專利名稱：角黃素的制備方法
技術領域：
本發明涉及用微生物制備角黃素或含有角黃素的類胡蘿卜素混合物的方法，該角黃素可用作飼料添加劑、食品添加劑等的天然紅色素。
背景技術：
作為一種改善蛋黃、肉類和家禽例如雞的皮膚色澤的方法，在動物飼料中添加角黃素已在全球廣泛使用。角黃素也用于動物飼料工業，以改善肉類的色澤或海產品如鮭魚、鱒魚、紅海魚或蝦的皮膚色澤，并且在食品工業中也可用作食品或飲料的著色劑。
已知某些種類的蘑菇(Botanical Gazette，112，228-232，1950)、魚類和甲殼綱動物中含有角黃素。已知的產角黃素微生物的實例為那些屬于短桿菌屬(Brevibacterium)的微生物(Applied and EnvironmentalMicrobiology，55(10)，2505，1989)，屬于紅球菌屬(Rhodococcus)的微生物(日本專利(未審查的申請)公告第2-138996號)，屬于棒桿菌屬(Corynebacterium)的微生物(日本專利(未審查的申請)公告第6-343482號)和屬于一新種屬的E-396菌株(日本專利(未審查的申請)公告第2001-95500號)。作為化學合成方法，已知的有β-胡蘿卜素的氧化(J.Amer.Chem.Soc.，78，1427，1956)和由3-氧代-C15鏻鹽合成(Pure Appl.Chem.，51，875，1979)。
發明內容
然而，前面提及的化學合成角黃素的方法要使用有機溶劑。因此，這個方法在安全性及現在優選天然產物的年代是有疑問的。常規的微生物培養也存在產率低和從天然產物中提取成本較高的問題。
關于E-396菌株，已知它是產類胡蘿卜素化合物微生物，其安全性已經確定，制備高濃度的含蝦青素的類胡蘿卜素化合物的方法已有報導。然而，角黃素占產生的總類胡蘿卜素的比率較低。
作為角黃素的替代物，從紅辣椒植物中提取出的辣椒紅可用于改善雞蛋黃的色澤。由于辣椒紅對熱、光等條件非常不穩定，以及紅辣椒的生長明顯地受到天氣的影響，所以它很難提供穩定工業水平的辣椒紅。
因此，需要十分安全并以低價格穩定地提供角黃素的制備方法。
針對前述問題的解決方案的廣泛而深入的研究，本發明人發現通過使產蝦青素微生物發生突變，可以容易地獲得其中角黃素比例相對于類胡蘿卜素總產量高的微生物，因而完成了本發明。
準確地講，本發明提供了下列方法。
(1)制備角黃素的方法，所述方法包括下述步驟誘導產蝦青素微生物發生突變，其中對應于其16S核糖體RNA的DNA核苷酸序列與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列基本同源；通過篩選角黃素的產率(質量百分比)相對于類胡蘿卜素的產量比親本菌株高的突變株，獲得產角黃素的微生物；以及從產角黃素微生物的培養物中回收角黃素或含角黃素的類胡蘿卜素化合物。
(2)依照上述(1)的方法，其中產角黃素微生物的角黃素產率相對于類胡蘿卜素總產量的質量百分比至少為40％。
(3)依照上述(1)的方法，其中產角黃素微生物所產生的β-隱黃素、玉米黃素、3-羥基海膽酮、海星酮(asteroidenone)、阿東玉紅(adonirubin)、阿東黃素(adonixanthin)和蝦青素等，每一種的產率相對于類胡蘿卜素總產量的質量百分比小于20％。
(4)依照上述(1)-(3)中任一項的方法，其中所述產蝦青素微生物選自E-396菌株(已于1993年4月27日保藏于通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(現稱獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心；日本國茨城縣筑波市東1丁目1番1中央第6)，(the National Institute of Bioscience and Human Technology(theInternational Patent Organism Depository of the National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology；AIST Tsukuba Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan，保藏號FERM BP-4283)及其突變株，以及A-581-1菌株(已于1994年5月20日保藏于通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(現稱獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心；日本國茨城縣筑波市東1丁目1番1中央第6)，保藏號FERM BP-4671)及其突變株。
本發明以下作更詳細地描述。
依照本發明的方法，產蝦青素微生物用作突變的親本菌株。此類微生物的實例是產蝦青素微生物，其中對應于其16S核糖體RNA的DNA核苷酸序列與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列基本同源。鑒于例如DNA核苷酸測序的錯誤頻率，本文所用的術語“基本同源的”代表98％或更高的同源性。
