磷脂酶,編碼磷脂酶的核酸以及制備和應用磷脂酶的方法
                            
            
                            
            文檔序號：449671閱讀：350來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：磷脂酶,編碼磷脂酶的核酸以及制備和應用磷脂酶的方法
            
技術領域：
            本發明總體上與磷脂酶，編碼磷脂酶的多核苷酸，制備以及應用這些多核苷酸和多肽的方法。特別地，本發明提供具有磷脂酶活性的新穎多肽，編碼它們的核酸以及與它們結合的抗體。也提供工業方法和包括應用這些磷脂酶的產品。 
            
背景技術：
             磷脂酶是水解磷脂的酯鍵的酶。與它們在磷脂代謝的重要性相對應，這些酶廣泛存在于真核和原核生物中。磷脂酶影響代謝，生物膜的形成和重組，并且磷脂酶也涉及信號的級聯。按照磷脂分子攻擊的鍵的位置，已知有幾種類型的特異性不同的磷脂酶。磷脂酶A1(PLA1)去除1-位的脂肪酸而產生游離的脂肪酸和1-溶血-2-酰基磷脂。磷脂酶A2(PLA2)去除2-位的脂肪酸而產生游離的脂肪酸和1-酰基-2-溶血磷脂。PLA1和PLA2酶可能是在細胞內也可以在細胞外，是膜結合的或者可溶的。發現胞內的PLA2存在于幾乎所有的哺乳動物細胞中。磷脂酶C(PLC)去除磷酸組分，產生1，2二酰基甘油和磷基。磷脂酶D(PLD)產生1，2-二酰基甘油磷酸和堿性基團。PLC和PLD在細胞功能和信號傳導中是重要的。PLD曾經是在生物催化中主要的磷脂酶(參見，如，Godfrey，T.and West S.(1996)工業酶學，299-300，Stockton Press，New York)。馬鈴薯塊莖儲藏蛋白(Patatins)是另一類磷脂酶，認為其作用如同PLA(參見例如，Hirschberg HJ，et al.，(2001)，EurJ Biochem 268(19)5037-44)。
            
普通的含油種子，如大豆，油菜籽，向日葵籽，芝麻和花生用于油的來源和原料。在榨油的過程中，種子用機械和熱處理。油分離，并且用溶劑從粗粉中分離。應用蒸餾法，從油中分離出溶劑并且回收。油經過“脫膠(degummed)”并且進行精練。粗粉中的溶劑組分可以通過“脫溶劑烤爐”的熱處理來蒸發，隨后，粗粉干燥和冷卻。當溶劑通過蒸餾分離以后，產生的粗油經過特殊的脫膠程序和物理精練的方法加工成為食用油。也可以作為原料產生脂肪酸和甲基酯。粗粉可以用做動物飼料(animal rations)。
            
脫膠(degumming)是精練植物油的第一步，脫膠設計為去除與油一起抽提、但影響以后的工藝過程的污染磷脂。這些磷脂僅僅以無水形式溶于植物油中，如果通過簡單的水合作用，磷脂可以沉淀并去除。水合作用一般通過少量的水與充分干燥的油連續混合進行。典型地，水的量是磷脂含量的75％，磷脂的量典型地是1到1.5％。雖然假如在50℃到80℃的范圍內，油的粘度會降低，水合膠的分離更好，但是溫度條件并不高度嚴格。
            
很多油脫膠(oil degumming)的方法目前都在使用。油脫膠的過程可以通過使用磷脂酶進行酶協助。磷脂酶A1和A2已經應用于不同商業過程中的油脫膠過程，如“ENZYMAXTM脫膠”(Lurgi Life Science Technologies GmbH，Germany)。也已經考慮磷脂酶C(PLC)應用于油的脫膠，因為磷脂酶C在磷脂上作用產生的磷酸組分是水溶性的，并且容易去除，而且甘油二酯與油在一起，降低了損失；參見，如Godfrey，T.and West S.(1996)工業酶學pp.299-300，Stockton Press，NewYork，Dahlke(1998)“An enzymatic process for the physical refining of seed oils，”Chem.Eng.Technol.21278-281，Clausen(2001)“Enzymatic oil degumming by anovel microbial phospholipase，”Eur.J.Lipid Sci.Technol.103333-340。
            
高磷脂油(high phosphatide oils)，例如黃豆，蕓苔和向日葵的處理方法不同于別的油如棕櫚的處理方法。不像低磷脂油的蒸汽或“物理精練”處理過程，這些高磷油需要特定的化學和機械處理去除含磷的磷脂。這些油一般通過化學精練的過程，化學精練過程必需中和形成皂的游離脂肪酸和一種不溶性的膠組成。中和過程對于去除游離脂肪酸和磷脂非常有效，但是該過程也導致了顯著的產率損失和質量的下降。在一些情況下，高磷脂的粗制油在苛性中和前進行脫膠。利用卵磷脂的大豆油就是這種情況，其中的油首先用水或者酸來脫膠。
            
植物固醇(phytosterols)(植物甾醇(plant sterols))是天然產物的三萜家族的成員，其包括超過100種不同的植物固醇和超過4000種其它種類的三萜。總體上，認為植物固醇是由于增加類固醇/磷脂的比例而導致膜的硬化從而穩定植物的細胞膜。在化學上，植物固醇在結構上非常類似于膽固醇。主要的植物固醇是β-谷甾醇，蕓苔固醇和豆固醇。其它的包括豆甾烯醇(二氫β-谷甾醇)，二氫谷甾醇，24-脫氫膽固醇，海綿甾醇，海綿甾醇，γ-谷甾醇和菜子甾醇。
            
植物甾醇是健康和營養工業中的重要的農產品。它們用于制造化妝品的乳化劑并且為激素藥物的生產提供大多數甾體中間體和前體。植物甾醇的飽和類似物以及它們的酯已經被認為是益于心血管健康的有效的降低膽固醇的試劑。植物甾醇通過在腸腔中抑制膽固醇的吸收來降低血清中的膽固醇水平，并且植物甾醇在很低的水平具有免疫調節特征，包括T淋巴細胞增強的細胞應答和抗癌癥細胞系的天然殺傷細胞的細胞毒性。此外，它們在治療肺結核，風濕性關節炎，控制HIV-感染的病人和馬拉松選手的免疫壓力抑制的臨床研究中的治療效應已經得到證明。
            
植物固醇的酯類，也指植物甾醇酯，由美國食品藥品管理局(FDA)批準為GRAS(一般認為安全，Generally Recognized As Safe)，用于人造黃油，并在1999年推廣。2000年9月，FDA也提出一個過渡性的規定，其準許了含有植物甾醇酯類的食品的健康申明標記(health-claiming labeling)。因此，用植物甾醇酯類進行營養強化的食品是高度預期被消費者接受的。
            
發明概述本發明提供包括與本發明的典型序列，例如SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQID NO15，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21，SEQ ID NO23，SEQID NO25，SEQ ID NO27，SEQ ID NO29，SEQ ID NO.31，SEQ ID NO33，SEQID NO35，SEQ ID NO37，SEQ ID NO39，SEQ ID NO41，SEQ ID NO43，SEQID NO45，SEQ ID NO47，SEQ ID NO49，SEQ ID NO51，SEQ ID NO53，SEQID NO55，SEQ ID NO57，SEQ ID NO59，SEQ ID NO61，SEQ ID NO63，SEQID NO65，SEQ ID NO67，SEQ ID NO69，SEQ ID NO71，SEQ ID NO73，SEQID NO75，SEQ ID NO77，SEQ ID NO79，SEQ ID NO81，SEQ ID NO83，SEQID NO85，SEQ ID NO87，SEQ ID NO89，SEQ ID NO91，SEQ ID NO93，SEOID NO95，SEQ ID NO97，SEQ ID NO99，SEQ ID NO101，SEQ ID NO103，SEQ ID NO105在至少大約10，15，20，25，30，35，40，45，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1000，1050，1100，1150，1200，1250，1300，1350，1400，1450，1500，1550，1600，1650，1700，1750，1800，1850，1900，1950，2000，2050，2100，2200，2250，2300，2350，2400，2450，2500，或者更多的殘基范圍內具有至少大約50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多的或者完全的(100％)的序列同一性的核酸序列的分離的或者重組的核酸，編碼具有磷脂酶，例如磷脂酶A，C或者D活性的至少一個多肽，同時序列同一性用序列比較算法分析或者目測檢查來確定。
            
發明提供包括與SEQ ID NO1在至少大約10，15，20，25，30，35，40，45，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850更多連續的殘基范圍內具有至少81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多，或者完全的(100％)序列同一性的核酸序列的分離的或者重組的核酸，其中該核酸編碼具有磷脂酶，例如磷脂酶A，B，C或者D活性的至少一個多肽，同時序列同一性用序列比較算法分析或者目測檢查來確定。
            
發明提供包括與SEQ ID NO3在至少大約10，15，20，25，30，35，40，45，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850更多連續的殘基范圍內具有至少78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多，或者完全的(100％)序列同一性的核酸序列的分離的或者重組的核酸，其中核酸編碼具有磷脂酶，例如磷脂酶A，B，C或者D活性的至少一個多肽，同時序列同一性用序列比較算法分析或者目測檢查來確定。
            
發明提供包括與SEQ ID NO5在至少大約10，15，20，25，30，35，40，45，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850更多連續殘基范圍內具有至少78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多，或者完全的(100％)序列同一性的核酸序列的分離的或者重組的核酸，其中核酸編碼具有磷脂酶，例如磷脂酶A，B，C或者D活性的至少一個多肽，同時序列同一性用序列比較算法分析或者目測檢查來確定。
            
發明提供包括與SEQ ID NO7在至少大約10，15，20，25，30，35，40，45，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850更多連續殘基范圍內具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多，或者完全的(100％)序列同一性的核酸序列的分離的或者重組的核酸，其中核酸編碼具有磷脂酶，例如磷脂酶A，B，C或者D活性的至少一個多肽，同時序列同一性用序列比較算法分析或者目測檢查來確定。
            
在可選擇的方面，分離的或者重組的核酸編碼包括在序列SEQ ID NO2，SEQID NO4，SEQ ID NO6，或者SEQ ID NO8中闡明的序列的多肽。一方面，這些多肽具有磷脂酶，例如，磷脂酶A，B，C或者D活性。
            
一方面，序列比較算法是BLAST算法，如BLAST 2.2.2版算法。一方面，篩選設置(filtering setting)設為blastall-p，blastp-d“nr pataa”-F F，所有其它可選項(options)設為默認值。
            
一方面，磷脂酶活性包括催化甘油磷酸酯鍵的水解(即，切斷甘油磷酸酯鍵)。磷脂酶活性可以包括催化植物油中磷脂的酯鍵的水解。植物油磷脂可以包括油籽的磷脂。磷脂酶活性包括磷脂酶C(PLC)活性，磷脂酶A(PLA)活性，如磷脂酶A1或者磷脂酶A2活性，磷脂酶D(PLD)活性，如磷脂酶D1或者磷脂酶D2活性或者patatin活性。磷脂酶活性可以包括糖蛋白的水解，如，在馬鈴薯塊莖中發現的糖蛋白的水解。磷脂酶活性可以包括馬鈴薯塊莖儲藏蛋白(patatin)的酶活性，磷脂酶活性可以包括脂酰水解酶(LAH)活性。
            
一方面，分離的或者重組的核酸編碼具有熱穩定性的磷脂酶活性的多肽。多肽可以在包括大約37℃到95℃；大約55℃到85℃，70℃到95℃，或者大約90℃到95℃之間的溫度范圍的條件下保持磷脂酶活性。另一方面，分離或者重組的核酸編碼具有耐熱的磷脂酶活性的多肽。多肽可以在暴露于37℃到95℃的溫度范圍內或者高于55℃到85℃的范圍內后仍保持磷脂酶活性。一方面，多肽在pH 4.5下，暴露于高于90℃到95℃的范圍后仍保持磷脂酶活性。
            
多肽在包括大約pH 7，pH 6.5，pH 6.0，pH 5.5，pH 5，或者pH 4.5的條件下可以保持磷脂酶的活性。多肽可以在包括溫度范圍為大約40℃到大約70℃的條件下保持磷脂酶活性。
            
一方面，分離的或者重組的核酸包括在嚴謹條件下與在SEQ ID NO1，SEQ IDNO3，SEQ ID NO5，或SEQ ID NO7中闡明的序列雜交的核酸，其中該核酸編碼具有磷脂酶活性的多肽。正如在此所述的，核酸可以是基因或者轉錄本的至少大約10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850殘基或者全長殘基，具有或者不具有信號序列。正如在此所述的，嚴謹條件可以是高度嚴謹，中度嚴謹或者低嚴謹性。嚴謹條件可以包括洗滌步驟，如，包括在0.2×SSC，大約65℃條件下洗滌大約15分鐘的洗滌步驟。
            
發明提供用于鑒定編碼具有磷脂酶，例如磷脂酶活性的多肽的核酸的核酸探針，其中該探針包括發明的序列，例如在SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ IDNO5，或者SEQ ID NO7中闡明的序列的至少10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850個或者更多的連續堿基，該探針通過結合或者雜交確定核酸。探針可以包括含有在SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，和/或SEQ ID NO7中闡明的序列的至少大約10到50，大約20到60，大約30到70，大約40到80，或者大約60到100的連續堿基的寡聚核苷酸。
            
發明提供用于鑒定編碼具有磷脂酶，如，磷脂酶活性的多肽的核酸的核酸探針其中探針包括發明的核酸，例如在至少大約10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850或者更多連續殘基的范圍內，與SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ IDNO5，和/或SEQ ID NO7或者它們的亞序列具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多，或者完全的(100％)的序列同一性的核酸，其中序列同一性通過序列比較算法分析或者目測檢查確定。
            
發明提供用于擴增編碼具有磷脂酶活性的多肽的核酸的擴增引物序列對，其中引物對可以擴增包括發明的核酸序列或者片段或者亞序列的核酸序列。擴增引物序列的每一個成員可能包括含有至少大約10到50個連續堿基元列，或者大約12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或者25個連續堿基元列的寡聚核苷酸。
            
發明提供擴增引物對，其中引物對包括具有如發明的核酸的大約第一個(5′端)12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或者25個殘基所闡明的序列的第一成員，和具有與第一成員的互補鏈的第一個(5′)12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或者25個殘基所闡明的序列的第二成員。
            
應用發明的擴增引物對，發明提供通過擴增，例如，聚合酶鏈式反應(PCR)產生的磷脂酶。應用發明的擴增引物對，發明提供通過擴增，例如，聚合酶鏈式反應(PCR)制備磷脂酶的方法。一方面，擴增引物擴增來自文庫的核酸，如，基因文庫(gene library)，如環境文庫(environmental library)。
            
發明提供擴增編碼具有磷脂酶活性的多肽的核酸的方法，包括用可以擴增發明的核酸序列或者其片段或者其亞序列的擴增引物序列來擴增模板核酸序列。擴增引物可以是發明的擴增引物對。
            
發明提供包括發明的核酸或者它的亞序列的表達盒(expression cassettes)。一方面，表達盒可以包括連接啟動子的核酸。啟動子可以是病毒的，細菌的，哺乳動物或者植物啟動子。一方面，植物啟動子可以是馬鈴薯，水稻，玉米，小麥，煙草或者大麥啟動子。啟動子可以是組成型啟動子。組成型啟動子可以包括CaMV35S。另一方面，啟動子可以是可誘導的啟動子。一方面，啟動子可以是組織-特異性啟動子或者環境調控或者發育調控啟動子。因此，啟動子可以是，如，種子-特異性，葉子-特異性，根-特異性，莖-特異性或者脫落-誘導的啟動子。一方面，表達盒可以進一步包括植物的或者植物病毒的表達載體。
            
發明提供包括發明的表達盒(如載體)或者發明的核酸的克隆載體。克隆載體可以是病毒載體，質粒，噬菌體，噬菌質粒，粘粒，fosmid，細菌噬菌體或者人工染色體。病毒載體可以包括腺病毒載體，逆轉錄病毒載體或者腺相關病毒載體。克隆載體可以包括細菌人造染色體(BAC)，質粒，細菌噬菌體P1衍生載體(PAC)，酵母人造染色體(YAC)，或者哺乳動物人造染色體(MAC)。
            
發明提供含有發明核酸或者發明表達盒(如，載體)或者發明克隆載體的轉化的細胞。一方面，轉化細胞可以是細菌細胞，哺乳動物細胞，真菌細胞，酵母細胞，昆蟲細胞或者植物細胞。一方面，植物細胞可以是馬鈴薯，小麥，水稻，玉米，煙草或者大麥細胞。
            
發明提供包括發明的核酸或者發明的表達盒(如，載體)的轉基因非-人類動物。一方面，動物是小鼠。
            
發明提供包括發明的核酸或者發明的表達盒(如，載體)的轉基因植物。轉基因植物可以是玉米植物，馬鈴薯植物，番茄植物，小麥植物，油籽植物，油菜籽植物，大豆植物，水稻植物，大麥植物，或煙草植物。發明提供包括發明的核酸或發明的表達盒(例如，載體)的轉基因種子。轉基因種子可以是玉米種子，小麥種子，油籽，油菜籽(蕓苔植物)，大豆種子，棕櫚種子，向日葵種子，芝麻種子，花生或煙草植物種子。
            
發明提供含有在嚴謹條件下可以與發明的核酸互補或雜交的核酸序列的反義寡核苷酸。發明提供抑制細胞內磷脂酶信使翻譯的方法，包括往細胞中施用或者在細胞中表達包括在嚴謹條件下可以與發明的核酸互補或雜交的核酸序列的反義寡核苷酸。
            
發明提供包括在嚴謹條件下可以與發明的核酸互補或雜交的核酸序列的反義寡聚核苷酸。發明提供抑制細胞內磷脂酶信使翻譯的方法，包括往細胞中施用或者在細胞中表達包括在嚴謹條件下可以與發明的核酸互補或雜交的核酸序列的反義寡核苷酸。反義寡聚核苷酸可以是在10到50，大約20到60，大約30到70，大約40到80，大約60到100，大約70到110，或者大約80到120個堿基的長度。
            
發明提供抑制細胞內磷脂酶如，磷脂酶信使翻譯的方法，包括往細胞中施用或者在細胞中表達包括在嚴謹條件下可以與發明的核酸互補或雜交的核酸序列的反義寡核苷酸。發明提供包括發明序列的亞序列的雙鏈抑制RNA(RNAi)分子。一方面，RNAi長度是大約15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25或者更多的雙鏈核苷酸。發明提供在細胞內抑制磷脂酶，如磷脂酶表達的方法，包括往細胞中施用或者在細胞中表達雙鏈抑制RNA(RNAi)，其中RNA包括發明序列的亞序列。
            
發明提供包括與發明的典型多肽或肽在至少大約25，50，75，100，125，150，175，200，225，250，275，300，325，350或者更多殘基，或者全長的多肽范圍內具有至少大約50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多，或者完全的(100％)同一性的氨基酸序列的分離的或者重組的多肽，序列同一性通過序列比較算法分析或者通過目測觀察來確定。發明的典型多肽或者肽序列包括SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQID NO6或者SEQ ID NO8。一方面，發明提供包括與SEQ ID NO2具有至少81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多，或者完全的(100％)序列同一性的氨基酸序列的分離的或者重組的多肽。一方面，發明提供包括與SEQID NO4具有至少78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多，或者完全的(100％)序列同一性的氨基酸序列的分離的或者重組的多肽。一方面，發明提供包括與SEQ ID NO6具有至少78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多，或者完全的(100％)序列同一性的氨基酸序列的分離的或者重組的多肽。一方面，發明提供包括與SEQID NO8具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或者更多，或者完全的(100％)序列同一性的氨基酸序列的分離的或者重組的多肽。發明提供由發明的核酸編碼的分離的或者重組的多肽。在可選擇方面，多肽可以具有如SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ IDNO6，或者SEQ ID NO8中闡明的序列。多肽可以具有磷脂酶活性，如，磷脂酶A，B，C或者D活性。
            
發明提供含有缺乏信號序列的發明的多肽的分離的或者重組的多肽，一方面，缺乏信號肽的多肽與SEQ ID NO2的殘基30到287具有至少81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或者更多序列同一性，缺乏信號肽的多肽具有與SEQ IDNO4的殘基25到283有至少78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多序列同一性的氨基酸序列，與SEQ ID NO6的殘基26到280有至少78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多序列同一性的氨基酸序列，與SEQ ID NO8的殘基40到330有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多的序列同一性的氨基酸序列。序列同一性通過序列比較算法分析或者通過目測觀察確定。
            
發明的另一方面提供分離的或者重組的多肽或者肽，分離的或者重組的多肽或者肽包括發明的多肽或肽序列，與之實質上的一致序列，與之互補序列的至少10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或者100或者更多的連續堿基。肽可以是，例如，產生免疫性的片段，基元(如，結合位點)或者活性位點。
            
一方面，發明分離的或者重組的多肽(有或沒有信號序列)具有磷脂酶活性。一方面，磷脂酶活性包括催化甘油磷酸酯鍵的水解(即，切割甘油磷酸酯鍵)。磷脂酶活性包括催化植物油中磷脂的酯鍵的水解。植物油磷脂可以包括油籽的磷脂。磷脂酶活性可以包括磷脂酶C(PLC)的活性，磷脂酶A(PLA)活性，如磷脂酶A1或者磷脂酶A2的活性，磷脂酶D(PLD)的活性，如磷脂酶D1或者磷脂酶D2的活性。磷脂酶活性可以包括水解糖蛋白，如，馬鈴薯儲存塊莖中的糖蛋白。磷脂酶活性可以包括脂酰水解酶(LAH)活性。
            
一方面，磷脂酶活性是熱穩定性的。多肽可以在包括溫度范圍在大約37℃到大約95℃之間，大約55℃到大約85℃之間，大約70℃到大約95℃之間，或者大約90℃到大約95℃之間的條件下保持磷脂酶活性。另一方面，磷脂酶活性可以是耐熱的。多肽可以在暴露于溫度范圍高于37℃到大約95℃，或者在高于55℃到大約85℃下后仍保持磷脂酶活性。一方面，多肽可以在暴露于溫度范圍在90℃到大約95℃，在pH4.5下后仍保持磷脂酶活性。
            
