專利名稱：：抗酸細菌的溶菌方法和用其進行基因擴增或檢測的方法
技術領域：
：本發明涉及一個抗酸細菌的溶菌方法和用其進行基因擴增或基因檢測的方法。
背景技術：
：結核病仍然是全球范圍內的一個嚴重的細菌性疾病，因此，不僅治療方法而且診斷方法都是非常的重要。通過進行一種培養方法完成對于結核病感染的最終診斷。但是，因為結核桿菌(tuberculebacilli)生長速率很低，因此希望可以建立在培養方法之前的初步診斷方法(preliminarydiagnosticmethod)。作為這樣的初步診斷方法，使用聚合酶鏈反應(PCR)的方法是引人注意的。在這個方法中，使用結核桿菌基因的特異引物擴增結核桿菌的基因，如果存在這樣的基因，則可以被檢測出來，因此能夠確定是否存在結核桿菌。在上述使用PCR方法的初步診斷方法中，對結核桿菌進行溶菌而提取基因是一個必需的預處理。常規的溶菌方法例如包括使用有機溶劑等的化學方法和使用超聲波或反復凍融的物理方法。但是，因為結核桿菌具有高的細胞壁脂質含量，這樣的常規溶菌方法不能充分地提取基因。為了充分地提取基因，需要使用特殊的設備和/或特殊的試劑及較劇烈的處理條件。而且，這可能需要較長的處理過程和更復雜的操作。有關溶菌的這些問題不是特異針對結核桿菌的，還涉及包括結核桿菌在內的全部抗酸細菌。
發明內容因此，依據前述，本發明的目的是提供一種不需使用任何特殊設備或特殊試劑的簡單且短時間的抗酸細菌的溶菌方法。為了完成以上目的，本發明的第一種溶菌方法是一種溶解抗酸細菌并從抗酸細菌中提取基因的方法，包括在含非離子表面活性劑的液體中在低于液體沸點的溫度下加熱抗酸細菌。而且，為了完成以上目的，本發明的第二種溶菌方法是一種溶解抗酸細菌并從抗酸細菌中提取基因的方法，包括通過使用脂肪酶處理抗酸細菌導致脂解作用，并在非離子表面活性劑存在時加熱抗酸細菌。依據本發明的第一種溶菌方法，僅僅通過在含有非離子表面活性劑的溶液中加熱抗酸細菌，例如，96℃，10分鐘，就可以從抗酸細菌中充分地提取基因。因此，隨后進行的擴增或檢測基因的方法能夠很容易地完成。而且，因為加熱溫度低于液體的沸點，所述方法具有以下優點，例如，因為防止了所述液體的沸騰，于是減少樣品的飛散。此外，因為溫度很容易被控制，所以不需要特殊的加熱器。另一方面，基于抗酸細菌具有高的細胞壁脂質含量這個事實，本發明的發明人提供了本發明的第二種溶菌方法。即，在本發明的第二種溶菌方法中，通過脂解作用使抗酸細菌的細胞壁脆弱化并且通過加熱溶解抗酸細菌。依據本發明的第一種和第二種溶菌方法，不使用任何特殊試劑如離液劑(chaotropicreagent)或任何特殊設備如超聲波裝置，可容易地在短時間內溶解抗酸細菌。此外，因為第一種和第二種溶菌方法是化學方法，因此它們是安全的，樣品飛散的風險低。而且，依據本發明的第一種和第二種溶菌方法，提取的基因不經純化即可以進行基因擴增過程或基因檢測過程。需要注意的是，本發明的第一種和第二種溶菌方法不僅適用于進行基因擴增或基因檢測的方法，而且還適用于其他領域如基因操縱。附圖簡述圖.1顯示確定本發明一個實施例的溶菌效果的電泳結果；圖.2顯示確定本發明另一個實施例的溶菌效果的電泳結果；圖.3顯示確定本發明再一個實施例的溶菌效果的電泳結果。完成本發明的最佳方式以下將進一步詳細描述本發明的第一種溶菌方法和第二種溶菌方法。首先，描述本發明的第一種溶菌方法。在本發明的第一種溶菌方法中，加熱溫度優選不低于70℃但低于100℃，更優選不低于80℃但低于100℃，最適宜的溫度是96℃。而且，例如，加熱1到30分鐘，優選10分鐘。例如，溶液的pH范圍是pH7.0到12.0，優選pH8.0。例如，液體中非離子表面活性劑的濃度是0.01％到10wt％，優選0.5到2.0wt％，更優選1.0wt％。非離子表面活性劑例如包括D-山梨糖醇脂肪酸酯例如Span20、Span40、Span60、Span65、Span80和Span85(所有產品由NacalaiTesque，Inc.生產)；聚氧乙烯二醇山梨聚糖烷基酯例如Tween20、Tween21、Tween40、Tween60、Tween65、Tween80、Tween81和Tween85(所有產品由NacalaiTesque，Inc.生產)；聚氧乙烯二醇對叔辛基苯基醚例如TritonX-100(由NacalaiTesque，Inc.生產)。這些表面活性劑可單獨使用或組合兩種或更多種使用。其中，優選TritonX-100，Tween20和Tween21，更優選TritonX-100。在本發明的第一種溶菌方法中，優選溶液還含有金屬螯合劑。金屬螯合劑可防止樣品中的基因降解酶如DNase降解基因。溶液中金屬螯合劑的濃度是，例如，0.1到100mM，優選1.0mM。