專利名稱：Hcv病毒體外培養方法
技術領域：
本發明涉及一種全新的體外培養丙型肝炎病毒的方法。
丙型肝炎病毒是通過輸血獲得肝炎的主要原因。丙型肝炎病毒也可以通過其他經皮途徑(例如通過靜脈注射毒品)傳播。而且，從事健康方面的職業人士被感染的風險也是不可以被忽視的。
丙型肝炎有別于其他形式的與病毒相關的肝臟疾病，例如甲型肝炎、乙型肝炎和丁型肝炎。丙型肝炎病毒(HCV)的感染通常為慢性，在大量病例中導致諸如肝炎、腹瀉和癌癥等肝臟疾病。
盡管通過輸血傳播的風險由于選擇供血者而降低，丙型肝炎病例的頻數仍然保持為高水平。目前，全世界約有1.7億人被HCV慢性感染。高危人群主要發現于曾進行輸血或靜脈藥物使用者的個體，但是也存在不屬于這些高危群體、體內發現循環抗HCV抗體的無癥狀供血者。對于后者，感染途徑尚未確定。
HCV是第一個使用分子生物學技術分離的趨肝病毒(hepatotropicvirus)。病毒基因組序列在未觀察到病毒顆粒的情況下得到克隆。
目前，即使已知存在其他形式的含有病毒RNA的顆粒，出現在感染患者血液中的僅有的天然病毒顆粒以無包膜的衣殼為特征。
出于方便起見，在本申請中，“病毒”這一術語將用來指任何含有HCV病毒RNA的顆粒。這兩個術語的使用也沒有區別。
HCV為約9.5kb的單鏈正鏈RNA病毒，通過互補RNA的拷貝進行復制，翻譯產物為一個單獨的、約3000個氨基酸的多聚蛋白質。HCV基因組的5’末端對應為非翻譯區，與編碼結構蛋白質、核衣殼核心蛋白質和兩種包膜糖蛋白E1和E2的基因毗鄰。在不同基因型中，5’非翻譯區和核心基因相對高度保守，但是E2包膜蛋白質則由高變異區編碼，此高變異區在各分離株均不同。HCV基因組3’末端含有編碼非結構蛋白質(NS)的基因和高度保守的3′非編碼區。
由于基因組結構和假設的復制模式，HCV被分類為黃病毒科的一個新的屬hepaciviruses。
術語“HCV病毒”指人類致病株、減毒株、以及來源于上述病毒株的缺陷株等任何病毒種類。當然，已知RNA病毒呈現高度自發突變率。因此存在具有更高或更低毒力的眾多病毒株。鑒定這些病毒株在本領域技術人員能力范圍內，例如，通過其關于參照毒株的核酸和/或肽序列同源性、和/或通過形態學和/或免疫學標準鑒定株系或分離物。
用于診斷HCV的許多技術得到了發展。例如，實施診斷性免疫試驗，檢測患者血清中抗HCV蛋白質的抗體。以病毒RNA反轉錄合成cDNA以及PCR擴增同樣用于檢測HCV基因組，例如對慢性感染者或對實驗感染的黑猩猩的血清中隱性感染的病毒進行間接測量。此外，在基因克隆的基礎上，使用DNA探針的雜交技術也得到發展。
然而，人們已經認識到，現有的診斷技術缺乏靈敏性和/或特異性和/或受累于其操作困難。例如，使用探針雜交方法，不可能將具有低感染能力的病毒與具有高感染能力的病毒區分開來。所以，有必要用待檢驗的病毒接種黑猩猩來檢測對動物的感染結果，但是卻難以實施。
因此，從公共衛生角度而言，最為重要的是能夠發展特異、靈敏且可行的方案來診斷和篩查HCV攜帶者。一種解決方法可以是產生一個體外培養HCV的有效系統，從而使實現病毒繁殖成為可能，尤其是用于研究復制機制、檢測中和抗體或抗病毒試劑，同時用來發展生物材料、診斷檢測物和疫苗制劑。事實上，盡管HCV的完整序列自從1989年即可獲得(Q.L.Choo等，Science 244，359(1989))，有關HCV生活周期和復制模式的認識卻由于缺乏適宜的體外培養系統而受到阻礙。Ito等人(J.Gen.Virol.771043-1054(1996))真正證實了在人類肝細胞原代培養中HCV保持復制，其中這些細胞來自攜帶HCV、緩慢起病和傳遞感染的病人，但是關于病毒的繁殖(長期培養的不確定性)的問題仍然存在，而且所發展的系統由于費力且需要人類肝臟供應而受到限制。另外，關于HCV的向性至今尚未形成普遍認可，而且，并非該病毒的所有細胞受體均得到鑒定。