一方面，多肽可以在包括大約pH 6.5，pH 6，pH 5.5，pH 5，pH 4.5或者pH4的條件下保持磷脂酶活性。另一方面，多肽可以在包括大約pH 7，pH 7.5，pH 8，pH 8.5，pH 9，pH9.5，pH 10，pH 10.5，或pH 11的條件下保持磷脂酶活性。
            
一方面，分離的或者重組的多肽可以包括發明的多肽，其缺乏信號序列。一方面，分離的或者重組的多肽可以包括含有異源信號序列，如異源的磷脂酶或者非-磷脂酶的信號序列的本發明多肽。
            
發明提供含有與SEQ ID NO2的1到29殘基有至少95％，96％，97％，98％，99％，或者更多序列同一性的分離的或者重組的肽，含有與SEQ ID NO4的1到24殘基有至少95％，96％，97％，98％，99％，或者更多序列同一性的分離的或者重組的肽，含有與SEQ ID NO6的1到25殘基有至少95％，96％，97％，98％，99％，或者更多序列同一性的分離的或者重組的肽，含有與SEQ ID NO8的1到39殘基有至少95％，96％，97％，98％，99％，或者更多序列同一性的分離的或者重組的肽，和別的在其它的SEQ ID列表中闡明的信號序列，其中序列同一性通過序列比較算法分析或者通過目測觀察來確定。這些肽可以作為內源性磷脂酶或者其它磷脂酶，或者外源蛋白(非磷脂酶或者其它蛋白)的信號肽序列。一方面，發明提供包括第一結構域和至少第二結構域的嵌合蛋白，第一結構域包括發明的信號序列。蛋白可以是融合蛋白。第二結構域可以包括酶，酶可以是磷脂酶。
            
發明提供包括至少第一結構域和至少第二結構域的嵌合多肽，第一結構域包括發明的信號肽(SP)或催化結構域(CD)，或發明的磷脂酶的活性位點，第二結構域包括異源多肽或肽，其中異源多肽或者肽與信號肽(SP)或者催化結構域(CD)之間并沒有天然的聯系。一方面，異源多肽或者肽不是磷脂酶。異源多肽或者肽可以是信號肽(SP)或者催化結構域(CD)的氨基末端，羧基末端或者羧基和氨基末端。
            
發明提供分離的或者重組的編碼嵌合多肽的核酸，其中嵌合多肽包括至少第一結構域和至少第二結構域，第一結構域含有發明多肽的信號肽(SP)或者催化結構域(CD)或者活性位點，第二結構域包括異源多肽或者肽，其中異源多肽或者肽與信號肽(SP)或者催化結構域(CD)之間并不是天然聯合。
            
一方面，磷脂酶活性包括在大約37℃下，每毫克蛋白大約100到大約1000單位的特異活性。另一方面，磷脂酶活性包括每毫克蛋白大約500到大約700單位的特異活性。可選擇的，磷脂酶活性包括在大約37℃下，每毫克蛋白大約500到大約1200單位的特異活性。一方面，磷脂酶活性包括在大約37℃下，每毫克蛋白大約750到大約1000單位的特異活性。另一方面，耐熱性包含在加熱至升高的溫度以后，在37℃下保持至少一半磷脂酶的特異活性。可選擇的，耐熱性包含在加熱至升高的溫度以后，在37℃下每毫克蛋白保持大約500到大約1200單位的特異活性。
            
發明提供發明分離的或者重組的多肽，其中多肽包括至少一個糖基化位點，一方面，糖基化可以是N-連接糖基化。一方面，多肽可以是在畢赤酵母(P.pastoris)或者裂變酵母(S pombe.)表達后進行糖基化。
            
發明提供包括發明多肽的蛋白制備，其中蛋白制備包括液相，固相或者凝膠。
            
發明提供包括發明多肽和第二個蛋白或者結構域的異源二聚物。異源二聚物的第二成員可以是不同的磷脂酶，不同的酶或者另一個蛋白。一方面，第二結構域可以是多肽，異源二聚物可以是融合蛋白。一方面，第二結構域可以是抗原決定簇或者標記。一方面，發明提供包括發明多肽的同源二聚物。
            
發明提供具有磷脂酶活性的固定化多肽，其中多肽包含發明的多肽，發明核酸編碼的多肽，或者包括發明多肽和第二結構域的多肽。一方面，多肽可以固定于細胞，金屬，樹脂，多聚物，陶瓷，玻璃，微電極，石墨顆粒，珠子，凝膠，金屬板，陣列或者毛細管。
            
發明提供包含固定多肽的陣列，其中多肽是發明的磷脂酶或者發明核酸編碼的多肽。發明提供含有發明的固定化核酸的陣列。發明提供含有發明的固定化抗體的陣列。
            
發明提供特異結合于發明多肽或者發明的核酸編碼的多肽的分離的或者重組的抗體。抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體。發明提供含有發明抗體的雜交瘤。
            
發明提供分離和鑒定具有磷脂酶活性的多肽的方法，包括以下步驟(a)提供發明的抗體；(b)提供含有多肽的樣品；以及(c)在抗體特異結合于多肽的條件下，步驟(a)的抗體與步驟(b)的樣品接觸，然后分離和鑒定磷脂酶。發明提供制備抗-磷脂酶抗體的方法，包括向非-人類動物以足夠的量施用發明的核酸或者發明的多肽，產生體液免疫應答，從而制備抗-磷脂酶抗體。
            
發明提供產生重組的多肽的方法，包含以下的步驟(a)提供可操作地連接于啟動子的發明的核酸，以及(b)在多肽表達的條件下表達步驟(a)的核酸，然后產生重組多肽。核酸可以包括與SEQ ID NO1序列在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少85％的同一性的序列，與SEQ ID NO3的序列在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少80％的同一性的序列，與SEQ ID NO5序列在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少80％的同一性的序列，或者與SEQ ID NO7序列在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少70％的同一性的序列，其中序列同一性通過序列比較算法分析或者目視檢測觀察來確定。核酸可以包括在嚴謹的條件下與SEQ ID NO1所列核酸或者亞序列，與SEQ ID NO3所列核酸或者亞序列，與SEQ ID NO5所列核酸或者亞序列，與SEQ ID NO7所列核酸或者亞序列雜交的核酸。方法進一步包括用步驟(a)的核酸轉化宿主細胞，隨后表達步驟(a)的核酸，然后在轉化的細胞中產生重組的多肽。方法進一步包括把步驟(a)的核酸插入到宿主非人類動物中，隨后表達步驟(a)的核酸，然后在宿主非人動物中產生重組多肽。
            
發明提供鑒定具有磷脂酶活性的多肽的方法，包括以下的步驟(a)提供發明的多肽或者編碼發明多肽的核酸，或者片段或者變異體，(b)提供磷脂酶底物；(c)步驟(a)的多肽或者片段或者變異體與步驟(b)的底物接觸，檢測底物的量的增加或者反應產物的量的減少，其中底物的量的減少或者反應產物的量的增加檢測了具有磷脂酶活性的多肽。在可選擇的方面，核酸可以包括與SEQ ID NO1在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少85％的同一性的序列，與SEQ ID NO3在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少80％的同一性的序列，與SEQ ID NO5在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少80％的同一性的序列，或者與SEQ IDNO7在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少70％的同一性的序列，其中序列同一性通過序列比較算法分析或者目視檢測觀察來確定。核酸可以包括在嚴謹的條件下與SEQ ID NO1所列核酸或者亞序列，與SEQ ID NO3所列核酸或者亞序列，與SEQ ID NO5所列核酸或者亞序列，與SEQ ID NO7所列核酸或者亞序列雜交的核酸。
            
發明提供確定磷脂酶底物的方法，包括以下步驟(a)提供發明的多肽或者編碼發明多肽的核酸；(b)提供檢測底物；以及(c)步驟(a)的多肽與步驟(b)的檢測底物接觸，檢測底物的量的增加或者反應產物的量的減少，其中底物的量的減少或者反應產物的量的增加確定底物為磷脂酶底物。在可選擇的方面，核酸可以包括與SEQ ID NO1在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少85％的同一性的序列，與SEQ ID NO3在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少80％的同一性的序列，與SEQ ID NO5在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少80％的同一性的序列，或者與SEQ ID NO7在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少70％的同一性的序列，其中序列同一性通過序列比較算法分析或者可視的檢測觀察來確定。在可選擇的方面，核酸可以包括在嚴謹的條件下與SEQ ID NO1所列核酸或者亞序列，與SEQ ID NO3所列核酸或者亞序列，與SEQ ID NO5所列核酸或者亞序列，與SEQ ID NO7所列核酸或者亞序列雜交的核酸。
            
發明提供確定是否化合物特異結合于磷脂酶的方法，包括以下步驟(a)在允許核酸翻譯成多肽的條件下，表達核酸或者包括該核酸的載體，其中核酸和載體包括發明的核酸或者載體；或者，提供發明的多肽，(b)使多肽與檢測化合物接觸；并且，(c)確定是否檢測化合物特異結合于多肽，從而確定該化合物特異地結合于磷脂酶。在可選擇的方面，核酸可以包括與SEQ ID NO1在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少85％的同一性的序列，與SEQ ID NO3在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少80％的同一性的序列，與SEQ ID NO5在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少80％的同一性的序列，或者與SEQ ID NO7在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少70％的同一性的序列，其中序列同一性通過序列比較算法分析或者可視的檢測觀察來確定。在可選擇的方面，核酸可以包括在嚴謹的條件下與SEQ ID NO1所列核酸或者亞序列，與SEQ ID NO3所列核酸或者亞序列，與SEQ ID NO5所列核酸或者亞序列，與SEQ ID NO7所列核酸或者亞序列雜交的核酸。
            
發明提供確定磷脂酶活性的調節物的方法，包括以下步驟(a)提供發明的多肽或者編碼發明多肽的核酸；(b)提供檢測化合物；以及(c)步驟(a)的多肽與步驟(b)的檢測化合物接觸，測定磷脂酶的活性，其中在檢測化合物存在的條件下檢測的磷脂酶活性與在無檢測化合物存在的條件下檢測的磷脂酶活性相比得到的變化證明檢測化合物調節磷脂酶的活性。在可選擇的方面，核酸可以包括與SEQ ID NO1在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少85％的同一性的序列，與SEQ ID NO3在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少80％的同一性的序列，與SEQ ID NO5在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少80％的同一性的序列，或者與SEQ ID NO7在至少大約100個殘基的范圍內，具有至少70％的同一性的序列，其中序列同一性通過序列比較算法分析或者可視的檢測觀察來確定。在可選擇的方面，核酸可以包括在嚴謹的條件下與SEQ ID NO1所列核酸或者亞序列，與SEQ ID NO3所列核酸或者亞序列，與SEQ ID NO5所列核酸或者亞序列，與SEQ ID NO7所列核酸或者亞序列雜交的核酸。
            
一方面，磷脂酶活性通過提供磷脂酶底物并且檢測底物的量的增加或者反應產物的量的減少測定。與不存在檢測化合物的條件下底物或者反應產物的量相比較，在存在檢測化合物的條件下，底物的量的減少或者反應產物的量的增加證明檢測化合物是磷脂酶活性的激活劑。與不存在檢測化合物的條件下底物或者反應產物的量相比較，在存在檢測化合物的條件下，底物的量的增加或者反應產物的量的減少證明檢測化合物是磷脂酶活性的抑制劑。
            
發明提供包含處理器和數據存儲設備的計算機系統，其中所述的數據存儲設備已經存儲了發明的多肽序列或者發明的核酸序列。
            
一方面，計算機系統可以進一步包括序列比較算法，和已經存儲了至少一個參照序列的數據存儲設備。序列比較算法可以包括表明多態性的計算機程序。計算機系統可以進一步包括鑒定所述序列的一個或者多個特征的鑒定器。
            
發明提供已經存儲了包括發明的多肽序列或發明的核酸序列的序列的計算機可讀存儲介質。
            
發明提供鑒定序列的特征的方法，包括以下步驟(a)應用鑒定序列的一個或者多個特征的計算機程序來讀取序列，其中該序列包括發明的多肽序列或者發明的核酸序列；和(b)用計算機程序鑒定序列中的一個或者多個特征。
            
發明提供比較第一序列和第二序列的方法，包括以下步驟(a)應用比較序列的計算機程序讀取第一序列和第二序列，其中第一序列包括發明的多肽序列或者發明的核酸序列；并且，(b)用計算機程序確定第一序列和第二序列的差別。一方面，確定第一序列和第二序列的差異的步驟進一步包括確定多態性的步驟。一方面，方法進一步包括鑒定序列中一個或者多個特征的鑒定器(以及鑒定器的應用)。一方面，方法包括用計算機程序讀取第一序列，鑒定序列中的一個或者多個特征。
            
發明提供從環境樣品中分離或者回收編碼具有磷脂酶活性的多肽的核酸的方法，包括以下步驟(a)提供擴增編碼具有磷脂酶活性的多肽的核酸的擴增引物序列對，其中引物對可以擴增發明的核酸(如，SEQ ID NO1或者亞序列，SEQ IDNO3或者亞序列，SEQ ID NO5核酸或者亞序列，SEQ ID NO7核酸或者亞序列。等等)；(b)從環境樣品中分離核酸或者處理環境樣品以便樣品中的核酸可以與擴增引物對雜交；和(c)步驟(b)的核酸和步驟(a)的擴增引物對結合，并且從環境樣品中擴增核酸，隨后從環境樣品中分離或者回收編碼具有磷脂酶活性的多肽的核酸。一方面，擴增引物序列對的每一個成員包括含有發明的核酸序列的至少大約10到50連續堿基的寡核苷酸。一方面，擴增引物序列對是發明的擴增對。
            
發明提供從環境樣品中分離或者回收編碼具有磷脂酶活性的多肽的核酸的方法，包括以下步驟(a)提供包含發明的核酸序列，或者亞序列的多核苷酸探針；(b)從環境樣品中分離核酸或者處理環境樣品以便樣品中的核酸可以與步驟(a)的多核苷酸探針雜交；(c)步驟(b)的分離的核酸或者經處理的環境樣品與步驟(a)的多核苷酸探針結合；和(d)與步驟(a)的多核苷酸探針特異雜交的核酸分離，因此從環境樣品中分離或者回收編碼具有磷脂酶活性的多肽的核酸。在可選擇的方面，環境樣品包括水樣品，液體樣品，土壤樣品，氣體樣品或者生物樣品。在可選擇的方面，生物樣品來源于細菌細胞，原生動物細胞，昆蟲細胞，酵母細胞，植物細胞，真菌細胞或者哺乳動物細胞。
            
發明提供產生編碼磷脂酶的核酸的變異體的方法，包括以下步驟(a)提供包括發明核酸的模板核酸；(b)模板序列中修飾，缺失或者添加一個或者多個核苷酸，或者它們的組合，產生模板核酸的變異體。
            
一方面，該方法進一步包括表達變異核酸，產生變異磷脂酶多肽。可選擇的方面，修飾，添加或者缺失由錯誤傾向PCR，重排，寡聚核苷酸定向誘變，組裝PCR，有性PCR誘變，體內誘變，盒式誘變，回歸整體誘變，指數整體誘變，定點誘變，基因重裝配，基因位點飽和誘變(GSSM)，合成連接重裝配(SLR)和/或其組合的方法來引入。在可選擇的方面，修飾，添加或者缺失由以下方法引入，包括重組，回歸序列重組，磷硫修飾的DNA誘變，含有尿嘧啶的模板誘變，缺口雙螺旋誘變，點錯配修復誘變，修復-缺陷宿主株誘變，化學誘變，放射誘變，缺失誘變，限制選擇誘變，限制純化誘變，人工基因誘變，整體誘變，嵌合核酸多聚體的產生和/或它們的組合。
            
一方面，該方法被反復重復，直到產生與模板核酸編碼的磷脂酶相比，具有改變的或者不同的活性或者改變的或者不同的穩定性的磷脂酶。一方面，改變的或者不同的活性是在酸性條件下的磷脂酶活性，其中模板核酸編碼的磷脂酶在酸性條件下沒有活性。一方面，改變的或者不同的活性是在較高的溫度下的磷脂酶活性。其中模板核酸編碼的磷脂酶在較高溫度的條件下沒有活性。一方面，該方法反復重復，直到產生與模板核酸的密碼子選擇相比具有改變的密碼子選擇的序列編碼的磷脂酶。該方法反復重復，直到產生與模板核酸產生的信使相比具有更高或更低水平的信使表達或者信使穩定性的磷脂酶基因。
            
發明提供改變編碼磷脂酶的核酸中密碼子，增強其在宿主細胞中表達的方法，該方法包括(a)提供發明的編碼磷脂酶的核酸；(b)鑒定步驟(a)的核酸中的非優選的或者較不優選的密碼子，并且用編碼相同氨基酸的優選的或者中性應用的密碼子替換，其中優選的密碼子是在宿主細胞的基因編碼區中超常出現的密碼子，非-優選的或者較不優選的密碼子是在宿主細胞的基因編碼區中不常出現的密碼子，從而修飾改變核酸，增強其在宿主細胞的表達。
            
發明提供在編碼磷脂酶的核酸中修飾密碼子的方法，該方法包括(a)提供發明的編碼磷脂酶的核酸；并且，(b)確定步驟(a)的核酸中的密碼子，作為被取代的密碼子，把它用編碼同一個氨基酸的不同的密碼子替換，從而修飾編碼磷脂酶的核酸中的密碼子。
            
發明提供修飾編碼磷脂酶的核酸中的密碼子的方法，增強其在宿主細胞中的表達，該方法包括(a)提供發明的編碼磷脂酶的核酸，并且(b)鑒定步驟(a)的核酸中的非優選的或者較不優選的密碼子，用編碼相同氨基酸的優選的或者中性應用的密碼子來替換，其中優選的密碼子是在宿主細胞的基因編碼區中超常出現的密碼子，不優選的或者較不優選的密碼子是在宿主細胞的基因編碼區中不常出現的密碼子，從而修飾核酸，增強其在宿主細胞的表達。
            
發明提供修飾編碼磷脂酶的核酸的密碼子的方法，降低其在宿主細胞的表達，該方法包括，(a)提供發明的編碼磷脂酶的核酸；和，(b)鑒定步驟(a)的核酸中的至少一個優選的密碼子并且用編碼相同氨基酸的不優選的或者較不優選的密碼子替換，其中優選的密碼子是在宿主細胞的基因編碼區中超常出現的密碼子，不優選的或者較不優選的密碼子是在宿主細胞的基因編碼區中不常出現的密碼子，從而修飾核酸，降低其在宿主細胞的表達。可選擇的方面，宿主細胞是細菌細胞，真菌細胞，昆蟲細胞，酵母細胞，植物細胞或者哺乳動物細胞。
            
發明提供產生編碼很多經修飾的磷脂酶活性位點或底物結合位點的核酸文庫的方法，其中經修飾的活性位點或者底物結合位點來源于包括編碼第一活性位點或者第一底物結合位點的序列的第一核酸，該方法包括(a)編碼第一個活性位點或者第一個底物結合位點的第一核酸序列，其中第一核酸序列包括發明的核酸，(b)提供一套在第一個核酸的多個靶密碼子編碼天然產生的氨基酸的突變體的誘變寡聚核苷酸；和，(c)應用這套誘變的寡聚核苷酸，產生一套編碼活性位點或者編碼底物結合位點的突變核酸，在每一個被誘變的氨基酸密碼子處，突變核酸編碼氨基酸突變體，從而產生編碼修飾的磷脂酶活性位點或者底物結合位點的核酸文庫。在可選擇的方面，該方法包括通過包括優化的定點進化系統，基因定點飽和誘變(GSSM)，和合成連接重裝配(SLR)的方法，誘變步驟(a)的第一核酸。方法進一步包括通過包括錯誤傾向PCR，重排，寡核苷酸定向突變，裝配PCR，有性PCR誘變，體內誘變，盒式誘變，回歸整體誘變，指數整體誘變，定點誘變，基因重裝配，基因位點飽和誘變(GSSM)，合成連接重裝配(SLR)和其組合的方法誘變步驟(a)的第一核酸或者突變體。方法進一步包括通過包括重組，回歸序列重組，磷硫修飾的DNA誘變，含有尿嘧啶的模板的誘變，缺口雙螺旋誘變，點錯配修復誘變，修復-缺陷宿主株誘變，化學誘變，放射誘變，缺失誘變，限制選擇誘變，限制純化誘變，人工基因誘變，整體誘變，嵌合核酸多聚體的產生和它們的組合的方法誘變步驟(a)的第一核酸或者變異體。
            
發明提供制備小分子的方法，包括以下步驟(a)提供可以合成或者修飾小分子的多個生物合成酶，其中一個酶包括由發明核酸編碼的磷脂酶；(b)對步驟(a)的至少一個酶提供底物，(c)在利于生物催化反應進行的條件下，步驟(b)的底物和酶反應，通過一系列生物催化反應產生小分子。
            
發明提供修飾小分子的方法，包括以下步驟(a)提供由發明核酸編碼的磷脂酶；(b)提供小分子；(c)在利于磷脂酶催化的酶反應進行的條件下，步驟(a)的酶與步驟(b)的小分子反應，從而通過磷脂酶反應修飾小分子。一方面，方法包括為步驟(a)的酶提供很多的小分子底物，從而產生了經修飾的小分子文庫，該小分子文庫通過至少一個由磷脂酶催化的酶促反應產生。一方面，方法進一步包括很多的額外酶，在利于很多酶催化的生物催化反應的條件下，通過很多酶促反應產生由很多酶促反應產生的經修飾的小分子文庫。一方面，方法進一步包括檢測文庫的步驟，確定在文庫中是否存在表現出所需活性的特定的經修飾的小分子。該檢測文庫的步驟可以進一步包括通過檢測經過修飾的小分子的部分存在或者不存在具有所需活性的特定經修飾的小分子部分，系統性地去除干擾，在庫中選擇一個用于產生經修飾的小分子部分的生物催化反應，并且確定至少一種特定的生物催化反應，該反應產生了特定的具有所需活性的經修飾的小分子。
            