金屬螯合劑例如包括乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙(β-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)、環己二胺四乙酸、鄰菲咯啉和水楊酸。這些金屬螯合劑可單獨使用或組合兩種或更多種使用。其中，優選EDTA和EGTA，更優選EDTA。本發明第一種溶菌方法使用的抗酸細菌例如包括鳥分枝桿菌(M.avium)、胞內分枝桿菌(M.intracellulare)、戈登分枝桿菌(M.gordonae)、結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、偶發分枝桿菌(M.fortuitum)、龜分枝桿菌(M.chelonei)、牛型分枝桿菌(M.bovis)、瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)、副結核分枝桿菌(M.paratuberculosis)、草分枝桿菌(M.phlei)、海分枝桿菌(M.marinum)、猿分枝桿菌(M.simiae)、瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)、斯氏分枝桿菌(M.szulgai)、麻風分枝桿菌(M.leprae)、蟾分枝桿菌(M.xenopi)、潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)、鼠麻風分枝桿菌(M.lepraemurium)、微黃分枝桿菌(M.flavescens)、土分枝桿菌(M.terrae)、不產色分枝桿菌(M.nonchromogenicum)、瑪爾摩分枝桿菌(M.malmoense)、亞洲分枝桿菌(M.asiaticum)、母牛分枝桿菌(M.vaccae)、胃分枝桿菌(M.gastri)、次要分枝桿菌(M.triviale)、嗜血分枝桿菌(M.haemophilum)、非洲結核菌(M.africanum)、抗熱分枝桿菌(M.thermoresistable)和恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)。在本發明的第一種溶菌方法中，含有抗酸細菌的生物樣品的實例包括痰液、脊髓液、糞便、唾液、血液、組織和尿液等。其次，例如，本發明的第一種溶菌方法可以按如下方式進行。首先，上述預先確定pH范圍的緩沖液中需要加入金屬螯合劑如EDTA，如需要可加入非離子表面活性劑，這樣制備成溶菌試劑溶液。緩沖液可以是Tris-HCl緩沖液、HEPES緩沖液、MOPS緩沖液、HEPPS緩沖液、TAPS緩沖液、磷酸鹽緩沖液等緩沖液。這個溶菌試劑溶液優選在高壓鍋內高壓蒸氣滅菌。另一方面，制備樣品溶液。例如，可以使用由N-乙酰基-L-半胱氨酸-NaOH方法(NALC-NaOH方法)均質和滅菌的痰液樣品等作為樣品溶液。離心樣品溶液并去除上清。向沉淀中加入溶菌試劑溶液。之后，使用加熱器等在上述預先確定的溫度范圍內加熱混合液進行溶菌處理。除了加熱器以外的加熱方式例如還包括水浴、微波爐和空氣浴。只有樣品正在或已被預處理后，這樣溶菌的樣品才可進行基因擴增過程或基因檢測過程。進行基因擴增或基因檢測的方法例如包括PCR方法和修飾的PCR方法，如RT-PCR方法。而且，被分析的基因例如包括DNA和RNA。下面，描述本發明的第二種溶菌方法。在本發明的第二種溶菌方法中，優選所述加熱也可使脂肪酶失活。這使得無需任何特殊過程而使脂肪酶失活。另外，脂肪酶可能影響溶菌處理后進行的過程的可能性，例如影響基因擴增過程或基因檢測過程的可能性可以被排除。在本發明的第二種溶菌方法中，優選在緩沖液中分別進行脂解作用和加熱。更優選在同樣的緩沖液中進行脂解作用和加熱。緩沖液的種類沒有特別的限制，例如，Tris緩沖液、HEPES緩沖液、磷酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、McIlvaine緩沖液等都可使用。其中，優選Tris緩沖液和HEPES緩沖液。在本發明的第二種溶菌方法中，優選在同樣的容器中如一個密閉的系統中進行脂解作用和加熱。通過在密閉的系統中進行脂解作用和加熱，有可能防止樣品飛散。而且，通過在同樣的容器中進行脂解作用和加熱，可提高處理效率。在本發明的第二種溶菌方法中，可以在脂解作用之后進行加熱，或脂解作用和加熱可同時進行。在前一種情況中，例如，在pH4到8和溫度為37℃到60℃，脂解5到30分鐘，并且在溫度為37℃到100℃，加熱5到30分鐘。優選地，在pH6到8和溫度為37℃到50℃，脂解5到20分鐘，并在溫度為80℃到100℃，加熱5到20分鐘。更優選地，在pH6.5到7.5和溫度為37℃到50℃，脂解10分鐘，并在溫度為90℃到98℃，加熱10分鐘。