285，1994)、質(zhì)粒DNA(Methods Enzymology，221，317-327，1993)、RNA載體；以及這些物質(zhì)和載體的復(fù)合物(Proceedings of NationalAcademy of Sciences of United States of America，89，7934-7938，1992)或蛋白(Journal of Biological Chemistry，266(6)，3361-3364，1991)；以及抗癌藥物、抗病毒藥物、毒素(diphtheria toxin(Biochim Biophys Acta，1192，253-262，1994)；賴氨酸(Biochim Biophys Acta，1070，246-252，1991))、酶(Immunology，81，280-284，1994)、和其它優(yōu)選生物活性物質(zhì)。優(yōu)選基因也可以插入基因組核酸中并由重組病毒表達(dá)。
本發(fā)明中組合物可用于對活體直接給藥(體內(nèi))或間接給藥(離體)，而且可在活體體外(體外)給藥入細(xì)胞內(nèi)。在體內(nèi)應(yīng)用中，組合物可通任何優(yōu)選的給藥途徑給藥，只要藥物或基因可到達(dá)靶細(xì)胞或組織。根據(jù)活性成分的特性，給藥可通過如口服、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、支氣管、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或皮下來完成，但不限于這些途徑。而且，該組合物可以系統(tǒng)地或局部地給藥。在體外(包括離體)給藥中，本發(fā)明中組合物是附加的以便于與靶細(xì)胞接觸，例如它們可加入細(xì)胞培養(yǎng)基。特別是因為本發(fā)明中組合物在血液中非常穩(wěn)定，它們可用于給藥到血液內(nèi)如靜脈內(nèi)注射的注射劑。
通過本發(fā)明的方法制備的，包括含有具血凝活性負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白的細(xì)胞膜的復(fù)合物，可以根據(jù)需要與優(yōu)選的并且可藥用的載體或運輸工具(vehicles)相結(jié)合?！翱伤幱玫妮d體或運輸工具”是可與該復(fù)合物一起給藥的物質(zhì)，并且其不會明顯抑制通過該復(fù)合物將藥物或基因?qū)爰?xì)胞?；衔锟赏ㄟ^適當(dāng)?shù)嘏c如無菌水、生理鹽水、培養(yǎng)液、血清、以及磷酸鹽緩沖的鹽溶液(PBS)混合來配制。當(dāng)負(fù)鏈RNA載體在雞蛋中增殖后，該組合物可能含有尿囊液。此外，本發(fā)明中組合物可含有載體或運輸工具如去離子水和5％葡聚糖水溶液；脂質(zhì)體膜穩(wěn)定劑(例如固醇類如膽固醇)；抗氧化劑(如生育酚和維生素E)；還有植物油、懸浮試劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、殺生物劑等。
此外，防腐劑和其它添加劑可添入其中。本發(fā)明中組合物可以是任何形式，如水溶液、膠囊、懸液、或糖漿、且也可是溶液形式、凍干制劑或氣溶膠。在凍干制劑的情況下，本發(fā)明中組合物可包括山梨糖醇、蔗糖、氨基酸、各種蛋白質(zhì)等作為穩(wěn)定劑。含有負(fù)鏈RNA病毒載體的組合物易于用作試劑和藥物。
本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)熟練技術(shù)人員可恰當(dāng)?shù)貨Q定本發(fā)明中組合物的劑量，其根據(jù)疾病、病人體重、年齡、性別、以及癥狀、給藥目的、組合物劑量、給藥方法、要導(dǎo)入的藥物或基因類型等而不同。該組合物包含感染性負(fù)鏈RNA病毒時，優(yōu)選由可藥用的載體給藥，優(yōu)選劑量在約105CIU/ml-約1011CIU/ml范圍間，更優(yōu)選在約107CIU/ml-約109CIU/ml間，并且最優(yōu)選在約1×108CIU/ml-約5×108CIU/ml間。在人類中，單一劑量優(yōu)選在2×109CIU-2×1010CIU范圍內(nèi)，且可在臨床可接受副作用的范圍內(nèi)一次或多次給藥。對每日給藥次數(shù)也如此。對于非人動物，根據(jù)靶動物和人類之間的體重比或給藥靶位點的體積比(例如平均值)，可從上述劑量中計算出其給藥量。
將用本發(fā)明中組合物給藥的動物沒有特別的限制，舉例來說可以是，鳥類、哺乳動物、以及其它脊椎動物、如雞、鵪鶉、小鼠、大鼠、狗、豬、貓、牛、兔、綿羊、山羊、猴、和人。當(dāng)本發(fā)明中的方法用于體外(包括離體)時，舉例來說可以使用如人類、非人哺乳動物以及鳥。當(dāng)本發(fā)明中的方法用于體內(nèi)時，尤其可以使用非人哺乳動物和鳥類。
此外，本發(fā)明涉及可與具血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白結(jié)合的抗體或其片段，其中結(jié)合于該細(xì)胞的化合物連接在該抗體或其片段上。這種抗體或其片段，通過與負(fù)鏈RNA病毒或其加工產(chǎn)物的吸附作用結(jié)合于包膜蛋白，并因此降低血凝活性，同時細(xì)胞結(jié)合化合物保持著幫助病毒吸附于細(xì)胞的功能。因此，這樣一種抗體或其片段在制備本發(fā)明中藥物-載體組合物或基因-載體組合物中非常有用。如前說述，該抗體或其片段可以是任何含有抗體L鏈和/或H鏈可變區(qū)的優(yōu)選片段。更明確地說，它們優(yōu)選Fab、Fab(t)、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv等。在其中，F(xiàn)(ab′)2是特別優(yōu)選使用的。至于細(xì)胞結(jié)合化合物，細(xì)胞表面受體的配體是特別優(yōu)選的，諸如葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、促紅細(xì)胞生成素、抗體、凝集素、半乳糖、甘露糖等。
本發(fā)明中的抗體或其片段，可與可藥用的載體一起形成一個組合物。這類載體包括，舉例說如水、乙醇、甘油、鹽、蛋白、以及明膠、以及pH緩沖試劑、穩(wěn)定劑、混懸劑、和本領(lǐng)域內(nèi)所知的防腐劑。