發明提供用于確定磷脂酶的功能性片段方法，其包括以下的步驟(a)提供包括發明氨基酸序列的磷脂酶；(b)缺失步驟(a)序列中的多個氨基酸殘基，并且測定余下的序列的磷脂酶活性，從而確定磷脂酶的功能性片段。一方面，磷脂酶活性通過提供磷脂酶底物，測定底物的量的增加或者反應產物的量的減少來測定。一方面，與不存在檢測化合物條件下確定的底物或者反應產物的量相比較，在檢測化合物存在的條件下，底物的量的減少或者反應產物的量的增加鑒定檢測化合物是磷脂酶活性的激活劑。
            
發明提供切割磷酸甘油酯鍵的方法，包括以下步驟(a)提供具有磷脂酶活性的多肽，其中多肽包括發明的氨基酸序列，或者多肽由發明的核酸序列編碼；(b)提供包括磷酸甘油酯鍵的組合物；(c)在多肽切割磷酸甘油酯鍵的條件下，把步驟(a)的多肽與步驟(b)的組合物接觸。一方面，條件包括大約pH5到大約5.5之間，或者大約pH4.5到大約5.0之間。一方面，條件包括大約40℃到大約70℃溫度之間。一方面，該組合物包括植物油。一方面，該組合物包括油籽磷脂。一方面，切割反應可以產生水可抽提的磷酸化的堿和甘油二酯。
            
發明提供油脫膠(oil degumming)的方法，包括以下步驟(a)提供具有磷脂酶活性的多肽，其中多肽包括發明的氨基酸序列，或者多肽由發明的核酸序列編碼；(b)提供包括植物油的組合物；(c)在多肽切割植物油的酯鍵的條件下，把步驟(a)的多肽與步驟(b)的植物油接觸，從而進行油的脫膠。一方面，植物油包括油籽。植物油可以包括棕櫚油，油菜籽，玉米油，大豆油，蕓苔油，芝麻油，花生油，或者葵花子油。一方面，方法進一步包括加入發明的磷脂酶，另外的磷脂酶或者它們的組合。
            
發明提供轉化非水合的磷脂成水合形式的方法，包括以下步驟(a)提供具有磷脂酶活性的多肽，其中多肽包括發明的氨基酸序列，或者多肽由發明的核酸編碼；(b)提供包括非水合磷脂的組合物；(c)在多肽切割非水合磷脂的酯鍵的條件下，把步驟(a)的多肽與步驟(b)的非水合磷脂接觸，從而非水合磷脂轉化為水合形式。
            
發明提供使油脫膠的方法，包括以下步驟(a)提供組成包括發明的具有磷脂酶活性的多肽，或者由發明核酸編碼的多肽；(b)提供包括脂肪或者油的組合物，脂肪或者油含有磷脂；(c)在多肽可以對含有磷脂的組合物進行脫膠的條件下，把步驟(a)的多肽與步驟(b)的組合物進行接觸(在發明的多肽可以催化磷脂水解的條件下)。一方面，含油的組合物包括植物，動物，藻或者魚的油。植物油可以包括大豆油，油菜籽油，玉米油，棕櫚仁的油，蕓苔油，葵花油，芝麻油或者花生油。多肽可以水解含油組合物中水合的和/或非水合的磷脂中的磷酸。多肽可以水解甘油磷脂鍵處的磷酸，產生甘油二酯和水溶性的磷酸化合物。多肽可以有磷脂酶C，B，A或者D的活性。一方面，加入了磷脂酶D活性和磷酸酶活性。接觸可以包括水解油中水合的磷脂。水解條件可以包括在堿性pH下，溫度為大約20℃到40℃之間。堿性條件可以包括大約pH 8到pH 10的pH。水解條件可以包括反應時間為3到10分鐘。水解條件可以包括水解油中水合的或者非水合的磷脂，溫度為大約50℃到60℃，pH大約為pH 5到pH 6.5，應用的反應時間為大約30到60分鐘。多肽可以結合于濾膜，含有磷脂的脂肪或者油通過濾膜。多肽可以加入到含有磷脂的脂肪或者油的溶液中，然后溶液通過濾膜過濾。
            
發明提供轉化非-水合的磷脂為水合形式的方法，包括以下的步驟(a)提供包括具有發明磷脂酶活性的多肽的組成，或者由發明的核酸序列編碼的多肽；(b)提供包括非-水合的磷脂的組合物；并且(c)在多肽轉化非-水合的磷脂為水合的磷脂形式的條件下，把步驟(a)的多肽與步驟(b)組合物接觸。多肽可以具有磷脂酶C的活性。多肽可以具有磷脂酶D的活性并且也加入磷酸酶。
            
發明提供堿法凈化含有磷脂的組合物的方法，包括以下步驟(a)提供包含發明的具有磷脂酶活性的多肽或者由發明核酸編碼的多肽的組合物；(b)提供包含磷脂的組合物，并且(c)在堿法凈化前，堿法凈化中或者后，把步驟(a)的多肽與步驟(b)的組合物接觸。多肽可以具有磷脂酶C的活性。多肽可以在堿法凈化前加入，并且含有磷脂的組成可以包括植物，并且多肽可以以轉基因方式在植物中表達，具有磷脂酶活性的多肽可以在壓榨種籽或者其它植物部分的過程中加入，或者具有磷脂酶活性的多肽在壓榨后或者在凈化前加入。多肽可以在堿法凈化中加入，并且依據磷的水平和游離脂肪酸的水平加入不同水平的酸和堿。多肽可以在堿法凈化后加入在分離前的劇烈攪拌器或者保持混合器中，隨后在離心機中，皂腳中，清洗水中進行，或者在漂白或者除臭步驟中進行加熱步驟。
            
發明提供純化植物甾醇或者三萜的方法，包括以下的步驟(a)提供包括發明的具有磷脂酶活性的多肽的組合物，或者多肽由發明核酸編碼；(b)提供含有植物甾醇或者三萜的組合物；并且(c)在多肽可以催化組合物中的磷脂的水解的條件下，把步驟(a)的多肽與步驟(b)的組合物接觸。多肽可以具有磷脂酶C的活性。植物甾醇或者三萜可以包括植物甾醇。植物甾醇可以來源于植物油。植物油可以包括椰子油，蕓苔油，可可黃油，玉米油，棉籽油，亞麻油，橄欖油，棕櫚油，花生油，來自稻麩子的油，紅花油，芝麻油，大豆油，或者葵花油。該方法可以包括應用非極性溶劑來定量地提取游離的植物甾醇和甾醇類脂肪酸酯。植物甾醇或者三萜可以包括β-谷甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，豆甾烷醇，β-谷甾烷醇，谷甾烷醇，鏈甾醇，海綿甾醇，  多孔甾醇，γ-谷甾醇或者菜籽甾醇。
            
發明提供精練粗油的方法，包括以下步驟(a)提供包括發明的具有磷脂酶活性的多肽的組合物，或者多肽由發明的核酸編碼；(b)提供包括含有磷脂的油的組合物；并且(c)在多肽催化組合物中的磷脂水解的條件下，把步驟(a)的多肽與步驟(b)的組合物接觸。多肽可以具有磷脂酶C的活性。多肽可以在加入到組分水溶液的情況下具有磷脂酶活性。水的水平可以是在0.5到5％之間。處理時間可以少于2小時，少于大約60分鐘，少于大約30分鐘，少于大約15分鐘，或者少于5分鐘。水解條件可以包括溫度范圍在大約25到70℃之間，水解條件可以包括應用苛性堿，水解條件可以包括pH范圍為大約pH 3到pH10之間，pH 4到pH9之間，或者pH 5到pH 8之間。水解條件可以包括在接觸步驟(c)后加入乳化劑和/或進行混合。該方法可以包括加入去乳化劑和/或加熱來促進水相的分離。該方法可以包括在接觸步驟前進行脫膠，通過離心收集卵磷脂，然后再加入PLC，PLC和/或PLA，去除非水合的磷脂。對于食用油，該方法可以包括粗油的水脫膠到少于10ppm，對于生物柴油，然后通過物理精練至少到大約50ppm。該方法可以包括加入酸來增強非水合磷脂的水合。
            
發明的一個或者多個具體例子的細節在附加圖表和以下說明中進行闡明。發明的其它特征，目標，以及優勢將通過描述和圖表以及權利要求得到闡明。
            
用于各種目的的所有出版物，專利，專利申請，GenBank序列以及美國模式菌種收集中心(ATCC)保藏物，在此一并引用和參考。
            
附圖簡述以下的圖是本發明的實施方案的例示性說明，并不意味著限制權利要求所包含的發明范圍。
            

            

            
圖1是計算機系統的框圖，具體的細節說明參見下文。
            
圖2是過程200的一個方面的流程圖，為了確定新序列和數據庫中的序列之間的同源性水平，把新的核苷酸或蛋白質序列與數據庫中的序列相比較，具體的細節說明參見下文。
            
圖3是說明在計算機中確定是否兩個序列是否是同源的過程的實施方案的流程圖，具體細節說明參見下文。
            
圖4是說明鑒定器過程的一個方面的流程圖，檢測序列中特征的存在，具體的細節說明參見下文。
            
圖5A，5B和5C用圖表說明用于同時PLC-介導脫膠的典型兩相系統，具體的細節說明參見下文。
            
圖6用圖表說明應用發明的磷脂酶的典型的植物油精練過程。
            
圖7用圖表說明用于物理精練油的發明的典型脫膠過程，具體的細節說明參見下文。
            
圖8用圖表說明用發明的磷脂酶C進行磷脂的水解，具體的細節說明參見下文。
            
圖9用圖表說明用發明的磷脂酶C作為“堿法凈化輔助”(長混合堿法凈化)，具體的細節說明參見下文。
            
圖10用圖表說明用發明的磷脂酶C作為脫膠輔助，具體的細節說明參見下文。
            
不同圖中的類似參考符號說明類似元素發明祥述發明提供磷脂酶(如，磷脂酶A，B，C和D，馬鈴薯塊莖儲藏蛋白酶)，編碼它們的核酸。以及制備和應用它們的方法。發明提供可以有效地切割油，如植物油，例如油籽磷脂中的甘油磷酸酯鍵的酶，產生水可提取的磷酸化的堿和甘油二酯。一方面，發明的磷脂酶具有脂酰水解酶(LAH)的活性。可選擇的方面，發明的磷脂酶可以切割卵磷脂，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸，和鞘磷脂中的甘油磷酸酯鍵。
            
發明的磷脂酶(如，磷脂酶A，B，C和D，馬鈴薯塊莖儲藏蛋白酶)可以用于植物油的酶法脫膠，因為磷酸組分在水中可溶，并且容易去除。甘油二酯產物將仍存留在油中，從而降低損失。發明的PLCs可以用于商業上的油脫膠中，加入到或者替換PLA1s和PLA2s，諸如ENZYMAX_工藝，其中磷脂是由PLA1和PLA2水解的。
            
一方面，發明的磷脂酶在較高的和/或較低的溫度下，或者在較寬的溫度范圍內，具有活性，例如，它們可以在溫度范圍在20到90℃，30到80℃，或者在40到70℃下具有活性。發明也提供發明的磷脂酶，其在堿性pH或者酸性pH下具有活性，例如低的水酸度。可選擇的方面，發明的磷脂酶可以在酸性pH低至pH6.5，pH6.0，pH5.5，pH5.0，pH4.5，pH4.0，和pH3.5仍具有活性。可選擇的方面，發明的磷脂酶可以在堿性pH高至pH7.5，pH8.0，pH8.5，pH9.0，和pH9.5仍具有活性。一方面，發明的磷脂酶在低水活性(低的水含量)條件下，在溫度范圍40到70℃之間具有活性。
            
發明也提供進一步修飾本發明的典型磷脂酶的方法，以便產生具有理想特性的酶。例如，由發明方法產生的磷脂酶可以具有改變了的底物特異性，底物結合特異性，底物切割形式，熱穩定性，pH/活性曲線，pH/穩定性曲線(如在較低pH值，例如pH小于6或者pH小于5或者較高的pH值，如pH大于9的情況下熱穩定性提高)，對于氧化作用的穩定性，Ca2+的依賴性，特異性活性，類似特性。發明提供對于任何感興趣特性的改變。例如，這些改變可以導致與原磷脂酶相比的變異體，具有改變的pH和溫度活性曲線。
            
一方面，發明的磷脂酶在不同的植物油處理步驟，如植物油提取中，特別地，在稱為“油脫膠”的過程中去除“磷脂膠”中的使用，如在此所述。植物油產生于不同的植物來源，如大豆，油菜，花生，芝麻，葵花和玉米。發明的磷脂酶可以在任何植物油處理過程中用于替代PLA，例如磷脂酶A2。
            
定義術語“磷脂酶”包括具有磷脂酶活性的酶，例如，切割油中，如植物油中的甘油磷酸酯鍵(催化水解甘油磷酸酯鍵)。發明的磷脂酶活性可以產生水可提取的磷酸化的堿以及甘油二酯。發明的磷脂酶活性也包括在高溫，低溫，堿性pH和酸性pH下水解甘油磷酸酯鍵。術語“磷脂酶活性”也包括切割甘油磷酸酯，產生水可提取的磷酸化的堿以及甘油二酯。術語“磷脂酶活性”也包括切割磷脂中甘油和磷酸的酯鍵。術語“磷脂酶活性”也包括其它的活性，如結合底物的能力，如油，例如植物油，底物也包括植物和動物的卵磷脂，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸，和鞘磷脂。磷脂酶活性可以包括磷脂酶C(PLC)的活性，磷脂酶A(PLA)的活性，如磷脂酶A1或者磷脂酶A2的活性，磷脂酶B(PLB)活性，如磷脂酶B1或者磷脂酶B2的活性，磷脂酶D(PLD)的活性，如磷脂酶D1或者磷脂酶D2的活性。磷脂酶活性可以包括水解糖蛋白，如馬鈴薯塊莖中或者任何茄屬植物(Solanum)，如，馬鈴薯(Solanum tuberosum.)中的糖蛋白。磷脂酶活性可以包括patatin酶活性，如patatin酯酶活性(見，例如，Jimenez(2002)Biotechnol.Prog.18635-640)。磷脂酶活性可以包括脂酰水解酶(LAH)活性。
            
術語“抗體”包括源自模式的或者實質上由免疫球蛋白基因或者免疫球蛋白基因的片段編碼的肽或者多肽，可以特異地結合于抗原或者抗原決定簇，見，例如Fundamental lmmunology，Third Edition，W.B.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993)Wilson(1994)J.Immunol.Methods 175267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 2585-97。術語抗體包括抗原結合部分，即，“抗原結合位點”(例如，保持了結合抗原能力的片段，亞序列，互補決定區(CDRs)，包括(i)Fab片段，包括由VL，VH，CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab’)2片段，包括在鉸鏈區通過二硫鍵連接兩個Fab片段的二價片段；(iii)包括VH和CH1結構域的Fd片段；(iv)包括抗體單臂的VL和VH結構域的Fv片段，(v)含有VH結構域的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341544-546)；以及(vi)分離的互補決定區(CDR)。作為參考，單鏈抗體也包括于術語“抗體”中。
            
在此應用的術語“陣列”或者“微陣列”或者“生物芯片”或者“芯片”是許多靶元素，每一個靶元素包括確定量的一個或者多個多肽(包括抗體)或者固定于底物表面積的確定區域的核酸，參見以下進一步的具體討論。
            
正如在此所用的術語“計算機”，“計算機程序”和“處理器”在上下文廣泛應用，并且用于所有的這樣的設備，如以下所述的。
            
“編碼序列”或者“序列編碼”特定的多肽或者蛋白，是指當置于合適的調控序列的控制下可以轉錄和翻譯成多肽或者蛋白的核酸序列。
            
在此使用的術語“表達盒”是指在與這樣的序列相容的宿主細胞中可以影響結構基因表達(即，編碼蛋白質，如本發明的磷脂酶的序列)的核苷酸序列。表達盒包括至少一個可以可操作地連接至編碼多肽的序列上的啟動子；并且，可選擇地，還有其它的序列例如，轉錄終止信號。另外的必要的或者有助于影響表達的因子也可以應用，例如，增強子。正如在此所應用的“可操作地連接”是指在上游連接啟動子與DNA序列，這樣該啟動子介導了該DNA序列的轉錄。這樣，表達盒也包括質粒，表達載體，重組病毒，任何形式的重組的“裸露DNA”載體，和類似物。“載體”包括可以感染，轉染，瞬間或者永久轉導細胞的核酸。可以認為載體可以是裸露的核酸，或者與蛋白或者脂類復合的核酸。載體可選擇地包括病毒或者細胞的核酸和/或蛋白，和/或膜(如，細胞膜，病毒的脂類包膜，等等)。載體包括，但不限于復制子(如，RNA復制子，細菌噬菌體)，其中DNA片段可以結合到其上，變成復制狀態。這樣的載體包括，但不限于是RNA，自主復制的環狀或者線性的DNA或者RNA(如，質粒，病毒，以及類似物，見，如，美國專利No.5,217,879)，并且也包括表達的和非表達的質粒。其中描述重組微生物或者細胞培養物是作為宿主培養“表達載體”，其包括染色體外的環狀和線性DNA，并且已經整合進入宿主染色體的DNA。其中載體保存在宿主細胞中，該載體可以在細胞有絲分裂中作為自主結構穩定地在細胞中復制，或者整合入宿主基因組中。
            
“質粒”的命名為在名稱前加上小寫字母“p”和/或接下來是大寫字母和/或數字。在此使用的起始質粒可以買到，在非限制的基礎上可以公開獲得，或者按照出版的程序從已有的質粒構建。此外，與那些在此描述的質粒等價的質粒是在本領域是已知的，并且對普通技術人員而言是顯而易見的。
            
術語“基因”是指DNA片段，涉及在產生多肽鏈，包括，除此之外，在編碼區的前面和后面的區域，如頭部和尾部，啟動子和增強子，當適合時，還有單個編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內含子)。
            
正如在此應用的短語“核酸”或者“核酸序列”是指寡核苷酸，核苷酸，多聚核苷酸，或者是指它們的任何之一的片段，是指基因組或者合成來源的DNA或者RNA(如，mRNA，rRNA，tRNA，iRNA)，其可以是單鏈的或者雙鏈的，并且可以代表有義鏈或者無義鏈，是指肽核酸(PNA)，或者是指天然的或者起始于合成的任何DNA樣或者RNA樣的物質，包括如，iRNA，核糖核蛋白(如雙鏈iRNA，如iRNPs)。術語包括核酸，即，寡核苷酸，包括天然核苷酸的已知類似物。術語也包括具有合成骨架的核酸樣結構，見，如，Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144189-197；Straus.-Soukup(1997)Biochemistry 368692-8698；Samstag(1996)Antisense NucleicAcid Drug Dev 6153-156。
            
在此應用的“氨基酸”或者“氨基酸序列”是指寡肽，肽，多肽，或者蛋白序列，或者是指以上任何這些的任何一個的片段、部分或亞基，并且是指天然產生或者合成的分子。
            
在此應用的術語“多肽”和“蛋白”是指通過肽鍵或者修飾的肽鍵連接在一起的氨基酸，即，肽等排體，可以含有不是20個基因編碼的氨基酸的修飾氨基酸。術語“多肽”也指肽或者多肽片段，基元(motif)，類似物。術語也包括糖基化的多肽。發明的肽或者多肽也包括所有“模擬”和“肽模擬”形式，以下進一步描述。
            
正如在此所應用的，術語“分離的”是指從起始的環境中分離的物質(如，如果是天然發生的，那么就是天然環境)。例如，存在于活動物中的天然發生的多聚核苷酸或者多肽不是分離的，但是，如果該同樣的多核苷酸或者多肽，與天然系統中的一些或者所有的共存物分離，那么就是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分和/或這樣的多核苷酸或者多肽可以是一個組合物的一部分，并且仍然是分離，因為這樣的載體或者組合物不是天然環境的一部分。正如在此使用的，分離的物質或者組合物可以是“純化”的組合物，即，它并不需要絕對的純度；更正確地，認為其是相對性的定義。從文庫中得到的單個核酸可以經過常規純化為電泳均一性。可選擇的方面，發明提供從基因組DNA或者從文庫中的其它序列中或者其它的環境中純化至少一個，兩個，三個，四個，五個或者更多數量級的核酸。
            
正如在此應用的，術語“重組”是指核酸鄰近于“骨架”核酸，而在天然環境下它們并不鄰近。一方面，核酸代表了核酸“骨架分子”群體中5％或者更多數目的插入物的核酸。按照發明，“骨架分子”包括核酸，如表達載體，自主復制核酸，病毒，整合的核酸，和其他的載體或者用于保持或者操作感興趣的核酸插入物的核酸。一方面，富集的核酸代表了重組骨架分子群體中的15％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或者更多數目的核酸插入物。“重組”多肽或者蛋白是指由重組DNA技術產生的多肽或者蛋白，如，從編碼所需多肽或者蛋白的外源DNA構建物轉化的細胞產生。“合成的”多肽或者蛋白是那些通過化學合成制備的多肽或者蛋白，如以下進一步的描述。
            
正如以下進一步討論的，當啟動啟動子處轉錄的RNA聚合酶轉錄編碼序列成為mRNA時，啟動子序列是“可操作地連接于”編碼序列。
            
“寡聚核苷酸”是指單鏈多聚脫氧核苷酸或者化學合成的兩個互補的多聚脫氧核苷酸鏈。這樣合成的寡聚核苷酸在5’沒有磷酸，并且在不用激酶和ATP加入磷酸的情況下，不能連接于另一個寡聚核苷酸。合成的寡聚核苷酸將連接于沒有脫磷酸化的片段。
            
上下文中的兩個核酸或者多肽“實質上相同”的短語，是指當使用任何已知的序列比較算法，如以下詳細討論的，或者通過目測的方法檢測，比較和對齊為最大同一性時，兩個或者多個序列至少具有50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或者99％的核苷酸或者氨基酸殘基(序列)的同一性。在可選擇的方面，發明提供與發明的典型序列，如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ IDNO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，等等，在核酸或者多肽的至少大約100個殘基，150個殘基，200個殘基，300個殘基，400個殘基，或者從大約50個殘基到全長的區域范圍內實質上具有同一性的核酸和多肽序列。發明的核酸可以是在整個長度的多肽編碼區域實質上一致。
            