另一方面，在后一種情況中，例如，在pH4到8和溫度為37℃到60℃，脂解和加熱10到30分鐘；優選在pH6到8和溫度為37℃到50℃，脂解和加熱10到20分鐘，和更優選在pH6.5到7.5和溫度為45℃到50℃，脂解和加熱10到20分鐘。緩沖液中脂肪酶的濃度為10到10000單位/ml，優選100到2000單位/ml，更優選200到1000單位/ml。使用的脂肪酶沒有特別的限制，例如，商品名為脂肪酶R“AMANO”G、脂肪酶M“AMANO”10、脂肪酶G“AMANO”50、脂肪酶AY“AMANO”30G、脂肪酶A“AMANO”6的產品(所有產品由AmanoPharmaceuticalCo.，Ltd生產)等。它們可以單獨使用或兩種或多種組合使用。其中，優選脂肪酶G“AMANO”50和脂肪酶AY“AMANO”30G，更優選脂肪酶AY“AMANO”30G。在緩沖液中非離子表面活性劑的濃度是，例如，0.01到10wt％，優選0.1到2.0wt％，更優選0.5到1.0wt％。非離子表面活性劑例如包括D-山梨糖醇脂肪酸酯如Span20、Span40、Span60、Span65、Span80和Span85(例如，所有產品由NacalaiTesque，Inc.生產)；聚氧乙烯二醇山梨聚糖烷基酯如Tween20、Tween21、Tween40、Tween60、Tween65、Tween80、Tween81和Tween85(例如，所有產品由NacalaiTesque，Inc.生產)；聚氧乙烯二醇對叔辛基苯基醚如TritonX-100(例如，由NacalaiTesque，Inc.生產)。這些表面活性劑可單獨使用或兩種或多種組合使用。其中，優選Tween20和TritonX-100，更優選TritonX-100。優選地，除了非離子表面活性劑之外，在金屬螯合劑存在下進行加熱。金屬螯合劑可以防止基因降解酶如包含在樣品中的DNase降解基因。金屬鰲合劑在溶液中的濃度是，例如，0.1到2.0mM，優選0.5到1.0mM。金屬螯合劑例如包括乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇醚二胺四乙酸(EGTA)、和1，2-環己二胺四乙酸(CyDTA)。這些金屬螯合劑可單獨使用或兩種或多種組合使用。其中，優選EDTA和EGTA，且更優選EDTA。第二種溶菌方法適用于與第一種溶菌方法相同的抗酸細菌。而且，在第二種溶菌方法中使用的包含抗酸細菌的生物樣品也與在第一種溶菌方法中的相同。其次，本發明的第二種溶菌方法例如按如下方式進行。首先，向具有上述預先確定范圍pH的緩沖液中加入脂肪酶和非離子表面活性劑，如需要可加入金屬螯合劑如EDTA，因此，制備溶菌試劑溶液。這個溶菌試劑溶液優選在高壓鍋內高壓蒸汽滅菌。將樣品加入該溶菌試劑溶液中，所得的混合液在45℃孵育10分鐘(脂解作用)，然后，在96℃孵育10分鐘(加熱)。抗酸細菌的細胞壁被前次孵育脆弱化，通過后次孵育，抗酸細菌被溶菌并且脂肪酶被失活。使用加熱器、水浴、熱循環儀等進行這2次孵育。或者，將樣品加入溶菌試劑溶液，然后，所得混合液在37℃到50℃孵育10到20分鐘來同時進行脂解作用和加熱。例如，通過N-乙酰基-L-半胱氨酸-NaOH方法(NALC-NaOH方法)等均質化和滅菌痰液來制備樣品。樣品離心并去除上清。之后，將溶菌試劑溶液加入留下的沉淀中。這樣溶菌的樣品只有當正在或已被預處理后，才可用于基因擴增過程或基因檢測過程。進行基因擴增或基因檢測的方法例如包括PCR方法和修飾的PCR方法，如RT-PCR方法。而且，被分析的基因例如包括DNA和RNA。實施例以下，與比較例一起描述本發明的實施例。實施例1-1、1-2、1-3和1-4涉及本發明的第一種溶菌方法，實施例2-1、2-2、2-3和2-4涉及本發明的第二種溶菌方法。(實施例1-1，比較例1)結核桿菌的臨床分離物在商品名為MycoBroth(KyokutoPharmaceuticalIndustrialCo.，Ltd)的產品中在37℃培養，直到獲得相應于McFarland標準濁度的#1的濁度。然后，培養物用磷酸鹽緩沖液(pH6.8)稀釋以得到10倍系列稀釋液(102倍到105倍)，這樣制備包含結核桿菌的測試溶液。隨后，分別將100μl上述濃度的測試溶液倒入螺旋蓋試管，然后，離心(10000g，15分鐘)制備沉淀。從各自的測試溶液中獲得的沉淀用做溶菌反應的樣品。另一方面，將商品名為TritonX-100(NacalaiTesque，Inc.)的產品溶解在TE緩沖液(10mMEDTA和25mMTris-HCl，pH8.0)中，使其濃度達到3wt％以制備溶菌試劑溶液。溶菌試劑溶液在高壓鍋內高壓蒸汽滅菌。