此外，本發(fā)明涉及試劑盒，其包括(a)與具血凝活性負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白結(jié)合的抗體或其片段，其中有一種化合物結(jié)合在該抗體或其片段上；和(b)藥物-載體組合物或基因-載體組合物，其包括含有包膜蛋白的細(xì)胞膜。藥物-載體組合物或基因-載體組合物的實施例包括含有所述包膜蛋白的細(xì)胞膜，包括感染性病毒粒子、滅活病毒、或含有病毒包膜的脂質(zhì)體。感染性病毒粒子可以是，例如負(fù)鏈RNA病毒或其它含有負(fù)鏈RNA病毒的具血凝活性包膜蛋白的病毒。血凝活性降低了的藥物-載體組合物或基因-載體組合物可通過如下步驟來制備，將上述抗體或其片段加入這些病毒中，使這些抗體或其片段結(jié)合在包膜蛋白上。舉例來說，血凝活性可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂?，以便增強其在血液中的穩(wěn)定性以便進(jìn)行體內(nèi)給藥。這些組合物可方便地通過在使用前混合試劑盒成分來制備，從而產(chǎn)生一種非常易于使用的遞藥系統(tǒng)。
附圖簡述圖1是一個示例圖，顯示用TPEG-和SPA-PEG修飾試劑對SeV載體的包膜蛋白(HN和F蛋白)進(jìn)行的PEG-修飾。
圖2是測定SeV載體和TPEG-修飾的SeV載體對大鼠血液的溶血活性的結(jié)果(37℃15分鐘)曲線。
圖3是一個柱圖，顯示SeV載體和TPEG-修飾的SeV載體在大鼠血液中穩(wěn)定性的測量結(jié)果。在37℃分別處理1、15和30分鐘后，分離血漿并用其感染HeLa細(xì)胞。24小時后，定量測量LacZ基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示為三次測定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖4是照片，顯示SeV載體和TPEG-修飾的SeV載體經(jīng)SDS電泳然后進(jìn)行銀染的結(jié)果。箭頭指示HN蛋白和F蛋白的電泳位置。0泳道對應(yīng)于SeV載體，而8-10泳道分別對應(yīng)于表2中的8-10號樣品。
圖5是一系列照片，顯示在兔抗SeV抗血清(稀釋10-、100-和1000-倍的血清)存在下，將SeV載體和SPA-PEG5K-修飾的SeV載體導(dǎo)入LLCMK2細(xì)胞后，利用X-gal染色法評估LacZ表達(dá)水平的結(jié)果。
圖6是示例圖，說明了用葉酸-結(jié)合的抗HN單克隆抗體對SeV載體中所含HN蛋白的選擇性修飾。
圖7是圖解，表示了通過NHS法制備的，用HN-1、HN-1/F(ab′)2、或其葉酸結(jié)合的抗體所修飾的SeV載體的HAU。y-軸代表抗體濃度，而x-軸代表血凝活性的對數(shù)(log2(HAU))。
圖8是柱圖，表示SeV載體、HN-1-修飾的SeV載體、以及葉酸-結(jié)合的HN-1-修飾的SeV載體對雞紅細(xì)胞的溶血活性。所得結(jié)果對應(yīng)的SeV載體濃度為1×107、1×108和1×109pfu/ml。修飾載體即用100μg/ml抗體修飾1×109pfu/ml的每種SeV載體。圖中x-軸是在570nm的吸收值，顯示測量的釋放血紅蛋白量。
圖9是柱圖，表示在用SeV載體、HN-1-修飾的SeV載體和葉酸-結(jié)合的HN-1-修飾的SeV載體感染KB細(xì)胞兩天后LacZ基因的表達(dá)。在感染試驗中，過量葉酸條件是通過在培養(yǎng)基中添加1mM的葉酸來創(chuàng)造的。結(jié)果表示為三次測定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖10是柱圖，表示在用經(jīng)HN-1、HN-1/F(ab′)2或其葉酸結(jié)合衍生物修飾的SeV載體感染KB細(xì)胞兩天后LacZ基因的表達(dá)。結(jié)果表示為三次測定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖11是圖示了了通過EDC法制備的用HN-1或葉酸結(jié)合的HN-1修飾的SeV載體，在不同量抗體存在下的HAU變化。y-軸代表抗體濃度，而x-軸代表紅細(xì)胞聚集活性的對數(shù)(log2(HAU))。
圖12是圖示了PEG-修飾的SeV的滴度改變。SeV用不同量的PEG修飾，并且對修飾后SeV載體的相對感染效率(％)進(jìn)行了檢測。
圖13是圖示了PEG-修飾SeV的HA活性的變化。SeV用不同量PEG修飾，并對修飾后SeV載體的HA活性進(jìn)行了檢測。
圖14是柱圖，顯示了PEG-修飾SeV的感染力和HA活性之間的相關(guān)性，說明與HA活性的相比，PEG-修飾可相對提高感染力。
圖15是一系列照片，顯示用銀染法分析PEG-修飾SeV組成型蛋白的結(jié)果。隨著參與反應(yīng)PEG量的增加，來自F和HN蛋白的條帶減少，并且在大分子級分中有其它條帶出現(xiàn)。
圖16是一系列照片，顯示通過Western印跡分析PEG-修飾SeV組成型蛋白的結(jié)果。
圖17出示一系列柱圖和照片，顯示PEG-修飾SeV對中和抗體的抗性?？剐允窃谛揎椀腟eV總病毒粒子數(shù)(總蛋白量)固定的條件下進(jìn)行比較的。
圖18說明對PEG10K-修飾SeV的體內(nèi)評價，顯示了修飾SeV的給藥方案和給藥條件，以及在抗SeV抗體滴度的變化。
圖19是一系列照片，表示了對PEG10K-修飾SeV的體內(nèi)評價，顯示了將圖18中修飾SeV的體內(nèi)給藥后，導(dǎo)入的基因在肺部的表達(dá)。
圖20是一系列柱圖，顯示在4℃貯存條件下PEG-修飾SeV感染力的維持效果。
圖21是柱圖，顯示聚乙烯亞胺(PEI750K)的修飾作用。PEI提高了PEG-修飾SeV的感染力。
實施例下文中，本發(fā)明將使用實施例來詳細(xì)描述，但不能解釋為局限于這些實施例。此處引用的文獻(xiàn)的全部內(nèi)容作為其一部分并入文中。