另外的，“實質上一致”的氨基酸序列是與參考序列不同的序列，其中具有一個或者多個保守性或者非保守性的氨基酸取代，缺失，或者插入，特別地，當這樣的取代發生在分子的非活性位點的一個位置，并且假設，多肽實質上保持了它的功能特性。保守氨基酸的取代，例如，用一個氨基酸取代另一個同類的氨基酸(如，用一個疏水氨基酸，如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸，或者甲硫氨酸，取代另一個，或者用極性氨基酸取代另一個極性氨基酸，如，用賴氨酸取代精氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸或者，谷酰胺取代天冬酰胺)。可以缺失一個或者多個氨基酸，例如，從磷脂酶多肽中缺失，得到多肽結構的修飾，而并不顯著改變其生物活性。例如，對于磷脂酶的生物活性，并不需要氨基或者羧基端氨基酸，可以去除。發明的修飾的多肽序列可以通過很多的方法分析其磷脂酶活性，包括讓改變的多肽序列與磷脂酶底物接觸，并且確定是否修飾的多肽減少了分析中的特異底物的量或者增加了功能性磷脂酶與底物的酶促反應的生物產物的量，如以下詳細說明的。
            
“雜交”是指通過堿基配對，核酸鏈與互補鏈結合的過程。雜交反應可能是敏感的并且具有選擇性，這樣在樣品量很低的濃度下可以鑒定感興趣的特定的序列。合適的嚴謹條件可以通過例如，預雜交和雜交溶液中的鹽和甲酰胺濃度，或者雜交溫度來確定，并且本領域是熟知的。例如，嚴謹性的增加可以通過降低鹽濃度，增加甲酰胺的濃度，或者提高雜交溫度，改變雜交時間予以實現，如以下所詳細描述。可選擇的方面，發明的核酸通過它們可以與在此所闡明的不同的嚴謹條件下雜交的能力(如，高，中，和低)來確定。
            
術語“變異體”是指在一個或者多個堿基對，密碼子，內含子，外顯子，或者氨基酸殘基(分別)改變的發明的多聚核苷酸或者多肽，但仍保持發明的磷脂酶的生物活性。變異體可以通過很多種方法產生，例如，錯誤傾向PCR，重排，寡聚核苷酸定向誘變，裝配PCR，有性PCR誘變，體外誘變，盒式誘變，回歸整體誘變，指數整體誘變，定點誘變，基因重裝配，GSSM和它們的組合。在此包括了產生在pH或溫度下具有活性的磷脂酶突變體，例如，不同與野生型磷脂酶的技術。
            
術語“飽和誘變”或者“GSSM”包括應用變性的寡聚核苷酸引物在多聚核苷酸中引入點突變的方法，如下的詳細解釋。
            
術語“優化的定向進化系統”或者“優化的定向進化”包括重組裝相關核酸序列片段的方法，例如，相關基因，以下詳細解釋。
            
術語“合成連接重組裝”或者“SLR”包括以非隨機的方式連接寡聚核苷酸片段的方法，以下詳細解釋。
            
核酸的產生和操作發明提供核酸(如，典型的SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ IDNO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21，SEQ ID NO23，SEQ ID NO25，SEQ IDNO27，SEQ ID NO29，SEQ ID NO31，SEQ ID NO33，SEQ ID NO35，SEQ IDNO37，SEQ ID NO39，SBQ ID NO41，SEQ ID NO43，SEQ ID NO45，SEQ IDNO47，SEQ ID NO49，SEQ ID NO51，SEQ ID NO53，SEQ ID NO55，SEQ IDNO57，SEQ ID NO59，SBQ ID NO61，SEQ ID NO63，SEQ ID NO65，SEQ IDNO67，SEQ ID NO69，SEQ ID NO71，SEQ ID NO73，SEQ ID NO75，SEQ IDNO77，SEQ ID NO79，SEQ ID NO81，SEQ ID NO83，SEQ ID NO85，SBQ IDNO87，SEQ ID NO89，SEQ ID NO91，SEQ ID NO93，SEQ ID NO95，SEQ IDNO97，SEQ ID NO99，SEQ ID NO101，SEQ ID NO103，SEQ ID NO105)，包括編碼發明的多肽和磷脂酶的表達盒，如表達載體。發明也包括應用發明的核酸發現新的磷脂酶序列的方法。也提供用于修飾的本發明核酸的方法，例如，合成連接重裝配，優化的定向進化系統和/或飽和誘變。
            
發明的核酸可以是制備的，合成和/或通過，如，克隆和表達cDNA文庫，通過PCR擴增信使或者基因組DNA，和類似方法進行操作。在實踐本發明的方法中，通過操作模板核酸，可以修飾同源基因，正如在此所述的。本發明可以和本領域已知的其它任何方法或者方案或者裝置結合進行實踐，這些在科學和專利的文獻中有很好的描述。
            
一般技術用于實踐本發明的核酸，不管是RNA，iRNA，反義核酸，cDNA，基因組DNA，載體，病毒或者它們的雜合體，都可以自不同的來源分離，遺傳工程，擴增，和/或表達/重組產生。從這些核酸產生的重組多肽可以單獨分離或者克隆，并且檢測所需的活性。可以應用任何重組表達系統，包括細菌，哺乳動物，酵母，昆蟲或者植物細胞表達系統。
            
可選擇地，這些核酸可以通過已知的化學合成技術在體外合成，正如在如Adams(1983)J.Am.Chem，Soc.105661；Belousov(1997)Nucleic Acids Res.253440-3444Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19373-380；Blommers(1994)Biochemistry 337886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.6890，Brown(1979)Meth.Enzymol.68109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.221859；美國專利4,458,066中描述的。
            
用于核酸操作的技術，如，亞克隆，探針標記(如，使用Klenow聚合酶的隨機引物標記，切口平移，擴增)，測序，雜交等等，這些方法在科學和專利文獻中有說明，見，如，Sambrook，ed.，MOLECULAR CLONINGA LABORATORYMANUAL(2ND ED.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel，ed.JohnWiley&Sons，Inc.，New York(1997)；LABORATORY TECHNIQUES INBIOCHEMSTRY AND MOLECULAR BIOLOGYHYBRlDlZATION WITHNUCLEIC ACID PROBES，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)。
            
另一個用于實踐發明的方法，即獲得和操作核酸的有用方法是從基因組樣品中克隆，并且如果需要，篩選和再克隆從例如，基因組克隆或者cDNA克隆中分離或者擴增的插入物。在發明方法中使用的核酸的來源包括包含于如，哺乳動物人工染色體(MACs)中的基因組或者cDNA文庫，見如，美國專利5,721,118，6,025,155；人的人工染色體，見，如，Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15333-335，酵母人工染色體(YAC)；細菌人工染色體(BAC)；P1人工染色體，見，如，Woon(1998)Genomics 50306-3 16；P1-來源的載體(PACs)，見，如，Kern(1997)Biotechniques 23120-124，粘粒，重組病毒，噬菌體或者質粒。
            
一方面，編碼發明多肽的核酸在適當的階段與可以引起翻譯的多肽或者片段分泌的先導序列裝配在一起。
            
發明提供融合蛋白和編碼融合蛋白的核酸。發明的多肽可以與異種的肽或者多肽融合，如N-末端鑒定肽，其賦予了所需的特征，如增加的穩定性或者純化方法的簡化。發明的肽和多肽也可以合成并且以與一個或者多個另外的結構域連接的融合蛋白形式進行表達，從而，如，產生更具免疫原性的肽，更容易分離的重組合成肽，鑒定和分離抗體和表達抗體的B細胞，等等。測定和純化促進結構域包括，如，可以在固定的金屬上純化的金屬鏊合肽，如，聚組氨酸序列片(polyhistidine tracks)和組氨酸-色氨酸模塊(histidine-tryptophan)，可以在固定的免疫球蛋白上純化的蛋白A結構域，以及在FLAGS伸展/親和純化系統(FLAGSextension/affinity purification system，Immunex Corp，Seattle WA)中使用的結構域。在純化的結構域和含有基元的肽或者多肽之間包含可以切割的如因子Xa或者腸激酶(lnvitrogen，San Diego CA)的接頭序列，以便于純化。例如，表達載體可能包括連接于六個組氨酸殘基的編碼抗原決定簇的核酸序列，然后是硫氧還蛋白和腸激酶切割位點(見，如，Williams(1995)Biochemistry 341787-1797，Dobeli(1998)Protein Expr.Purif.12404-414)。腸激酶切割位點提供從融合蛋白的殘留物中純化抗原決定簇的方法，同時組氨酸殘基有利于檢測和純化。關于編碼融合蛋白的載體以及應用融合蛋白的技術在科學和專利文獻中有很好的說明，見，例如，Kroll(1993)DNA Cell.Biol.，12441-53。
            
轉錄和翻譯控制序列發明提供可操作地與表達控制序列(如，轉錄和翻譯)如，啟動子或者增強子連接的發明的核酸(如，DNA)序列，指導或者調控RNA的合成/表達。表達控制序列可以在表達載體中。典型的細菌啟動子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λPR，PL和trp啟動子。典型的真核啟動子包括CMV即刻早期，HSV胸腺嘧啶激酶激酶，早期和晚期SV40，來自逆轉錄病毒的LTRs(長末端重復序列)和鼠金屬硫蛋白I。
            
適于在細菌中表達多肽的啟動子包括大腸桿菌lac或者trp啟動子，lacI啟動子，lacZ啟動子，T3啟動子，T7啟動子，gpt啟動子，λPR啟動子，λPL啟動子，來自編碼糖酵解的酶的操縱子的啟動子如，3-磷酸甘油激酶(PGK)，和酸性磷酸酶啟動子。真核啟動子包括CMV即刻早期啟動子，HSV胸腺嘧啶激酶啟動子，熱休克啟動子，早期和晚期SV40啟動子，來自逆轉錄病毒的LTRs，和鼠金屬硫蛋白-I啟動子。也可以應用已知的在原核或者真核細胞或者其病毒中控制基因表達的其它啟動子。
            
表達載體(expression vectors)和克隆(運)載體(cloning vehicles)發明提供包括發明的核酸，如，編碼發明額磷脂酶的序列的表達載體和克隆載體，發明的表達載體和克隆載體可以包括病毒顆粒，桿狀病毒，噬菌體，質粒，噬菌粒，粘粒，fosmids，細菌人工染色體，病毒DNA(如，牛痘，腺病毒，禽類痘病毒，偽狂犬病病毒和SV40衍生物)，以P1為基礎的人工染色體，酵母質粒，酵母人工染色體，以及對感興趣的特定宿主(如桿狀菌，曲霉屬(Aspergillus)和酵母)特異的任何其它載體。發明的載體可以包括染色體的，非染色體的和合成的DNA序列。很多合適的載體為本領域技術熟練人員所了解，并且可以買到。典型的載體包括細菌的pQE載體(Qiagen)，pBluescript質粒，pNH載體，(λ-ZAP載體(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pDR540，pRIT2T(Pharmacia)；真核的PXTI，pSG5(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVLSV40(Pharmacia)。然而，也可以應用任何其它的質粒或載體，只要可以在宿主中復制并且可繁殖。低拷貝數或者高拷貝數的載體可以應用于本發明。
            
表達載體可以包括啟動子，用于翻譯起始的核糖體結合位點和轉錄終止子。載體也包括擴增表達的合適序列。哺乳動物表達載體可以包括復制起始位點，任何必要的核糖體結合位點，多聚腺苷酸化位點，剪接供體和接納位點，轉錄終止序列，和5′側非轉錄序列。一些方面，源于SV40的剪接和多聚腺苷酸化位點的DNA序列可以用于提供所需的非-轉錄遺傳元件。
            
一方面，表達載體含有一個或者多個選擇性標記基因，使得可以選擇含有這些載體的宿主細胞。這些選擇標記包括編碼二氫葉酸還原酶的基因或對真核細胞培養有新霉素抗性的基因，大腸桿菌中賦予抗四環素或者抗氨芐青霉素的基因，以及釀酒酵母(S.cerevisiae)的TRP1基因。啟動子區域可以使用氯霉素轉移酶(CAT)載體或者具有選擇標記的其它載體，從任何所需基因中選擇。
            
在真核細胞中表達多肽或者其片段的載體也包括用于增加表達水平的增強子。增強子是DNA的順式作用元件，一般長度從大約10到大約300bp，其作用于啟動子，增強啟動子的轉錄。例子包括在復制起點的晚期側100到270bp的SV40增強子，巨細胞病毒的早期啟動子增強子，在復制起點的晚期側的多瘤增強子，和腺病毒增強子。
            
DNA序列可以以不同的程序插入到載體中。總體上，DNA序列連接于載體上所需的位置，是在用適合的限制性內切酶消化切下插入片段和消化切割載體之后進行的。可選擇地，插入片段和載體兩者可以以平端的形式連接。在專業上已知不同的克隆技術，例如，如在Ausubel和Sambrook中所描述的技術。這樣的程序和其它程序被認為是屬于本領域的技術人員的范圍之內。
            
載體可以是質粒，病毒顆粒或者噬菌體的形式。其它的載體包括染色體的，非染色體的和合成的DNA序列，SV40的衍生物；細菌質粒，噬菌體DNA，桿狀病毒，酵母質粒，源于質粒和噬菌體DNA組合的載體，病毒DNA如牛痘，腺病毒，禽類痘病毒，和偽狂犬病病毒。在原核和真核宿主中使用的多種克隆和表達載體，在如Sambrook中所說明的。
            
可以應用的特定細菌載體包括可以買到的含有以下克隆載體遺傳學元件的質粒，pBR322(ATCC 37017)，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pD10，psiX174，pBlueScript II KS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)，ptrc99a，pKK223-3，pKK223-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，pKK232-8和pCM7。特定的真核載體包括pSV2CAT，pOG44，pXTI，pSG(Stratagene)pSVK3，pBPV，pMSG，和pSVL(Pharmacia)。然而，任何其它的載體也可以應用，只要它在宿主細胞可以復制和繁殖。
            
宿主細胞和轉化細胞發明也提供包括發明核酸序列，如，編碼發明磷脂酶的序列，發明的載體的轉化的細胞。宿主細胞可以是技術熟練人員所熟悉的任何宿主細胞，包括原核細胞，真核細胞，如，細菌細胞，真菌細胞，酵母細胞，哺乳動物細胞，昆蟲細胞，或者植物細胞。典型的細菌細胞包括大腸桿菌E.coli，鏈霉菌Streptomyces，枯草桿菌Bacillus subtilis，沙門氏菌Salmonella typhimurium和假單胞菌Pseudomonas，鏈霉菌Streptomyces，和葡萄球菌Staphylococcus屬中的各種種類。典型的昆蟲細胞包括果蠅S2(Drosophila S2)和草地夜蛾Sf9(Spodoptera Sf9)。典型的動物細胞包括CHO，COS或者Bowes melanoma或者任何小鼠或者人類細胞系。適當的宿主的選擇是在專業知識的范圍內。
            
載體可以應用任何不同的技術引入到宿主細胞，包括轉化，轉染，轉導，病毒感染，基因槍，或者Ti-介導的基因轉移。特定的方法包括磷酸鈣轉染，DEAE-Dextran介導的轉染，脂質體轉染，或者電穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。
            
適當地，工程化的宿主細胞可以在傳統營養培養基中培養，可以修改以便適于活化啟動子，選擇轉化子或者擴增發明的基因。隨后轉化適當的宿主株，并且該宿主株生長至適當的細胞密度，通過適當的方法誘導所選擇的啟動子(如，溫度變換或者化學誘導)，細胞被額外培養一段時間，使得它們產生所需的多肽或者其片段。
            
細胞通過離心收集，通過物理或者化學的方法破碎，得到的粗提取物保留用于進一步的純化。用于表達蛋白的微生物細胞可以通過方便的方法破碎，包括反復冷凍-融化循環，機械破碎，或者應用細胞裂解試劑。這樣的方法為技術熟練人員所熟悉。表達的多肽或者片段可以通過下述方法從重組細胞培養物中回收純化，包括硫酸銨或者乙醇沉淀，酸抽提，陽離子或者陰離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水相互作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析和植物凝集素層析。如果必要的話，可以在實現多肽的構象中應用蛋白重新折疊步驟。如果需要，可以應用高效液相色譜(HPLC)進行最終的純化步驟。
            
各種哺乳動物培養系統可以用來表達重組蛋白。哺乳動物表達系統的例子包括可以從相容性載體中表達蛋白的猴腎成纖維細胞COS-7細胞系和其它的細胞系，如C127，3T3，CHO，Hela和BHK細胞系。
            
宿主細胞中的構建物可以應用傳統的方式來產生重組序列編碼的基因產物。依賴于在重組產生程序中采用的宿主，含有載體的宿主細胞產生的多肽可以是糖基化或者是非糖基化的。發明的多肽可以包括，也可以不包括起始的甲硫氨酸氨基酸殘基。
            
無細胞的翻譯系統可能也用于產生發明的多肽。無細胞翻譯系統可以應用從在帶有啟動子的編碼多肽或者其片段的核酸的DNA構建物轉錄的mRNA。一些方面，DNA構建物可以，在體外轉錄反應前，先線性化。然后轉錄的mRNA與合適的無細胞翻譯提取物如，兔網織紅細胞提取物一起溫育來產生所需的多肽或者片段。
            
表達載體可以含有一個或者多個選擇性標記基因，提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型特征，如，二氫葉酸還原酶和真核細胞培養的新霉素抗性，或者如大腸桿菌中的四環素或者氨芐青霉素抗性。
            
核酸的擴增在實踐發明時，編碼發明多肽的核酸，或者修飾的核酸可以再生，如通過擴增。發明提供用于擴增編碼具有磷脂酶活性的多肽的核酸的擴增引物序列對。一方面，引物對可以擴增發明的核酸序列，如，包括典型的SEQ ID NO1，或者其一個亞序列；如SEQ ID NO3所闡明的一個序列，或者其一個亞序列；如SEQ ID NO5所闡明的一個序列，或者其一個亞序列；如SEQ ID NO7所闡明的一個序列，或者其一個亞序列，等等。技術熟練人員可以設計這些序列的任何部分或全長的擴增引物序列對。
            
發明提供用于擴增編碼具有磷脂酶活性的多肽的核酸的擴增引物序列對，其中引物對可以擴增包括發明序列的核酸，或者其片段或亞序列。用于擴增的引物序列對的一個或每一個成員可以包括含有該序列的至少大約10到50個連續堿基的寡聚核苷酸，或者包括含有該序列的大約12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或者25個連續堿基的寡聚核苷酸。
            
發明提供擴增引物對，其中引物對包括具有在發明核酸的大約第一個(5′)12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或者25個殘基中闡明的序列的第一成員，和具有在第一成員的互補鏈的大約第一個(5′)12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或者25個殘基中闡明的序列的第二成員。發明提供通過擴增產生的磷脂酶，如應用本發明的擴增引物對的多聚酶鏈式反應(PCR)。發明提供使用發明的擴增引物對，通過擴增，例如，多聚酶鏈式反應(PCR)制備發明磷脂酶的方法。一方面，擴增引物擴增從文庫，例如，基因文庫，如環境文庫中得到的核酸。
            
擴增反應也可以用于定量樣品中(如在細胞樣品中的信使的量)的核酸，標記的核酸(如，用于分析或者印跡)的量，確定核酸，或者定量樣品中特異核酸的量。發明的一方面，對分離自細胞或者DNA文庫的信使進行擴增。技術熟練人員可以選擇和設計合適的寡聚核苷酸擴增引物。擴增的方法為技術熟練人員所熟悉，并且包括，如，多聚酶鏈式反應，PCR(見，如，PCRPROTOCOLS，AGUIDETO METHODS AND APPLICATIONS，ed.Innis，Academic Press，N.Y.(1990)和PCR STRATEGIES(1995)，ed.Innis，Academic Press，Inc.，N.Y.，連接酶鏈式反應(LCR)(見，如，Wu(1989)Genomics 4560，Landegren(1988)Science 2411077，Barringer(1990)Gene 89117)；轉錄擴增(見，如，Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173)，和自支持序列復制(見如，Guatelli(1990)Proc.Natl，Asad.Sci.USA 871874)，Q-β復制酶擴增(見，如，Simth(1997)J.Clin.Microbiol.351477-1491)，自動的Q-β復制酶擴增分析(見，如，Burg(1996)Mol.Cell.Probes 10257-271)  和其它RNA聚合酶介導的技術(如，NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)，也見，例如，Berger(1987)Methods Enzymol.152307-316；Sambrook；Ausubel；美國專利4,683,195和4,683,202；Sooknanan(1995)Biotechnology 13563-564。
            
確定序列同一性的水平發明提供包括與發明的典型核酸(例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SBQID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ IDNO15，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21，SEQ ID NO23，SEQ IDNO25，SEQ ID NO27，SEQ ID NO29，SEQ ID NO31，SEQ ID NO33，SEQ IDNO35，SEQ ID NO37，SEQ ID NO39，SEQ ID NO41，SEQ ID NO43，SEQ IDNO45，SEQ ID NO47，SEQ ID NO49，SEQ ID NO51，SEQ ID NO53，SEQ IDNO55，SEQ ID NO57，SEQ ID NO59，SEQ ID NO61，SEQ ID NO63，SEQ IDNO65，SEQ ID NO67，SEQ ID NO69，SEQ ID NO71，SEQ ID NO73，SEQ IDNO75，SEQ ID NO77，SEQ ID NO79，SEQ ID NO81，SEQ ID NO83，SEQ IDNO85，SEQ ID NO87，SEQ ID NO89，SEQ ID NO91，SEQ ID NO93，SEQ IDNO95，SEQ ID NO97，SEQ ID NO99，SEQ ID NO101，SEQ ID NO103，SEQID NO105，和編碼SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，SBQ ID NO18，SEQ ID NO20，SEQ ID NO22，SEQ ID NO24，SEQ ID NO26，SEQ ID NO28，SEQ ID NO30，SEQ ID NO32，SEQ ID NO34，SEQ ID NO36，SEQ ID NO38，SEQ ID NO40，SEQ ID NO42，SBQ ID NO44，SEQ ID NO46，SEQ ID NO48，SEQ ID NO50，SEQ ID NO52，SEQ ID NO54，SEQ ID NO56，SEQ ID NO58，SEQ ID NO60，SEQ ID NO62，SEQ ID NO64，SEQ ID NO66，SEQ ID NO68，SEQ ID NO70，SEQ ID NO72，SEQ ID NO74，SEQ ID NO76，SEQ ID NO78，SEQ ID NO80，SEQ ID NO82，SEQ ID NO84，SEQ ID NO86，SEQ ID NO88，SEQ ID NO90，SEQ ID NO92，SEQ ID NO94，SEQ ID NO96，SEQ ID NO98，SEQ ID NO100，SEQ ID NO102，SEQ ID NO104，SEQ ID NO106的核酸)在至少大約50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1000，1050，1100，1150，1200，1250，1300，1350，1400，1450，1500，1550或者更多的殘基范圍內具有至少大約50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多，或者完全的(100％)序列同一性的序列的核酸。發明提供含有與發明的典型多肽具有至少大約50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多，或者完全(100％)的序列同一性的序列的多肽。序列同一性(同源性)的范圍可以應用任何計算機程序和相關參數來確定，包括那些在此所說明的，如用默認參數的BLAST 2.2.2.或者FASTA 3.0t78版。
            