然后，將50μl上述的溶菌試劑溶液加入各個樣品，在加熱器中在96℃，加熱所得的混合物10分鐘進行溶菌處理。而比較例1使用商品名為AMPLICORSpecimenPretreatment試劑盒(NipponRocheK.K)的產品溶菌按照以上方法制備的樣品。向37.5μl實施例1-1和比較例1的這樣獲得的溶菌樣品溶液中加入50μl商品名為AMPLICORAmplificationandDetection試劑盒(NipponRocheK.K)的產品和12.5μl的12mM醋酸鎂的預先混合物。在COBASAMPLICOR中依據試劑盒的操作說明，采用PCR方法擴增和檢測每一個獲得的混合物。已發現在實施例1-1和比較例1的上述擴增和檢測的結果中，從測試溶液制備的稀釋率達到107倍的樣品被鑒定為結核病陽性，那些稀釋率超過107倍的樣品被鑒定為結核病陰性。因此，可以認為依據實施例1-1的溶菌方法可達到常規方法(比較例1)的靈敏度(溶菌效率)。而且，依據實施例1-1的溶菌方法僅需常規方法(比較例1)一半的處理時間。(實施例1-2，比較例2)結核桿菌的臨床分離物在商品名為MycoBroth(KyokutoPharmaceuticalIndustrialCo.，Ltd)的產品中在37℃培養，直到獲得相應于McFarland標準濁度的#1的濁度。然后，使用已被商品名為SUPTAZYME(KyokutoPharmaceuticalIndustrialCo.，Ltd)的產品均質化的非結核病痰液稀釋培養物以便得到10倍系列稀釋液(100倍到1010倍)。生成的稀釋液被用做樣品。另一方面，商品名為TritonX-100(NacalaiTesque，Inc.)的產品溶解在TE緩沖液(10mMEDTA和25mMTris-HCl，pH8.0)中，使其濃度達到3wt％以制備溶菌試劑溶液。溶菌試劑溶液在高壓鍋內高壓蒸汽滅菌。然后，將50μl上述的溶菌試劑溶液加入各個樣品(100μl)中，在加熱器中在96℃，加熱生成的混合液10分鐘進行溶菌處理。而比較例2使用商品名為AMPLICORSpecimenPretreatment試劑盒(NipponRocheK.K)的產品溶菌按照以上方法制備的樣品。向37.5μl實施例1-2和比較例2的這樣獲得的溶菌樣品溶液中加入50μl的商品名為AMPLICORAmplificationandDetection試劑盒(NipponRocheK.K)的產品和12.5μl的12mM醋酸鎂的預先混合物。在COBASAMPLICOR中依據試劑盒的操作說明，采用PCR方法擴增和檢測每一個獲得的混合液。已發現在實施例1-2和比較例2的上述擴增和檢測的結果中，稀釋率達到104倍的樣品被鑒定為結核病陽性，那些稀釋率超過104倍的樣品被鑒定為結核病陰性。因此，可以認為，即使在污染物的影響下，依據實施例1-2的溶菌方法也可達到與常規方法(比較例2)相當的靈敏度(溶菌效率)。而且，依據實施例1-2的溶菌方法僅用常規方法(比較例2)一半的處理時間。(實施例1-3，比較例3)收集病人的90個痰液樣品，通過NALC-NaOH方法(“NewGuidelineforTubercleBacillusTest2000”，由日本結核病學會編輯)將其均質化并滅菌。然后，將100μl每種已處理的痰液樣品離心，13000g，10分鐘。去除上清后，收集沉淀。另一方面，將商品名為TritonX-100(NacalaiTesque，Inc.)的產品溶解在TE緩沖液(10mMEDTA和25mMTris-HCl，pH8.0)中，使其濃度達到3wt％以制備溶菌試劑溶液。溶菌試劑溶液在高壓鍋內高壓蒸汽滅菌。特別地，將50μl已滅菌的溶菌試劑溶液加入到各自樣品獲得的沉淀中以懸浮沉淀。然后，在加熱器中在96℃，加熱懸液10分鐘進行溶菌處理。另一方面，比較例3采用如上的同樣方法制備的樣品(沉淀)使用AMPLICORSpecimenPretreatment試劑盒(NipponRocheK.K)溶菌。向12.5μl這樣獲得的實施例1-3和比較例2的溶菌樣品中加入50μl的商品名為AMPLICORAmplificaitonandDetection試劑盒(NipponRocheK.K)的產品和37.5μl的12mM醋酸鎂的預先混合物。在COBASAMPLICOR中依據試劑盒的操作說明，采用PCR方法擴增和檢測每一個獲得的混合液。另外，對如上述的同樣方法制備的樣品(沉淀)采用常規方法進行培養測試。結果，當采用常規方法(比較例3)處理時，在90個唾液樣品中，41個樣品被鑒定為結核病陽性，49個樣品被鑒定為結核病陰性。另一方面，當采用本發明的第一種溶菌方法處理時(實施例1-3)，41個樣品被鑒定為結核病陽性，49個樣品被鑒定為結核病陰性。因此，當采用實施例1-3的方法處理所獲得的結果與采用常規方法(比較例3)處理所獲得的結果非常一致。