在HCV感染者血漿中，發現含有病毒RNA的顆粒密度具有很強的異質性。含有病毒RNA的顆粒的密度異質性歸結于這些顆粒與不同比例的脂蛋白結合(Thomsen等，1993，Med.Microbiol.Immunol.182639)。在本發明申請的描述中，發明者將這些雜合顆粒稱為LVPs(脂-病毒-顆粒)。每個患者中各種形式顆粒的密度梯度分布均有不同。現有的對低密度顆粒的分析顯示，其密度包括LDLs(低密度脂蛋白)和VLDLs(極低密度脂蛋白)的密度。
含有病毒RNA的LVPs的性質現在尚無精確的認識。
專利申請WO 01/09289描述了一種使用具有內吞途徑的細胞對病毒(例如HCV)進行體外培養的方法，病毒來自感染者血清或血漿LVPs的至少一個級分，細胞的內吞途徑依賴至少一種脂蛋白受體，且可以被激活劑調節。此方法尤其致力于促進級分在培養基中進入細胞。然而，病毒復制仍然受限，因而必須優化。
專利申請WO 02/10353描述了一種與已知數據相反(Hijikata等，1993，J.Virol.，1953-1958)的由結合人免疫球蛋白的LVPs組成的復合物，密度小于或等于1.063g/ml，主要含有HCV病毒RNA。事實上，Hijikata等顯示，當顆粒密度小于1.06g/ml時，對黑猩猩具有高度傳染性，因此這種類型的低密度顆粒中不可能含有密度很大的人免疫球蛋白。這些復合物組成了具有很強的感染性的HCV病毒的一種特殊形式。
在那個專利申請中同樣描述了一種由LVP/免疫球蛋白復合體體外培養HCV的方法，該方法中使用的細胞其表面至少有一種類型的免疫球蛋白Fc片段受體、或具有免疫球蛋白結合能力的一種受體。此方法再次促進了復合物在培養基中進入細胞，但是卻不允許病毒的大量繁殖。
現在，本發明的發明者發現了一種全新的HCV體外培養方法，可以解決上述缺點，即，使用兼具促成含有HCV病毒RNA的顆粒進入和促進復制、繁殖能力的細胞。
事實上，本發明者令人驚訝的證實了稱為LVPs的含有HCV RNA的顆粒-是完整的球狀單位顆粒；因此它們并不是像現有技術所提示的結合到正常脂蛋白上的病毒體團塊，-含有載脂蛋白B和載脂蛋白E以及甘油三酯它們因此具有脂蛋白結構，尤其是VLDL或乳糜微粒的結構類型，和-含有病毒包膜和RNA它們因此有別于通常發現于人類的脂蛋白，并組成病毒的非常規形式。
由于LVPs是雜合顆粒，即含有病毒組件的脂蛋白，因此使用能夠合成脂蛋白的細胞可以出乎意料的促進復制。
因此，本發明的主題為HCV的體外培養方法，包括步驟有在促進脂蛋白合成和分泌的適宜的培養基中，將含有丙型肝炎病毒RNA的顆粒與能夠合成并且分泌脂蛋白的細胞接觸，以及收集由此得到的病毒。
詞語“含有HCV RNA的顆粒”意為病毒顆粒，尤其是諸如LVP/免疫球蛋白復合物形式，或出現在HCV檢測陽性并且含有這樣顆粒的形式的患者血清或血液中，以及含有病毒RNA的接種物，無論上述接種物中病毒RNA的制備模式如何。
LVP/免疫球蛋白復合物以及從HCV感染者血清或血漿樣品中純化該復合物的方法已經在專利申請WO 02/10353中描述。
然而，那個文件中既沒有描述也沒有提示脂蛋白類型中這些LVPs的獨特性質，即它們是否具有甘油三酯、載脂蛋白B以及可選的載脂蛋白E。
載脂蛋白B是與內質網膜結合的人類蛋白，它引發VLDLs組裝，在微粒體甘油三酯轉運蛋白出現時啟動甘油三酯的轉入，還引發內質網腔內VLDLs的組裝。該載脂蛋白具有兩種形式，apo B 100和apo B 48，在肝臟和腸內合成。
載脂蛋白E可以被許多細胞合成，尤其是肝細胞。而且，它可以在血流中被VLDLs獲得。