含NLS-LacZ基因SeV載體的制備和純化載有含一個核定位信號的LacZ基因的NLS-LacZ/SeV是通過以前公開的方法(Kato等，Genes Cells，1996，1，569-579；Hasan等，J.Gen.Virol.，1997，78，2813-2820)制備的。此載體接種于含10日齡胚的雞蛋中。在35.3℃溫育三天以后，收獲尿囊液，然后以4,000rpm離心15分鐘。所得上清液接著在10,000rpm離心一小時以沉淀該載體。在PBS中重懸后，將該載體在蔗糖密度梯度(30％/50％)上分層，然后在25,000rpm離心一小時(在Beckmanrotor SW28中)。收獲在蔗糖交界面的載體，離心、沉淀，然后在PBS中重懸浮從而制備純化載體(這以后描述為SeV載體)的貯存溶液。該載體的蛋白濃度通過BCA蛋白測定法(Pierce)測定，將溶解后的載體與等體積2％SDS溶液混合作為樣品，用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)。血凝單位(HAU)按照下面描述的來測定。在96-孔圓底板(Asahi Technoglass)中，該載體用PBS連續(xù)稀釋兩倍(50μl每孔)。每孔加入50μl用PBS洗過的1％雞紅細(xì)胞溶液，4℃溫育一小時，然后測定。HAU表示為引起血凝的最大載體稀釋比率。此外，利用下述公式可計算噬斑形成單位(pfu)1HAU的SeV＝約106pfu/ml。對于純化的載體來說，該公式如下1mg蛋白/ml＝4096-5120HAU/ml＝約5×109pfu/ml。
TPEG-修飾的SeV載體的制備實施例1中的SeV載體貯存溶液在PBS中稀釋至2mg蛋白/每ml。在0.5ml此溶液中加入0.5ml 0.5M的硼酸緩沖液(pH8.5)以制備出pH8.5的1mg蛋白/ml的溶液。在攪拌下以小量將1mg Tresyl-活化的PEG試劑(TPEG，MW5000)(Shearwater Polymers)加入上述溶液中，在室溫下反應(yīng)90分鐘(圖1)。反應(yīng)完后，反應(yīng)混合物用冰冷的PBS(14ml)稀釋，然后通過在15,000rpm離心一小時回收載體(在Beckman rotor SW28.1中)。載體重懸于PBS(0.8ml)中，并獲得TPEG-修飾的SeV載體。該修飾載體的蛋白濃度及HAU如實施例1中測定。
利用TPEG-修飾的SeV載體進(jìn)行體外基因表達(dá)實施例1中的SeV載體貯存溶液在PBS中稀釋至1×105pfu/ml。實施例2中TPEG-修飾SeV載體溶液和非修飾SeV載體溶液的蛋白濃度都是經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化的，因此兩種載體提供等數(shù)目的病毒粒子。實驗前一天，將HeLa細(xì)胞(來自人子宮頸癌)以5×104細(xì)胞/孔培養(yǎng)(在1ml/孔的并補加有10％滅活胎牛血清(FCS)的MEM培養(yǎng)基中)于12孔板(Sumitomo Bakelite)上。培養(yǎng)基減少至0.5ml，每孔中加入50μl上述稀釋載體溶液(當(dāng)轉(zhuǎn)換成SeV載體以后，等同于5×103pfu/孔，moi＝0.1)，在5％CO2存在時37℃下進(jìn)行感染。一小時后，去掉載體細(xì)胞用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩遍。將新鮮培養(yǎng)基(2ml)加入細(xì)胞，然后在5％CO2存在、37℃下進(jìn)一步溫育24小時。通過使用Galacto-LightPlusTM(Tropix)方法測量LacZ基因的表達(dá)，而細(xì)胞蛋白用BCA法(Pierce)來測定。結(jié)果表示為光單位(RLU/μg蛋白)。
表1顯示TPEG-SeV載體的HAU以及該載體的基因表達(dá)水平。對于同樣的蛋白濃度，也就是同樣的病毒粒子數(shù)，TPEG-SeV載體的HAU是SeV載體的HAU的1/2000或更少。與此同時，對于同樣病毒粒子數(shù)，TPEG-SeV載體在HeLa細(xì)胞中保持約50％的基因表達(dá)水平。因此，現(xiàn)在已有可能制備一種載體，其中僅HAU顯著降低，而其將基因?qū)爰?xì)胞的能力卻沒有嚴(yán)重?fù)p害。
表1
溶血活性測定實驗中使用新鮮血液，使用肝素化注射器采集自處于乙醚麻醉下的SD品系大鼠頸動脈。實施例1中的SeV載體和實施例2中的TPEG-修飾的SeV載體在PBS中稀釋，制備一系列含1-1000μg蛋白每ml的溶液。
載體稀釋溶液(50μl)和大鼠血液(50μl)混合然后在37℃溫育15分鐘。在4℃下于冰上冷卻后，血漿通過離心分離。通過570nm(OD570)吸收值測量血色素釋放入血漿的量。利用PBS代替載體溶液時的OD570用作陰性對照。用蒸餾水所得的OD570作為陽性對照(100％溶血)。載體的溶血活性利用下式計算溶血活性(％)＝[(載體溶液的OD570)-(PBS的OD570)]/[(蒸餾水的OD570)-(PBS的OD570)]×100。
如圖2所示，SeV載體顯示了強的濃度依賴溶血活性。而另一方面，發(fā)現(xiàn)TPEG-修飾的SeV載體溶血活性非常地低。1000μg的TPEG-修飾SeV載體具有的溶血活性相當(dāng)于5μg SeV載體的，說明經(jīng)TPEG-修飾載體安全性提高了約200倍。
大鼠血液中穩(wěn)定性試驗實施例1中的SeV載體用PBS稀釋至1×108pfu/ml。實施例2中的TPEG-修飾SeV載體用PBS稀釋使得其病毒蛋白濃度與SeV載體的濃度相等。250μl稀釋載體溶液和250μl新鮮SD大鼠(雄性)血液混合，并37℃溫育。在預(yù)定時間后，收集80μl血液樣品，在4℃離心收集血漿。用50μl通過10μl血漿在PBS中稀釋50倍制備的溶液，通過實施例3中的方法測定LacZ基因在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)。
如圖3所示，SeV載體在血液處理后穩(wěn)定性立即顯著降低，而且15分鐘的血液處理將其基因表達(dá)能力降低至未經(jīng)處理SeV載體的1/1000。另一方面，TPEG-修飾的SeV載體在血液中的穩(wěn)定性提高了，表明與非修飾的載體相比其顯示了非常高的表達(dá)能力。
SPA-PEG2K-修飾SeV載體的制備實施例1中的SeV載體貯存溶液用PBS稀釋，調(diào)整濃度至2mg蛋白/ml。該溶液用0.5M硼酸緩沖液(pH8.5)稀釋兩倍，以制備出1mg/ml蛋白溶液。在攪拌下將琥珀酰亞胺基丙酸衍生物PEG試劑(分子量2000)(SPA-PEG2K，Shearwater Polymers)(1、2或4mg)以小量加入上述溶液中，在室溫反應(yīng)30分鐘(圖1)。反應(yīng)完后，反應(yīng)混合物用冰冷的PBS(14ml)稀釋，然后在13000rpm離心一小時(在Beckman rotor SW28.1中)。回收的載體接著重懸于0.8ml PBS中，以獲得SPA-PEG2K-修飾的SeV載體(表2，樣品號1-3)。修飾載體的蛋白濃度按照實施例1來測定。