而且，依據培養測試，42個樣品被鑒定為結核病陽性而48個樣品被鑒定為結核病陰性，這些結果與采用實施例1-3和比較例3方法處理所獲得的結果大約100％(97.8％)一致。因此，可以認為本發明的溶菌方法能夠產生相當于常規方法的溶菌效果并可在實際臨床測試中作為一個有用的方法。另外，在實施例1-3的方法中，溶菌處理需要的時間比比較例3方法中的時間少30分鐘。(實施例2-1，實施例1-4)將商品名為脂肪酶G“AMANO”50(AmanoPharmaceuticalCo.，Ltd)的產品和商品名為脂肪酶AY“AMANO”30G(AmanoPharmaceuticalCo.，Ltd)的產品溶解于10mMHEPES緩沖液(pH7.0)中制備脂肪酶試劑溶液。此外，在TE緩沖液(10mMTris和1mMEDTA，pH8.0)中加入商品名為TritonX-100(NacalaiTesque，Inc.)的產品制備溶菌試劑溶液并在高壓鍋內高壓蒸汽滅菌混合液(這樣獲得的溶菌試劑溶液以下稱為“TE-Triton試劑溶液”)。通過在生長抗酸細菌(產品商品名為MycoBroth，由KyokutoPharmaceuticalIndustrialCo.，Ltd生產)的液體培養基中培養BCG制備物用于制備樣品的BCG培養物，直到含有BCG的溶液達到相應于McFarland標準濁度的#1的濁度。然后，按所需稀釋該溶液。此后，生成的含有BCG的溶液使用磷酸鹽緩沖液(pH6.8)梯度稀釋(10-4，10-3.5，10-3，10-2.5，10-2)，這樣制備了測試溶液。隨后，將100μl上述濃度的測試溶液分別倒入螺旋蓋試管，然后離心(10000g，15分鐘)制備沉淀。從各自測試溶液獲得的沉淀被用做溶菌反應的樣品。制備上述的脂肪酶溶液以使脂肪酶濃度分別為100，500，1000，2000和3000(單位/ml)。將50μl每種上述濃度的脂肪酶溶液加入樣品。生成的混合液在渦旋混合器上混合，然后稍稍離心，37℃孵育30分鐘。然后，將50μlTE-Triton試劑溶液(Triton濃度2％)加入混合液，在96℃加熱生成的混合液20分鐘來進行溶菌處理。另一方面，除未進行脂肪酶處理之外，實施例1-4進行同樣的步驟。在通過上述步驟獲得的100μl的每種溶菌液中，2μl被用作模板進行PCR以確定細胞是否被溶解。PCR按如下步驟完成94℃，1分鐘變性，30個循環，每個循環由94℃30秒，60℃1分鐘，及72℃1分鐘組成。引物序列和反應液成分如下(PCR反應成分)10×Ex-TaqBuffer2.5μl2.5mMdNTPMixture2.0μl100μM引物No.10.125μl(序列號1)100μM引物No.20.125μl(序列號2)Ex-Taq(5μ/μL)0.125μlD.W.18.125μl每種溶菌樣品2.0μl———————————————————總體積25.0μl8μl每種擴增反應產物使用3％瓊脂糖凝膠進行電泳。結果在圖1顯示。圖1中泳道1到7的樣品如下。(圖1說明)(1)樣品僅在TE-Triton試劑溶液中熱處理。(2)樣品使用脂肪酶G“AMANO”50處理，然后，在TE-Triton試劑溶液中熱處理。脂肪酶濃度100單位/ml。(3)樣品使用脂肪酶G“AMANO”50處理，然后，在TE-Triton試劑溶液中熱處理。脂肪酶濃度500單位/ml。(4)樣品使用脂肪酶G“AMANO”50處理，然后，在TE-Triton試劑溶液中熱處理。脂肪酶濃度1000單位/ml。(5)樣品使用脂肪酶AY“AMANO”30G處理，然后，在TE-Triton試劑溶液中熱處理。脂肪酶濃度100單位/ml。(6)樣品使用脂肪酶AY“AMANO”30G處理，然后，在TE-Triton試劑溶液中熱處理。脂肪酶濃度500單位/ml。(7)樣品使用脂肪酶AY“AMANO”30G處理，然后，在TE-Triton試劑溶液中熱處理。脂肪酶濃度1000單位/ml。*圖1的標記“M”指示一個100bp梯形分子量標記。*在(1)到(7)的每個區域中，從左邊的泳道開始，樣品的稀釋率是10-4，10-3.5，10-3，10-2.5和10-2。從圖1可見，即使在TE-Triton試劑溶液中只進行加熱處理時，也可以獲得充分的溶菌作用((1)，實施例1-4)，當用脂肪酶進行預處理后((2)到(7)，實施例2-1)，仍然可獲得改善的溶菌作用。(實施例2-2，實施例2-3)使用磷酸鹽緩沖液(pH6.8)梯度稀釋(10-4，10-3.5，10-3，10-2.5)按上述方式獲得的含BCG的溶液。生成的稀釋液被用作測試溶液。隨后，將100μl上述濃度的測試溶液分別加入螺旋蓋試管，然后，離心(10000g，15分鐘)生成沉淀。從各自的測試溶液獲得的沉淀被用作溶菌反應的樣品。