本發明方法中使用的細胞是具有合成和分泌脂蛋白能力的所有細胞。
這些細胞既可以是原代細胞也可以是細胞系。
術語“細胞系”指建立的自發或人工永生化細胞系。在實踐中，為了培養感興趣的病毒，需要在培養基中易于維持的允許細胞(permissivecells)。因此，細胞株優選是已經建立的或者通過各種方法永生化的細胞系。這可以通過下列進行(i)通過將允許細胞與具有相同性質的腫瘤化允許細胞共培養，建立穩定、確立的持續細胞系，所述腫瘤化允許細胞可以無限繁殖并保證病毒在培養基中繁殖，病毒接種發生在培養基中，(ii)使用病毒感染的原代細胞，接著與腫瘤化允許細胞共培養，該腫瘤化允許細胞保證了病毒在由此建立的細胞系培養物中的繁殖，(iii)用病毒感染細胞系，例如使用Epstein-Barr病毒感染永生化B淋巴細胞系，或(iv)修飾端粒酶活性。
詞語“本發明中使用的具有合成和分泌脂蛋白能力的細胞”特別是指自發具有這種能力的細胞，以及在促進細胞分化或再分化的培養基質中經誘導、或者轉染合成載脂蛋白B和微粒體甘油三酯轉移蛋白MTP基因后獲得這種能力的細胞。
適于本發明目的、具有合成和分泌脂蛋白能力的細胞的實例有腸細胞型的腸上皮細胞、腦細胞和肝臟細胞。
根據一個實施方案，所用的細胞是能在促進該細胞分化或再分化的培養基中經誘導而合成和分泌脂蛋白的細胞。
事實上，一些細胞(例如肝細胞)喪失了產生脂蛋白的能力，或者其他細胞(例如腸上皮細胞)此能力可以增強。為了克服這些障礙，可以將這些細胞與適宜的、促進分化或再分化的培養基接觸，來誘導細胞的分化或再分化。
根據一個特定的實施方案，適用于本發明目的的細胞是腸上皮細胞，特別是Caco-2細胞(Van Greevenbroeck，M.M.J.等，2000，Atherosclerosis，25-31)。
為了提高其合成和分泌脂蛋白的能力，可以在包被膠原或者置于半透膜之下的培養皿中，將腸上皮細胞(例如Caco-2)在添加10％胎牛血清的DMEM培養基中預先培養3周。
肝臟細胞可以是肝細胞(Moshage，H.等，1992，Journal ofHepatology，15，404-413)和肝癌，例如Hep G2細胞(Gherardi，E，等，1992，Journal of Cell Science，103，531-539)。
根據另一個特定的實施方案，本發明方法中使用的細胞是肝癌細胞。
然而，在此例中，這些細胞可以通過與改良的DMEM培養基接觸(即含有至少一種誘導脂蛋白合成的試劑)，來提高其合成和分泌脂蛋白的能力。這些細胞優選是Hep G2細胞。
至于誘導脂蛋白合成的試劑，可以以各種脂類為例，例如脂肪酸，優選C18或C20脂肪酸，例如油酸(Luchoomun，J.等，1999，The Journalof Biological Chemistry，Vol 274(28)，19565-19572))，和磷脂(例如溶血磷脂酰膽堿(Zhou，Z.，1998，Biochimica et Biophysica Acta，1391，13-24))。
在肝癌細胞再分化培養基中使用油酸組成本發明一個特定的實施方案。
根據本發明的一個實施方案，除DMEM(Gibco BRL)和誘導脂蛋白合成的試劑之外，改良DMEM培養基還由1％HEPES(Gibco)、1％谷氨酰胺(Gibco)、0.25mg/ml慶大霉素(Gibco)、1.5％Ultroser-G(Gibco)、5×10-6M毛喉素(ICN)、1.6×10-7M PMA(4-α-佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)(Sigma)、5.6IU/ml醋酸維生素A(Sigma)、0.5×10-3M丁酸鈉(Sigma)、10-2M niacidamide(ICN)、2×10-6g/mlPolybrene(Sigma)、2.9×10-8M亞硒酸鈉(ICN)和1×10-9M三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽(ICN)。