其序列與以上序列基本同源的產蝦青素微生物的具體實例包括E-396菌株(FERM BP-4283)、A-581-1菌株(FERM BP-4671)、通過突變或改進E-396或A-581-1菌株獲得的多種突變株及其相關菌種。如SEQ ID NO1所示的DNA核苷酸序列對應于E-396菌株的核糖體RNA，而如SEQ ID NO2所示的DNA核苷酸序列對應于A-581-1菌株的核糖體RNA。E-396菌株和A-581-1菌株間的16S核糖體RNA核苷酸序列的同源性為99.4％，這表明它們為緊密相關的菌株。因此，這些菌株形成一組產類胡蘿卜素細菌。依照本發明方法，用于突變的親本菌株定義為產蝦青素微生物，即E-396菌株、A-581-1菌株、E-396菌株或A-581-1菌株的突變株及其相關菌種，其中對應于其16S核糖體RNA的DNA核苷酸序列與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的同源性為98％或更高。
本發明將E-396菌株作為產蝦青素微生物的范例進行描述。該菌株為本發明人最新分離并已于1993年4月27日保藏于通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(現稱獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心)，保藏號FERM BP-4283。另一微生物的更具體的實例是A-581-1菌株。該菌株為本發明人最新分離并已于1994年5月20日保藏于通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(現稱獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心)，保藏號FERM BP-4671。
在本發明中，對使產蝦青素微生物發生突變的方法并無具體限制，只要所述方法可以誘導突變即可。可利用的方法的實例包括利用突變劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或者甲磺酸乙酯(EMS)的化學方法、利用如紫外照射或X-射線照射的物理方法和利用基因重組或轉座子的生物學方法。這種突變可以進行一次。或者，突變可進行兩次或更多次，如通過該突變制備產蝦青素微生物的突變株，由該突變株進一步突變，直至獲得最終突變株。
在本發明中，角黃素的產率相對于類胡蘿卜素總量顯著高的突變株可通過使產蝦青素微生物發生突變，并分析突變株的培養液中的類胡蘿卜素化合物，從突變株中篩選獲得。
例如，該培養方法按下列方式進行。具體地講，培養在培養基中進行，該培養基含有產角黃素微生物生長和產生類胡蘿卜素化合物必需的組分。培養方法可以是用試管、燒瓶等進行振蕩培養或通過通氣攪拌培養。只要可分離并檢測出類胡蘿卜素化合物，從而可用任何方法對類胡蘿卜素化合物進行分析。例如，可利用高效液相層析、薄層層析或紙層析。
在本發明中，可以篩選角黃素的比率相對于類胡蘿卜素總量高的突變株，獲得產角黃素微生物。本文所用的術語“類胡蘿卜素總量”代表類胡蘿卜素化合物如蝦青素、角黃素、阿東黃素、β-胡蘿卜素、海膽酮、玉米黃素、β-隱黃素、3-羥基海膽酮、海星酮或阿東玉紅等的總量。
產蝦青素微生物如E-396菌株同時產生多種類胡蘿卜素化合物如蝦青素、角黃素、阿東黃素、β-胡蘿卜素、海膽酮、玉米黃素、β-隱黃素、3-羥基海膽酮、海星酮或阿東玉紅等。因此，角黃素相對于類胡蘿卜素總量的比率較低，它通常為2％到20％。
本發明中篩選到的突變株在產蝦青素微生物中誘導突變，且角黃素相對于類胡蘿卜素總量的產率特別高。作為最低的角黃素比率的篩選標準條件是該比率比其親本菌株進行產角黃素突變前的高。基于類胡蘿卜素總產量，可以篩選產生的類胡蘿卜素優選含有至少40％(質量)角黃素，更優選含有至少60％(質量)角黃素的突變株。
推斷蝦青素的生物合成如下。酮酶和羥化酶修飾β-胡蘿卜素兩端的6元環。如果該羥化酶完全缺失，則推斷僅可產生β-胡蘿卜素、海膽酮和角黃素，而β-隱黃素、玉米黃素、3-羥基海膽酮、海星酮、阿東玉紅、阿東黃素和蝦青素等，因需要羥化酶，所以不會產生。如果該羥化酶缺失不完全，則推斷相對于類胡蘿卜素總量的β-隱黃素、玉米黃素、3-羥基海膽酮、海星酮、阿東玉紅、阿東黃素和蝦青素等的比率降低了。因此，作為另一種從突變株中篩選產角黃素微生物的有效方法，可基于相對于類胡蘿卜素總量的β-隱黃素、玉米黃素、3-羥基海膽酮、海星酮、阿東玉紅、阿東黃素和蝦青素等比率較低的現象進行篩選。可基于每一化合物相對于總類胡蘿卜素的質量比率優選低于20％，更優選低于10％的現象進行篩選。
在本發明中，只要產生角黃素，培養產角黃素微生物并回收角黃素或含角黃素的類胡蘿卜素化合物的方法可以是任何方法。可利用的方法的實例如下。具體地講，培養基含有碳源、氮源、無機鹽且必要時含有產角黃素微生物生長所需的特殊營養需要(例如維生素、氨基酸或核酸)。碳源的實例包括糖類如葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和麥芽糖；有機酸如乙酸、富馬酸、檸檬酸、丙酸、蘋果酸和丙二酸；和醇類如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇和異丁醇。加入碳源的量因種類而變化，通常為每升培養基1-100克，優選為2-50克。氮源的實例包括硝酸鉀、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨、氨水和尿素。這些可以單獨使用或聯合兩個或兩個以上使用。