另一方面，脂肪酶AY“AMANO”30G加入上述TE-Triton溶液以使其濃度達到500單位/ml制備溶菌試劑溶液。將100μl溶菌試劑溶液加入樣品。生成的混合液在渦旋混合器上混合，然后稍稍離心，45℃孵育。按照如下兩個不同時間進行孵育10分鐘和30分鐘。隨后，在96℃加熱混合液10分鐘進行溶菌處理(實施例2-2)。此外，除了同時進行脂肪酶處理和加熱處理之外，實施例2-3進行同樣的步驟(45℃，10分鐘)。在通過上述步驟獲得的100μl每種溶菌液中，2μl被用作模板進行PCR以確定細胞是否被溶解。進行PCR的條件與實施例2-1的相同。8μl每種PCR擴增反應產物進行3％瓊脂糖凝膠電泳以確定細胞是否被溶解。圖2顯示結果。圖2中泳道(1)到(5)的樣品如下。(圖2說明)(1)在含脂肪酶AY“AMANO”30G和TE-Triton試劑(實施例2-3)的混合試劑中的樣品同時進行脂肪酶處理和加熱處理。(2)用含脂肪酶AY“AMANO”30G和TE-Triton試劑的混合試劑處理樣品。45℃，10分鐘→96℃，10分鐘(3)用含脂肪酶AY“AMANO”30G和TE-Triton試劑的混合試劑處理樣品。45℃，30分鐘→96℃，10分鐘(4)用脂肪酶AY“AMANO”30G在37℃處理樣品10分鐘，然后，加入TE-Triton試劑，在96℃加熱處理10分鐘。(5)用脂肪酶AY“AMANO”30G在37℃處理樣品10分鐘，然后，加入TE-Triton試劑，在96℃加熱處理10分鐘。*圖2的標記“M”指示一個100bp梯形分子量標記。*在(1)到(7)的每個區域中，從左邊的泳道開始，樣品的稀釋率是10-4，10-3.5，10-3和10-2.5。從圖2可見，即使同時進行脂解處理和加熱處理也可以獲得充分的溶菌效果(實施例2-3)。另一方面，當脂解處理和加熱處理分別進行時(實施例2-2)，仍然可獲得改善的溶菌效果。進行孵育的時間不影響溶菌效果，在同樣的緩沖液中溶解非離子表面活性劑和脂肪酶不會出現問題。(實施例2-4)將TritonX-100(NacalaiTesque，Inc.)加入TE緩沖液(10mMTris和1mMEDTA，pH8.0)和Tris緩沖液(10mMTris，pH8.0)中以使其濃度達到1％。生成的混合液在高壓鍋內滅菌，這樣制備了含有EDTA的試劑和不含EDTA的試劑。以下，這些試劑分別被稱為TE-Triton試劑(含EDTA)和Tris-Triton試劑(不含EDTA)。通過在生長抗酸細菌(產品商品名為MycoBroth，由KyokutoPharmaceuticalIndustrialCo.，Ltd生產)的液體培養基中培養BCG制備物用于制備樣品的BCG培養物，直到含有BCG的溶液具有相應于McFarland濁度標準的#1的濁度，然后按所需稀釋溶液。其后，用磷酸鹽緩沖液(pH6.8)梯度稀釋(10-4.5，10-4，10-3.5，10-3，10-2.5)生成的含BCG的溶液，這樣制備測試溶液。隨后，將100μl上述濃度的測試溶液分別加入螺旋蓋試管，然后離心(10000g，15分鐘)生成沉淀。從各自的測試溶液獲得的沉淀被用作溶菌反應的樣品。將脂肪酶AY“AMANO”30G加入上述的TE-Triton溶液和Tris-Triton溶液以使其濃度達到500單位/ml。然后，將100μl每種溶液加入樣品。生成的混合液在渦旋混合器上混合，然后稍稍離心，45℃孵育。按照如下兩個不同時間進行孵育10分鐘和30分鐘。隨后，在96℃加熱混合液10分鐘進行加熱處理。在通過上述步驟獲得的100μl的每種溶菌液中，取2μl用作模板以進行PCR以確定細胞是否被溶解。進行PCR的條件與實施例2-1的相同。將8μl每種PCR擴增反應產物進行3％瓊脂糖凝膠電泳以確定細胞是否被溶解。圖3顯示結果。圖3中泳道(1)到(6)的樣品如下。(圖3說明)(1)到(3)用含脂肪酶AY“AMANO”30G和TE-Triton試劑(存在EDTA)的混合試劑處理樣品。45℃，10分鐘→96℃，10分鐘(4)到(6)用含脂肪酶AY“AMANO”30G和Tris-triton試劑(不存在EDTA)的混合試劑處理樣品。45℃，10分鐘→96℃，10分鐘*圖3的標記“M”指示一個100bp梯形分子量標記。*在(1)到(7)的每個區域中，從左邊的泳道開始，樣品的稀釋率是10-4.5，10-4，10-3.5，10-3和10-2.5。從圖3可見，即使未使用EDTA((4)到(6))，也可以獲得充分的溶菌效果。但是，使用EDTA((1)到(3))，仍然可獲得改善的溶菌效果。工業應用如上所述，本發明提供了一種不使用任何特殊設備或特別試劑的可以容易地在短時間內安全地對抗酸細菌溶菌的方法。因此，在抗酸細菌測試中，通過利用基因擴增和檢測應用本發明的方法例如預處理一個要分析的樣品，可以容易地改善測試效率。