抗cd20抗體及其融合蛋白和使用方法

專利名稱：抗cd20抗體及其融合蛋白和使用方法
背景技術：
1.發明領域本發明涉及人源化、嵌合型和人抗CD20抗體，特別是人源化、嵌合型和人抗CD20抗體的單克隆抗體(MAb)治療和診斷綴合物，和涉及用人源化、嵌合型和人抗CD20抗體來治療B-細胞淋巴瘤和白血病以及多種自身免疫病的方法。本發明涉及抗體融合蛋白或者其片段，它們含有至少兩個抗CD20 MAb或其片段，或者含有至少一種抗CD20 MAb或其片段和至少一種除了抗CD20 MAb或其片段之外的第二種MAb或其片段。人源化、嵌合型和人抗CD20 MAb、其片段、其抗體融合蛋白或其片段可以單獨進行施用，作為治療綴合物(congjugate)或者與治療免疫綴合物、與其他裸露的抗體或與治療試劑聯合進行施用，或者作為診斷綴合物進行施用。本發明涉及編碼人源化、嵌合型和人抗CD20抗體和抗體融合蛋白的DNA序列、含有該DNA序列的載體和宿主細胞以及制造人源化、嵌合型和人抗CD20抗體的方法。
2.背景脊椎動物的免疫系統由許多器官和細胞類型組成，它們已經進化成可準確地識別外來抗原，并特異性地與這些外來抗原結合和去除/破壞這些外來抗原。其中，淋巴細胞對于免疫系統是關鍵性的。淋巴細胞劃分為兩個主要亞群，即T-細胞和B-細胞。雖然是相互依賴的，但是T-細胞主要在細胞介導的免疫中起作用，而B-細胞主要在抗體產生(體液免疫)中起作用。
在人中，每個B-細胞能夠產生大量的抗體分子。這種抗體的產生一般在外來抗原已被中和的時候停止(或者基本上減退了)。可是，有時特殊B-細胞的增殖會持續地不減弱，從而可以導致稱為B-細胞淋巴瘤的癌癥。B-細胞淋巴瘤例如非Hodgkin’s淋巴瘤的B-細胞亞型對于癌癥死亡率起著重要的作用。混合了B-細胞惡性腫瘤對于多種形式的治療的反應。例如，在可能對非Hodgkin’s淋巴瘤進行恰當的臨床分期的情況下，場放射療法能夠提供令人滿意的治療。但是仍有大約一半的患者死于該疾病。Devesa等人，J.Nat’l Cancer Inst.79701(1987)。
慢性淋巴細胞白血病的大部分是B-細胞系的。Freedman，Hematol.Oncol.Clin.North Am.4405(1990)。這一類型的B-細胞惡性腫瘤在西方世界中是最普遍的白血病。Goodman等人，Leukemia andLymphoma 221(1996)。慢性淋巴細胞白血病的天然病史分成幾個階段。在早期階段中，慢性淋巴細胞白血病是無痛感的疾病，其特征在于積聚了小的、成熟的、功能不全的惡性B-細胞，它們具有延長的壽命。最后，惡性B-細胞的倍增時間減少，和患者的癥狀增加。雖然治療能夠提供癥狀的緩解，但是患者的總存活率只是最低程度地受到了影響。慢性淋巴細胞白血病的后期階段的特征為貧血和/或血小板減少。在這一點上，中值存活時間小于兩年。Foon等人，Annals Int.Medicine 113525(1990)。由于非常低的細胞增殖率，慢性淋巴細胞白血病對于細胞毒性藥物治療具有抗性。
包括化學療法和放射療法在內的治療B-細胞惡性腫瘤的傳統方法由于毒副作用而具有有限的應用。使用單克隆抗體來引導放射性核素、毒素或其他治療試劑提供了這樣的可能性，即這些試劑可以選擇性地遞送到腫瘤部位，因此限制了對于正常組織的毒性。此外，在這些B-細胞惡性腫瘤上B-細胞抗原的存在使得它們成為使用未綴合的B-細胞抗體(例如抗B-細胞上的CD19、CD20、CD21、CD23和CD22標記)的療法的最佳目標。HLA-DR和其他抗原可以用作正常和惡性B-細胞的目標，雖然它們也在其他細胞類型上表達。此外，某些MUC1、MUC2、MUC3和MUC4抗原(優選為MUC1)也在不同的造血惡性腫瘤中表達，包括表達CD20和其他B-細胞標記的B-細胞腫瘤。另外的其他抗原目標，如那些與腫瘤的血管內皮相聯系的抗原，包括腱生蛋白、血管內皮生長因子(VEGF)和胎盤生長因子(P1GF)，以及其他類別的與B-細胞惡性腫瘤相聯系的抗原如癌基因產物，它們也是在本發明中使用的該互補性抗體的合適的目標。
B-細胞具有可用作用于區分和鑒定的標記的細胞表面蛋白。一種這樣的人B-細胞標記為人局限于B-淋巴細胞的分化抗原Bp35，稱為CD20。CD20在前B-細胞的發育早期期間進行表達，并保持到漿細胞的分化。CD20在正常的B-細胞和惡性B-細胞上表達，惡性B-細胞的不正常生長能夠導致B-細胞淋巴瘤。已經研究了抗CD20抗原的抗體用于B-細胞淋巴瘤的治療。例如，標示為“IDEC-C2B8”的嵌合型抗CD20抗體當以下列條件進行施用時具有抗B-細胞淋巴瘤的活性，即以未綴合的抗體形式進行提供，并以每次注射超過500mg的劑量進行重復的注射。Maloney等人，Blood 842457(1994)；Longo，Curr.Opin.Oncol.8353(1996)。大約50％的具有低級無痛感形式的非Hodgkin’s患者在用這一治療方法進行治療時顯示出反應。當以每次注射超過600mg的劑量進行重復給藥時，治療反應也可以通過使用131I標記的抗CD20鼠類單克隆抗體B1來獲得。Kaminski等人，N.Engl.J.Med.329459(1993)；Press等人，N.Engl.J.Med.3291219(1993)；Press等人，Lancet 346336(1995)。可是，這些以未綴合的形式或者以放射性標記的形式提供的抗體在具有更普遍和致死形式的B-細胞淋巴瘤(中間或侵染性形式)的患者中沒有顯示出高比率的客觀和持久的反應。因此，存在需要來形成對于B-細胞惡性腫瘤的免疫療法，其可獲得具有明顯持續時間的治療反應。
已經用抗CD20鼠類單克隆抗體IF5驗證了另外的將CD20表面抗原作為目標的研究，IF5通過持續的靜脈內輸注而施用于B-細胞淋巴瘤患者。據報道，需要非常高水平(＞2克)的IF5來減少循環的腫瘤細胞，該結果被Press等人(人B-細胞淋巴瘤的單克隆抗體IF5(抗CD20)血清療法(Monoclonal Antibody IF5(Anti-CD20)Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas)，Blood 69/2584-591(1987))描述為“短暫的”。可是，該方法的潛在問題是非人單克隆抗體(例如鼠類單克隆抗體)通常缺乏人效應物功能性，即它們不能夠介導依賴補體的裂解，或者通過依賴抗體的細胞毒性或Fc受體介導的吞噬作用來裂解人靶細胞。此外，非人單克隆抗體能夠被人宿主識別為外源蛋白質，因此重復注射這種外源抗體可以引起導致有害過敏反應的免疫反應。對于基于鼠類的單克隆抗體，這常常稱為人抗鼠抗體(HAMA)反應。