加入氮源的量因種類而變化，通常為每升培養基0.1-20克，優選為1-10克。無機鹽的實例包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、氯化鎂、硫酸鐵、氯化鐵、硫酸錳、氯化錳、硫酸鋅、氯化鋅、硫酸銅、氯化鈣、碳酸鈣和碳酸鈉。這些可以單獨使用或聯合兩個或兩個以上使用。加入無機鹽的量因種類而變化，通常為每升培養基0.1毫克到10克。特殊的營養需要的實例包括維生素、核酸、酵母提取物、蛋白胨、肉膏、麥芽汁、玉米漿、干酵母、大豆餅、大豆油、橄欖油、玉米油和亞麻子油。這些可以單獨使用或聯合兩個或兩個以上使用。加入的特殊營養需要的量因種類而變化，通常為每升培養基0.01毫克到100克。培養基的pH調整到介于2和12之間，優選介于6和9之間。振蕩培養或通氣攪拌培養可在10℃到70℃，優選在20℃到35℃間進行，通常進行1-20天，優選為2-9天。
隨后，除去從如此獲得的培養液中的水分。為獲得含角黃素的物質而應除去培養液中水分的量根據條件如培養液中的色素成分而變化。通常，首先進行過濾，如果應進一步除去水分，則使沉淀物脫水。可通過通常使用的方法如過濾或離心法進行過濾。如果將沉淀進行脫水除去水分，則沉淀中的類胡蘿卜素化合物應該增加。脫水方法的實例包括通常的噴霧干燥、滾筒干燥和冷凍干燥。
如此獲得的含角黃素的微生物的培養物沉淀可用作所述的含色素的飼料添加劑。如果通過本發明的方法獲得的角黃素和類胡蘿卜素化合物用作飼料等的著色劑，可以添加抗氧化劑如丁基羥基甲苯、乙氧基喹或維生素E等保護角黃素和類胡蘿卜素化合物免于降解。此外，其表面可用明膠等包衣。
本說明書包括公開于日本專利申請第2002-112240號說明書中的部分或全部內容，這是本發明優先權的基礎。
實施本發明的優選方式在下文參考實施例，更詳細地描述本發明，但并不限于此。
讓E-396菌株(FERM BP-4283，角黃素的質量百分比產率7.4％)在28℃靜置30分鐘并用150mg/L的NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)進行突變。將具有如表1所示成份的培養基(6ml)置入試管(內徑18mm)中并于121℃蒸汽滅菌15分鐘，制備成試管培養基。將經過菌落分離的400個突變株中的每一個用接種環接種至試管培養基上，并且在28℃進行往復式振蕩培養(300轉/分鐘)達4天。隨后，將該培養物離心，并且用高效液相層析分析所得細胞的類胡蘿卜素化合物。結果，獲得一株其角黃素的產率相對于類胡蘿卜素總產量的質量百分比為60％或更高的菌株，該菌株中類胡蘿卜素化合物的分析結果示于表2中。
表1
表2
用NTG突變E-396菌株(FERM BP-4283)，篩選深紅色菌落，獲得增強的蝦青素生產力變異株Y-1071(角黃素的質量百分比產率6.5％)。該Y-1071進一步用NTG突變。將具有如表1所示成份的培養基(6ml)置入試管(內徑18mm)中并于121℃蒸汽滅菌15分鐘，制備成試管培養基。將經過菌落分離的1000個突變株中的每一個用接種環接種至試管培養基上，并且在28℃進行往復式振蕩培養(300轉/分鐘)達4天。隨后，將該培養物離心，并且用高效液相層析分析所得細胞的類胡蘿卜素化合物。結果，獲得兩株其中每一株的β-隱黃素、玉米黃素、3-羥基海膽酮、海星酮、阿東玉紅、阿東黃素和蝦青素的產率相對于其產生的類胡蘿卜素總量的質量百分比小于10％的菌株，這兩個菌株中類胡蘿卜素化合物的分析結果示于表3和表4中。
表3
表4
通過利用紫外燈的紫外光照射，可突變A-581-1菌株(FERM BP-4671，角黃素的質量百分比產率5.3％)。將具有如表1所示成份的培養基(6ml)置入試管(內徑18mm)中并于121℃蒸汽滅菌15分鐘，制備成試管培養基。將經過菌落分離的300個突變株中的每一個用接種環接種至試管培養基上，并且在28℃進行往復式振蕩培養(300轉/分鐘)達4天。隨后，將該培養物離心，并且用高效液相層析分析所得細胞的類胡蘿卜素化合物。結果，獲得一株其中角黃素的產率相對于類胡蘿卜素總量的質量百分比為60％或更高的菌株，該菌株中類胡蘿卜素化合物的分析結果示于表5中。
表5
本文引用的所有出版物、專利和專利申請都通過引用全部結合到本文中。
工業應用性本發明提供了一種制備角黃素的方法，該方法廉價、可穩定供給并十分安全。
序列表<110>新日本石油株式會社(Nippon Oil Corporation)<120>角黃素的制備方法<130>PH-1759<140>
<141>
<160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1452<212>DNA<213>未知<220>