本發明方法中使用的其他類型的細胞由轉染基因后獲得的細胞組成，其中轉染的基因合成載脂蛋白apo B，可選的apo E和微粒體甘油三酯轉運蛋白。這些細胞可以以轉染的昆蟲細胞系為例，該細胞系見D.G.Gretch等在Journal of Biological Biochemistry，1998，Vol 271(15)，8682-8691中的描述。
當與具有合成和分泌脂蛋白能力的細胞接觸后，含有HCV RNA的顆粒既可以經過上述細胞的LDL受體類型中的脂蛋白受體(如以LVPs為例的情況)進入這些細胞、也可以根據本領域技術人員已知的技術經轉染內化(如以病毒RNA制劑為例的情況)而進入細胞。
本發明方法中因此使用促進脂蛋白合成和分泌的培養基，所述脂蛋白優選為VLDL或乳糜微粒類型。
選用的適宜的培養基是改良的DMEM，其內添加了在培養中促進細胞代謝的試劑，還有至少一種誘導脂蛋白合成的試劑。
促進細胞代謝的試劑，可以以地塞米松和胰島素為例。
優選的改良DMEM培養基如上文所定義，并且添加地塞米松和胰島素。
誘導脂蛋白合成的試劑例如有各種脂類，比如脂肪酸(優選C18或C20脂肪酸，例如油酸)、磷脂(例如溶血磷脂酰膽堿)，還有22-羥-膽固醇或25-羥-膽固醇。
使用油酸誘導脂蛋白合成(可選地與22-羥-膽固醇或25-羥-膽固醇聯合使用)組成本發明另一個特定的實施方案。
因此，使用本發明方法培養的病毒可以通過諸如離心(例如密度梯度離心)、使用抗apo B和/或apo E抗體的免疫沉淀等各種方法收獲。
本發明還涉及了至少包括根據本發明方法獲得的病毒顆粒或其組分為抗原來源的診斷組合物。
本領域技術人員將能夠根據使用的診斷技術確定所使用的病毒顆粒的數量。
本發明還涉及用來篩選和/或選擇至少一種抗病毒分子的方法，包括步驟在本發明培養方法過程中，將上述抗病毒分子與培養基接觸。
對抗病毒分子的選擇，通過廣為本領域技術人員所熟知的技術完成，例如細胞內病毒RNA數量的減少、和/或在存在不同濃度的各種抑制劑時分泌到上清中的感染性病毒顆粒數量的減少。
這些抑制劑可以是核苷酸或核苷類似物，或者是病毒蛋白酶的抑制劑或干擾其他病毒蛋白質功能的別的分子的抑制劑。
然而，本發明還開辟了其他的治療前景，使開發能定性和/或定量影響HCV體內復制和增殖的治療組合物成為可能，該組合物的特征在于，它包含能夠調節、壓制或抑制脂蛋白合成的試劑(例如微粒體甘油三酯轉運蛋白的抑制劑)以及其他物質。
詞語“能夠調節、壓制或抑制脂蛋白合成的試劑”意指任何可能分別控制、降低或抑制HCV體內增殖和復制的分子。
這些試劑可以從經驗證對脂類代謝具有藥理學活性的分子文庫中篩查而選擇。
能夠抑制脂蛋白合成的試劑，可以以微粒體甘油三酯轉運蛋白抑制劑為例。
通過下面給出的用作非限制性說明的實施例，以及附加的
圖1至圖3，本發明將得到更加全面的理解。
圖1描繪的圖形，顯示培養條件(添加油酸的改良DMEM培養基與標準培養基)對Hep G2細胞分泌HCV病毒顆粒的影響，HCV病毒顆粒的分泌通過對培養上清中病毒RNA定量來評價，并且是時間的函數；圖2描繪的圖形，顯示在改良DMEM培養基中添加油酸對病毒顆粒的分泌的影響，病毒顆粒的分泌通過對培養上清中HCV RNA定量來評價，并且是時間的函數；圖3描繪的圖形，顯示由Caco-2細胞培養3周分化后產生的HCV病毒，上述產物通過培養上清中病毒RNA的數量來證明，并且是時間的函數。