序列表<110>愛科來株式會社<120>抗酸細菌的溶菌方法和用其進行基因擴增或檢測的方法<130>H1724-01<150>JP2002-146823<151>2002-05-21<150>JP2002-183461<151>2002-06-24<160>2<170>PatentInversion3.1<210>1<211>16<212>DNA<213>Artificial<220><223>PrimerNo.1<400>1tcgtccagcgccgctt16<210>2<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>PrimerNo.2<400>2caaaggccacgtaggcgaac20權利要求1.一種溶解抗酸細菌以提取抗酸細菌的基因的方法，包含在含有非離子表面活性劑的液體培養基中在低于所述液體的沸點的溫度下加熱所述抗酸細菌。2.依據權利要求1的方法，其中所述加熱溫度不低于70℃但低于100℃。3.依據權利要求1或2的方法，其中加熱進行1到30分鐘。4.依據權利要求1的方法，其中在96℃加熱10分鐘。5.依據權利要求1到4任一項的方法，其中所述液體的pH值范圍是7.0到12.0。6.依據權利要求1到5任一項的方法，其中所述液體中的非離子表面活性劑的濃度是0.01到10wt％。7.依據權利要求1到6任一項的方法，其中所述非離子表面活性劑至少是從D-山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯二醇山梨聚糖烷基酯和聚氧乙烯二醇對叔辛基苯基醚的組成的組中選出的一種。8.依據權利要求1到7任一項的方法，其中所述液體還含有金屬螯合劑。9.依據權利要求8的方法，其中所述液體中金屬螯合劑的濃度是0.1到100mM。10.依據權利要求8或9的方法，其中所述金屬螯合劑至少是從乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-雙(β-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)、環己二胺四乙酸、鄰菲咯啉和水楊酸組成的組中選出的一種。11.依據權利要求1到10任一項的方法，其中被裂解的所述抗酸細菌至少是從鳥分枝桿菌(M.avium)、胞內分枝桿菌(M.intracellulare)、戈登分枝桿菌(M.gordonae)、結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、偶發分枝桿菌(M.fortuitum)、龜分枝桿菌(M.chelonei)、牛型分枝桿菌(M.bovis)、瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)、副結核分枝桿菌(M.paratuberculosis)、草分枝桿菌(M.phlei)、海分枝桿菌(M.marinum)、猿分枝桿菌(M.simiae)、瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)、斯氏分枝桿菌(M.szulgai)、麻風分枝桿菌(M.leprae)、蟾分枝桿菌(M.xenopi)、潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)、鼠麻風分枝桿菌(M.lepraemurium)、微黃分枝桿菌(M.flavescens)、土分枝桿菌(M.terrae)、不產色分枝桿菌(M.nonchromogenicum)、瑪爾摩分枝桿菌(M.malmoense)、亞洲分枝桿菌(M.asiaticum)、母牛分枝桿菌(M.vaccae)、胃分枝桿菌(M.gastri)、次要分枝桿菌(M.triviale)、嗜血分枝桿菌(M.haemophilum)、非洲結核菌(M.africanum)、抗熱分枝桿菌(M.thermoresistable)和恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)組成的組中選出的一種。12.依據權利要求1到11任一項的方法，其中含抗酸細菌的生物樣品至少是從痰液、脊髓液、糞便、唾液、血液、組織和尿液組成的組中選出的一種。13.一種特異性擴增或檢測抗酸細菌基因的方法，包含依據權利要求1到12任一項的方法溶解抗酸細菌以提取所述抗酸細菌的基因；和使用提取的基因作為樣品特異性擴增或檢測所述基因。14.一種溶解抗酸細菌提取抗酸細菌的基因的方法，包含用脂解酶處理抗酸細菌產生脂解作用，和在非離子表面活性劑存在時加熱所述抗酸細菌。15.依據權利要求14的方法，其中加熱也用作使脂肪酶失活。