在可選擇的實施方案中，序列同一性可以在核酸或者多肽的至少大約5，10，20，30，40，50，100，150，200，250，300，350，400個連續的殘基，或者全長的范圍內。序列同一性(同源性)的程度可以應用任何計算機程序和相關聯的參數來確定，包括那些在此所說明的，如使用默認參數的BLAST 2.2.2.或者FASTA3.0t78版。
            
同源性序列也包括RNA序列，其中在核酸序列中尿嘧啶替代了胸腺嘧啶。同源序列可以應用在此說明的任何程序得到或者可以由校正序列錯誤得到。應該理解到的是，在此所列的核酸序列可以以傳統的單一字母的形式來代表(見，如，Stryer，Lubert.Biochemistry 3rd Ed.，W.H.Freeman & Co.，New York)或者以記錄序列中的核苷酸的同一性的任何其他形式來代表。
            
在發明的這一方面，在此指明的各種序列比較程序得以使用。蛋白和/或核酸序列同一性(同源性)可以應用技術上已知的任何序列比較算法和程序評估。這樣的算法和程序包括，但不限于，TBLASTN，BLASTP，FASTA，TFASTA，和CLUSTALW(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)2444-2448，1988Altschul et al.，J.Mol.Biol.215(3)403-410，1990；Thompson et al.，NucleicAcids Res.22(2)4673-4680，1994；Higgins et al.，Methods Enzymol.266383-402，1996；Altschul et al.，J.Mol.Biol.215(3)403-410，1990；Altschul et al.，NatureGenetics 3266-272，1993)。
            
同源性或者同一性可以應用序列分析軟件來測定(如，遺傳學計算機組的序列分析軟件包，Uinversity of Wisconsin Biotechnology Center，1710 UniversityAvenue，Madison，WI 53705)。這樣的軟件通過對各種缺失，替換，或者其它的修飾進行同源性水平賦值比較相似的序列。在兩個或者多個核酸或者多肽序列的語境下，術語“同源性”和“同一性”是指兩個或者多個序列或者亞序列，當在比較窗口或者指定區域中應用任何數量的序列比較算法或者手動排列和目測來測定，通過比較和排列以便獲得最大的一致性時，它們是相同的或者具有氨基酸殘基或者核苷酸的特異百分比。對于序列比較，一個序列可以作為參照序列(典型序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，.SEQ ID NO5，SEQID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，等等)與待測序列進行比較。當應用序列比較算法，待測序列和參照序列被輸入到計算機中，如果必要指定亞序列坐標，指定序列算法程序參數。可以應用默認程序參數，或者指定選擇性參數。序列比較算法依據程序參數，計算待測序列和參照序列同一性的百分比。
            
在此應用的“比較窗口”，包括涉及連續殘基的數目的任何一個片段。例如，在發明可選擇的方面，連續殘基的范圍從20到全長的發明的典型序列，例如，SEQID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，等等，當兩個序列優化地排列后，與參照序列的相同數目的連續位置進行比較。如果參照序列與發明的典型序列，例如SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ IDNO7，SEQ ID NO8等具有必要的序列同一性，如，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者更多的序列同一性，該序列是屬于發明的范圍。在可選擇的實施方案中，當兩個序列優化地排列后，從大約20到600，大約50到200，和大約100到150范圍的序列與參照序列的同樣的連續位置比較。用于比較的序列比對方法為技術熟練人員所熟悉。用于比較的優化序列比對可以用，例如，Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482，1981的局部同源性算法，Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48443，1970的同源排列算法，Person & Lipman，Proc，Nat′1.Acad.Sci.USA 852444，1988的搜索相似性法，通過計算機化這些算法(Wisconsin的遺傳學軟件包，遺傳學計算機組，575 Science Dr，Madison，WI的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA)或者通過手動排列和目測完成。其它的用于確定同源性或者同一性的算法包括，例如，除了(在生物信息國家中心的基本局部排列搜索工具)BLAST程序外，ALIGN，AMAS(多排列的序列分析)，AMPS(蛋白多序列比對)，ASSET(比對片段的統計評估工具)，BANDS，BESTSCOR，BIOSCAN(生物序列比較分析節點)，BLIMPS(BLocks IMProved Searcher)，FASTA，Intervals & Points，BMB，CLUSTAL V，CLUSTAL W，CONSENSUS，LCONSENSUS，WCONSENSUS，Smith-Waterman算法，DARWIN，Las Vegas算法，FNAT(強迫核苷酸比對工具)，Framealign，Framesearch，DYNAMIC，FILTER，FSAP(Fristensky序列分析包)，GAP(通用比對程序)，GENAL，GIBBS，GenQuest，ISSC(靈敏的序列比較)，LALIGN(局部序列比對)，LCP(局部含量程序)，MACAW(多比對構建&分析工作臺)，MAP(多比對程序)，MBLKP，MBLKN，PIMA(模式誘導的多序列比對)，SAGA(遺傳算法的序列比對)和WHAT-IF。這樣的比對程序也可以用于篩查基因組數據庫，鑒定具有實質上同一性序列的多核苷酸序列。目前已經有很多基因組數據庫，例如，人類基因組的實質上部分可以作為人類基因組測序計劃(Gibbs，1995)的一部分。幾個基因組已經測序完成，如，生殖道支原體Mgenitalium(Fraseret al.，1995)，甲烷球菌M.jannaschii(Bult et al.，1996)，流感嗜血菌H influenzae(Fleischmann et al.，1995)，大腸桿菌E coli(Blattner et al.，1997)，和酵母(S.cerevisiae)(Mewes et al.，1997)，和果蠅D.melanogaster(Adams et al.，2000)。模式生物的基因組測序中已經取得了顯著的進展，如小鼠，線蟲，和擬南芥Arabadopsis sp.。含有具功能性信息注解的基因組信息的數據庫由不同的組織保持，并且可以通過因特網進行訪問。
            
BLAST，BLAST 2.0和BLAST 2.22算法也用于實踐發明。這些算法在，如，Altschul(1977)Nuc.Acids Res.253389-3402，Altschul(1990)J.Mol.Biol.215403-410中有描述。進行BLAST分析的軟件可以通過生物技術信息國家中心(the National Center for Biotechnology Information)公開得到。此算法包括首先通過確定詢問序列中長度為W的短詞，當與數據庫中相同長度的詞對齊時，其或者匹配或者滿足正值閾得分T，從而確定高分值序列對(HSPs)。T值是指作為鄰近詞的分數閾值(Altschul(1990)，見上文)。這些起始的鄰近詞命中作為起始搜索的起始，從而發現更長的含有鄰近詞的HSPs。只要積累的比對值可以增加，詞命中就沿著每個序列向兩個方向延伸。對于核苷酸序列，積累值的計算應用參數M(匹配殘基對的獎勵得分值；一般情況下大于0)。對于氨基酸序列，應用記分矩陣來計算累積值。當累積的比對得分值從其最大所得值跌落到數量X；由于一個或者多個負值殘基的比對的積累，累積值趨向零或者零以下；或者任何一個序列的到達了末端，單詞命中的延伸在每一個方向終止。BLAST算法參數W，T，和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用字母長度(W)為11，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4的默認值并且比較兩條鏈。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用字母長度為3，期望值(E)為10的默認值，BLOSUM62記分矩陣(見Henikoff & Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915)比對值(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，并且比較兩條鏈。BLAST算法也對兩個序列之間的相似性進行統計分析(見，如，Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873)。由BLAST算法提供的一個相似性測定是最小總概率(P(N))，其通過兩個核苷酸之間或者氨基酸序列之間隨機配對，提供概率的指標。例如，在檢測核酸和參照序列比較時，如果最小的總概率小于大約0.2，更優選的是小于大約0.01，最優選的小于大約0.001，那么認為核酸與參考序列相似。一方面，蛋白質和核酸序列的同源性應用基本局部比對搜索工具(“BLAST”)評估。例如，五個特異性的BLAST程序可以用于以下任務(1)BLASTP和BLAST3把氨基酸詢問序列與蛋白序列數據庫進行比較。(2)BLASTN把核酸詢問序列與核酸序列數據庫進行比較。(3)BLASTX把詢問的核苷酸序列的六個框架的翻譯產物(兩個鏈)與蛋白序列數據庫進行比較。(4)TBLASTN把詢問的蛋白序列與六個閱讀框架(雙鏈)中翻譯的核酸序列數據庫進行比較，并且(5)TBLASTX把詢問核酸的六個閱讀框架的翻譯與數據庫中核苷酸序列的六個閱讀框架的翻譯進行比較。BLAST程序通過鑒定相似片段來鑒定同源序列，相似片段在此是指詢問氨基酸或者核酸序列之間的“高分值片段對”，檢測序列優選的從蛋白質或者核酸序列數據庫中獲得。高分值片段配對優選地通過記分矩陣鑒定(比對)，它們中的很多為技術熟練人員所熟悉。優選地，應用的記分矩陣是BLOSUM62矩陣(Gonnet et al.，Science 2561443-1445，1992，Henikoff和Henikoff，Proteins 1749-61，1993)。較不優選地，PAM或者PAM250矩陣也可以應用(見，例如，Schwartz和Dayhoff，eds.，1978，檢測距離關系的矩陣蛋白質序列和結構集，華盛頓  國家生物醫學研究基金會)。
            
發明的一方面，為了確定是否核酸具有發明范圍內的必需序列同一性，應用NCBI BLAST 2.2.2程序，默認值的選擇是blastp。在BLAST 2.2.2程序中，有大約38個設定的選擇。在發明的典型方面，除了默認的過濾設置外，所有都應用默認值(即除了過濾設定為關閉，所有的參數設定為默認值)，在該位置上應用不進行過濾“-F F”設置。一般由于序列的長度，默認過濾的使用經常導致Karlin-Altschul違背。
            
發明的典型方面的使用的默認值包括“低復雜性過濾on＞字長3＞矩陣Blosum62＞缺口成本存在值11  
            
＞延伸1”其它的默認值設置為低復雜性過濾關閉(off)，蛋白質字母長度為3，BLOSUM62矩陣，缺口存在補償-11，并且缺口延伸補償-1。
            
典型的NCBI BLAST 2.2.2程序設置在以下的實施例1中闡明。注意，“-W”選擇默認值為0。這是指，如果沒有設置，對于蛋白，字母長度默認值為3，對于核苷酸字母長度默認值為11。
            
計算機系統和計算機程序產品為了確定和鑒定序列同一性，結構同源性，基元等等，發明的序列可以在任何計算機可以讀取的介質上儲存，記錄和操作。相應地，發明提供計算機，計算機系統，計算機可讀介質，計算機程序產品和等等可以記錄和儲存發明的核酸和多肽序列，例如，發明的典型序列，如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，等等的產品。正如在此使用的，單詞“記錄的”和“存儲的”是指在計算機介質上儲存信息的過程。熟練的技術人員可以很容易地采用任何已知的方法在計算機的可讀介質上記錄信息，產生含有一個或者多個發明的核酸和/或多肽序列的產品。
            
發明的另一方面是具有記錄發明的至少一個核酸和/或多肽序列的計算機可讀介質。計算機可讀介質包括磁性可讀介質，光學可讀介質，電子可讀介質和磁性/光學介質。例如，計算機可讀介質可以是硬盤，軟盤，磁帶，CD-ROM，DVD，隨機存取存儲器(RAM)，只讀存儲器(ROM)以及其它類型的技術人員熟知的其它媒介。
            
發明的方面包括系統(如，以因特網為基礎的系統)，特別的計算機系統，其存儲和操作在此說明的序列和序列信息。計算機系統100的一個實施例在圖1的方塊圖中有說明。正如在此所使用的，“計算機系統”是指用于分析發明的核苷酸和多肽序列的硬件組件，軟件組件，以及數據存儲組件。計算機系統100可以包括用于序列數據處理，訪問和操作的處理器。處理器105可以是任何已知類型的中央處理器如，例如，Intel公司的奔騰III處理器或者Sun，Motorola，Compaq，AMD或者IBM公司相似的處理器。計算機系統100是一般目的的系統，其包括處理器105和用于存儲數據的一個或者多個內部數據存儲組件110，和一個或者多個用于檢索存儲于數據存儲裝置的數據的數據檢索裝置。熟練的技術人員可以很容易地應用任何一個目前可得到的合適的計算機系統。
            
一方面，計算機系統100包括連接于總線的處理器105，該總線連接于主存儲器115，(優選地，作為RAW執行)和一個或者更多的內部數據存儲裝置110，如硬盤驅動器和/或其它的具有數據存儲的計算機可讀介質。計算機系統100可以進一步包括一個或者多個用于讀取存儲于內部數據存儲裝置110的數據的數據檢索裝置118。
            
數據檢索裝置118可以為，例如，軟盤驅動器，光盤驅動器，磁帶驅動器或者可以連接于遠端數據存儲系統的調制解調器(如通過因特網)等等。在一些具體情況下，內部的數據存儲裝置110是可移動的計算機可讀介質如，軟盤，光盤，磁帶，等等。含有控制邏輯和/或其中記錄的數據。當數據存儲組件插入到數據檢索裝置中時，計算機系統100可以優勢地包括或者通過適當的軟件執行來讀取控制邏輯和/或數據。
            
計算機系統100包括用于給計算機應用者顯示輸出的結果的顯示器120。應當注意到計算機系統100可以在網絡中或者寬帶網中連接于其它的計算機系統125a-c，提供集中地接到計算機系統100。連接和處理發明的核酸或者氨基酸序列的軟件可以在執行過程中駐留在主存儲器115中。
            
一些方面，計算機系統100可以進一步包括比較發明的核酸序列的序列比較算法。算法和序列可以儲存在計算機可讀的介質中。“序列比較算法”是指一個或者多個程序，可以安裝在(局域地或者遠程地)計算機系統100上，把核酸序列與別的核酸序列和/或在數據存儲方式中存儲的化合物相比較。例如，序列比較算法可以把典型的序列的核苷酸序列，如，存儲在計算機可讀介質中的SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID.NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ IDNO7，SBQ ID NO8等等與存儲在計算機可讀介質中的參照序列進行比較，確定同源性或者結構基元。
            
以上算法應用的參數可以依據所研究的序列長度和同源性水平而加以變化。一些方面，算法使用的參數可以在使用者沒有給出指令的情況下，應用默認參數。圖2是說明過程200的流程圖，把新的核苷酸或者蛋白序列和數據庫的序列加以比較，確定新序列和數據庫序列之間的同源性水平。序列數據庫可以是在儲存于計算機系統100的私人數據庫，或者公開數據庫，如通過因特網可以查到的GENBANK。過程200在起始狀態201開始，并且移動到狀態202，其中待比較的新序列儲存于計算機系統100的存儲器中。正如以上所討論的，存儲器可以是任何類型的存儲器，包括RAM或者內部存儲裝置。
            
過程200隨后移至狀態204，其中的序列數據庫開放用于分析和比較。進程200然后移至狀態206，其中讀取存儲在數據庫的第一序列至計算機的存儲器中。在狀態210下進行比較，確定是否第一序列與第二序列一樣。值得注意的是，本步驟并不限于進行新序列和數據庫中的第一序列進行精確的比較。技術熟練人員熟悉比較兩個核苷酸或者蛋白序列的方法，盡管它們并不相同。例如，為了提高兩個待檢測序列的同源性水平，可以在一個序列中引入缺口。在比較過程中控制是否引入缺口或者其它的特征到序列中的參數一般由計算機系統的使用者輸入。
            
一旦在狀態210的情況下，進行了兩個序列的比較，那么在決定狀態210就作出是否兩個序列一樣的確定。當然，術語“同樣”并不限于完全絕對一樣的序列。在使用者輸入的同源性參數內的序列將在過程200中被標記為“相同的”。如果確定了兩個序列是一樣的，過程200移至狀態214，其中來自數據庫的序列的名稱給使用者顯示出來。該狀態告訴使用者顯示了名稱的序列具有輸入所限制的同一性。一旦儲存序列的名稱給使用者顯示出來，過程200移至決定狀態218，作出是否在數據庫中有更多的序列的結論。如果在數據庫中沒有更多的序列，那么過程200終止于結束狀態220。然而，如果在數據庫中存在更多的序列，那么過程200移至狀態224，其中指示器移到數據庫中下一個序列，以便可以與新序列進行比較。以這種方式，比對新序列并且與數據庫中的每一個序列進行比較。
            
應當注意，如果在決定狀態212作出了決定，序列沒有同源性，那么過程200將立即移至決定狀態218，確定在數據庫中是否有其它的序列用于比較。同樣地，發明的一方面是包括處理器，儲存有發明的核酸序列的數據存儲裝置以及用于進行比較的序列比較軟件的計算機系統。序列比較器可以指示待比較序列之間的同源性水平或者鑒定結構基元，或者可以確定與核酸密碼子和多肽密碼相比較的序列中的結構基元。
            
圖3是說明計算機中過程250的一個具體例子，確定是否兩個序列具有同源性的流程圖。過程250開始于起始狀態252，并且隨后移至狀態254，其中待比較的第一序列存儲于存儲器中。待比較的第二序列隨后在狀態256存儲于存儲器中。過程250然后移至狀態260，其中讀取第一序列的第一個字母，然后移至狀態262，其中讀取第二序列的第一個字母。應當理解如果序列是核苷酸序列，那么字母是A，T，C，G，或者U。如果序列是蛋白序列，那么字母為單個的氨基酸序列密碼，以便第一序列與第二序列可以很容易地進行比較。在決定狀態264作出是否兩個字母是一樣的決定。如果它們一樣，過程250移至狀態268，來讀取第一和第二序列的下一個字母，然后確定是否下一個字母是相同的。如果相同，過程250繼續該循環一直到兩個字母不同。如果確定下一個兩個字母不同，過程250移至決定態274，確定是否在序列中有任何更多的字母來讀取。如果沒有更多的字母來讀取，那么過程250移至狀態276，其中第一和第二序列的同源性水平給使用者顯示出來。同源性水平通過計算序列間的相同字母的數目占第一序列總的字母數的比例來確定。這樣，如果在第一個100個核苷酸序列中比對的每一個字母與第二序列的每一個字母一樣，同源性水平將是100％。
            
可選擇地，計算機程序可以比較參照序列與發明的序列，確定是否序列在一個或者多個位置上不同。程序可以記錄發明序列和參照序列中插入，缺失或者替換核苷酸或者氨基酸殘基的長度和同一性，計算機程序可以是確定是否參照序列與發明的序列相比含有單一核苷酸多態性(SNP)，或者是否發明的序列含有已知序列的SNP的程序。這樣，在一些方面，計算機程序是鑒定SNPs的程序。該方法可以通過以上說明的計算機系統來完成并且該方法在圖3中有說明。該方法可以通過應用計算機程序讀取發明序列和參照序列來進行，并且用計算機程序來鑒定差異。
            
另一方面，以計算機為基礎的系統包括鑒定發明的核酸或者多肽特征的鑒定器。“鑒定器”是指一個或者多個鑒定核酸序列的一些特征的程序。例如，鑒定器可以包括鑒定核酸序列中開放閱讀框架(ORF)的程序。圖4是說明用于檢測序列中存在特征的鑒定器程序300的一個方面的流程圖。過程300起始于起始狀態302然后移至狀態304，其中待檢測特征的第一序列存儲于計算機系統100的存儲器115。過程300然后移至狀態306，在該狀態下，開放具有序列特征的數據庫。這樣數據庫將包括每一個特征屬性和特征名稱的菜單。例如，特征名稱可以是“起始密碼子”，特征屬性為“ATG”。另一個例子是特征名稱為“TAATAA盒”，特征屬性為“TAATAA”。這樣的數據庫是由威斯康辛大學遺傳學計算機組制作。可選擇地，特征可以是結構多肽基元如α螺旋，β折疊，或者功能性多肽基元如，酶的活性位點，螺旋-轉角-螺旋基元或者其它的技術熟練人員所熟知的基元。一旦在狀態306特征數據庫開放，過程300移至狀態308，其中第一特征從數據庫中讀取。然后在狀態310中進行第一特征的屬性與第一序列的比較。然后在狀態316下作出決定是否在第一序列發現有特征的屬性。如果發現屬性，過程300移至狀態318，其中發現特征的名稱顯示給使用者。過程300然后移至決定狀態320，在其中作出是否在數據庫中存在更多的特征的決定。如果不存在更多的特征，過程300終止于結束狀態324。然而，如果數據庫中有更多的特征，過程300在狀態326讀取下一個序列特征，并且循環至狀態310，其中下一個特征的屬性與第一序列進行比較。如果在狀態316并沒有在第一序列中發現特征屬性，過程300直接移至決定狀態320，作出是否有更多的特征存在于數據庫中的確定。這樣，一方面，發明提供鑒定開放閱讀框架(ORFs)的計算機程序。
            