實施例1LVPs的表征1.1 LVPs完整球狀形式的證實來自丙型肝炎病毒檢測陽性的病人血清中的LVPs按照專利申請WO02/10353的說明進行純化。
純化的LVPs以及去除LVPs的低密度(LDL)級分以PBS稀釋，在200目的銅網上形成樣品浮滴后，其中該銅網在室溫下已用Formvar支持膜(Electron Microscopy Science，PA)包被3分鐘，在以NaOH緩沖的pH7.2的4％(質量/體積)光鎢酸介質中漂洗染色3分鐘，干燥后使用電子顯微鏡(JEOL device，Centre Commun d’Imagerie deLaennec，Lyon，France)觀察。
與正常LDL一樣，LDL級分由具有同質球狀結構、平均直徑為25nm的顆粒組成。
另一方面，純化的LVPs為平均半徑100nm的異常巨大的球狀結構。
1.2檢測LVP組成a)測定LVPs脂質濃度按照生產廠商介紹，使用膽固醇RTU、磷脂酶促PAP 150和甘油三酯酶促PAP 150試劑盒(bioMérieux，Marcy l’Etoile，France)以及建立的標準曲線，對總膽固醇、磷脂和甘油三酯濃度進行測定。
b)測定LVPs中apo B濃度使用ELISA實驗測定純化的LVPs中載脂蛋白apo B的濃度。為進行此實驗，將96孔平底ELISA板(Maxisorb；Nunc)用抗人apo B單克隆抗體(5ul/ml；clone 1609；Biodesign，Saco，Maine)的PBS(磷酸鹽緩沖液)100ul包被。將板置于4℃過夜，然后用2％BSA(牛血清白蛋白)封閉反應。
首先在添加10ug/ml人IgG的PBS-0.2％BSA混合液中，將樣品在室溫下孵育30分鐘，然后按照100ul/孔的比例加到板上。
經過37℃孵育2小時并使用PBS-0.05％Tween 20溶液清洗后，按照100ul/孔的比例，加入含有綴合過氧化酶的山羊抗人apo B抗體(1.6μg/ml；Biodesign)的PBS-0.2％BSA混合液，將板于37℃孵育90分鐘。
將板清洗后，按照150ul/孔的比例加入鄰-苯二胺(Sigma)。反應可以進行10分鐘，在490nm讀取結果。
c)結果結果按照甘油三酯/膽固醇(TG/Chol)和甘油三酯/apo B(TG/apo B)比值在下表中給出。此表同樣包括了患者正常脂蛋白(即提取LVPs后獲得的脂蛋白)的同種比值，以作比較。
表
ap≤0.04bp≤0.01在密度不同的兩個級分(即低密度和極低密度)中發現的LVPs比同種級分中正常脂蛋白含有更多的甘油三酯(基于每分子apo B計算)。
這些數據證明-LVPs的確含有脂質，-LVPs的脂質濃度與正常脂蛋白不同，因此排除了任何污染；以及-LVPs含有apo B。
1.3存在載脂蛋白B和E按照如下方法封閉PLC細胞apo B和apo E受體結合位點后，阻止了LVPs進入PLC細胞，這證實apo B和apo E的存在將5×105PLC/PFR/5人肝細胞瘤細胞系細胞(ATCC CRL 8024)(Alexander細胞)(人肝細胞瘤)在96孔板內，在添加10％胎牛血清(Biowhittaker，Emerainville，France)、2mM HEPES(Gibco/BRL)、1％非必需氨基酸(Gibco/BRL)和50IU青霉素/鏈霉素(Gibco/BRL)的DMEM(Gibco，BRL)/ml培養基中，于37℃培養24小時。