16.依據權利要求14或15的方法，其中在緩沖液中進行脂解作用和加熱。17.依據權利要求14到16任一項的方法，其中脂解作用和加熱在同一容器如一個密閉系統中進行。18.依據權利要求14到17任一項的方法，其中在脂解作用后進行加熱。19.依據權利要求18的方法，其中在pH4到pH8，溫度37℃到60℃，5到30分鐘進行脂解作用，和在溫度37℃到100℃加熱5到30分鐘。20.依據權利要求14到19任一項的方法，其中脂解作用和加熱同時進行。21.依據權利要求20的方法，其中在pH4到pH8，溫度37℃到60℃進行脂解作用和加熱5到30分鐘。22.依據權利要求16到21任一項的方法，其中所述緩沖液中脂肪酶的濃度是10到10000單位/ml。23.依據權利要求14到22任一項的方法，其中所述非離子表面活性劑至少是從D-山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯二醇山梨聚糖烷基酯和聚氧乙烯二醇對叔辛基苯基醚組成的組中選出的一種。24.依據權利要求16到23任一項的方法，其中所述緩沖液中的非離子表面活性劑的濃度是0.01到10wt％。25.依據權利要求14到24任一項的方法，其中在存在離子表面活性劑和金屬螯合劑時，進行加熱。26.依據權利要求25的方法，其中所述金屬螯合劑至少是從乙二胺四乙酸(EDTA)，乙二醇醚二胺四乙酸(EGTA)和1，2-環己二胺四乙酸(CyDTA)組成的組中選出的一種。27.依據權利要求25或26的方法，其中所述緩沖液中金屬螯合劑的濃度是0.1到2.0mM。28.依據權利要求14到27任一項的方法，其中被溶解的所述抗酸細菌至少是從鳥分枝桿菌(M.avium)、胞內分枝桿菌(M.intracellulare)、戈登分枝桿菌(M.gordonae)、結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、偶發分枝桿菌(M.fortuitum)、龜分枝桿菌(M.chelonei)、牛型分枝桿菌(M.bovis)、瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)、副結核分枝桿菌(M.paratuberculosis)、草分枝桿菌(M.phlei)、海分枝桿菌(M.marinum)、猿分枝桿菌(M.simiae)、瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)、斯氏分枝桿菌(M.szulgai)、麻風分枝桿菌(M.leprae)、蟾分枝桿菌(M.xenopi)、潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)、鼠麻風分枝桿菌(M.lepraemurium)、微黃分枝桿菌(M.flavescens)、土分枝桿菌(M.terrae)、不產色分枝桿菌(M.nonchromogenicum)、瑪爾摩分枝桿菌(M.malmoense)、亞洲分枝桿菌(M.asiaticum)、母牛分枝桿菌(M.vaccae)、胃分枝桿菌(M.gastri)、次要分枝桿菌(M.triviale)、嗜血分枝桿菌(M.haemophilum)、非洲結核菌(M.africanum)、抗熱分枝桿菌(M.thermoresistable)和恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)組成的組中選出的一種。29.依據權利要求14到28任一項的方法，其中含抗酸細菌的生物樣品至少是從痰液、脊髓液、糞便、唾液、血液、組織、藥簽、洗胃術獲得的液體和尿液組成的組中選出的一種。30.一種特異性擴增或檢測抗酸細菌基因的方法，包括依據權利要求14到29任一項的方法溶解抗酸細菌以提取所述抗酸細菌的基因；和使用提取的基因作為樣品特異性擴增或檢測所述基因。全文摘要本發明提供了一種抗酸細菌的溶菌方法，包括在含有非離子表面活性劑的液體中在低于所述液體的沸點的溫度下加熱所述抗酸細菌。這個方法可以實現在短時間內不使用特殊的設備和試劑的情況下簡單地安全溶解抗酸細菌，而且提取基因。所述加熱優選在96℃進行10分鐘。所述非離子表面活性劑可以是D－山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯二醇山梨聚糖烷基酯和聚氧乙烯二醇對叔辛基苯基醚等。所述液體的pH值優選8，且所述液體優選含有EDTA。還優選在加熱前，用脂肪酶處理所述抗酸細菌。文檔編號C12N1/06GK1656211SQ0381143公開日2005年8月17日申請日期2003年5月21日優先權日2002年5月21日發明者鐮田達夫,和泉澤裕司申請人:愛科來株式會社