使用嵌合型抗體是更加優選的，因為它們不會引起與鼠類抗體一樣強的HAMA反應。嵌合型抗體是含有來自兩個或更多個不同物種的部分的抗體。例如Liu，A.Y.等人(具有有效的Fc依賴性生物活性的抗CD20小鼠-人嵌合型單克隆抗體的生產(Production of a Mouse-HumanChimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-DependentBiologic Activity)，J.Immun.139/103521-3526(1987))描述了導向抗CD20抗原的小鼠/人嵌合型抗體。也可見PCT發表號WO88/04936。可是，在該文獻中沒有提供關于使用這種嵌合型抗體對于治療B-細胞紊亂的能力、效用或實用性的信息。要注意的是，體外功能測定(例如依賴補體的裂解(CDC)；依賴抗體的細胞毒性(ADCC)等等)不能自然地預測嵌合型抗體破壞或減少表達特異性抗原的靶細胞的體內能力。見例如，Robinson，R.D.等人，介導不同的抗腫瘤細胞生物活性的嵌合型小鼠-人抗癌抗體(Chimetic mouse-humananti-carcinoma antibodies that mediate different anti-tumorcell biological activities)，Hum.Antibod.Hybridomas 284-93(1991)(具有無法覺察的ADCC活性的嵌合型小鼠-人抗體)。因此，嵌合型抗體的潛在治療效能只能真正地通過體內實驗來評測，優選地在用于特異性療法的目標物種中進行實驗。
有一種方法已經改善了鼠類單克隆抗體的能力以使其在治療B-細胞紊亂中是有效的，這一方法將放射性標記或化療試劑與抗體綴合，從而標記或試劑可定位于腫瘤部位。例如，上面所提及的IF5抗體和其他B-細胞抗體用131I進行標記，并據報道對于在兩個患者中的生物分布進行評價。見Eary，J.F.等人，B-細胞淋巴瘤的成像和治療(Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma)，J.Nuc.Med.31/81257-1268(1990)；也可見Press，O.W.等人，用放射性標記的MB-1(抗CD37)抗體治療頑固性非Hodgkin’s淋巴瘤(Treatmentof Refractory Non-Hodgkin’s Lymphoma with Radiolabeled MB-1(Anti-CD37)Antibody)，J.Clin.Onc.7/81027-1038(1989)(表明一個用131I標記的IF-5進行治療的患者獲得了部分的反應)；Goldenberg，D.M.等人，用131I標記的LL2單克隆抗體對于B-淋巴瘤進行定向、劑量測定和放射免疫治療(Targeting，Dosimetry andRadioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with131I-Labeled LL2Monoclonal Antibody)，J.Clin.Oncol.9/4548-564(1991)(報道了八個接受多次注射的患者中有三個形成了對于該CD22鼠類抗體的HAMA反應)；Appelbaum，F.R.，在治療非Hodgkin’s淋巴瘤中的放射標記單克隆抗體(Radiolabeled Monoclonal Antibodies in theTreatment of Non-Hodgkin’s LymDhoma)，Hem./Oncol.Clinics ofN.A.5/51013-1025(1991)(綜述文章)；Press，O.W.等人，用自體骨髓支持物所進行的B-細胞淋巴瘤的放射性標記抗體療法(Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma withAutologous Bone Marrow Support)，New England Journal ofMedicine 329/171219-12223(1993)(131I標記的抗CD20抗體IF5和B1)；和Kaminski，M.G.等人，用[13I]抗B1(抗CD20)抗體所進行的B-細胞淋巴瘤的放射免疫療法(Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with[131I]Anti-B1(Anti-CD20)Antibody)，NEJM329/7459(1993)(131I標記的抗CD20抗體B1；在下文中稱為“Kaminski”)；PCT發表的申請WO 92/07466(與化療試劑如阿霉素或絲裂霉素綴合的抗體)。可是，這些方法沒有消除與使用鼠類抗體相聯系的障礙，盡管有這樣的事實，即在侵染之前接受細胞毒性化療的許多具有淋巴瘤的患者是免疫抑制的，因此比沒有進行深切預治療的淋巴瘤患者具有更低的HAMA比率。
自身免疫病是一類與B-細胞紊亂相聯系的疾病。例子包括免疫介導的血小板減少癥如急性原發性血小板減少性紫瘢和慢性原發性血小板減少性紫癜、重癥肌無力、狼瘡腎炎、紅斑狼瘡和類風濕性關節炎。最普通的治療為皮質類固醇和細胞毒性藥物，其可以是非常毒的。這些藥物也抑制整個免疫系統，從而可導致嚴重的感染，和對于骨髓、肝和腎產生不利的影響。到目前為止已用于治療III型自身免疫病的其他治療劑已經導向抗T-細胞和巨噬細胞。有需要來獲得更有效的治療自身免疫病的方法，特別是III型自身免疫病。
為了找出許多與B-細胞紊亂和其治療相關的組織，本發明提供了人源化、嵌合型和人抗CD20單克隆抗體，這些單克隆抗體具有同樣的與本發明的CD20抗原結合的互補決定區(CDR)，它們可單獨使用、與治療試劑綴合使用或者與其他治療形式聯合使用，以用于在人和其他哺乳動物中治療B-細胞淋巴瘤與白血病和自身免疫紊亂，而沒有與使用鼠類抗體相聯系的不利反應。
發明概述因此，本發明提供了人源化、嵌合型和人抗CD20抗體，它們與被稱為CD20的人B-細胞標記結合，該B-細胞標記可用于B-細胞紊亂如B-細胞惡性腫瘤和自身免疫病的治療和診斷。
本發明進一步提供了用一種或多種人源化、嵌合型和人CD20抗體來治療哺乳動物受試者如人或家養動物的方法，這些抗體單獨使用，或者作為抗體融合蛋白、作為治療綴合物單獨或作為抗體融合蛋白的一部分進行使用，或者聯合其他抗體、其他治療試劑或免疫調節劑而以多形式療法進行使用，或者作為與至少一種治療試劑、治療放射性核素或免疫調節劑相連的免疫綴合物進行使用。這些人源化、嵌合型和人CD20抗體也可以單獨、與其他診斷成像劑聯合和/或與治療應用一起而用作診斷成像劑。
本發明另外涉及抗CD20 MAb或其片段，它們含有特異性鼠類CDR或來自多于一種鼠的鼠類CDR組合，或者含有對于CD20具有特異性的嵌合型抗CD20 MAb。這些MAb可以為人源化、嵌合型和人抗CD20 MAb。
本發明也涉及抗體融合蛋白，其含有至少兩個抗CD20 MAb或其片段，或者含有具有抗CD20 MAb或其片段的第一種MAb和第二種MAb。
本發明進一步涉及抗CD20 MAb或其片段、或者抗CD20 MAb或其他MAb或其片段的抗體融合蛋白與至少一種治療試劑或至少一種診斷試劑結合所形成的治療或診斷綴合物。具有多個相同或不同類型的治療試劑的抗體融合蛋白包括在本發明之內。
本發明另外涉及使用抗CD20 MAb或其片段或者其抗體融合蛋白或其片段進行治療的方法，它們單獨進行施用，互相聯合進行施用，作為具有一個或多個治療試劑的治療免疫綴合物的抗體成分進行施用，或者與一個或多個治療試劑或各自與具有一個或多個治療試劑的治療免疫綴合物聯合施用。
本發明進一步涉及使用抗CD20 MAb或其片段或者其抗體融合蛋白或其片段作為與一種或多種診斷試劑結合的診斷劑的方法。
本發明另外涉及在患有B-細胞淋巴瘤或白血病或者自身免疫病的患者中用本發明的抗體融合蛋白或其片段預定向細胞的方法。
附圖簡述

圖1公開了通過RT-PCR從產生鼠類抗CD20的雜交瘤細胞系中克隆得到的V基因序列，和由此推斷出的A20抗體可變輕鏈(圖1A)和重鏈(圖1B)的氨基酸序列，分別標示為A20Vk和A20VH。下劃箭頭線指明了用于克隆的PCR引物的序列。由Kabat編號方案所定義的推定CDR區域序列以粗體和下劃線表示。氨基酸序列以位于相應核苷酸序列之下的單字母碼來給出。Kabat編號方案用于氨基酸殘基。根據Kabat，用一個字母編號的氨基酸殘基代表了插入殘基，其具有與以前殘基的編號一樣的編號。例如，圖1B中的殘基82、82A、82B和82C分別表示為82A、B和C。