發明的多肽和核酸序列可以以不同的形式用不同的數據處理程序存儲并且處理。例如，序列可以以如文本的字處理文件儲存，如，Miorosoft WORD或者WORDPERFECT或者那些技術熟練人員熟悉的不同的數據程序的ASCll文件，如，DB2，SYBASE，或者ORACLE。此外，很多的計算機程序和數據庫可以作為序列比較算法，鑒定器，或者，參照核苷酸序列或者多肽序列的來源，與發明的核酸序列比較。用于實踐發明的程序和數據庫包括，但不限于MacPattern(EMBL)，DiscoveryBase(Molecular Applications Group)，GeneMine(Molecular ApplicationsGroup)，Look(Molecular Applications Group)，MacLook(Molecular ApplicationsGroup)，BLAST和BLAST2(NCBI)，BLASTN和BLASTX(Altschul et al，J.Mol.Biol.215403，1990)，FASTA(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444，1988)，FASTDB(Brutlag et al.Comp.App.Biosci.6237-245，1990)，Catalyst(Molecular Simulations Inc.)，Catalyst/SHAPE(Molecular Simulations Inc.)，Cerius2.DBAccess(Molecular Simulations Inc.)，HypoGen(Molecular Simulations Inc.)，Insight II，(Molecular Simulations Inc.)，Discover(Molecular Simulations Inc.)，CHARMm(Molecular Simulations Inc.)，Felix(Molecular Simulations Inc.)，DelPhi，(Molecular Simulations Inc.)，QuanteMM，(Molecular Simulations Inc.)，Homology(Molecular Simulations Inc.)，Modeler(Molecular Simulations Inc.)，ISIS(Molecular Simulations Inc.)，Quanta/Protein Design(Molecular Simulations Inc.)，WebLab(Molecular Simulations Inc.)，WebLab Diversity Explorer(MolecularSimulations Inc.)，Gene Explorer(Molecular Simulations Inc.)，SeqFold(MolecularSimulations Inc.)，MDL可用的化學品目錄數據庫，MDL的藥物數據報告數據庫，綜合藥物化學數據庫(the Comprehensive Medicinal Chemistry database)，Derwent′s世界藥物索引數據庫，BioByteMasterFile數據庫，Genbank數據庫，和Genseqn數據庫。很多其它的程序和數據庫對于技術熟練人員是顯然的。
            
可以應用以上程序檢測的基元包括序列編碼的亮氨酸拉鏈，螺旋-轉角-螺旋基元，糖基化位點，泛素化位點，α螺旋，和β折疊，編碼信號肽的信號序列，信號肽引導編碼蛋白的分泌，轉錄調控涉及的序列，如，同源盒，酸性分枝，酶活性位點，底物結合位點，和酶切割位點。
            
核酸的雜交發明提供可以在嚴謹的條件下，與發明的典型序列，例如，在SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SBQID NO13，SEQ ID NO15，SBQ ID NO17，SEQ ID NO19，SBQ ID NO21，SEQID NO23，SEQ ID NO25，SEQ ID NO27，SEQ ID NO29，SEQ ID NO31，SEQID NO33，SEQ ID NO35，SEQ ID NO37，SEQ ID NO39，SEQ ID NO41，SEQID NO43，SEQ ID NO45，SEQ ID NO47，SEQ ID NO49，SEQ ID NO51，SEQID NO53，SEQ ID NO55，SEQ ID NO57，SEQ ID NO59，SEQ ID NO61，SEQID NO63，SEQ ID NO65，SEQ ID NO67，SEQ ID NO69，SEQ ID NO71，SEQID NO73，SEQ ID NO75，SEQ ID NO77，SEQ ID NO79，SEQ ID NO81，SEQID NO83，SEQ ID NO85，SEQ ID NO87，SEQ ID NO89，SEQ ID NO91，SEQID NO93，SEQ ID NO95，SEQ ID NO97，SEQ ID NO99，SEQ ID NO101，SEQ ID NO103，SEQ ID NO105中闡明的序列，或者編碼包括在SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQID NO14，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，SEQ ID NO22，SEQID NO24，SEQ ID NO26，SEQ ID NO28，SEQ ID NO30，SEQ ID NO32，SEQID NO34，SEQ ID NO36，SEQ ID NO38，SEQ ID NO40，SEQ ID NO42，SEQID NO44，SEQ ID NO46，SEQ ID NO48，SEQ ID NO50，SEQ ID NO52，SEQID NO54，SEQ ID NO56，SEQ ID NO58，SEQ ID NO60，SEQ ID NO62，SEQID NO64，SEQ ID NO66，SEQ ID NO68，SEQ ID NO70，SEQ ID NO72，SEQID NO74，SEQ ID NO76，SEQ ID NO78，SEQ ID NO80，SEQ ID NO82，SEQID NO84，SEQ ID NO86，SEQ ID NO88，SEQ ID NO90，SEQ ID NO92，SEQID NO94，SEQ ID NO96，SEQ ID NO98，SEQ ID NO100，SEQ ID NO102，SEQ ID NO104，SEQ ID NO106中闡明序列的多肽的核酸雜交的分離的或者重組的核酸。嚴謹條件可以是高度嚴謹條件，中度嚴謹條件，低度嚴謹條件，包括在此說明的高度和降低嚴謹性的條件。在可選擇的具體情況下，通過在嚴謹條件下雜交能力所定義的發明的核酸可以是大約5個殘基到全長分子之間，例如，發明的典型核酸。例如，它們的長度可以是至少5，10，15，20，25，30，35，40，50，55，60，65，70，75，80，90，100，150，200，250，300，350，400個殘基。比全長核酸較短的核酸也包括在內。這些核酸可以用于如雜交探針，標記探針，PCR寡聚核苷酸探針，iRNA(單鏈或者雙鏈)，反義或者編碼抗體結合肽(抗原決定簇)的序列，基元，活性位點和類似物。
            
一方面，發明的核酸通過其可以在高的嚴謹性條件下雜交的能力定義，高嚴謹性包括條件為大約37℃到42℃，大約50％的甲酰胺。一方面，發明的核酸通過其可以在降低的嚴謹性條件下雜交的能力定義，降低的嚴謹性包括條件為大約30℃到35℃，大約35％到25％的甲酰胺。可選擇地，發明的核酸通過其可以在高嚴謹性條件下雜交的能力定義，高嚴謹性包括條件為42℃，50％的甲酰胺中，5×SSPE，0.3％的SDS，以及作為封閉核酸的重復序列，如cot-1或者鮭魚精DNA(例如，200n/ml剪切的和變性的鮭魚精DNA)。一方面，發明的核酸通過其可以在降低的嚴謹條件下雜交的能力定義，降低的嚴謹性包括條件為降低的溫度35℃，含有35％的甲酰胺。
            
雜交以后，濾膜可以在50℃，用6×SSC，0.5％的SDS洗膜。認為超過25％的甲酰胺的這些條件是“中度”條件，而小于25％的甲酰胺的條件是“低度”條件。“中度”雜交條件的一個特定例子是當以上的雜交在30％的甲酰胺下進行。“低嚴謹性”的特定例子是當上述雜交在10％的甲酰胺下進行。
            
與特定水平的嚴謹性相對應的溫度范圍可以進一步通過計算該核酸中嘌呤與嘧啶的比例來細化，并且相應地調節溫度。發明的核酸也通過其可以在Ausubel和Sambrook中所述的高度，中度，低度嚴謹性條件下雜交的能力來定義。以上范圍和條件的變化為技術熟練人員所熟悉，雜交條件在以下有進一步的討論。
            
寡聚核苷酸探針和應用方法發明也提供用于鑒定編碼具有磷脂酶活性的多肽的核酸的核酸探針。一方面，探針包括在SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ IDNO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO17，SEQ IDNO19，SEQ ID NO21，SEQ ID NO23，SEQ ID NO25，SEQ ID NO27，SEQ IDNO29，SEQ ID NO31，SEQ ID NO33，SEQ ID NO35，SEQ ID NO37，SEQ IDNO39，SEQ ID NO41，SEQ ID NO43，SEQ ID NO45，SEQ ID NO47，SEQ IDNO49，SEQ ID NO51，SEQ ID NO53，SEQ ID NO55，SEQ ID NO57，SEQ IDNO59，SEQ ID NO61，SEQ ID NO63，SEQ ID NO65，SEQ ID NO67，SEQ IDNO69，SEQ ID NO71，SEQ ID NO73，SEQ ID NO75，SEQ ID NO77，SEQ IDNO79，SEQ ID NO81，SEQ ID NO83，SEQ ID NO85，SEQ ID NO87，SEQ IDNO89，SEQ ID NO91，SEQ ID NO93，SEQ ID NO95，SEQ ID NO97，SEQ IDNO99，SEQ ID NO101，SEQ ID NO103，SEQ ID NO105中闡明的序列的至少10個連續堿基。可選擇地，發明的探針可以是發明的序列中所闡明的序列的至少大約5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，50，55，60，65，70，75，80，90，100，150，大約10到50，大約20到60，大約30到70個連續堿基。探針通過結合或者雜交來鑒定核酸。探針可以用于本發明的陣列中，見以下討論，包括，例如，毛細管陣列。發明的探針也可以用于分離其它的核酸或者多肽。
            
發明的探針可以用于確定是否生物樣品，如土壤樣品，含有具有發明的核酸序列的生物或者含有核酸來源的生物。在這一程序中，獲得潛在地隱藏了從其中分離核酸的生物體的生物樣品，并且從樣品中獲得核酸。核酸在允許探針與樣品中存在的任何互補序列特異雜交的條件下與探針接觸。如果必要，探針與互補序列特異雜交的條件可以通過將探針與已知含有互補序列核酸的樣品中的互補序列接觸來確定，同時對照序列為不含有互補序列。可以改變雜交條件，如雜交緩沖液中的鹽濃度，雜交緩沖液中的甲酰胺濃度，或者雜交溫度，來使得探針特異性地與互補的核酸序列雜交(見，特異雜交條件的討論)。
            
如果樣品中含有核酸自其中分離的生物，檢測探針特異的雜交。雜交可以通過用檢檢測劑，如放射性同位素，熒光染料或者可以催化形成可檢測產物的酶，標記探針進行檢測。應用標記的探針來檢測在樣品中存在互補的核酸的很多方法為技術熟練人員所熟悉。這些方法包括Southern印跡，Northern印跡，菌落雜交程序，以及斑點印跡雜交。每一個程序的具體方法參見Ansubel和Sambrook。
            
可選擇地，多于一個探針(至少一種可以與存在于核酸樣品中的任何互補序列雜交的探針)可以在擴增反應中使用，確定是否樣品中含有具有發明的核酸序列的生物(如，核酸自其中分離的生物)。一方面，探針包括寡核苷酸。一方面，擴增反應可以包括PCR反應。PCR的具體方法在Ansubel和Sambrook的書中有說明(參見擴增反應的討論)。在這樣的程序中，樣品中的核酸與探針接觸，進行擴增反應，檢測得到的任何擴增產物。擴增產物可以通過反應產物進行凝膠電泳來檢測，并且用如溴乙啶的插入試劑來染膠。可選擇的，一個或者多個探針可以用放射性同位素標記，并且在凝膠電泳后，通過放射自顯影檢測是否存在放射性標記的擴增產物。
            
來源于發明的核酸序列的近3’或者5’端的探針也可以用染色體步行程序來確定含有另外的，如基因組序列的克隆。這樣的方法允許從宿主生物體中分離編碼另外感興趣蛋白的基因。
            
一方面，發明的核酸作為探針鑒定和分離相關的核酸。在一些方面，這樣確定的相關核酸可以是來自于非發明核酸首次自其中分離的生物體的cDNA或者基因組DNA，通過這樣的程序，核酸樣品與探針在允許探針特異地與相關序列雜交的條件下接觸。探針與來源于相關生物體的核酸雜交后，應用以上說明的任何方法來檢測。
            
在核酸雜交反應中，用于達到特定嚴謹性水平的條件可以根據待雜交核酸的性質來進行改變。例如，在選擇雜交條件中要考慮長度，互補水平，核酸雜交區域的核苷酸序列組成(如，GC對AT含量的比率)，以及核酸類型(如，RNA對DNA)。另外考慮是否核酸中的一個是固定于，如濾膜上。雜交可以在低嚴謹性，中度嚴謹性或者高嚴謹性的條件下進行。作為核酸雜交的一個例子，含有固定的變性的核酸的多聚膜首先在45℃下，在含有0.9M NaCl，50mM NaH2PO4，PH 7.0，5.0mM Na2EDTA，0.5％SDS，10×Denhardt′s和0.5mg/ml多核腺苷酸的溶液中預雜交30分鐘。大約2×107cpm(特異活性4-9×108cpm/ug)的32P末端標記的寡聚核苷酸探針加入到溶液中。在12-16小時的溫育以后，膜在室溫(RT)下于含有0.5％SDS的1×SET(150mM NaCl，20mM Tris鹽酸，PH 7.8，1mM Na2EDTA)中洗滌30分鐘，然后在新鮮配制的1×SET，寡聚核苷酸探針的Tm-10℃下，再洗滌30分鐘。然后將膜暴露于自顯影膠片上來檢測雜交信號。
            
通過改變鑒定核酸，如可以與探針雜交的cDNA或者基因組DNA，時所用的雜交條件的嚴謹性，可以鑒定和分離與探針具有不同同源性水平的核酸。嚴謹性變化可以通過在低于探針熔鏈溫度的改變溫度下進行雜交來進行。熔鏈溫度Tm，是(在確定的離子強度和pH值的條件下)50％的靶序列與完全互補探針雜交的溫度。對于特定的探針，非常嚴謹性的條件是選擇等于或者低于特定探針Tm值5℃。探針的熔鏈溫度可以通過以下的經驗公式計算。對于長度為14到70個核苷酸長度的探針，熔鏈溫度(Tm)的計算應用以下公式Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C部分)-(600/N)，其中N是探針的長度。如果雜交是在含有甲酰胺的溶液中進行，熔鏈溫度的計算用以下的公式Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C部分)-(0.63％甲酰胺)-(600/N)其中N是探針的長度。預雜交可以在6×SSC，5×Denhardt′s試劑，0.5％SDS，100μg變性的鮭魚精DNA片段或者6×SSC，5×Denhardr′s試劑，0.5％SDS，100μg變性的鮭魚精DNA片段，50％甲酰胺中進行。SSC和Denhardt′s以及其它溶液的配方見，例如，Sambrook。
            
雜交是通過加入可檢測到的探針于以上所列的預雜交溶液中進行，其中的探針包括雙鏈DNA。探針在加入到雜交溶液之前先要進行變性。濾膜首先與雜交溶液充分接觸一段時間，使得探針與含有互補序列或者同源序列的cDNA或者基因組DNA雜交。對于長度超過200個核苷酸的探針，雜交在比Tm低15到25℃進行。對于較短的探針如寡聚核苷酸探針，雜交在比Tm低5到10℃進行。一方面，在6×SSC中，大約是68℃進行雜交。一方面，在含有50％甲酰胺的溶液，溫度大約為42℃進行雜交。認為前述的所有雜交認為是在高嚴謹性條件下進行。
            
雜交以后，濾膜洗滌去除任何非特異結合的可以檢測到的探針。洗膜所用的嚴謹性也可以根據雜交的核酸的性質，雜交核酸的長度，互補的程度，核苷酸序列的組成(如，GC對AT的含量)，以及核酸類型(如，RNA對DNA)來進行變化。逐漸增高嚴謹性條件的洗膜例子如下2×SSC，室溫下0.1％SDS 15分鐘，(低嚴謹性)；0.1×SSC，室溫下0.5％SDS30分鐘到1小時(中度嚴謹性)；0.1×SSC，0.5％SDS，雜交溫度和68℃之間15到30分鐘(高嚴謹性)；0.15M NaCl，在72℃下15分鐘(很高嚴謹性)，最后低嚴謹性洗滌可以在0.1×SSC室溫下進行。以上的例子僅僅是用于洗膜的一系列條件。技術熟練人員應該了解對于不同嚴謹性的洗滌有很多不同的方法(recipes)。
            
可以與探針雜交的核酸可以通過放射自顯影或者其它傳統的技術來確定。可以改變以上的程序來鑒定具有與探針序列具有降低的同源性水平的核酸。例如為了獲得與探針序列具有降低的同源性水平的核酸，可以應用不太嚴謹的條件。例如，在含有Na+濃度為大約1M的雜交緩沖液中，雜交溫度可以從68℃到42℃以5℃的幅度降低。雜交后，濾膜用2×SSC，0.5％SDS在雜交溫度下洗膜。認為高于50℃的條件為“中度”條件，低于50℃的條件為“低度”條件。“中度”雜交條件的一個例子是當以上的雜交在55℃的條件下進行。“低嚴謹性”雜交條件的一個例子是當以上的雜交在45℃的條件下進行。
            
可選擇地，雜交在緩沖液，如含有甲酰胺的6×SSC中，在42℃下進行。在這種情況下，雜交緩沖液中甲酰胺的濃度可以以5％的幅度從50％降低到0％來確定對探針具有降低的同源性水平的克隆。雜交后，濾膜可以用6×SSC，0.5％SDS在50℃下洗滌，認為當甲酰胺濃度大于25％為“中度”條件，而低于25％為“低度”條件。“中度”雜交條件的一個例子是當以上的雜交在30％的甲酰胺中進行。“低嚴謹性”雜交條件的一個例子是當以上的雜交在10％的甲酰胺中進行。
            
發明的這些探針和方法可以用于分離具有與發明的核酸序列有至少大約99％，98％，97％，至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少60％，至少55％，或者至少50％的序列同源性的序列的核酸，該核酸包括至少大約10，15，20，25，30，35，40，50，75，100，150，200，250，300，350，400，或者500個連續的堿基和與之互補的序列。同源性可以應用在此所述的比對算法測定。例如，同源的多聚核苷酸可以具有在此說明的一個編碼序列的天然發生等位基因突變體的編碼序列。這樣的等位基因突變體與發明的核酸比較，可以具有取代，缺失或者插入一個或者多個核苷酸。
            
此外，發明的探針和方法可以用于分離編碼與發明多肽具有至少大約99％，至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少60％，至少55％，，或者至少50％的序列同一性(同源性)的多肽的核酸，應用序列比對算法(如，使用默認參數的FASTA版本3.0t78的算法，或者具有在此闡明的典型設置的BLAST2.2.2程序)確定的，該多肽具有其至少5，10，15，20，25，30，35，40，50，75，100，或者150個連續的氨基酸。
            
抑制磷脂酶的表達發明進一步提供與發明的核酸序列如磷脂酶編碼核酸互補的核酸(如，反義序列)。反義序列可以抑制磷脂酶編碼基因的轉運，剪接或者轉錄。抑制可以通過靶向基因組DNA或者信使RNA起作用。靶核酸的轉錄或者功能可以被抑制，例如，通過雜交和/或切割。發明提供的特別有效的一套抑制物包括可以結合磷脂酶基因或者信使PNA的寡聚核苷酸，在每一種情況下，阻止或者抑制磷脂酶的產生或者功能。結合是通過序列特異性的雜交實現的。另一類有用的抑制物包括引起磷脂酶信使RNA失活或者切割的寡聚核苷酸。寡聚核苷酸可以具有引起切割的酶活性，如核酶。寡聚核苷酸可以通過化學修飾或者接合到可以切割互補核酸的酶或成分上。操作人員可以從很多不同的此類寡聚核苷酸所構成的文庫中篩選出具有所需活性的這樣寡聚核苷酸。
            
磷脂酶表達的抑制可以具有多種不同的工業用途。例如，抑制磷脂酶的表達可以減慢或者阻止酸敗。當脂類或多肽，如，結構脂類或者多肽，被酶降解時，可能發生酸敗。這可以導致水果和蔬菜的變質或者腐敗。一方面，應用可以抑制磷脂酶的表達和/或活性的本發明的組分，例如，抗體，反義寡聚核苷酸，核酶和RNAi可以用于減緩或者阻止酸敗。這樣，一方面，發明提供包括應用于植物或者植物產品(如，水果，種籽，根，葉，等等)的方法和組分的本發明的抗體，反義寡聚核苷酸，核酶和RNAi，用于阻止或者延緩酸敗。這些組分也可以由植物表達(如，轉基因植物)或者其它生物(如，用本發明的磷脂酶基因轉化的細菌或者其它微生物)。
            
用于抑制磷脂酶表達的本發明的組分(如反義，iRNA，核酶，抗體)可以作為藥物的組分。
            
反義寡聚核苷酸發明提供可以結合磷脂酶信使的反義寡聚核苷酸，反義寡聚核苷酸可以通過靶向mRNA來抑制磷脂酶活性。設計反義寡聚核苷酸的策略在科學和專利文獻中有說明，并且技術熟練人員可以應用發明的新試劑設計這樣的磷脂酶寡聚核苷酸。例如，基因步行/RNA作圖方法來篩查有效的反義寡聚核苷酸為技術熟練人員所了解，見，如，Ho(2000)Methods Enzymol.314168-183，描述了RNA圖譜分析，RNA圖譜分析以標準的分子技術為基礎，給有效的反義序列的篩選提供了簡易的和可靠的方法。也見Smith(2000)Eur.J.Pharm.Sci.11191-198。
            
也可以應用天然產生的核酸作為反義寡聚核苷酸。反義寡聚核苷酸可以是任何長度；例如，在可選擇的方面，反義寡聚核苷酸在大約5到100，大約10到80，大約15到60，大約18到40之間。優化的長度可以通過常規的篩查來確定。反義寡聚核苷酸可以以任何濃度存在。優化的濃度可以通過常規的篩查來確定。已知有許多合成的，非天然產生的核苷和核酸類似物可以解決潛在的問題。例如，可以應用含有非離子性骨架，如N-(2-氨基乙基)甘氨酸單位的肽核酸(PNAs)。也可以應用具有磷硫連接的反義寡聚核苷酸，如，WO 97/03211；WO 96/39154所述；Mata(1997)Toxicol Appl Pharmacol 144189-197；反義治療學，ed.Agrawal(Humana Press，Totowa，N.J.，1996)。發明提供的具有合成的DNA骨架類似物的反義寡聚核苷酸也可以包括磷-二硫，甲基磷酸，磷阿米酮，烷基磷三酯，氨基磺酸鹽，3’-硫代乙縮醛，甲叉(甲基亞胺)，3′-N-氨基甲酸酯劑，和嗎啉代氨基甲酸酯核酸，如以上所述。
            
可以應用組合化學的方法產生大量的寡核苷酸，這些寡核苷酸是可以快速篩選對任何靶具有適當結合親和性和特異性的寡聚核苷酸，如發明的有義和反義的磷脂酶序列(見，如，Gold(1995)J.of Biol.Chem.27013581-13584)。
            