表2
SPA-PEG5K-修飾SeV載體的制備實施例6中的SPA-PEG2K用SPA-PEG5K(MW5000)(ShearwaterPolymers)代替。使用1、2.5、5或10mg的PEG反應(yīng)量，進(jìn)行同樣的反應(yīng)和純化來獲得SPA-PEG5K-修飾的SeV(表2，樣品號4-7)。
SPA-PEG20K-修飾SeV載體的制備實施例6中的SPA-PEG2K用SPA-PEG20K(MW20000)(ShearwaterPolymers)代替。使用10、20或40mg的PEG反應(yīng)量，進(jìn)行同樣的反應(yīng)和純化來獲得SPA-PEG20K-修飾的SeV(表2，樣品號8-10)。
圖4顯示SPA-PEG20K-修飾的SeV載體經(jīng)SDS電泳，然后對每一個組成型蛋白進(jìn)行銀染的結(jié)果。隨著參與反應(yīng)PEG量的增加，來自HN蛋白的條帶減少，并且同時在較高分子量級分有條帶出現(xiàn)。這些條帶認(rèn)為來自聚合的PEG-結(jié)合的HN蛋白。另一方面，F(xiàn)蛋白帶也發(fā)現(xiàn)有少量減少。這些結(jié)果顯示在HN和F這兩個蛋白中，HN蛋白是在SeV外膜的PEG修飾中主要被修飾的。
SPA-PEG-修飾SeV載體的HAU以及該載體在體外的基因表達(dá)實施例1中SeV載體以及實施例6、7和8(樣品號1-10)中PEG-修飾的SeV載體的HAU，通過使用實施例1所述方法來測量。此外，在HeLa細(xì)胞中的LacZ基因表達(dá)通過使用實施例3中所述方法來測定，但MOI變?yōu)?.5，溫育天數(shù)變?yōu)閮商煲酝狻?br> 表2顯示HAU和LacZ表達(dá)結(jié)果。隨著PEG的反應(yīng)量增加，所得修飾SeV載體的HAU減少。盡管PEG-修飾SeV載體的LacZ基因表達(dá)與SeV載體相比減少了，但通過如表2所示限制PEG的反應(yīng)量，在抑制基因表達(dá)能力的降低同時，HAU可大幅度降低。因此，通過選擇修飾條件，發(fā)現(xiàn)可獲得具有足夠基因表達(dá)能力的修飾載體。
SPA-PEG-修飾SeV載體在紅細(xì)胞存在下的體外基因表達(dá)HeLa細(xì)胞如實施例3中制備。在馬上開始實驗前去掉培養(yǎng)基，取而代之的是加入300μl經(jīng)PBS洗過、調(diào)整為1×109細(xì)胞/ml的雞紅細(xì)胞。在對照組中，PBS用來代替紅細(xì)胞溶液。將實施例1中的SeV載體或表2中的PEG-修飾SeV載體(樣品號1、2、4、5、6、8和9)以各50μl加入孔中，在37℃短時間感染細(xì)胞5分鐘。加入載體的量根據(jù)表2調(diào)整，使得表達(dá)效率相同。對于實施例3，48小時后處理細(xì)胞以測定LacZ基因表達(dá)水平。
表3顯示在紅細(xì)胞存在下每種樣品的基因表達(dá)水平。結(jié)果表示為相對比率(以沒有紅細(xì)胞存在的表達(dá)水平作100)。對于SeV載體，紅細(xì)胞的存在將基因表達(dá)水平降低至對照的約20％。另一方面，在PEG-修飾樣品中，伴隨著載體與紅細(xì)胞相互作用的減少HAU降低，說明即使在紅細(xì)胞存在下也有高的基因?qū)胄?。這些結(jié)果說明，在臨床方案中，PEG-修飾的SeV載體可以允許通過血液介導(dǎo)的快速基因?qū)搿?br> 表3

在中和抗體存在下通過SPA-PEG5K-修飾SeV載體進(jìn)行基因?qū)?1)SPA-PEG5K-修飾的SeV載體的制備NLS-LacZ/SeV載體如實施例1來制備和純化，從而制備出其貯存溶液。利用實施例7的方法，該載體與5mg SPA-PEG5K反應(yīng)，然后制備得到SPA-PEG5K-修飾的SeV載體。該載體對LLCMK2細(xì)胞的滴度按下面所述測定。在試驗前一天，將LLCMK2細(xì)胞以1×106細(xì)胞/孔(在2ml/孔補加有10％FCS的MEM培養(yǎng)基中)鋪于6孔板(Sumitomo Bakelite)上。載體在含1％FCS的PBS中稀釋至濃度為1mg蛋白/ml，然后進(jìn)一步制備分別稀釋10倍的連續(xù)稀釋系列溶液。去掉上述細(xì)胞的培養(yǎng)基后，每孔中加入1ml稀釋載體溶液，在5％CO2存在時37℃下進(jìn)行感染一小時。去掉載體溶液后，細(xì)胞用培養(yǎng)基洗滌，以2ml/孔加入新鮮培養(yǎng)基。在5％CO2存在、37℃下進(jìn)一步溫育。兩天后去掉培養(yǎng)基。用PBS洗滌后，表達(dá)LacZ基因的細(xì)胞用β-Gal染色試劑盒進(jìn)行X-gal染色。計數(shù)一個孔的任何十個隨機點的200x放大視野內(nèi)的感染細(xì)胞數(shù)目。根據(jù)平均細(xì)胞數(shù)和該視野的面積，利用下述公式可計算出該孔中總的滴度LacZ感染滴度(CIU/ml)＝(感染細(xì)胞數(shù))×854.865×(稀釋比例)結(jié)果，SeV載體和SPA-PEG5K-修飾的SeV載體的滴度分別為1.4×1010CIU/ml和2.7×109CIU/ml。
(2)在中和抗體存在下的基因?qū)胗肞BS稀釋實施例11-(1)中的SeV載體和SPA-PEG5K-修飾的SeV載體，調(diào)整滴度至1×107CIU/ml。通過用SeV(在56℃處理一小時)免疫兔子制備所得的抗SeV抗血清經(jīng)10-、100-和1000-倍稀釋后的溶液或PBS(每個取30μl)加入30μl載體溶液中，并在室溫溫育一小時。在試驗前一天，將LLCMK2細(xì)胞以2×105細(xì)胞/孔(在1ml/孔補加有10％FCS的MEM培養(yǎng)基中)鋪于12孔板(Sumitomo Bakelite)上。培養(yǎng)基減少至0.5ml，每孔加入40μl上述抗血清處理的載體溶液，在存在5％CO2下，在37℃溫育一小時以感染細(xì)胞。接著兩天后，如實施例11-(1)用X-gal染色評估LacZ基因表達(dá)。