圖2公開了cA20這一嵌合型抗CD20抗體的Vk(可變輕鏈)和VH(可變重鏈)的序列。CDR區域的序列用粗體和下劃線表示。氨基酸殘基和核苷酸順次進行編號，同樣的編號系統用于人源化的V序列。輕鏈可變區顯示在圖2A中，重鏈可變區顯示在圖2B中。編號系統與用于圖1的是一樣的。用于構建cA20的限制位點用下劃線表示。
圖3顯示了嵌合型A20(cA20)和鼠類A20(A20)在對于125I標記的A20的細胞表面競爭性結合測定中結合親和力的比較。cA20的濃度增加以與鼠類A20(用實心的菱形來描繪)相當的方式阻斷了放射性標記的A20(用實心的圓來描繪)與Raji細胞的結合。
圖4比較了人抗體與嵌合型和人源化抗CD20抗體的可變重鏈(VH)和可變輕鏈(Vk)的氨基酸序列。圖4A比較了人抗體EU和NEWM(只是FR4)、嵌合型抗體(cA20VH)與兩個人源化抗體(hA20VH1和hA20VH2)的可變重鏈(VH)的氨基酸序列；圖4B比較了人抗體(REIVk)、嵌合型抗體(cA20Vk)與人源化抗體(hA20Vk)的可變輕鏈(Vk)的氨基酸序列。點表示A20中的殘基與人抗體中的相應殘基是一樣的。CDR標示為加框的區域。Kabat編號方案用于將氨基酸殘基進行編號。
圖5分別公開了hA20輕鏈V基因(hA20Vk)的核苷酸序列(圖5A)，和重鏈V基因hA20VH1(圖5B)與hA20VH2(圖5C)的核苷酸序列，以及VKpBR2(圖5A)和VHpBS2(圖5B和5C)分階段載體的鄰近側翼序列。非翻譯核苷酸序列以小寫字母顯示。用于亞克隆的限制位點加上下劃線而指明。分泌信號肽序列用雙下劃線來指明。Vk和VH氨基酸殘基的編號與圖2中的一樣。
圖6顯示了細胞表面競爭性結合測定的結果，該測定是為了比較兩種人源化A20抗體(hA20-1和hA20-2)與A20、cA20和嵌合型抗CD20MAb(c2B8)的結合活性。圖6A顯示了hA20-1(實心的三角形)與hA20-2(實心的圓形)和鼠類抗CD20抗體A20(實心的正方形)同樣良好地競爭125I-A20與Raji細胞的結合。圖6B顯示了hA20-1(實心的圓形)、cA20(實心的正方形)和c2B8(實心的菱形)同樣良好地競爭125I-c2B8與Raji細胞的結合。
圖7公開了人IgG1的恒定區(CH-鉸鏈)(圖7A)和人κ鏈的恒定區(Ck)(圖7B)。
圖8為競爭性細胞表面結合測定。通過與鼠類2B8和rituximab(IDEC制藥公司，San Diego，CA)所進行的細胞表面競爭性結合測定來評價人源化抗CD20 Ab(cA20、hA20和c1F5，通過A蛋白柱上的親和層析而純化)的Ag結合特異性和親和性研究。圖8(A)為cA20(正方形)、hA20-2(三角形)和hA20-1(圓形)與m2B8(菱形)的結合活性的比較；圖8(B)比較了cA20(正方形)、c1F5(三角形)和rituximab(菱形)的結合活性。
圖9為通過細胞表面競爭性結合檢測來比較hA20與其他抗CD20Ab(包括rituximab和鼠類B1)的結合活性的研究。在存在濃度變化(0.2-700nM)的競爭Ab、hA20(三角形)、mB1(倒三角形)或rituximab(正方形)的情況下，將恒定數量(100,000cpm，約10 ìCi/ìg)的125I標記的rituximab與Raji細胞于4℃溫育1-2小時。
圖10描繪了交聯的hA20和其他CD20 Ab對于培養的淋巴瘤細胞的細胞毒性效應。通過(A)錐蟲藍染色和細胞計數或者(B)MTT測定來測量總細胞和存活細胞群體。
圖11為使用多種抗CD20和其他Ab的體內治療研究的圖。將Raji細胞以靜脈內注射方式給予SCID小鼠，從而形成播散性疾病的Raji淋巴瘤模型。
圖12為描繪了使用hA20和hLL2的體內治療的圖。將Raji細胞以靜脈內注射方式給予SCID小鼠，從而形成播散性疾病的Raji淋巴瘤模型。
發明詳述1.總述正如上面所討論的，未綴合或用治療性放射性核素標記的抗CD20抗體不能在具有中間或侵染性形式的B-細胞淋巴瘤的患者中提供高比率的客觀和持續的反應。本發明提供了用于治療哺乳動物受試者(人和家養動物)的人源化、嵌合型和人抗CD20抗體及其抗體融合蛋白，它們作為綴合物單獨施用，或者與其他治療試劑(包括其他裸露的抗體和抗體治療綴合物)聯合施用。
本發明的抗CD20 MAb含有特異性鼠類CDR或者來自多于一種鼠的鼠類CDR組合，或者含有對于CD20抗原具有特異性的嵌合型抗CD20MAb。本發明的抗CD20 MAb是人源化、嵌合型或人MAb，它們具有鼠類抗CD20 MAb的CDR的氨基酸，并基本上保持了鼠類抗CD20 MAb對B-細胞和B-細胞淋巴瘤以及白血病細胞的定向。抗CD20 MAb的輕鏈可變區的CDR具有含有氨基酸RASSSVSYIH、RASSSLSFMH或RASSSVSYMH的CDR1，含有氨基酸ATSNLAS的CDR2，和含有氨基酸QQWTSNPPT、HQWSSNPLT或QQSFSNPPT的CDR3；抗CD20 MAb的重鏈可變區的CDR具有含有氨基酸SYNMH的CDR1，含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG的CDR2，和含有氨基酸STYYGGDWYFDV、STYYGGDWYFNV、SHYGSNYVDYFDV或VVYYSNSYWYFDV的CDR3。
在一個實施方案中，人源化和嵌合型MAb或其片段不具有含有STYYGGDWYFNV的重鏈可變區的CDR3。更優選地，當輕鏈可變區的CDR3含有HQWSSNPLT并且重鏈可變區的CDR3含有SHYGSNYVDYFDV時，輕鏈可變區的CDR1不含有RASSSLSFMH。在另一個實施方案中，當輕鏈可變區的CDR1含有RASSSLSFMH時并且當重鏈可變區的CDR3含有SHYGSNYVDYFDV時，輕鏈可變區的CDR3不含有HQWSSNPLT。在另外的一個實施方案中，當輕鏈可變區的CDR1含有RASSSLSFMH并且輕鏈可變區的CDR3含有HQWSSNPLT時，重鏈可變區的CDR3不含有SHYGSNYVDYFDV。在另一個實施方案中，當輕鏈可變區的CDR3含有QQSFSNPPT并且重鏈可變區的CDR3含有VVYYSNSYWYFDV時，輕鏈可變區的CDR1不含有RASSSVSYMH。
此外，在另一個實施方案中，當輕鏈可變區的CDR1含有RASSSVSYMH并且重鏈可變區的CDR3含有VVYYSNSYWYFDV時，抗CD20單克隆抗體(MAb)或其片段不含有氨基酸為QQSFSNPPT的輕鏈可變區的CDR3。另外，當輕鏈可變區的CDR1含有RASSSVSYMH并且輕鏈可變區的CDR3含有QQSFSNPPT時，抗CD20 MAb不含有氨基酸為VVYYSNSYWYFDV的重鏈可變區的CDR3。
在一個優選的實施方案中，人源化抗CD20(hCD20)單克隆抗體或其抗原結合片段含有至少一種鼠類抗CD20 MAb可變區的互補決定區(CDR)和至少一種人MAb可變區的構架區(FR)，其中該人源化抗CD20 MAb或其片段基本上保持了該鼠類抗CD20 MAb對B-細胞和B-細胞淋巴瘤以及白血病細胞的定向。人源化抗體的可變區可以含有輕鏈可變區、重鏈可變區或者輕鏈和重鏈可變區。人源化抗體或其片段可以進一步含有至少一種人抗體的輕鏈和重鏈恒定區。