首先，使用抗apo B受體結合位點的單克隆抗體(4G3和5E11；OttawaHeart Institute Research Corporation，Ottawa，Ontario Canada)封閉apo B受體結合位點，然后用單克隆抗體1D7(Ottawa HeartInstitute Research Corporation)封閉apo E受體結合位點。PLC細胞用PBS洗滌3次后，與純化的LVPs孵育3小時。細胞經洗滌后，使用Rneasy試劑盒(Qiagen)中的裂解液350ul收獲，按照上文說明提取RNA。
通過封閉apo B和apo E識別位點阻斷了LVPs的識別，說明LVPs含有載脂蛋白，并證實了LVPs的脂蛋白結構。
1.4 LVPs中存在由核心蛋白和病毒RNA組成的衣殼通過將LVPs在85％醚-15％丁醇溶液中孵育30分鐘，同時輕柔攪拌，將純化的LVPs去脂化，證實了衣殼的存在。按照上文1.1節中說明，使用電子顯微鏡(JEOL device，Centre Commun d’Imagerie de Laennec，Lyon，France)顯示衣殼的存在。
將上文所述去脂化的LVPs與抗-HCV核心蛋白單克隆抗體(19D9D6；Jolivet-Reynaud，C.P.，等，1998，J.Med.Virol.，56，300-309)和10nm-金標記二抗接觸，在3％乙酸雙氧鈾中漂洗、負染進行免疫檢測，如上所述用銅網觀察，從而通過Western印跡證實了HCV病毒核心蛋白的存在。
最后，使用QIAamp試劑盒(Qiagen S.A.Courtaboeuf，France)提取已純化并去脂化的LVPs，證實了病毒RNA的存在。
實施例2培養條件對Hep G2細胞產生HCV的影響首先，將Hep G2細胞在專利申請WO 01/09289中所述的由DMEM和10％胎牛血清組成的培養基(標準培養基)中培養或在改良DMEM培養基(即含有添加1％HEPES、1％谷氨酰胺、0.25mg/ml慶大霉素、1.5％Ultroser-G、5×10-6M毛喉素、1.6×10-7M PMA、5.6IU/ml醋酸維生素A、0.5×10-3M丁酸鈉、10-2M niacidamide、2×10-6g/mlPolybrene、2.9×10-8M亞硒酸鈉和1×10-9M三碘-L-甲腺原氨酸鈉鹽的DMEM)中培養。
按照150 000細胞/孔的比例，將細胞與標準培養基或改良DMEM培養基接種于Falcon 24孔培養板，培養24小時。
吸去培養基，在病毒存在下(按照500 000 HCV RNAs/孔的比例)，將細胞在添加0.2％BSA的DMEM中培養6小時。
細胞以PBS洗滌后，在標準培養基或改良培養基(如前文說明，但是還添加了hexamethasone、胰島素和含有0.15mM油酸的油酸-BSA混合物)中培養。
所有的培養都在含5％CO2的空氣及37℃下進行。
然后從孔中取上清樣品(三份)，根據Komurian-Pradel，F.在J.Virol.Methods，2001，95，111-119中說明的程序，使用RT-PCR對HCVRNA定量。
圖1中給出的結果(每毫升上清中的RNA拷貝數，其為時間的函數)，菱形代表使用標準培養基，正方形代表使用促進脂蛋白合成和分泌的培養基。
此圖證明，使用具有分泌和合成脂蛋白能力的細胞、以及將細胞至于有利條件下，促進了病毒的復制及分泌。
實施例3在培養基中加入脂質對于促進脂蛋白合成和分泌的重要性首先將Hep G2細胞于前文實施例2中所說明的改良培養基中培養24小時，按照每孔150 000個細胞的比例加入Falcon 24孔培養板。
在病毒存在下(比例為每孔400 000 HCV RNAs)，將細胞在添加0.2％BSA的DMEM中單獨培養或與0.1μm25-羥-膽固醇共同培養6小時。
按照前文實施例2指示洗滌細胞，并在改良培養基中培養。
細胞接種3天后，加入含有0.15mM油酸的油酸-BSA混合液。