如圖5所示，在抗血清存在下SeV載體的基因?qū)胄曙@著降低。另一方面，SPA-PEG5K-修飾SeV載體即使在該抗血清存在下也可保持足夠的基因?qū)肽芰Α?br> 抗-HN單克隆抗體，即HN-1的制備和純化生產(chǎn)抗-HN單克隆抗體，即HN-1(Miura等，Exp.Cell Res.，1982，141，409-420)的雜交瘤細(xì)胞，在雜交瘤-SFM培養(yǎng)基(Gibco-BRL)中，5％CO2存在下于37℃連續(xù)傳代，并制備得到1000ml含2×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液。培養(yǎng)再持續(xù)兩個星期，然后通過在3000rpm離心10分鐘獲得上清液。該上清液隨后經(jīng)0.45μm的濾膜過濾。單克隆抗體用蛋白G柱層析純化。利用蠕動泵(peristaltic pump)以4.2ml/min的流速，將培養(yǎng)液上清通過經(jīng)20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)平衡過的5ml蛋白G柱(Pharmacia)，且所述抗體結(jié)合在柱上。用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)洗柱后，用0.1M甘氨酸鹽酸緩沖液(pH2.7)將抗體洗脫。洗脫液用1M Tris-HCl緩沖液(pH9.0)中和，然后通過超濾(Centriplus-20，分子量截流30,000Amicon)濃縮。使用經(jīng)PBS平衡好的PD-10脫鹽柱(Pharmacia)，用PBS交換緩沖液后，該溶液再次進(jìn)行超濾濃縮，然后得到160μl的HN-1 PBS溶液。以牛血清γ-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，蛋白濃度通過BCA蛋白分析法(Pierce)測定，結(jié)果為37.6mg/ml。
抗-HN單克隆抗體HN-1的F(ab′)2片段實施例12中純化的單克隆抗體HN-1以0.2M乙酸鹽緩沖液(pH4.5)稀釋，調(diào)整濃度為2mg蛋白/ml。將2.35ml在0.2M乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中調(diào)節(jié)濃度為0.1mg/ml的胃蛋白酶溶液(Sigma)加入2.35ml該蛋白溶液中，然后在37℃反應(yīng)21小時。用700μl 1N氫氧化鈉溶液中和該反應(yīng)混合物后，將PBS加入該溶液以調(diào)整總體積至25ml。該溶液上樣至用PBS平衡過的1ml蛋白A柱(Pharmacia)，沒有參加反應(yīng)的抗體吸附于柱上。通過柱子的級分回收后按照實施例12經(jīng)超濾濃縮。濃縮后的溶液使用PBS平衡過的Sephadex 75柱(Pharmacia)，通過凝膠過濾法來進(jìn)一步純化。純化溶液通過超濾濃縮，以回收HN-1的F(ab′)2片段(下文中縮寫為HN-1/F(ab′)2)的PBS溶液(300μl)。蛋白濃度按實施例12測定，所得HN-1/F(ab′)2測定為4.08mg/ml。
通過NHS法制備葉酸-結(jié)合的單克隆抗體(1)合成NHS-活化的葉酸合成通過Robert等的方法來完成(Joumal of Biological ChemistryFeb.4，269(5)，3198-3204，1994)。具體地，葉酸(Sigma)溶于二甲基亞砜(DMSO)，制備成50mg/ml的溶液。在此溶液中依次加入250μl三乙胺(Pierce)、470mg二環(huán)己基碳二亞胺(dicyclohexylcarbodiimide)(Tokyo Kasei Kogyo Co.，Ltd.)以及260mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(Sigma)。所得混合物在暗處室溫攪拌過夜。沉淀的副產(chǎn)物經(jīng)過濾除去，然后在攪拌下將濾液滴加入250ml二乙醚。黃色沉淀用醚重復(fù)清洗，然后減壓干燥以獲得NHS-活化的葉酸。
(2)制備葉酸結(jié)合的HN-1100μl含2.0mg/ml經(jīng)實施例12方法純化的HN-1溶液的PBS溶液，和100μl 0.5M的硼酸緩沖液(pH8.0)混合，然后用作反應(yīng)溶液。將2.5μl實施例14-(1)中含NHS-活化的葉酸(5mg或10mg/ml)的DMSO溶液，一滴滴地加入該反應(yīng)溶液中。然后在暗處室溫反應(yīng)一小時。未反應(yīng)的葉酸用經(jīng)PBS平衡的PD-10柱除去?；厥盏鞍准壏郑ㄟ^超濾濃縮以獲得葉酸結(jié)合的HN-1，接著根據(jù)實施例12測定蛋白濃度。
(3)葉酸結(jié)合的HN-1/F(ab′)2的制備用HN-1/F(ab′)2溶液代替HN-1，并使NHS-活化的葉酸濃度改變?yōu)?0mg/ml，接下來的反應(yīng)和純化按照實施例14-(2)來進(jìn)行，以獲得葉酸結(jié)合的HN-1/F(ab′)2。
葉酸結(jié)合的單克隆抗體修飾的SeV載體的HA活性實施例1的NLS-LacZ/SeV用PBS稀釋至1×108pfu/ml，然后以50μl每孔分配入一塊96孔圓底板中。通過實施例12的方法純化的HN-1；實施例13中的HN-1/F(ab′)2；以及實施例14中的葉酸結(jié)合的HN-1和葉酸結(jié)合的HN-1/F(ab′)2用PBS稀釋，調(diào)整其濃度至1-100μg蛋白/ml。50μl稀釋后的抗體溶液分別與這些載體混合，并且于室溫下放置30分鐘以制備經(jīng)修飾的載體(Fig.6)。然后用實施例1中的方法測定HAU。
圖7顯示了HAU測定的結(jié)果。在所有經(jīng)修飾的SeV載體中，HAU隨著所加抗體量的增加而減少，當(dāng)抗體濃度為10μg蛋白/ml或更高時變成無法檢測。從這些結(jié)果中看到，有可能制備以葉酸結(jié)合的抗體修飾的SeV載體，該載體與紅細(xì)胞的相互作用顯著降低。
以葉酸結(jié)合的單克隆抗體修飾的SeV載體的溶血活性實施例1的NLS-LacZ/SeV用PBS稀釋至1×109pfu/ml，然后以50μl每孔分配入96孔圓底板中。通過實施例12的方法純化的HN-1以及實施例14中葉酸結(jié)合的HN-1，用PBS稀釋至濃度為100μg蛋白/ml?？贵w稀釋液或PBS(各50μl)與載體混合，并于室溫放置30分鐘以制備經(jīng)修飾的載體。除了將實施例4的方法中的大鼠血用1×109細(xì)胞/ml的雞血代替，并將溫育時間變?yōu)?0分鐘外，溶血活性按前述方法檢測。