本發明的人源化抗CD20 MAb或其片段含有鼠類抗CD20 MAb的CDR和人抗體輕鏈和重鏈可變區的構架區(FR)，同時基本上保持了親代鼠類抗CD20 MAb對B-細胞和B-細胞淋巴瘤以及白血病細胞的定向，其中鼠類抗CD20 MAb的輕鏈可變區的CDR具有含有氨基酸RASSSVSYIH的CDR1，含有氨基酸ATSNLAS的CDR2，和含有氨基酸QQWTSNPPT的CDR3；鼠類抗CD20MAb的重鏈可變區的CDR具有含有氨基酸SYNMH的CDR1，含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG的CDR2，和含有氨基酸STYYGGDWYFDV的CDR3。但是，人源化抗CD20 MAb或其片段可以在抗體輕鏈和重鏈可變區的FR中進一步含有至少一種來自鼠類MAb的相應FR的氨基酸。人源化MAb可以進一步含有人抗體的輕鏈和重鏈恒定區。特別地，人源化抗CD20 MAb或其片段含有選自圖4A中標示為hA20VH1或hA20VH2的鼠類重鏈可變區的1、5、27、30、38、48、67、68、70、95、155和116位氨基酸殘基的至少一個氨基酸殘基，和含有選自圖4B中標示為hA20Vk的鼠類輕鏈可變區的4、21、35、38、45、46、59、99、104和106位氨基酸殘基的至少一個氨基酸殘基。如果需要保持與CD20抗原的適當結合或者增強與CD20抗原的結合，可以在輕鏈和重鏈可變鏈的人FR區域中保留一個或多個鼠類氨基酸序列。更優選地，本發明的人源化抗CD20 MAb或其片段含有圖4B的hA20Vk和圖4A的hA20VH1。最優選地，本發明的人源化抗CD20 MAb或其片段含有圖4B的hA20Vk和圖4A的hA20VH2。該后者序列在VH2鏈的FR內比VH1含有更多的人氨基酸序列，因此是更加人源化的。
本發明的優選的嵌合型抗CD20(cCD20) MAb或其片段含有鼠類抗CD20 MAb的CDR和鼠類抗CD20 MAb的輕鏈和重鏈可變區的FR區域(即親代鼠類MAb的Fv)，還含有人抗體的輕鏈和重鏈恒定區，其中嵌合型抗CD20 MAb或其片段基本上保持了鼠類抗CD20 MAb對B-細胞和B-細胞淋巴瘤以及白血病細胞的定向，其中嵌合型抗CD20 MAb的輕鏈可變區的CDR具有含有氨基酸RASSSVSYIH、RASSSLSFMH或RASSSVSYMH的CDR1，含有氨基酸ATSNLAS的CDR2，和含有氨基酸QQWTSNPPT、HQWSSNPLT或QQSFSNPPT的CDR3；嵌合型抗CD20 MAb的重鏈可變區的CDR具有含有氨基酸SYNMH的CDR1，含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG的CDR2，和含有氨基酸STYYGGDWYFDV、STYYGGDWYFNV、SHYGSNYVDYFDV或VVYYSNSYWYFDV的CDR3，前提是，(a)其中當輕鏈可變區的CDR1含有氨基酸RASSSVSYIH，輕鏈可變區的CDR2含有氨基酸ATSNLAS，輕鏈可變區的CDR3含有氨基酸QQWTSNPPT，重鏈可變區的CDR1含有氨基酸SYNMH，并且重鏈可變區的CDR2含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG時，重鏈可變區的CDR3不含有STYYGGDWYFNV；(b)其中當輕鏈可變區的CDR1含有氨基酸RASSSLSFMH，輕鏈可變區的CDR2含有氨基酸ATSNLAS，輕鏈可變區的CDR3含有氨基酸HQWSSNPLT，重鏈可變區的CDR1含有氨基酸SYNMH，并且重鏈可變區的CDR2含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG時，重鏈可變區的CDR3不含有SHYGSNYVDYFDV；和(c)其中當輕鏈可變區的CDR1含有氨基酸RASSSVSYMH，輕鏈可變區的CDR2含有氨基酸ATSNLAS，輕鏈可變區的CDR3含有氨基酸QQSFSNPPT，重鏈可變區的CDR1含有氨基酸SYNMH，并且重鏈可變區的CDR2含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG時，重鏈可變區的CDR3不含有VVYYSNSYWYFDV。
更優選地，嵌合型抗CD20 MAb或其片段含有鼠類抗CD20 MAb的互補決定區(CDR)和鼠類抗CD20 MAb的輕鏈和重鏈可變區的構架區(FR)，還含有人抗體的輕鏈和重鏈恒定區，其中嵌合型抗CD20 MAb或其片段基本上保持了鼠類抗CD20 MAb對B-細胞和B-細胞淋巴瘤以及白血病細胞的定向，其中嵌合型抗CD20 MAb的輕鏈可變區的CDR具有分別顯示在圖4B和4A中并標示為cA20Vk和cA20VH的CDR。最優選地，嵌合型抗CD20 MAb或其片段含有分別顯示在圖4B和4A中并標示為cA20Vk和cA20VH的鼠類抗CD20 MAb的輕鏈和重鏈可變區。
本發明也包括人抗CD20 MAb或其片段，它們含有人抗體的輕鏈和重鏈可變區與恒定區，其中該人CD20 MAb基本上保持了鼠類抗CD20MAb對B-細胞和B-細胞淋巴瘤以及白血病細胞的定向和細胞結合特性，其中人抗CD20 MAb的輕鏈可變區的CDR具有與上面對于嵌合型和人源化抗CD20 MAb所提及的同樣的CDR，其顯示在圖4A和4B中。
本發明也想要包括抗體融合蛋白或其片段，它們含有至少兩個上述的抗CD20 MAb或其片段。本發明的抗體融合蛋白或其片段也想要包括這樣的抗體融合蛋白或其片段，即它們含有至少一種第一種上述的抗CD20 MAb或其片段，和含有至少一種除了上述的抗CD20 MAb或其片段之外的第二種MAb或其片段。更優選地，該第二種MAb為與CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產物或其組合反應的MAb，甚至是不同于此處描述的抗CD20 MAb的抗CD20 MAb。本發明的抗體融合蛋白可以由一個CD20 MAb和一個或多個用于提供對于不同抗原的特異性的第二種MAb所組成，它們在下面將進行更詳細的描述。
人源化、嵌合型和人抗CD20抗體可以具有增強的與表位結合的親和性以及抗腫瘤和抗B-細胞活性，這是CDR突變和對于CDR與可變區中的其他序列進行操作的結果，從而獲得優良的治療試劑以用于治療B-細胞紊亂，包括B-細胞淋巴瘤和白血病以及自身免疫病。對于抗體的結合特異性和親和性或親和力所進行的修飾是已知的，并在WO98/44001中進行了描述，這種修飾稱之為親和力成熟，該申請概括了修飾的方法，在此處以其整體進行引用作為參考。
也可希望修飾本發明的抗體以改善效應物功能，例如以致增強拮抗物的依賴抗原的細胞介導細胞毒性(ADCC)和/或依賴補體的細胞毒性(CDC)。在Fc區域中可以取代一個或多個氨基酸或者引入半胱氨酸，由此改善內化能力和/或增加的補體介導的細胞殺傷能力和ADCC。見Caron等人，J.Ex.Med.1761191-1195(1991)和Shopes，B.J.Immunol.1482918-2022(1992)，在此處以其整體進行引用作為參考。可以制備這樣的抗體融合蛋白，即其含有具有增強的補體裂解和ADCC能力的雙重Fc區域。