抑制性核酶發明提供可以結合磷脂酶信使的核酶，其可以通過靶向mRNA來抑制磷脂酶的酶活性。設計核酶和選擇用于靶向的磷脂酶特異的反義序列在科學和專利文獻中有說明，并且技術熟練人員可以應用發明的新試劑設計這樣的核酶。核酶通過核酶的靶RNA結合部分結合靶RNA起作用，核酶的靶RNA結合部分靠近RNA的酶活部分，酶活部分切割靶RNA。這樣，核酶通過互補的堿基配對識別并且結合靶RNA，并且一旦結合于正確的位點，將以酶的方式來切割并且使靶RNA失活。如果切割發生在編碼序列，以這種方式的靶RNA的切割將破壞其引發編碼蛋白合成的能力。當核酶結合并且切割其靶RNA后，一般情況下，將從RNA上釋放，然后對新的靶重復結合和切割過程。
            
在一些情況下，核酶的酶本質決定了其比其它技術如反義技術(其中核酸分子簡單地結合于核酸靶來阻止其轉錄，翻譯或者與其它分子的結合)更優越，因為作為治療處理有效的必要的核酶的活性濃度低于反義寡聚核苷酸的濃度。這一潛在的優點反映了核酶可以以酶的方式起作用的能力。這樣，單一的核酶分子可以切割靶RNA的很多分子。此外，核酶是典型的高度特異性的抑制劑，其抑制的特異性不僅僅依賴于結合的堿基配對機制，也依賴于分子抑制其結合的RNA表達的機制。即，抑制是通過切割RNA靶來引起的，并且特異性是通過切割的靶RNA的切割率占切割的非靶RNA中的切割率的比率來確定。這一切割機制依賴于涉及堿基配對的另外的因子。這樣，核酶的特異性作用高于結合于同一個RNA位點的反義寡聚核苷酸。
            
具有酶活的核酶RNA分子可以形成錘頭基元，但是也可以形成發夾，肝炎δ病毒，I類內含子或者RnaseP樣的RNA(與RNA的引導序列有關)基元。這樣的錘頭基元的例子在Rossi(1992)Aids Research and Human Retroviruses 8183中有說明；發夾基元在Hampel(1989)Biochemistry 284929，和Hampel(1990)Nuc.Acids Res.18299中有說明；肝炎δ病毒基元在Perrotta(1992)Biochemistry3116中有說明；RNaseP基元在Guerrier-Takada(1983)Cell 35849中有說明；并且I類內含子在Cech U.S.Pat.No.4,987,071中有說明。列舉這些特異基元的目的不是在于對此進行限制；技術熟練人員可以認識到本發明的酶RNA分子具有與一個或者多個靶基因RNA區域互補的特異性底物結合位點，并且在底物結合位點中或者周圍具有賦予該分子的RNA切割活性的核苷酸序列。
            
RNA干涉(RNAi)一方面，發明提供包括發明的磷脂酶序列的RNA抑制分子，叫做“RNAi”分子。RNAi分子包括雙鏈RNA(dsRNA)分子。RNAi可以抑制磷脂酶基因的表達。一方面，RNAi是長度為大約15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25或者更長的雙螺旋核苷酸。雖然發明并不受限于任何特別的作用機理，但是RNAi可以進入細胞，并且造成相似或相同序列的單鏈RNA(ssRNA)，包括內源性mRNA的降解。當細胞暴露于雙鏈RNA(dsANA)時，來自同源基因的mRNA被選擇性地被降解，該過程叫做RNA干涉(RNAi)。RNAi背后的可能的基本機理是與特異的基因序列配對的雙鏈RNA(dsANA)斷裂形成短片段，叫做短干擾RNA，這些短片段可以觸發與其序列配對的mRNA的降解。一方面，發明的RNAi在基因沉默治療中使用，見，例如Shuey(2002)Drug Discov.Today 71040-1046。一方面，發明提供使用發明的RNAi選擇性降解RNA的方法。該方法可以在體外，離體或在體內進行。一方面，發明的RNAi分子可以用于在細胞，器官或動物內產生功能缺失的突變。產生和使用RNAi分子選擇性降解RNA的方法在本領域眾所周知，見，例如美國專利號6,506,559；6,511,824；6,515,109；6,489,127。
            
核酸修飾本發明提供產生發明的核酸的變異體的方法，例如，那些編碼磷脂酶的核酸。這些方法可以重復或者在不同的組合中使用，產生與模板核酸編碼的磷脂酶相比具有改變的或不同活性或者改變的或不同穩定性的磷脂酶。這些方法也可以重復或者在不同的組合中使用，例如，產生基因/信息表達，信息翻譯或者信息穩定性的變異。另一方面，細胞的遺傳組分可以通過，例如離體的同源基因修飾，然后再插入細胞中而加以改變。
            
本發明的核酸可以通過任何方法改變。例如，無規則或隨機方法，或者，非隨機方法，或者“定向進化”方法。
            
基因的隨機突變的方法在技術上眾所周知，見，例如，美國專利號5,830,696。例如，誘變劑可以用于隨機突變基因。誘變劑包括，例如，紫外線或者γ-輻射，或者化學誘變劑，例如，絲裂霉素，亞硝酸，光致活性補骨脂素，它們單獨使用或組合使用，誘導可以通過重組修復的可修復DNA斷裂。別的化學誘變劑包括，例如，重亞硫酸鈉，亞硝酸，羥胺，肼或者甲酸。別的誘變劑是核苷酸前體的類似物，例如，亞硝基胍，5-溴尿嘧啶，2-氨基嘌呤，或者吖啶氮蒽。這些試劑可以在PCR反應時代替核苷酸前體加入，從而把序列變異。嵌入試劑例如原黃素，吖啶黃，阿的平等等也可以使用。
            
任何分子生物學技術都可以使用，例如，隨機PCR誘變，見，例如，Rice(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895467-5471；或者組合多重盒式誘變，見，例如Crameri(1995)Biotechniques 18194-196。做為選擇，核酸，例如，基因，可以在隨機分裂后重新裝配，見，例如，美國專利號6,291,242；6,287,862；6,287,861；5,955,358；5,830,721；5,824,514；5,811,238；5,605,793。可選擇的方面，可以通過錯誤傾向PCR，重排，寡核苷酸-定向的誘變，裝配PCR，有性PCR誘變，體外誘變，盒式誘變，回歸整體誘變，指數整體誘變，位點專一誘變，基因重裝配，基因位點飽和誘變(GSSW)，合成的連接重裝配(SLR)，重組，回歸序列重組，磷硫修飾的DNA誘變，含有尿嘧啶的模板誘變，缺口雙螺旋誘變，點錯配修復誘變，修復缺失宿主株變異，化學誘變，放射產生的誘變，缺失誘變，限制選擇誘變，限制純化誘變，人造基因合成，整體誘變，嵌合核酸多聚體產生，和/或這些方法和別的方法的組合導入修飾，添加或缺失。
            
以下出版物描述了多種可以與發明的方法結合的回歸重組程序和/或方法Stemmer(1999)“Molecular breeding of viruses for targeting and other clinicalproperties”Tumor Targeting 41-4，Ness(1999)Nature Biotechnology 17893-896，Chang(1999)“Evolution of a cytokine using DNA family shuffling”NatureBiotechnology 17793-797，65 Minshull(1999)“Protein evolution by molecularbreeding”Current Opinion in Chemical Biology 3284-290，Christians(1999)“Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA familyshuffling”Nature Biotechnology 17259-264，Crameri(1998)“DNA shuffling of afamily of genes from diverse species accelerates directed evolution”Nature391288-291，Crameri(1997)“Molecular evolution of an arsenate detoxificationpathway by DNA shuffling，”Nature Biotechnology 15436-438，Zhang(1997)“Directed evolution of an effective fucosidase from a.galactosidase by DNA shufflingand screening”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 944504-4509，Patten et al.(1997)“Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines”Current Opinion inBiotechnology 8724-733，Crameri et al.(1996)“Construction and evolution ofantibody-phage libraries by DNA shuffling”Nature Medicine 2100-103，Crameri et ai.(1996)“Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNAshuffling”Nature Biotechnology 14315-319，Gates et al.(1996)“Affinity selectiveisolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor ′headpiecedimer″，Journal of Molecular Biology 255373-3 86，Stemmer(1996)“Sexual PCRand Assembly PCR”InThe Encyclopedia of Molecular Biology.VCH Publishers，NewYork.pp.447-457，Crameri and Stemmer(1995)“Combinatorial multiple cassettemutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes”Bio Techniques 18194-195，Stemmer et al.(1995)“Single-step assembly of a geneand entire plasmid form large numbers of oligodeoxyobonucleotides”Gene，16449-53，Stemmor(1995)“The Evolution of Molecular Computation”Science 2701510，Stemmer(1995)“Searching Sequence Space”Bio/Technology 13549-553；Stemmer(1994)“Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling”Nature 370389-391，and Stemmer(1994)“DNA shuffling by random fragmentation and reassemblyInvitro recombination for molecular evolution.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA9110747-10751.  
            
產生多樣性的誘變方法包括，例如定向誘變(Ling et al.(1997)“Approashesto DNA mutagenesisan overview”Anal Biochem.254(2)157-178；Dale et al.(1996)“Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioatemethod”Methods Mol.Biol.57369-374，Smith(1985)“In vitro mutagenesis”Ann.Rev.Genet.19423-462，Botstein & Shortle(1985)“Strategies and applications of invitro mutagenesis″Science 2291193-1201，Carter(1986)“Site-directed mutagenesis″Biochem.J.2371-7；and Kunkel(1987)“The efficiency of oligonucleotide directedmutagenesis”in Nucleic Acids & Molecular Biology(Eckstein，F.and Lilley，D.M.J.eds.，Springer Verlag，Berlin))；使用含尿嘧啶的模板進行誘變(kunkel(1985)“Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492.Kunkel et al.(1987)“Rapid and efficient site-specificmutagenesis without phenotypic selection”Methods in Enzymol.154，367-382，andBass et al.(1988)“Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities”Science 242240-245)，寡核苷酸定點誘變(Methods in Enzymol.100468-500(1983)，Methods in Enzymol.154329-350(1987)，Zoller & Smith(1982)“Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectorsan efficient andgeneral procedure for the production of point mutations in any DNA fragment”NucleicAcids Res.106487-6500，Zoller & Smith(1983)“Oligonucleotide-directedmutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors”Methods in Enzymol.100468-500，and Zoller & Smith(1987)“Oligonucleotide-directed mutagenesisasimple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template”Methods in Enzymol.154329-350)；磷硫修飾的DNA誘變(Taylor et al.(1985)“The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to preparenicked DNA”Nucl.Acids Res.138749-8764，Taylor et al.(1985)“The rapidgeneration of oligonucleotide-directed mutations at high frequency usingphosphorothioate-modified DNA”Nucl.Acids Res.138765-8787(1985)；Nakamaye(1986)“Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioategroups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis”Nucl.Acids Res.149679-9698，Sayers et al.(1988)“Y-T Exonucleases in phosphorothioate-basedoligonucleotide-directed mutagenesis”Nucl.Acids Res.16791-802，and Sayers et al.(1988)“Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reactionwith restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide”Nucl.Acids Res.16803-814)；使用有缺口的雙螺旋DNA進行誘變(Kramer et al.(1984)“Thegapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction”Nucl.Asids Res.129441-9456；Kramer & Fritz(1987)Methods in Enzymol.“Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex  DNA”154350-367；Kramer et al.(1988)“improved enzymatic in vitro reactions in thegapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations”Nucl.Acids Res.167207；and Fritz et al.(1988)“Oligonucleotide-directedconstruction of mutationsa gapped duplex DNA procedure without enzymaticreactions in vitro”Nucl.Acids Res.166987-6999).  
            
發明的方法中使用的另外方案包括點錯配修復(Kramer(1984)“PointMismatch Repair”Cell 38879-887)，使用修復缺陷宿主菌株進行誘變(Carter et al.(1985)“Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors”Nucl.Acids Res.134431-4443，和Carter(1987)“Improved oligonucleotide-directedmutagenesis using M13 veotors”Methods in Enzymol.154382-403)，缺失誘變(Eghtedarzadeh(1986)“Use of oligonucleotides to generate large deletions”Nucl.Asids Res.145115)，選擇限制和選擇限制和純化限制(Wells et al.(1986)“Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin”Phil.Trans.K Soc.Lond.A 317415-423)，通過全基因合成進行誘變(Nambiar et al.(1984)“Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein”Science 2231299-1301；Sakamar and Khorana(1988)“Total synthesis andexpression of a gene for the α-subunit of bovine rod outer segment guaninenucleotide-binding protein(transducin)”Nucl.Asids Res.146361-6372，Wells et al.(1985)“Cassette mutagenesisan efficient method for generation of multiplemutations at defined sites”Gene 34315-323，和Gnmdstrom et al.(1985)“Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale‘shot-gun’gene synthesis”Nucl.Asids Res.133305-3316)，雙鏈斷裂修復(Mandecki(1986)，Amold(1993)“Protein engineering for unusual environments”Current Opinion in Biotechnology.4450455.“Oligonucleotides directed double-strand break repair in plasmids ofEscherichia colia method for site-specific mutagenesis”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，837177-7181)。以上許多方法的另外細節可以在Methods in Enzymology Volume154中找到，此書也描述了針對不同誘變方法的故障檢測問題的有用控制。
            
也參見Stemmer的美國專利5,605,793(Feb.25，1997)，“Methods for In VitroRecombination；”Stemmer等人的美國專利5,811,238(Sep.22，1998)“Methods forGenerating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection andRecombination；”Stemmer等人的美國專利5,830,721(Nov.3，1998)，“DNAMutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly；”Stemmer等人的美國專利5,834,252(Nov.10，1998)“End-Complementary Polymerase Reaction；”Minshull等人的美國專利5,837,458(Nov.17，1998)，“Methods and Compositions for Cellularand Metabolic Engineering；”WO 95/22625，Stemmer和Cramen，“Mutagenesis byRandom Fragmentation and Reassembly；”Stemmer和Lipschutz的WO 96/33207“End Complementary Polymerase Chain Reaction；”Stemmer和Crameri的WO97/20078“Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics byIterative Selection and Recombination；”Mmshull和Stemmor的WO 97/35966，“Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering；”Punnonen等人的WO 99/41402“Targeting of Genetic Vaccine Vectors；”Punnonen等人的WO 99/41383“Antigen Library Immunization；”Punnonen等人的WO 99/41369“GeneticVaccine Vector Engineering；”Punnonen等人的WO 99/41368“Optimization ofImmunomodulatorv Properties of Genetic Vaccines；”Stemmer和Crameri的EP 752008“DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly；”Stemmer的EP0932670“Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination；”Stemmer等人的WO 99/23107，“Modification of Virus Tropism and Host Range byViral Genome Shuffling；”Apt等人的WO 99/21979，“Human Papillomavirus Vectors；”del Cardayre等人的WO 98/31837“Evolution of Whole Cells and Organisms byRecursive Sequence Recombination；”Patten和Stemmer的WO 98/27230“Methodsand Compositions for Polypeptide Engineering，”Stemmer等人的WO 98/27230，“Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling andSelection，”WO 00/00632，“Methods for Generating Highly Diverse Libraries，”WO00/09679，“Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide SequenceBanks and Resulting Sequences，”Arnold等人的WO 98/42832，“Recombination ofpolynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers，”Arnold等人的WO99/29902，“Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences，”Vind的WO 98/41653，“An in Vitro Method for Construction of a DNA Library，”Borchert等人的WO 98/41622，“Method for constructing a Library Using DNA Shuffling，”和Pati和Zarling的WO 98/42727，“Sequence Alterations using HomologousRecombination.”某些美國申請提供了關于多種不同產生方法的另外細節，包括Patten等人的“SHUFFLING OF CODON ALTEAED GENES”，歸檔于1999年9月28日，(U.S.Ser.No.09/407,800)，del Cardayre等人的“EVOLUTION OF WHOLE CELLS ANDORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION”，歸檔于1998年7月15日(U.S.Ser.No.09/166,188)和1999年7月15日(U.S.Ser.No 09/354,922)；Crameri等人的“OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACIDRECOMBINATION”，歸檔于1999年9月28日(U.S.Ser.No.09/408,392)和Crameri等人的“OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION”，歸檔于2000年1月18日(PCT/US00/01203)；Welch等人的“USE OFCODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETICSHUFFLING”，歸檔于1999年9月28日(U.S.Ser.No.09/408,393)；Selifonov等人的“METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS，POLYNUCLEOTIDS& POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS”，歸檔于2000年1月18日(PCT/US00/01202)和，例如，Selifonov等人的“METHODS FOR MAKINGCHARACTER STRINGS，POLYNUCLEOTIDS & POLYPEPTIDES HAVINGDESIRED CHARACTERISTICS”，歸檔于2000年7月18日(U.S.Ser.No.09/618,579)，Selifonov和Stemmer的“METHODS OF POPULATING DATASTRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS”，歸檔于2000年1月18日(PCT/US00/01138)；Affholter的“SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACIDTEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENTISOLATION”，歸檔于2000年9月6日(U.S.Ser.NO.09/656,549)。
            
非隨機的，或者“定向進化”的方法包括，例如，飽和誘變(GSSM)，合成的連接重組裝(SLR)，或者這些方法的組合用于修飾發明的核酸，產生具有新的或者性質改變(例如，在高的酸性或堿性，高溫，等等條件下具有活性)的磷脂酶。修飾的核酸編碼的多肽可以在檢測磷脂酶前篩查其活性或者別的活性。可以使用任何檢測的形式或者方案。例如，使用毛細管陣列平臺，見，例如，美國專利6,280,926；5,939,250。
            
飽和誘變，或者GSSM發明的一個方面，非隨機的基因修飾，“定向進化過程”用于產生具有新的或者改變的特性的磷脂酶。本方法的各種變化已經被稱為“基因位點-飽和誘變”，“位點飽和誘變”，“飽和誘變”或者簡單地為“GSSM”。飽和誘變可以與別的誘變過程相結合。見，例如，美國專利6,171,820；6,238,884。一方面，GSSM包括提供模板多核苷酸和多數的寡核苷酸，其中每種寡核苷酸包括一個與模板多核苷酸同源的序列，因此靶向模板多核苷酸的特異序列，每種寡核苷酸包括一個同源基因的變異體的序列；通過使用寡核苷酸復制模板多核苷酸產生包括非隨機序列變異體的子代多核苷酸，因此產生包括同源基因序列變異體的多核苷酸。
            
一方面，為了產生一套子代多肽，其中在每個氨基酸位置都是全范圍的單氨基酸取代，例如酶活性位點或者配基結合位點中的氨基酸殘基被靶向修飾，將含有簡并N，N，G/T序列的密碼子引物用于往多核苷酸中引入點突變。這些寡核苷酸可以包括連續的第一同源序列，簡并N，N，G/T序列，和任選地，第二同源序列。從使用這些寡核苷酸得到的下游的子代翻譯產物包括沿著多肽的每個氨基酸位點的所有可能的氨基酸變異，因為N，N，G/T序列的簡并性包括所有20種氨基酸的密碼子。一方面，一個這樣的簡并寡核苷酸(包括，例如，一個簡并N，N，G/T盒)用于使母本多核苷酸模板中的每個最初密碼子形成全范圍的密碼子取代。另一方面，為了使母本多核苷酸模板中的至少兩個最初密碼子形成全范圍的密碼子取代，使用至少兩個簡并盒—或者在相同的寡核苷酸中，或者在不相同的寡核苷酸中。例如，一個寡核苷酸中可以含有多于一個N，N，G/T序列，可以在多于一個位點引入氨基酸突變。此N，N，G/T序列的大多數可以直接相鄰，或者被一個或多于一個的另外核苷酸序列分隔開。另一方面，適用于引入添加或者缺失的寡核苷酸可以單獨使用或者與含有N，N，G/T序列的密碼子合并使用，引入氨基酸添加，缺失，和/或取代的任何組合或者排列組合。
            
一方面，使用含有相鄰的N，N，G/T三聯體，即簡并的(N，N，G/T)n序列的寡核苷酸，可以同時誘變兩個或者更多相鄰的氨基酸位點。另一方面，使用具有比N，N，G/T序列簡并性小的簡并盒。例如，理想的是在一些例子中(例如，在寡核苷酸中)使用包括僅僅一個N的簡并的三聯體序列，其中所述N可以在三聯體的第一，第二或者第三位置上。包含任何別的堿基的任何組合和排列組合可以在三聯體的剩下兩個位置上使用。可選擇地，理想的是在一些例子中(例如，在寡核苷酸中)使用簡并的N，N，N三聯體序列。
            
一方面，簡并的三聯體(例如，N，N，G/T三聯體)的使用可以使得系統的和容易的在多肽中的每個氨基酸位置上產生全范圍的可能的天然氨基酸(全部20種氨基酸)(在可選擇的方面，該方法也包括在每個氨基酸殘基，或者密碼子，位置上產生少于所有可能的取代)。例如，對于100個氨基酸的多肽，可以產生2000個不同的種類(即，每個位置20種可能的氨基酸×100個氨基酸位置)。通過使用含有簡并的N，N，G/T三聯體的寡核苷酸或一套寡核苷酸，32個單獨的序列可以編碼所有20種可能的天然氨基酸。因此，在其中，母本多核苷酸序列被使用至少一個這樣的寡核苷酸飽和誘變的反應容器中，可以產生編碼20種不同多肽的32種不同的子代多核苷酸。相反，在定點誘變中使用非簡并的寡核苷酸可以導致每個反應容器中僅僅有一種多肽產物。非簡并寡核苷酸可以任選地與公開的簡并引物組合使用；例如，非簡并寡核苷酸可以用于在一個處理中的多核苷酸中產生特異的點突變。這就提供了一種產生特異的沉默點突變，可以導致相應的氨基酸改變的點突變，和導致終止密碼子產生和相應的多肽片段表達的點突變的方法。
            
一方面，每個飽和誘變反應容器中都含有編碼至少20種子代多肽(例如，磷脂酶)分子的多核苷酸，這樣所有20種天然氨基酸相應地在母本多肽的經誘變密碼子位置上的特異氨基酸位置上呈現出來(別的方面使用少于所有20種天然氨基酸的組合)。每個飽和誘變反應容器所產生的32重簡并子代多肽可以進行克隆擴增(例如，使用，例如表達載體克隆到合適的宿主，例如大腸桿菌(E.coli)宿主中)和表達篩選。當單獨的子代多肽通過篩選鑒定具有有利的特性改變時(當與母本多肽比較，例如在堿性或酸性條件下具有增加的磷脂酶活性時)，可以相應測序鑒定其中含有的有利的氨基酸取代。
            