圖8顯示溶血活性測量結(jié)果。用HN-1和葉酸結(jié)合的HN-1修飾的SeV載體的溶血活性非常低，而且當(dāng)與SeV載體比較時，上述載體的溶血活性甚至比濃度為其1/100的SeV載體的溶血活性都低。
葉酸結(jié)合的單克隆抗體修飾的SeV載體的體外基因?qū)朐囼炌ㄟ^改變實施例15中SeV載體的滴度至1×107pfu/ml，抗體濃度至10μg/ml，制備修飾的載體。試驗前一天，將KB細(xì)胞(來自人鼻咽癌)以2×105細(xì)胞/孔(補加有10％FCS的無葉酸RPMI1640培養(yǎng)基中Gibco-BRL，1ml/孔)鋪板于12孔板。試驗前一小時，培養(yǎng)基用0.5ml無葉酸RPMI1640培養(yǎng)基或補加有1mM葉酸的同樣培養(yǎng)基替換。每孔中加入20μl上述載體，在5％CO2存在時在37℃感染細(xì)胞。三小時后，去掉載體，細(xì)胞用培養(yǎng)基洗兩遍，將每孔加入2ml新鮮培養(yǎng)基。然后在5％CO2存在下、在37℃溫育各孔48小時。LacZ基因的表達(dá)按照實施例3中方法測量。
圖9顯示LacZ基因在KB細(xì)胞中表達(dá)的結(jié)果。HN-1修飾的SeV載體的基因表達(dá)是未修飾SeV載體的1/100或更少，說明隨著HAU的減少基因?qū)胍矞p少。另一方面，與沒有葉酸的HN-1相比，觀察到對應(yīng)葉酸結(jié)合的HN-1的基因表達(dá)顯著增加，顯示約為未修飾SeV載體基因?qū)氲?5％。當(dāng)過量葉酸存在于培養(yǎng)基中時，觀察到利用葉酸結(jié)合的HN-1的基因?qū)氡灰种?。這表明通過葉酸結(jié)合的HN-1的基因?qū)氲陌l(fā)生，是由于作為配體結(jié)合于HN-1的葉酸與KB細(xì)胞的葉酸受體結(jié)合，接著由F蛋白介導(dǎo)融合而引起的。
當(dāng)抗體分子是HN-1/F(ab′)2時進(jìn)行的比較如圖10所示。只有當(dāng)葉酸結(jié)合于該抗體時，才能在HN-1/F(ab′)2和HN-1中都觀察到高水平的基因?qū)搿?br> 通過EDC法制備葉酸結(jié)合的HN-1以及對該修飾抗體的評估(1)通過EDC法制備葉酸結(jié)合的HN-1制備是通過Leamon等(Journal of Biological Chemistry，1992，267(35)，24966-24971)報道的方法。也就是，將二甲基亞砜(DMSO)中濃度為21.7mg/ml的1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDCSigma)(1ml)，加至DMSO中濃度為10mg/ml的葉酸(Sigma)(1ml)中?；旌衔镉诎堤幨覝仂o止30分鐘。在攪拌下，將葉酸-EDC溶液(16.6μl)一滴滴地加入實施例12的HN-1溶液(300μl)中，用PBS調(diào)整濃度為1mg蛋白/ml。所得混合物在暗處室溫反應(yīng)一小時，于是獲得了如實施例14-(2)的葉酸結(jié)合的HN-1。
(2)葉酸結(jié)合HN-1修飾的SeV載體的HA活性通過用實施例18-(1)的葉酸結(jié)合的HN-1代替實施例15的葉酸結(jié)合的HN-1，制備修飾的載體并測定了HAU。
如圖11所示，通過EDC發(fā)制備的葉酸結(jié)合的HN-1也可有效地用于通過修飾SeV載體消除HAU。
(3)葉酸結(jié)合的HN-1修飾的SeV載體的基因表達(dá)修飾載體利用實施例1的SeV載體溶液(1×107pfu/ml)，以及實施例12的HN-1和實施例18-(1)的葉酸結(jié)合HN-1(兩個都是100μg/ml)來制備。除實施例16的KB細(xì)胞外還使用A549細(xì)胞(人肺癌)，類似地進(jìn)行感染試驗。
表4比較KB細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中葉酸受體以高水平表達(dá)，而在A549細(xì)胞中幾乎無此受體(Wang等，Bioconjugate Chemistry.1997，8，673-679)。葉酸結(jié)合HN-1修飾的SeV載體在KB細(xì)胞中表現(xiàn)出高水平基因?qū)耄珒H是在沒有過量葉酸存在時。這說明取代了HN蛋白血凝活性的葉酸配體通過與葉酸受體結(jié)合而介導(dǎo)特定基因?qū)搿?br> 表4LacZ基因表達(dá)的相對比例(有過量葉酸(-)的SeV載體為100％)
攜帶GFP的SeV載體的制備和純化攜帶GFP基因的SeV/GFP是通過已知方法制備的(Kato等，Genes Cells，1996，1，569-579；Hasan等，J.Gen.Virol.，1997，78，2813-2820)。此載體接種于含10日齡胚的雞蛋中。在35.3℃溫育三天后，收獲尿囊液，然后以在4℃以3000rpm離心30分鐘。所得上清液在4℃、35000xg離心一小時以沉淀該載體。載體在PBS中重懸，然后在4℃以3000rpm再離心30分鐘，然后上清液在4℃、35000xg離心一小時以沉淀該載體。載體重懸于PBS以制備純化載體的貯存溶液(下文中指為SeV載體)。該載體的蛋白濃度通過BCA蛋白測定法(Pierce)測定，將溶于等體積3％Triton X-100溶液的載體作為樣品，用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品。純化載體的濃度約為1mg蛋白/ml。
SPA-PEG2K-修飾的SeV載體的制備硼酸鹽緩沖液(pH8.5)(0.5ml)加入實施例19的SeV載體貯存溶液中(0.5ml)，以制備出0.5mg蛋白/ml(pH8.5)的溶液。在攪拌下將0、2、4、6、8和10mg PEG丙酸試劑(MW2000)(SPA-PEG2K，Shearwater Polymers)的琥珀酰亞胺基衍生物，以小量加入上述溶液。然后該溶液在室溫下反應(yīng)一小時。反應(yīng)完后，反應(yīng)溶液在4℃以15000rpm離心一小時。獲得沉淀用冰冷的PBS懸浮，然后在4℃以15000rpm再離心一小時已回收載體，然后重懸于PBS(0.5ml)，以獲得SPA-PEG2K-修飾的SeV載體。此修飾載體的蛋白濃度按照實施例19來測定。
SPA-PEG5K-修飾的SeV載體的制備用SPA-PEG5K(MW5000)(Shearwater Polymers)代替實施例20的SPA-PEG2K后，并使用0、5、10、15、20和25mg的PEG反應(yīng)量，按照實施例20中的方法制備和純化SPA-PEG5K-修飾的SeV。此載體的蛋白濃度按實施例19來測定。