本發明也涉及含有編碼選自下組的MAb或其片段的核酸的DNA序列(a)此處描述的抗CD20 MAb或其片段，(b)含有至少兩種抗CD20 MAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段，
(c)含有至少一種含有此處描述的抗CD20 MAb或其片段的第一種MAb或其片段和至少一種除了抗CD20 MAb或其片段之外的第二種MAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段，和(d)含有至少一種含有抗CD20 MAb或其片段的第一種MAb或其片段和至少一種第二種MAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段，其中第二種MAb為與CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產物或其組合反應的MAb。
本發明也包括含有DNA序列的表達載體。在載體用于制備人源化、嵌合型和人抗CD20 MAb或者其抗體融合蛋白或其片段的情況下，這些載體含有人免疫球蛋白輕鏈和重鏈恒定區以及鉸鏈區。在需要的時候，這些載體另外含有用于在選定的宿主細胞中表達MAb的啟動子以及免疫球蛋白增強和信號或引導序列。在本發明中特別有用的載體為pdHL2或GS，特別是當用于表達嵌合型、人源化或人抗體如gig時，載體在此編碼IgG1的重鏈和輕鏈恒定區以及鉸鏈區。更優選地，輕鏈和重鏈恒定區以及鉸鏈區來自人EU骨髓瘤免疫球蛋白，在此任選將至少一個同種異型位置上的氨基酸改變為在不同的IgG1同種異型中發現的氨基酸，其中可以任選將基于EU編號系統的EU重鏈的253位氨基酸用丙氨酸進行取代。見Edelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA6378-85(1969)，此處以其整體進行引用作為參考。
本發明包括含有編碼本發明的抗CD20 MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的DNA序列的宿主細胞，或者含有具有這些DNA序列的載體的宿主細胞。特別有用的宿主細胞為哺乳動物細胞，更特殊的是淋巴細胞，例如骨髓瘤細胞，這將在下面進行更詳細的討論。
本發明也包括具有下列步驟的表達抗CD20 MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的方法(a)用編碼抗CD20 MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的DNA序列轉染哺乳動物細胞，和(b)培養用DNA序列轉染從而能夠分泌抗CD20 MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的細胞。可以使用在載體上具有選擇標記的已知方法，從而能夠容易地選擇出表達MAb和標記的宿主細胞。
本發明特別地包括定向于B淋巴瘤細胞與白血病細胞的診斷或治療綴合物，其具有含有本發明的與B淋巴瘤細胞和白血病細胞結合的抗CD20 MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的抗體組分，該抗體組分與至少一種診斷或至少一種治療試劑結合。
診斷綴合物具有含有抗CD20 MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的抗體組分，其中診斷試劑含有至少一種光活診斷試劑，更優選地其中標記為具有60-4,000keV的能量的放射性標記或者非放射性標記。放射性標記優選地為發射γ射線、β射線和正電子的同位素，其選自125I、131I、123I、124I、86Y、186Re、188Re、62Cu、64Cu、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、18F、11C、13N、15O、76Br及其組合。
本發明的診斷綴合物也使用診斷試劑，例如造影劑如錳、鐵或釓。
本發明的治療綴合物具有含有抗體融合蛋白或其片段的抗體組分，其中每個該MAb或其片段與至少一種治療試劑結合。治療綴合物的治療試劑優選地選自放射性標記、免疫調節劑、激素、光活治療試劑、可以為藥物或毒素的細胞毒性試劑及其組合。在本發明中使用的藥物為那些具有選自下組的藥物特性的藥物抗有絲分裂、抗激酶、烷基化、抗代謝、抗生素、生物堿、抗血管生成、細胞凋亡試劑及其組合。更特別地，這些藥物選自氮芥、氮丙啶衍生物、烷基磺酸酯、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、COX-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗生素、酶、表鬼臼毒素、鉑配位復合物、長春花生物堿、取代的脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質抑制劑、拮抗劑、內他丁(endostatin)、紫杉醇、喜樹堿、蒽環類、紫杉烷和它們的類似物以及其組合。本發明包括的毒素選自蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)如onconase、DNA酶I、葡萄球菌(Staphylococcal)腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素、假單胞菌(Pseudomonas)外毒素和假單胞菌內毒素。
本發明的有用的治療試劑為選自下組的免疫調節劑細胞因子、干細胞生長因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、紅細胞生成素、血小板生成素及其組合。特別有用的為淋巴毒素如腫瘤壞死因子(TNF)、造血因子如白細胞介素(IL)、集落刺激因子如粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素如干擾素-α、-β或-γ和干細胞生長因子如稱為“S1因子”的干細胞生長因子。更特別地，免疫調節劑如IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素-γ、TNF-α或其組合在本發明中是可用的。
特別有用的治療綴合物含有一種或多種具有60-700keV的能量的放射性標記。這種放射性標記選自225Ac、67Ga、90Y、111In、131I、125I、186Re、188Re、177Lu、32P、64Cu、67Cu、212Bi、213Bi、211At及其組合。
其他有用的治療綴合物為光活治療試劑，如發色團或染料。
其他有用的治療綴合物含有寡核苷酸，特別是反義寡核苷酸，其優選地導向B-細胞惡性腫瘤的癌基因和癌基因產物如bc1-2。
本發明特別地包括在受試者中治療B-細胞淋巴瘤或白血病細胞疾病或者自身免疫病的方法，例如哺乳動物，包括人、家養或伴侶寵物如狗和貓，該方法包括將治療有效量的本發明的抗CD20 MAb或其片段施用于受試者，該抗CD20 MAb或其片段配制在可藥用的載體之中。該治療使用沒有結合治療試劑的“裸露的抗體”。“裸露的抗CD20抗體”的施用可以通過同時或順次將治療有效量的另一種“裸露的抗體”施用于受試者來補充，另一種“裸露的抗體”可與靶細胞表面上的另一種抗原結合或反應，或者具有其他功能如MAb的Fc部分中的效應物功能，這種功能是治療性的，這些在此處進行了討論。優選的附加MAb為至少一種選自下組MAb的人源化、嵌合型、人或鼠類(在非人動物的情況下)MAb與CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產物或其組合反應的MAb，并將其配制在可藥用的載體之中。