一方面，如在此公開的，使用飽和誘變誘變母本多肽中的每個氨基酸位置，有利的氨基酸改變可以在多于一個氨基酸位置上得到鑒定。可以產生含有全部或部分這些有利的氨基酸取代的組合的一個或多個新的子代分子。例如，假如一個多肽中的每3個氨基酸位置中都可以鑒定到2個特異的有利氨基酸改變，在每個位置，排列包括3個可能(最初的氨基酸沒有改變，和兩個有利改變中的每一個)，并且有三個位置。因此，總的可能性就有3×3×3或者27種，包括以前檢測到的7種可能性-6種是點突變(即，三個位置中的每一個都有兩種可能性)和在任何位置都沒有改變。
            
另一方面，為了改變序列，定點飽和誘變可以與任何隨機的或非隨機方法一起使用，例如，合成的連接重組裝(見下文)，重排，嵌合化，重組和別的誘變過程和誘變劑。本發明提供以重復方式使用任何誘變過程，包括飽和誘變。
            
合成的連接重組裝(SLR)發明提供叫做“合成的連接重組裝”，或者簡單地為“SLR”，的非隨機基因修飾系統產生具有新的或者改變的特性的磷脂酶，這是一種“定向的進化過程”。SLR是非隨機的把寡核苷酸片段連接在一起的方法。此方法與隨機的寡核苷酸重排不同，因為核酸構件不是改組的，串聯的或者隨機地嵌合的，而是非隨機的組裝，見，例如，美國專利申請系列號(USSN)09/332,835，題目是”Synthetic LigationReassembty in Directed Evolution”，于1999年6月14日歸檔(“USSN 09/332,835”)。一方面，SLR包括以下步驟(a)提供模板多核苷酸，其中模板多核苷酸包括編碼同源基因的序列；(b)提供多個構件多核苷酸，其中設計的構件多核苷酸用于與模板多核苷酸以一個預定序列進行交叉重組裝，并且構件多核苷酸包括一個是同源基因的變異體的序列，和一個與模板多核苷酸兩側的變異序列同源的序列；(c)構件多核苷酸與模板多核苷酸合并，這樣構件多核苷酸與模板多核苷酸交叉重組裝，產生包括同源基因序列變異體的多核苷酸。
            
SLR并不依賴于將要重排的多核苷酸之間的高水平同源性的存在。因此，此方法可以用于非隨機產生包括多于10100種不同的嵌合體的子代分子庫(或套)。SLR可以用于產生包括多于101000種不同子代嵌合體的庫。因此，本發明的方面包括產生一套最終嵌合核酸分子的非隨機方法，其掠過設計所選擇的全面組裝順序。此方法包括步驟設計產生眾多具有可用的相互兼容連接末端的特異核酸構件，把這些核酸構件組裝，這樣得到設計的全面組裝順序。
            
假如構件可以以預確定的順序偶聯起來，那么核酸構件的相互兼容連接末端進行組裝被認為對于這種類型的順序組裝是“可用的”。因此，核酸構件偶聯的全面組裝順序是由連接末端的設計決定的。假如使用步驟多于一步的話，那么核酸構件偶聯的全面組裝順序也由組裝步驟的相繼順序所確定。一方面，退火的構件部分用酶處理，例如連接酶(例如，T4 DNA連接酶)，得到構件部分的共價連接。
            
一方面，寡核苷酸構件是通過分析的序列模板進行設計的，序列模板作為產生最終嵌合多核苷酸核酸子代的基礎。這些母本寡核苷酸模板作為設計待誘變的例如，嵌合的或改組的核酸構件的序列信息來源。
            
本方法的一方面，為了選擇一個或多個分界點，把大多數母本核酸模板的序列進行比對。分界點可以位于同源區域，并且包括一個或多個核苷酸。這些分界點優選的由至少兩個祖代模板所共同所有。因此，為了母本多核苷酸重排，分界點可以用于描繪產生的寡核苷酸構件的界限。在祖代分子中確定和選擇的分界點作為最終嵌合子代分子組裝的潛在的的嵌合點。分界點可以是由至少兩個母本多核苷酸序列具有的同源區域(包括至少一個同源核苷酸堿基)。做為選擇，分界點可以是由至少一半的母本多核苷酸序列具有的同源區域，或者分界點可以是由至少三份之二的母本多核苷酸序列具有的同源區域。甚至更優選的適用的分界點是由至少四分之三的母本多核苷酸序列具有的同源區域，或者分界點可以是由幾乎全部母本多核苷酸序列具有的同源區域。一方面，分界點是由全部母本多核苷酸序列具有的同源區域。
            
一方面，為了產生子代嵌合多核苷酸的完備文庫，連接重組裝過程要深入的進行。換句話說，所有可能的核苷酸構件的順序組合都在最終的嵌合核酸分子組中表現出來。同時，在另一個具體例子中，每個組合中的組裝順序(即，每個最終嵌合核酸的5’到3’序列中每個構件的組裝順序)都如以上描述的(或者非隨機的)設計。因為本發明的非隨機特性，所有不需要的副產物的可能性大大降低。
            
另一方面，連接重組裝方法是系統地進行的。例如，為了產生子代分子的系統性劃分的文庫，劃分的區域可以系統地，例如逐個地篩選出來，可以實施此方法。換句話說，通過選擇性的和明智的使用特異核酸構件，同時選擇性的和明智的使用后繼步驟的組裝反應，本發明提供可以在幾個反應容器的每一個中都得到子代產物的特異組的設計。這就使得可以進行系統的檢測和篩選程序。因此，這些方法可以使在更小的組中對一個待檢測的潛在的非常大數目的子代分子進行系統檢測。因為可以以高度靈活，卻是完備和系統的方式，特別是當祖先分子中具有低水平的同源性時進行嵌合，所以這些方法提供了包括大數目的子代分子的文庫(或者組)的產生。因為本連接重組裝發明的非隨機特性，所以產生的子代分子，優選包括具有由設計所選擇的全面組裝順序的最終嵌合核酸分子文庫。飽和誘變和完善的定點進化方法也可以用于產生不同的子代分子種類。關于分界點的選擇，核酸構件的大小和數目，偶聯的大小和設計，本發明提供了選擇和控制的自由，這一點是應該予以理解的。而且，應該理解的是，對于本發明的可操作性來說，分子內同源性的要求并不高。實際上，分界點甚至可以選擇在很少或沒有分子內同源性的區域。例如，因為密碼子的擺動，即，密碼子的簡并性，核苷酸取代可以引入核酸構件中而不會改變在相應的祖代模板中編碼的氨基酸。作為選擇，可以改變密碼子，這樣最初的氨基酸被改變。為了增加分子內同源分界點的發生率，從而增加構件中可以得到的偶聯的數目，本發明提供這樣的可以引入核酸構件中的取代，這反過來會產生更大數目的子代嵌合分子。
            
另一方面，構件產生的步驟的合成特性允許核苷酸(例如，一個或者多個核苷酸，可以是，例如密碼子或內含子或者調控序列)的設計和引入，其以后可以被任選在體外過程(例如，通過誘變)或者體內過程(例如，通過利用宿主微生物的基因剪切能力)中除去。在許多情況中，應該理解的是，除了產生適用的分界點的潛在好處之外，由于許多別的原因，這些核苷酸的引入也是理想的。
            
一方面，核酸構件用于引入內含子。因此，根據在此描述的方法，功能性的內含子被引入進生產的人造基因中。人工引入的內含子在宿主細胞中可以功能性的用于基因剪切中，以天然產生的內含子作用功能性的方式進行基因剪切。
            
優化的定向進化系統發明提供非隨機的基因修飾系統，叫做“優化的定向進化系統”，產生具有新的或者改變的特性的磷脂酶。優化的定向進化針對的是使用重復輪次的還原性重配、重組和選擇這個重復循環，從而通過重組進行核酸的定向分子進化。優化的定向進化可以產生大量的進化的嵌合序列，其中產生的群體大大富含具有預確定數目的交換事件的序列。
            
交換事件是嵌合序列中的一個點，其中序列中的交換發生于從一個母本變異體到另一個母本變異體。這樣的點一般在兩個母本連接在一起形成一個單一序列的寡核苷酸的接頭處都具有。此方法可以計算寡核苷酸序列的正確濃度，這樣最終序列的嵌合總體由于選擇數目的交換事件而得到富集。這提供了針對選擇具有預確定數目的交換事件的嵌合變異體的更大控制。
            
另外，與別的系統相比，此方法提供了開發巨大數目的可能蛋白變異體空間的合宜方法。以前，假如嵌合分子產生，例如，在反應過程中產生了1013個嵌合分子，檢測這樣高數目的特異活性的嵌合變異體是十分困難的。而且，子代群體中的一大部分將具有非常高數目的交換事件，這導致蛋白質具有增加水平的特異活性的可能性降低。通過使用這些方法，嵌合分子群體可以富集具有特定數目交換事件的變異體。因此，雖然在反應過程中可以產生1013嵌合分子，但是選擇用于進一步分析的每個分子最可能，例如，僅僅有三個交換事件。因為得到的子代群體可以傾向于具有預定數目的交換事件，所以嵌合分子之間的函數變量的范圍減小。當計算從最初母本多核苷酸得到的可能影響特定性狀的寡核苷酸時，這提供了更易控制的變量數目。
            
產生嵌合子代多核苷酸的一個方法是產生每個母本序列的片段或部分的對應寡核苷酸。每個寡核苷酸優選的包括獨特的重疊區域，這樣當寡核苷酸混合在一起，得到每個寡核苷酸片段以正確順序組裝的新的變異體。在USSN 09/332,835中可以發現另外的信息。每個母本變異體產生的寡核苷酸的數目與最終產生的嵌合分子中得到的交換總數目之間具有相關性。例如，為了發現具有，例如在高溫下具有更大活性的嵌合變異體，三個母本核苷酸序列變異體可能經過連接反應。作為一個例子，對應于每個母本變異體的每部分產生一組50個寡核苷酸序列。相應地，在連接重組裝過程中，在每個嵌合序列中可以有高達50個交換事件。每個產生的嵌合多核苷酸以改變的順序含有從每個母本變異體得到的寡核苷酸的概率是很低的。假如每個寡核苷酸片段在連接反應中以相同摩爾數存在，那么可能在相同母本多核苷酸得到的多個位點寡核苷酸中將彼此緊靠的相鄰，從而不會導致交換事件。假如在本例子中，從每個母本得到的每個寡核苷酸的濃度在連接步驟中保持恒定，那么有1/3的機會(假設為3個母本)從相同母本變異體得到的寡核苷酸將在嵌合序列中連接，而且并不產生交換。
            
相應地，在給定母本變異體的組數目，對應于每個變異體的寡核苷酸的數目，和連接反應的每一步驟中每個變異體的濃度的情況下，確定概率濃度函數(PDF)，可以用于預測連接反應的每一步驟中可能發生的交換事件的群體。以下描述確定PDF的統計學和數學。通過利用這些方法，人們可以計算這樣的概率濃度函數，從而富集在特定連接反應中得到的預確定交換事件數目的嵌合子代群體。而且，交換事件的靶數目可以預確定，然后對系統進行編程，計算連接反應的每一步驟中每個母本寡核苷酸的起始數量，得到關于預確定數目的交換事件的概率濃度函數。這些方法針對的是使用還原性重配，重組和選擇這個重復循環，使得可以通過重組進行編碼多肽的核酸的定向分子進化。此系統可以產生大數量的進化的嵌合序列，其中產生的群體大大富集了具有預確定數目的交換事件的序列。交換事件是嵌合序列中的點，其中序列的變換發生于從一個母本變異體到另一個母本樣板田。這樣的點一般在兩個母本連接形成一個單一序列的寡核苷酸連接處。該方法可以計算寡核苷酸序列的正確濃度，這樣附件所選定數目的交換事件的序列的最終嵌合群體。這提供了對選擇具有預確定數目的交換事件的嵌合變異體的更多控制。
            
另外，與別的系統相比，此方法提供了開發巨大數目的可能蛋白變異體空間的合宜方法。通過使用在此描述的方法，嵌合分子群體可以富集那些具有特定數目的交換事件的變異體。因此，雖然人們仍然可以在反應過程中產生1013嵌合分子，選擇的進行進一步分析的每個分子最可以具有，例如，只有三個交換事件。因為得到的子代群體傾向于具有預確定交換事件，所有嵌合分子之間的函數變量的范圍減小。當計算從最初母本多核苷酸得到的可能影響特定性狀的寡核苷酸時，這提供了更易控制的變量數目。
            
一方面，方法通過產生對應于每個母本片段或部分的寡核苷酸，產生了嵌合子代核苷酸序列。每個寡核苷酸優選的包括獨特的重疊區域，這樣當寡核苷酸混合在一起，得到每個寡核苷酸片段以正確順序組裝的新的變異體。也見USSN09/332,835。
            
每個母本變異體產生的寡核苷酸的數目與最終產生的嵌合分子中得到的交換總數目之間具有相關性。例如，為了發現具有，例如在高溫下具有更大活性的嵌合變異體，三個母本核苷酸序列變異體可能經過連接反應。一個例子，對應于每個母本變異體的每部分產生一組50個寡核苷酸序列。相應的，在連接重組裝過程中，在每個嵌合序列中可以有高達50個交換事件。每個產生的嵌合多核苷酸以改變的順序含有從每個母本變異體得到的寡核苷酸的概率是很低的。假如每個寡核苷酸片段在連接反應中以相同摩爾數存在，那么可能在相同母本多核苷酸得到的多個位點寡核苷酸中將彼此緊靠的相鄰，從而不會導致交換事件。假如在本例子中，從每個母本得到的每個寡核苷酸的濃度在連接步驟中保持恒定，那么有1/3的機會(假設為3個母本)從相同母本變異體得到的寡核苷酸將在嵌合序列中連接，而且并不產生交換。
            
相應地，確定概率濃度函數(PDF)，預測連接反應的每一步驟中可能發生的交換事件群體，是在給定母本變異體的組數、對應于每個變異體的寡核苷酸數目、和連接反應的每一步驟中每個變異體的濃度的條件下。以下描述確定PDF的統計學和數學。通過利用這些方法，人們可以計算這樣的概率濃度函數，從而富集在特定連接反應中得到的預確定交換事件數目的嵌合子代群體。而且，交換事件的靶數目可以預確定，然后對系統進行編程，計算連接反應的每一步驟中每個母本寡核苷酸的起始數量，得到關于預確定數目的交換事件的概率濃度函數。
            
確定交換事件發明的具體例子包括系統和軟件，可以接受所需交換概率濃度函數(PDF)，要重組裝的母本基因的數目和重組裝中片段的數目，作為輸入。此程序的輸出是“片段PDF”，可以用于確定產生重裝配基因的配方和那些基因的預計交換PDF。優選地，在此描述的處理用MATLAB_(Mathworks，Natick，masschusetts)，一種程序語言和技術計算發展環境進行。
            
重復過程在本發明的實踐過程中，這些過程可以反復重復。例如，對改變的磷脂酶表型的核酸(或者，核酸)進行鑒定，再分離，再修飾，活性再檢測。此過程可以反復重復，直到得到所需的表型。例如，整個生物化學的合成代謝或者分解代謝途徑可以工程進細胞中，包括磷脂酶活性。
            
相似地，假如確定特定的寡核苷酸對于所需性狀沒有影響(例如，新的磷脂酶表型)，那么可以通過合成包括待除去序列的更大母本寡核苷酸，把它作為變量除去。因為序列與更大序列合并阻止了交換事件，所以在子代多核苷酸中此序列沒有任何變化。此確定哪種寡核苷酸與所需性狀最為相關，哪種寡核苷酸與所需性狀無關的反復過程，可以允許對所有可能蛋白質變異體的有效開發，這些變異體可能個年個特定性狀或活性。
            
體內改組在提供發明的多肽變異體，例如，抗體，磷脂酶，和類似物的本發明方法中使用分子的體內改組。體內改組可以利用正常性狀的細胞，得到重組的多聚體。雖然體內重組提供了獲得分子多樣性的主要天然途徑，但是遺傳重組仍然是相對復雜的過程，涉及1)同源性的識別；2)導致產生重組交叉的鏈切割，鏈侵入，和代謝步驟，和最后3)交叉轉變成為分離的重組分子。交叉的形成要求同源序列的識別。
            
一方面，發明提供由至少第一個多核苷酸和第二個多核苷酸產生雜交多核苷酸的方法。發明可以用于通過引入具有至少部分序列同源性的一個區域的至少第一多核苷酸和第二多核苷酸于合適的宿主細胞中而產生雜交多核苷酸。部分序列同源性區域促進導致產生雜交多核苷酸的序列識別的過程。正如在此使用的，術語“雜交多核苷酸”是任何由本發明的方法產生的核苷酸序列，含有從至少兩個最初多核苷酸序列得到的序列。這樣的雜交多核苷酸可以由促進DNA分子間的序列整合的分子間重組事件產生。另外，這樣的雜交多核苷酸可以由利用重復序列，改變DNA分子中的核苷酸序列的分子內還原性重配過程產生。
            
產生序列變異體發明也提供使用發明的核酸和多肽產生發明的核酸和磷脂酶序列變異體，或者分離的磷脂酶，例如，磷脂酶的序列變異體的方法。一方面，發明提供發明的磷脂酶基因的變異體，變異體可以使用任何方法改變，包括，例如隨機方法，或者非隨機方法或者“定向進化”方法，如以上描述。
            
分離的變異體可以是天然發生的。變異體也可以體外產生。變異體可以使用基因工程技術，例如定點誘變，隨機化學誘變，核酸外切酶III缺失程序和標準克隆技術產生。做為選擇，這樣的變異體，片段，類似物或衍生物可以使用化學合成或者修飾程序產生。產生變異體的別的方法也被那些技術熟練人員所熟悉。這些方法包括修飾天然分離得到的核酸序列，產生編碼具有特性的多肽的核酸的程序，多肽的特性增加它們在工業或實驗室應用中的價值。在這些程序中，產生并且定性許多與天然分離得到的序列相比具有一個或多個核苷酸差異的變異體序列。這些核苷酸差異可以產生與天然分離物得到的核酸編碼的多肽相比的氨基酸變化。
            
例如，變異體可以使用錯誤傾向PCR產生。在錯誤傾向PCR中，PCR在DNA聚合酶復制忠實度度低的情況下進行，這樣在PCR產物的全長中獲得高比率的點突變。錯誤傾向PCR在，例如Leung，D.W.，等，技術，111-15，1989)和Caldwell，R.C.& Joyce G.F.，PCR方法應用，228-33，1992中有描述。簡要而言，在這些程序中，為了在全長的PCR產物中得到高比率的變突變，待誘變的核酸與PCR引物，反應緩沖液，MgCl2，MnCl2，Taq聚合酶和合適濃度的dNTP混合。例如，反應使用20毫微微摩爾(fmoles)待誘變的核酸，每種PCR引物30皮摩爾，反應緩沖液包括50mM KCl，10mM Tris HCl(PH8.3)和0.01％明膠，7mM MgCl2，0.5mMMnCl2，5單位的Taq聚合酶，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP和1mM dTTP。PCR進行30個循環，每個循環為94℃1分鐘，45℃1分鐘，72℃1分鐘。然而，這些參數可以適當的改變。誘變發核酸克隆進入合適的載體中，評估誘變的核酸編碼的多肽的活性。
            
變異體也可以使用寡核苷酸定向誘變產生，在感興趣的任何和克隆DNA中得到位點專一的變異。寡核苷酸誘變在，例如，Reidhaar-Olson(1988)Science24153-57中有描述。簡要地，在這些程序中，合成待引入的克隆DNA中多數具有一個或多個突變的雙鏈寡核苷酸，并且插入待誘變的克隆DNA中。回收含有經誘變的DNA的克隆，評定經誘變的DNA編碼的多肽的活性。
            
產生變異體的另一個方法是組裝PCR。組裝PCR涉及從小DNA片段中得到的PCR產物的組裝。在相同管中平行發生了許多不同的PCR反應，一個反應的產物是另一個反應產物的引物。組裝PCR在，例如美國專利5,965,408中描述。
            
另一種產生變異體的方法是有性PCR誘變。在有性PCR誘變中，在體外，強迫同源重組在不同的，但是高度相關的DNA序列之間發生，是基于序列同源性的DNA分子隨機斷裂的結果，然后通過PCR反應中引物延伸從而固定交換。有性PCR誘變在，例如，Stenlnier(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110747-10751中描述。簡要地，在此程序中，待重組的多數核酸都用DNA酶消化，產生平均大小為50-200個核苷酸的片段。純化所需平均大小的片段，再懸浮于PCR混合物中。在促進核酸片段之間重組的條件下進行PCR。例如，通過把純化的片段以10-30ng/μl的濃度再懸浮于每種dNTP 0.2mM，2.2mM MgCl2，50mM KCl，10mMTris HCl，PH 9.0和0.1％Triton X-100的溶液中進行PCR。以反應混合物的100∶1加入2.5單位Taq聚合酶，使用以下方案進行PCR94℃60秒，94℃30秒，50-55℃30秒，72℃30秒(30-45次)，72℃5分鐘。然而，這些參數可以適當的改變。一些方面，寡核苷酸可以包括在PCR反應中。另一方面，DNA聚合酶Klenow片段可以在第一組PCR反應中使用，Taq聚合酶可以在隨后組的PCR反應中使用。分離重組序列，評估重組序列編碼的多肽的活性。
            
變異體也可以通過體內誘變產生。在一些具體例子中，序列中感興趣的隨機突變通過在細菌株，例如一個或多個DNA修復途徑中具有突變的大腸桿菌中增殖感興趣序列而產生。這樣的“突變”菌株具有比野生型母本高的隨機突變率。DNA在這些菌株中的一種中增殖將最終產生DNA中的隨機突變。適合于體內誘變的突變菌株在，例如PCT
            
發明者S·格拉馬蒂科瓦, G·黑爾伍德, D·拉姆, N·巴頓 申請人:戴弗薩公司
            


                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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