PEG2NHS-10K-修飾的SeV載體的制備用PEG2NHS-10K(MW10000)(兩個分枝(two-branched)；ShearwaterPolymers)代替實施例20的SPA-PEG2K后，并使用0、5、10、15、20和25mg的PEG反應(yīng)量，按照實施例20中的方法制備和純化SPA-PEG10K-修飾的SeV。此修飾載體的蛋白濃度按實施例19來測定。
PEG-修飾的SeV載體的血凝活性(HAU)和體外感染力(CIU)對實施例20、21和22的PEG-修飾的SeV載體的血凝活性(HAU)和體外感染力(CIU)進(jìn)行了測定。如圖12、13和14所示，測定上述三種類型PEG-修飾SeV載體的HAU和CIU，顯示了HAU和CIU隨反應(yīng)中PEG量的增加而降低的趨勢。PEG衍生物的分子量越大，通過增加其反應(yīng)量而造成的HAU和CIU的降低程度越小。而且，檢測HAU和CIU之間的相關(guān)性時，用適量SPA-PEG5K修飾的SeV其每HAU的CIU約是未經(jīng)修飾載體的7-8倍。這些結(jié)果認(rèn)為是顯示了通過PEG修飾保持感染力，同時降低血凝并提高SeV載體在血液中的穩(wěn)定性的可能性。
HAU測定如下載體用PBS(50μl)在96孔圓底板(Asahi Technoglass)中進(jìn)行連續(xù)2倍稀釋。每孔加入50μl用PBS洗滌過的1％雞紅細(xì)胞溶液，4℃靜置一小時，對其進(jìn)行血凝檢測。HAU表示為造成血凝的最大稀釋比。
CIU測定如下載體用PBS/1％BSA連續(xù)稀釋10倍，然后以10μl/孔感染24孔板中的滿底LLC-MK2細(xì)胞。兩天以后，計數(shù)每孔中GFP表達(dá)細(xì)胞數(shù)以計算CIU。
PEG修飾的確證對實施例20、21和22所述PEG-修飾SeV載體進(jìn)行SDS-PAGE分析。如圖15所示，當(dāng)病毒載體組成型蛋白用凝膠銀染分析時，隨著PEG反應(yīng)量的增加，來自包膜蛋白F和HN的條帶減少，而在較高分子量級分中有條帶出現(xiàn)。與HN蛋白相比F蛋白量的降低較小，很可能說明有比F蛋白更多的HN蛋白被修飾。此外，如圖16所示，用兔抗F1多克隆抗體和小鼠抗HN單克隆抗體，通過Western印跡對PEG-修飾的SeV載體的包膜蛋白即F和HN蛋白進(jìn)行分析，所得結(jié)果與經(jīng)銀染分析獲得的結(jié)果相似。
在中和抗體存在下通過PEG2-NHS10K-修飾的SeV載體的體外基因?qū)肱c實施例22描述相符，PEG2-NHS10K修飾的SeV通過反應(yīng)和純化得到(使用0、15、20和25mg的PEG反應(yīng)量)。此修飾載體的蛋白濃度按實施例19所述來測定。載體溶液以PBS/1％BSA稀釋至濃度為0.01μg/μl。抗-SeV抗血清(通過用SeV免疫兔(56℃，一小時)制備)，經(jīng)10、100和1000倍稀釋，并將此稀釋抗血清或者35μl PBS/1％BSA加入35μl載體溶液，然后于室溫反應(yīng)1個小時。將20μl由抗血清處理的上述載體溶液加入滿底的LLC-MK2細(xì)胞24孔板的每個孔中，并進(jìn)行感染。感染后第三天GFP的表達(dá)通過使用熒光顯微鏡拍照進(jìn)行評價，并且使用熒光讀板計在熒光波長530nm和激發(fā)波長485nm處定量性地評價GFP的熒光強度。
如圖17所示，未修飾的SeV載體顯示了隨著抗體濃度增高感染效率降低的趨勢，但是，這種下降可通過用PEG2-NHS10K修飾載體而抑制。在所有測試的抗體濃度中，感染效率高于那些未修飾的載體，顯示出感染效率最大提高了約70％。
PEG2-NHS10K-修飾的SeV載體的體內(nèi)基因?qū)雽⒂?mg PEG制備的未修飾SeV對照載體和由20mg PEG反應(yīng)量制備的PEG-修飾的SeV載體反復(fù)對小鼠給藥，上述兩種載體都在實施例25中制備。如圖18和19所示，小鼠被分為五組A-E；首次給藥時，攜帶螢光素酶的SeV通過對小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)給藥以產(chǎn)生抗-SeV的抗體；兩個星期后，第二次給藥通過分別在組B中使用攜帶GFP的未修飾的SeV作為對照和在組C中使用PEG-修飾的SeV作為對照來進(jìn)行。組A用作未處理的對照，組D和E用作單次給藥的對照。從小鼠中收集首次給藥前，首次給藥一星期后，和首次給藥兩星期后的血樣以使用商品ELISA試劑盒(Prezyme“Seiken”，Denka Seiken Co.，Ltd.)檢測抗SeV抗體的滴度。在已接受首次給藥的組B和組C的小鼠中，觀察抗SeV抗體的滴度升高情況。首次給藥兩星期后當(dāng)抗體滴度充分升高時，進(jìn)行第二次給藥。兩天后，解剖小鼠，肺中GFP的表達(dá)通過使用熒光顯微鏡拍照進(jìn)行觀察。
如圖19的熒光照片所示，可在很寬的范圍內(nèi)觀測到SeV感染，并且在未修飾的載體和PEG修飾的載體中沒有觀察到很大差異。在第二次給藥中，未修飾的SeV顯示整個畫面中幾乎沒有GFP的表達(dá)，并且甚至在放大的畫面中，只在肺部表面的一些部分中稀疏可見表達(dá)。另一方面，PEG修飾的SeV，盡管有比在首次給藥中更低的GFP表達(dá)，而在與未修飾的SeV比較時仍然在更大的范圍內(nèi)顯示出更多的GFP表達(dá)細(xì)胞。如在特別放大的畫面中所示，可觀察到GFP表達(dá)細(xì)胞的集落。
在4℃貯存條件下PEG修飾的SeV保持感染力的效果PEG2NHS-20K-修飾的SeV和PEG2NHS-40K-修飾的SeV以相似的方式制備和純化，分別用PEG2NHS-20K(MW20000)(兩個分枝(two-branched)；Shearwater Polymers)代替實施例20中的SPA-PEG2K，使用10、20和40mg的PEG反應(yīng)量；以及用PEG2NHS-40K(MW40000)(兩個分枝；ShearwaterPolymers)替換，使用20、40和80mg的PEG反應(yīng)量。修飾載體的蛋白濃度按實施例19來測定。
使用實施例5中的方法檢測上述PEG修飾的SeV以及未修飾的SeV在4℃貯存8天和20天時的CIU。如圖20所示，在未處理的SeV對照中，貯存于4℃兩周后滴度降至1/3，而經(jīng)適當(dāng)量的帶有兩個分枝的大分子PEG修飾的SeV保持了最大感染效率的近80％。