單獨用裸露的抗CD20或者聯合上面討論的其他裸露的MAb進行治療可以進一步地通過同時或順次施用治療有效量的至少一種治療試劑來補充，它們配制在可藥用的載體之中。正如此處所討論的，治療試劑可以包括細胞毒性試劑、放射性標記、免疫調節劑、激素、酶、寡核苷酸、光活治療試劑或其組合，它們配制在可藥用的載體之中。
在另一種治療方法中，單獨用裸露的抗CD20或者聯合上面討論的其他裸露的MAb進行治療可以進一步地通過同時或順次施用治療有效量的至少一種治療綴合物來補充，它們在此處進行了描述并配制在可藥用的載體之中。治療綴合物的抗體組分含有至少一種選自下組MAb的人源化、嵌合型、人或鼠類(對于非人的受試者)MAb與CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產物或其組合反應的MAb，并將其配制在可藥用的載體之中。正如此處所討論的，治療試劑可以包括細胞毒性試劑、放射性標記、免疫調節劑、激素、光活治療試劑或其組合，它們配制在可藥用的載體之中。
正如此處所描述的，本發明特別地包括在受試者中治療B-細胞淋巴瘤或白血病或者自身免疫病的方法，該方法包括將治療有效量的抗體融合蛋白或其片段施用于受試者，該抗體融合蛋白或其片段含有至少兩個本發明的抗CD20 MAb或其片段，或者含有至少一種本發明的抗CD20 MAb或其片段和至少一種附加的MAb，附加的MAb優選地選自與CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產物或其組合反應的MAb，它們配制在可藥用的載體之中。
該治療方法可以進一步通過同時或順次將治療有效量的至少一種配制于可藥用的載體之中的治療試劑施用于受試者來補充，其中治療試劑優選地為細胞毒性試劑、放射性標記、免疫調節劑、激素、光活治療試劑或其組合，它們配制在可藥用的載體之中。
此外，抗體融合蛋白可以治療有效量的治療綴合物的形式同時或順次施用于受試者，治療綴合物含有至少一種與至少一種治療試劑結合的MAb，其中綴合物的該MAb組分優選地含有至少一種選自下組MAb的人源化、嵌合型、人或鼠類(對于非人的受試者)MAb與CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產物或其組合反應的MAb，它們配制在可藥用的載體之中。抗體融合蛋白本身可以與治療試劑綴合，從而提供了一種載體來將多于一個的治療試劑與抗體組分相連，這些治療試劑可以為不同的所述試劑的聯合或者同樣試劑的聯合，例如兩個不同的治療放射性標記。本發明也包括在受試者中診斷B-細胞淋巴瘤或白血病的方法，該方法包括將含有本發明的與淋巴瘤或白血病細胞結合的抗CD20 MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的診斷綴合物施用于受試者的方法，例如哺乳動物，包括人以及家養和伴侶寵物如狗、貓、兔、豚鼠，其中抗CD20 MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段與至少一種診斷試劑結合，它們配制在可藥用的載體之中。此處描述了有用的診斷試劑。
2.定義在下面的描述中，使用了許多術語和提供了下面的定義來使得能夠容易理解本發明。
此處所述的抗體是指全長的(即天然存在的或者通過正常免疫球蛋白基因片段重組過程形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗體)或者免疫球蛋白分子的具有免疫活性(即特異性結合)的部分如抗體片段。
抗體片段是抗體的一部分，例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、scFv等等。不管結構，抗體片段與被完整抗體所識別的同樣的抗原結合。例如，抗CD20單克隆抗體片段與CD20的表位結合。術語“抗體片段”也包括任何合成的或經遺傳工程改造的蛋白質，它們像抗體一樣通過與特異性抗原結合從而形成復合物來起作用。例如，抗體片段包括分離得到的由可變區組成的片段，如由重鏈和輕鏈可變區組成的“Fv”片段；重組單鏈多肽分子，其中輕鏈和重鏈可變區由肽連接體相連(“scFv蛋白”)；和由模擬高變區的氨基酸殘基所組成的最小識別單位。
裸露的抗體一般是未與治療試劑綴合的完整抗體。之所以如此，是因為抗體分子的Fc部分提供了效應物功能如補體結合和ADCC(依賴抗體的細胞毒性)，其將機制轉化為可能導致細胞裂解的作用。可是，Fc部分可能對于具有其他機制的治療功能是不需要的，例如正在起作用的凋亡。裸露的抗體包括多克隆和單克隆抗體以及某些重組抗體，例如嵌合型、人源化或人抗體。
嵌合型抗體是含有包括來自一個物種的抗體互補決定區(CDR)在內的可變區的重組蛋白質，該抗體優選為嚙齒動物抗體，而抗體分子的恒定區來自人抗體的恒定區。對于獸醫應用，嵌合型抗體的恒定區可以來自其他物種，例如貓或狗。
人源化抗體是重組蛋白質，其中將來自一個物種的抗體如嚙齒動物抗體的CDR從嚙齒動物抗體的重鏈和輕鏈可變區轉移至人重鏈和輕鏈可變區中。抗體分子的恒定區來自人抗體的恒定區。
人抗體是從轉基因小鼠中獲得的抗體，這種小鼠已經“經過工程改造”而可產生對于抗原激發進行反應的特異性人抗體。在該技術中，將人重鏈和輕鏈基因座的元件導入來自這樣的胚胎干細胞系的小鼠品系中，即該胚胎干細胞系具有內源重鏈和輕鏈基因座的定向破裂。轉基因小鼠能夠合成對于人抗原特異的人抗體，這些小鼠可以用于產生分泌人抗體的雜交瘤。用于從轉基因小鼠中獲得人抗體的方法由下列學者進行了描述，Green等人，Nature Genet.713(1994)；Lonberg等人，Nature 368856(1994)；和Taylor等人，Int.Immun.6579(1994)。完整的人抗體也可以通過遺傳或染色體轉染方法以及噬菌體展示技術來構建，這些技術在本領域中是已知的。見例如，McCafferty等人，Nature 348552-553(1990)描述了在體外從來自來免疫的供體的免疫球蛋白可變區基因庫中生產人抗體和其片段。在該技術中，將抗體可變區基因按閱讀框架克隆進絲狀噬菌體的主要或次要的外殼蛋白基因，并在噬菌體顆粒表面上作為功能性抗體片段進行展示。因為絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基于抗體功能特性的選擇也導致對于編碼顯示出那些特性的抗體的基因進行選擇。以這種方式，噬菌體模擬了一些B-細胞的特性。噬菌體展示可以多種形式來實施，對于其概況，見例如Johnson和Chiswell，CurrentOpinion in Structural Biology 35564-571(1993)。
人抗體也可以由體外活化的B-細胞來產生。見U.S.專利號5,567,610和5,229,275，在此以其整體進行引用作為參考。
治療試劑是與抗體部分分別、同時或順次施用或者與抗體部分綴合而進行施用的分子或原子，抗體部分即為抗體或抗體片段或亞片段，這些試劑在疾病的治療中是有用的。治療試劑的例子包括抗體、抗體片段、藥物、毒素、核酸酶、激素、免疫調節劑、螯合劑、硼化合物、光活試劑或染料和放射性同位素。