收集上清，通過RT-PCR對HCV RNA進行定量。
圖2給出了證明使用油酸的重要性的結果，菱形代表僅使用改良培養基，正方形代表使用添加了油酸和25-OH-膽固醇的改良培養基。
實施例4使用Caco-2細胞培養病毒Caco-2細胞在24孔板內的半透膜(Transwell，Costar)上，于標準培養基(添加10％胎牛血清的DMEM)中分化3周。
由此制備的細胞在比例為200 000HCV RNAs/孔的病毒顆粒中孵育6小時。
細胞經洗滌后，在DMEM中培養，所述DMEM中添加了10％胎牛血清、以及含0.15mM油酸的油酸-牛磺膽酸。
取插入物上方的上清，通過RT-PCR對病毒RNA進行定量。
圖3給出證明在促進脂蛋白合成和分泌的培養基中使用腸上皮細胞培養HCV病毒方法的結果。
權利要求
1.丙型肝炎病毒體外培養方法，其特征在于包括以下步驟在促進脂蛋白合成和分泌的適宜的培養基中，將含有丙型肝炎病毒RNA的顆粒與具有合成并且分泌脂蛋白能力的細胞接觸，以及收集由此得到的病毒。
2.權利要求1的方法，其特征在于，含有丙型肝炎病毒RNA的所述顆粒為LVP脂-病毒-顆粒。
3.權利要求1或2的方法，其特征在于，具有合成和分泌脂蛋白能力的細胞選自自發具有該能力的細胞、以及在促進細胞分化或再分化的培養基中經誘導后獲得該能力或者轉染了合成載脂蛋白B和微粒體甘油三酯轉運蛋白的基因后而獲得該能力的細胞。
4.權利要求3的方法，其特征在于，使用的細胞為在促進該細胞分化或再分化的培養基中經誘導后獲得合成和分泌脂蛋白能力的細胞。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其特征在于，所述細胞為腸上皮細胞。
6.權利要求5的方法，其特征在于，所述細胞為Caco-2細胞。
7.權利要求4-6中任一項的方法，其特征在于細胞用添加10％胎牛血清的DMEM培養基預處理3周。
8.權利要求1-4中任一項的方法，其特征在于，所述細胞為肝細胞癌細胞。
9.權利要求8的方法，其特征在于，所述肝細胞癌細胞為Hep G2細胞。
10.權利要求8和9中任一項的方法，其特征在于，預先將所述細胞與含有誘導脂蛋白合成的試劑的改良DMEM培養基接觸。
11.權利要求10的方法，其特征在于，誘導脂蛋白合成的所述試劑為油酸。
12.前述權利要求中任一項的方法，其特征在于，促進該脂蛋白合成和分泌的所述培養基來源于改良的DMEM培養基，其中添加了促進培養細胞代謝的試劑以及至少一種誘導脂蛋白合成的試劑。
13.權利要求12的方法，其特征在于，所述培養基包括作為脂蛋白合成誘導試劑的油酸。
14.權利要求13的方法，其特征在于，所述培養基還含有作為另一脂蛋白合成誘導試劑的22-羥-膽固醇或25-羥-膽固醇。
15.用于篩選和/或選擇至少一種抗病毒分子的方法，其特征在于，它包括在權利要求1-14中任一項的培養方法的過程中將所述抗病毒分子與培養基接觸這一步驟。
16.可以定性和/或定量影響HCV在體內繁殖和復制的治療組合物，其特征在于，該組合物包括能夠調節、壓制或抑制脂蛋白合成的試劑以及其它物質。
全文摘要
本發明涉及一種體外培養HCV病毒的方法，包括步驟在促進脂蛋白合成和分泌的適宜的培養環境下，將含有丙型肝炎病毒RNA的顆粒與能夠合成并且分泌脂蛋白的細胞接觸，以及收集由此得到的病毒。本發明具有診斷和治療應用。
文檔編號C12N7/02GK1662646SQ03814092
公開日2005年8月31日 申請日期2003年6月16日 優先權日2002年6月18日
發明者P·安德烈, F·克姆里安-普拉德爾, V·勒特奧, G·帕蘭赫斯-巴卡拉 申請人:拜奧默里克斯公司, 國家健康醫學研究所