通過PEI修飾提高PEG修飾的SeV的感染效率在實施例21中使用0、5、10和15mg的反應(yīng)量的PEG制備的SPA-PEG5K-修飾的SeV載體，用MW為750000的聚乙烯亞胺(PEI；SIGMA)，按照PEI∶SeV的重量比為0、0.01、0.025、0.05、0.1和0.2進(jìn)行修飾，以檢測對LLC-MK2細(xì)胞的感染效率(檢測方法見實施例23)。如圖21所示，加入一定量的PEI有提高PEG修飾的SeV感染效率大約10倍的效果。PEG修飾的量越高，PEI的提高效果越好。用MW為25000的PEI(Sigma)也可得到相似的結(jié)果。
工業(yè)實用性在藥物療法或基因治療中一個重要的技術(shù)領(lǐng)域，涉及到向靶細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器遞送生物活性物質(zhì)，如藥品(特別是大分子化合物)和核酸的系統(tǒng)，即，藥物遞送系統(tǒng)(以下簡稱為DDS)。DDS可通過使用病毒載體或通過給藥一種組合物(其中優(yōu)選的生物活性物質(zhì)包含于其中或攜帶于人工或半人工載體上)來實現(xiàn)。本發(fā)明能夠降低兩種類型的DDS中的血凝活性，提高在血液中的穩(wěn)定性以及基因?qū)胄省＠?，在使用病毒載體的DDS中，具有特異性降低的血凝活性的病毒載體可以通過如下方式產(chǎn)生通過將本發(fā)明應(yīng)用到負(fù)鏈RNA病毒載體或源自編碼具血凝活性的外膜蛋白的所述病毒的基因的假型病毒載體等。此外，本發(fā)明也能夠降低人工脂質(zhì)體制備物等情況中的血凝活性。使用本發(fā)明制備的用于DDS的化合物在體內(nèi)應(yīng)用中非常有效。
權(quán)利要求
1.一種藥物-載體組合物或基因-載體組合物，其包含細(xì)胞膜，該細(xì)胞膜含有具血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白，其中(a)一種化合物附著于所述蛋白；(b)血凝活性比沒有附著所述化合物的組合物降低；且(c)該組合物具有將藥物或基因?qū)氚屑?xì)胞的能力。
2.權(quán)利要求1的組合物，且其中(d)對紅細(xì)胞的溶血活性比沒有附著所述化合物的組合物降低。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其包含負(fù)鏈RNA病毒的感染性病毒粒子。
4.權(quán)利要求1或2的組合物，其包含滅活的負(fù)鏈RNA病毒，或該病毒的包膜部分。
5.權(quán)利要求1-4中任何一個的組合物，其中所述負(fù)鏈RNA病毒是副粘病毒科的病毒。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述副粘病毒科的病毒是仙臺病毒。
7.權(quán)利要求1-6中任何一個的組合物，其中所述附著于蛋白的化合物具有1,800或更高的分子量。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述附著于蛋白的化合物具有4,500或更高的分子量。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述附著于蛋白的化合物具有16,000或更高的分子量。
10.權(quán)利要求1-9中任何一個的組合物，其中所述附著于蛋白的化合物是聚乙二醇。
11.權(quán)利要求1-10中任何一個的組合物，其中所述蛋白進(jìn)一步與聚乙烯亞胺形成復(fù)合物。
12.權(quán)利要求1-11中任何一個的組合物，其中所述蛋白與細(xì)胞結(jié)合化合物形成復(fù)合物。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述細(xì)胞結(jié)合化合物與所述附著于蛋白的化合物相結(jié)合。
14.權(quán)利要求12或13的組合物，其中所述附著于蛋白的化合物是與該蛋白相結(jié)合的抗體或其片段。
15.權(quán)利要求12-14中任何一個的組合物，其中所述細(xì)胞結(jié)合化合物是細(xì)胞表面受體的配體。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述配體是葉酸。
17.與細(xì)胞結(jié)合化合物結(jié)合的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與具血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白相結(jié)合。
18.權(quán)利要求17的抗體或其片段，其是F(ab′)2。
19.權(quán)利要求17或18的抗體或其片段，其中所述細(xì)胞結(jié)合化合物是細(xì)胞表面受體的配體。
20.權(quán)利要求19的抗體或其片段，其中所述配體是葉酸。
21.一種藥物-載體試劑盒或基因-載體試劑盒，其包括(a)一種抗體或其片段，其與具血凝活性的負(fù)鏈RNA病毒包膜蛋白相結(jié)合，并且與細(xì)胞結(jié)合化合物相結(jié)合；和(b)包含所述包膜蛋白的藥物-載體組合物或基因-載體組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了血凝活性降低了的藥物載體組合物或基因載體組合物。通過將化合物附加于具血凝活性的負(fù)鏈PNA病毒的包膜蛋白，可成功地構(gòu)建得到一種藥物載體組合物或基因載體組合物，與其中沒有附著化合物的組合物相比，所述組合物有較低的血凝活性。例如，本發(fā)明的一種實施方案提供一種病毒載體，其紅細(xì)胞聚集活性和溶血活性顯著降低，而其血液中的穩(wěn)定性卻明顯提高。本發(fā)明中提供的藥物載體組合物或基因載體組合物可優(yōu)選用于體內(nèi)轉(zhuǎn)移藥物或基因。
文檔編號C12N15/86GK1665544SQ0381546
公開日2005年9月7日 申請日期2003年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月30日
發(fā)明者榊原裕幸, 原裕人, 上田泰次, 長谷川護(hù), 游軍 申請人:株式會社載體研究所