診斷試劑是與抗體部分綴合而進行施用的分子或原子，抗體部分即為抗體或抗體片段或亞片段，這些試劑在通過定位含有抗原的細胞來診斷疾病中是有用的。有用的診斷試劑包括放射性同位素、染料(例如具有生物素-鏈霉抗體生物素蛋白復合物)、造影劑、熒光化合物或分子和用于磁共振成像(MRI)的增強劑(例如順磁性離子)，但并不局限于此。U.S.專利號6,331,175描述了MRI技術和與MRI增強劑綴合的抗體的制備，在此將其以整體進行引用作為參考。優選地，診斷試劑選自放射性同位素、用于磁共振成像的增強劑和熒光化合物。為了向抗體組分加載放射性金屬或順磁性離子，可能需要將抗體與具有長尾的試劑進行反應，在長尾上附加了多個用于結合離子的螯合基團。這樣的尾可以是聚合物，例如聚賴氨酸、多糖或者其他具有側鏈的衍生或可衍生的鏈，在這些側鏈上可以結合螯合基團如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、雙硫縮氨基脲、聚肟等等已知用于該目的的基團。螯合物通過用標準的化學方法與肽抗原偶聯。螯合物通常通過能夠以最小的免疫反應性損失和最小的聚合和/或內部交聯與分子形成鍵的基團而與抗體相連。其他更不常見的用于將螯合物與抗體綴合的方法和試劑公開于Hawthorne的U.S.專利4,824,659中，題目為“抗體綴合物”，其于1989年4月25日出版，此處以其整體引用了該公開內容作為參考。特別有用的金屬-螯合劑組合包括與位于60-4,000kev的通常能量范圍內的診斷同位素一起使用的2-芐基-DTPA和其單甲基與環己基類似物，這些同位素例如為125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、11C、13N、15O、76Br以用于放射性成像。當與本發明的抗體一起使用時，與非放射性金屬如錳、鐵和釓復合的同樣的螯合物可用于MRI。大環螯合物如NOTA、DOTA和TETA可使用多種金屬和放射性金屬，最特別地分別使用鎵、釔和銅的放射性核素。這種金屬-螯合劑復合物可以通過將環大小適合目標金屬的大小而非常穩定地形成。本發明也包括其他環型螯合物如大環聚醚，其對于穩定地結合核素如223Ra與RAIT具有重要的影響。
免疫綴合物是抗體組分和治療或診斷試劑的綴合物。診斷試劑可以含有放射性或非放射性標記、造影劑(例如用于磁共振成像、計算斷層X射線照相法或者超聲波)，放射性標記可以為發射γ射線、β射線、α射線、俄歇電子或正電子的同位素。
表達載體是含有在宿主細胞中表達的基因的DNA分子。通常地，將基因表達置于某些調節元件的控制之下，包括組成型或誘導型啟動子、組織特異性調節元件和增強子。稱這樣的基因“可操作地”與調節元件相連。
重組宿主可以為任何含有克隆載體或表達載體的原核或真核細胞。該術語也包括那些這樣的原核或真核細胞以及轉基因動物，即它們經過遺傳工程改造而在宿主細胞的染色體或基因組或者宿主細胞的細胞中含有克隆基因。合適的哺乳動物宿主細胞包括骨髓瘤細胞如SP2/0細胞和NS0細胞，以及中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、雜交瘤細胞系和其他用于表達抗體的哺乳動物宿主細胞。也是特別有用于表達MAb和其他融合蛋白的細胞為WO 0063403 A2中所公開的人細胞系PER.C6，其與常規的哺乳動物細胞系如CHO、COS、Vero、Hela、BHK和SP2-細胞系相比可產生2-200倍更多的重組蛋白。具有經修飾的免疫系統的特殊轉基因動物對于產生完整的人抗體是特別有用的。
在此處使用時，術語抗體融合蛋白是重組產生的抗原結合分子，在其中連接具有相同或不同特異性的兩個或更多個相同或不同的單鏈抗體或者抗體片段。融合蛋白的價表明融合蛋白具有多少個與單個抗原或表位結合的臂或位點；即單價的、二價的、三價的或多價的。抗體融合蛋白的多價表示其能夠利用多重相互作用與抗原結合，因此增強與抗原結合的親和力。特異性表明抗體融合蛋白能夠結合多少種抗原或表位；即單特異性的、雙特異性的、三特異性的、多特異性的。使用這些定義，天然抗體如IgG是二價的，因為其具有兩個結合臂，但是其是單特異性的，因為其結合一種表位。單特異性、多價融合蛋白對于一個表位具有多于一個的結合位點，但是只結合一種表位，例如雙抗體具有兩個與同樣抗原反應的結合位點。融合蛋白可以含有單個抗體組分、不同抗體組分的多價或多特異性組合或者同樣抗體組分的多重拷貝。融合蛋白可以附加地含有抗體或抗體片段和治療試劑。適合于這種融合蛋白的治療試劑的例子包括免疫調節劑(“抗體-免疫調節劑融合蛋白”)和毒素(“抗體-毒素融合蛋白”)。優選的毒素包括核糖核酸酶(RNA酶)，優選為重組RNA酶。
多特異性抗體是這樣的抗體，即其能夠同時結合至少兩個具有不同結構的目標，例如兩個不同的抗原、同一抗原上的兩個不同的表位或者半抗原和/或抗原或表位。一種特異性可以是對于B-細胞、T-細胞、骨髓細胞、漿細胞和肥大細胞抗原或表位。另一種特異性可以是對于同一細胞類型上的不同抗原，例如B-細胞上的CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、MUC1和CD22。多特異性、多價抗體為具有多于一個結合位點的結構物，這些結合位點具有不同的特異性。例如雙抗體，在其中一個結合位點與一個抗原反應，另一個結合位點與其他抗原反應。
雙特異性抗體是能夠同時結合兩個具有不同結構的目標的抗體。雙特異性抗體(bsAb)和雙特異性抗體片段(bsFab)具有至少一個特異地與例如B-細胞、T-細胞、骨髓細胞、漿細胞和肥大細胞抗原或表位結合的臂，和至少一個特異地與具有治療或診斷試劑的可定向綴合物結合的其他臂。多種雙特異性融合蛋白可以通過分子工程來產生。在一種形式中，雙特異性融合蛋白是單價的，其由例如具有對于一個抗原的單個結合位點的scFv與具有對于第二種抗原的單個結合位點的Fab片段組成。在另一種形式中，雙特異性融合蛋白是二價的，其由例如具有對于一個抗原的結合位點的IgG與具有對于第二種抗原的兩個結合位點的兩個scFv組成。
狗源化或貓源化抗體為這樣的重組蛋白，即在其中將單克隆抗體的嚙齒動物(或其他物種)互補決定區從嚙齒動物(或其他物種)免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區中分別轉移至狗或貓的免疫球蛋白可變區中。
家養動物包括大型動物如馬、牛、綿羊、山羊、駱駝、羊駝和豬以及伴侶動物。在優選的實施方案中，家養動物是馬。
伴侶動物包括作為寵物飼養的動物。這些動物主要是狗和貓，雖然正如類人的靈長類動物如猴包括在內一樣，小型動物如豚鼠、倉鼠、大鼠和雪貂也包括在內，。在優選的實施方案中，伴侶動物為狗或貓。
3.包括嵌合型、人源化和人抗體的單克隆抗體的制備單克隆抗體(MAb)對于特殊抗原的同型類群的抗體，這種抗體只含有一種類型的抗原結合位點和只結合抗原決定簇上的一個表位。對于特異的抗原的嚙齒動物單克隆抗體可以通過本領域熟練技術人員已知的方法來獲得。見例如，Kohler和Milstein，Nature 256495(1975)，和Coligan等人(編者)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，VOL.1，2.5.1-2.6.7頁(John Wiley & Sons 1991)[在下文中稱為“Coligan”]。簡要地，單克隆抗體可以通過下列步驟來獲得，即給小鼠注射含有抗原的組合物，通過取得血清樣品來證實抗體產生的存在，摘除脾以獲得B-淋巴細胞，將B-淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以產生雜交瘤，克隆雜交瘤，選擇出產生抗抗原的抗體的陽性克隆，培養產生抗抗原的抗體的克隆，和從雜交瘤培養物中分離得到抗體。