<223>未知生物體的描述E-396<400>1agtttgatcc tggctcagaa cgaacgctgg cggcaggctt aacacatgca agtcgagcga 60gaccttcggg tctagcggcg gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtgccc ttctctacgg 120aatagccccg ggaaactggg agtaataccg tatacgccct ttgggggaaa gatttatcgg 180agaaggatcg gcccgcgttg gattaggtag ttggtggggt aatggcccac caagccgacg 240atccatagct ggtttgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300ctacgggagg cagcagtggg gaatcttaga caatgggggc aaccctgatc tagccatgcc 360gcgtgagtga tgaaggcctt agggttgtaa agctctttca gctgggaaga taatgacggt 420accagcagaa gaagccccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggggct 480agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgtaggc ggactggaaa gtcagaggtg 540aaatcccagg gctcaacctt ggaactgcct ttgaaactat cagtctggag ttcgagagag 600gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc 660gaaggcggct cactggctcg atactgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 720attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgc cagacgtcgg caagcatgct 780tgtcggtgtc acacctaacg gattaagcat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa 840aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900aacgcgcaga accttaccaa cccttgacat ggcaggaccg ctggagagat tcagctttct 960cgtaagagac ctgcacacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttc 1020ggttaagtcc ggcaacgagc gcaacccacg tccctagttg ccagcaattc agttgggaac 1080tctatggaaa ctgccgatga taagtcggag gaaggtgtgg atgacgtcaa gtcctcatgg 1140gccttacggg ttgggctaca cacgtgctac aatggtggtg acagtgggtt aatccccaaa 1200agccatctca gttcggattg tcctctgcaa ctcgagggca tgaagttgga atcgctagta 1260atcgcggaac agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1320accatgggag ttggttctac ccgacgacgn tgcgctaacc ttcggggggc aggcggccac 1380ggtaggatca gcgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtaggggaa cctgcggctg 1440
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1.一種制備角黃素的方法，所述方法包括下述步驟誘導產蝦青素微生物發生突變，其中對應于其16S核糖體RNA的DNA核苷酸序列與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列基本同源；通過篩選角黃素的質量百分比產率相對于類胡蘿卜素的產量比親本菌株高的突變株，獲得產角黃素的微生物；以及從產角黃素微生物的培養物中回收角黃素或含角黃素的類胡蘿卜素混合物。
2.權利要求1的方法，其中產角黃素微生物的角黃素產率相對于類胡蘿卜素總產量的質量百分比至少為40％。
3.權利要求1的方法，其中產角黃素微生物所產生的β-隱黃素、玉米黃素、3-羥基海膽酮、海星酮、阿東玉紅、阿東黃素和蝦青素等，每一種的產率相對于類胡蘿卜素總產量的質量百分比小于20％。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述產蝦青素微生物選自E-396菌株(FERM BP-4283)及其突變株和A-581-1菌株(FERM BP-4671)及其突變株。
全文摘要
本發明提供了一種制備角黃素的方法，其特征在于所述方法包括下述步驟誘導產蝦青素微生物對應于16S核糖體RNA的DNA堿基序列發生突變，所述DNA堿基序列與SEQ ID NO1所示的堿基序列基本同源；篩選如此產生的角黃素相對于類胡蘿卜素總產量的比率(質量百分比)比親本菌株高的突變株；培養所獲得的產角黃素菌株；以及從如此獲得的培養基中回收角黃素或含角黃素的類胡蘿卜素混合物。
文檔編號C12N15/09GK1659279SQ0381346
公開日2005年8月24日 申請日期2003年4月7日 優先權日2002年4月15日
發明者平澤和明, 坪倉章, 水田美能 申請人:新日本石油株式會社