MAb可以用多種完全確立的技術從雜交瘤培養物中分離和純化出來。這種分離技術包括使用A蛋白瓊脂糖凝膠的親和層析、大小排阻層析和離子交換層析。見例如，Coligan在2.7.1-2.7.12頁和2.9.1-2.9.3頁所述。也可見Baines等人，免疫球蛋白G的純化(Purification of Immunoglobulin G (IgG))，METHODS INMOLECULAR BIOLOGY，VOL.10，79-104頁(Humana出版社，1992)。
在起始形成對于免疫原的抗體之后，抗體可以進行測序并隨后用重組技術來制備。鼠類抗體和抗體片段的人源化和嵌合化對于本領域中的熟練技術人員來說是熟知的。例如，人源化單克隆抗體通過下列步驟來產生，即將小鼠互補決定區從小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區中轉移至人可變區中，然后在鼠類對應物的構架區中用人殘基取代。來自人源化單克隆抗體的組分的使用避免了與鼠類恒定區的免疫原性相聯系的潛在問題。
已描述了用于克隆鼠免疫球蛋白樣可變區的一般技術，例如Orlandi等人，Proc.Nat’1 Acad.Sci.USA 863833(1989)的發表，此處以其整體進行引用作為參考。用于構建嵌合型抗體的技術對于本領域中的熟練技術人員是熟知的。作為一個例子，Leung等人，Hybridoma 13469(1994)描述了它們是如何通過下列方法產生LL2嵌合體的，即將編碼LL2單克隆抗體(抗CD22抗體)的Vκ和VH區域的DNA序列分別與人κ和IgG1恒定區區域結合在一起。該文獻也提供了分別標示為Vκ和VH的LL2輕鏈和重鏈可變區的核苷酸序列。已描述了產生人源化MAb的技術，例如Jone等人，Nature 321522(1986)；Riechmann等人，Nature 332323(1988)；Verhoeyen等人，Science2391534(1988)；Carter等人，Proc.Nat’1 Acad.Sci.USA 894285(1992)；Sandhu等人，Crit.Rev.Biotech.12437(1992)；和Singer等人，J.Immun.1502844(1993)，在此處引用了其中的每一個文獻作為參考。
嵌合型抗體是這樣的重組蛋白，即其含有包括來自一種動物如嚙齒動物抗體的CDR的可變區，而抗體分子的其余部分即恒定區來自人抗體。因此，嵌合型單克隆抗體也可以通過用一個或多個不同的人FR取代嵌合型MAb的可變區中的鼠類FR序列來進行人源化。特別地，將小鼠CDR從小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區中轉移至人抗體的相應可變區。因為簡單地將小鼠CDR轉移至人FR中常常導致抗體親和性的降低或者甚至是喪失，所以可能需要附加的修飾以恢復鼠類抗體的原始親和性。這能夠伴隨著在FR區域中將一個或多個人殘基用它們的鼠類對應物進行取代，以便獲得對于其表位具有良好的結合親和性的抗體。見例如，Tempest等人，Biotechnology 9266(1991)和Verhoeyen等人，Science 2391534(1988)。此外，人源化、嵌合型和人MAb對于特異表位的親和性可以通過CDR的誘變而得到增加，因此較低劑量的這種抗體可以與較高劑量的誘變之前的較低親和性MAb一樣有效。見例如WO0029584A1。
用于產生本發明的抗體的另一種方法為在轉基因家畜的乳汁中生產。見例如，Colman，A.，Biochem.Soc.Symp.，63141-147，1998；U.S.專利5,827,690，這兩個文獻以其整體進行引用作為參考。制備兩個DNA構建體，其分別含有編碼成對的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的DNA片段。將DNA片段克隆進表達載體中，該表達載體含有優先地在乳腺上皮細胞中表達的啟動子序列。例子包括來自下列基因的啟動子，即兔、奶牛和綿羊酪蛋白基因、奶牛α-乳球蛋白基因、綿羊β-乳球蛋白基因和小鼠乳清酸性蛋白基因，但并不局限于此。優選地，插入片段在其3′一側與來自乳腺特異性基因的同源基因組序列相接。這提供了聚腺苷酸化位點和穩定轉錄的序列。將表達盒共注射進受精的哺乳動物卵細胞的原核中，然后將卵細胞移植入受體雌性的子宮中并進行孕育。在出生之后，通過Southern分析來確定兩個轉基因的存在以對于后代進行篩選。為了產生抗體，重鏈和輕鏈基因必須在同一個細胞中同時表達。用本領域中已知的標準免疫學方法對于來自轉基因雌性動物的乳汁進行分析，以確定抗體或抗體片段的存在和功能性。抗體可以用本領域中已知的標準方法從乳汁中純化出來。
本發明的完整的人抗體，即人抗CD20MAb，或者其他與人源化、嵌合型或人抗CD20抗體進行聯合治療的人抗體，例如抗CD22、抗CD19、抗CD23或抗CD21 MAb，它們可以從轉基因的非人動物中獲得。見例如，Mendez等人，Nature Genetics，15146-156(1997)；U.S.專利號5,633,425，它們以其整體進行引用作為參考。例如，人抗體可以從具有人免疫球蛋白基因座的轉基因小鼠中重新獲得。通過讓內源免疫球蛋白基因失活和導入人免疫球蛋白基因座而將小鼠體液免疫系統人源化。人免疫球蛋白基因座是極其復雜的，其具有大量的不連續片段，這些片段在一起占據了人基因組的大約2％。為了確保轉基因小鼠能夠產生足夠的抗體的所有組成部分，大部分的人重鏈和輕鏈基因座必須導入小鼠基因組中。這在逐步的過程中來完成，該過程的開始是形成酵母人工染色體(YAC)，其在種系構型中含有人重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座。因為每個插入物的大小為大約1Mb，所以YAC的構建需要覆蓋免疫球蛋白基因座的片段的同源重組。將兩個YAC即一個含有重鏈基因座的YAC和一個含有輕鏈基因座的YAC分別導入小鼠中，這是通過將含有YAC的酵母球芽和小鼠胚胎干細胞融合來進行的。然后將胚胎干細胞克隆微注射進小鼠胚泡中。將結果所得的嵌合型雄性根據它們通過其種系傳遞YAC的能力進行篩選，并將它們與在鼠類抗體產生上有缺陷的小鼠進行交配。將兩個轉基因品系進行交配，即一個含有人重鏈基因座的品系和另一個含有人輕鏈基因座的品系，從而形成可產生對于免疫作出反應的人抗體的后代。
更新近的用于產生雙特異性MAb的方法包括經工程改造的重組MAb，其含有附加的半胱氨酸殘基從而它們可比更普通的同型免疫球蛋白交聯得更加牢固。見例如，FitzGerald等人，Protein Eng.10(10)1221-1225，1997。另一個方法為對于重組融合蛋白進行工程改造，該重組融合蛋白連接了兩個或更多個不同的具有所需的雙特異性的單鏈抗體或抗體片段。見例如，Coloma等人，Nature Biotech.15159-163，1997。多種雙特異性融合蛋白可以通過分子工程來產生。在一種形式中，雙特異性融合蛋白是單價的，其例如由具有單個對于一個抗原的結合位點的scFv和具有單個對于第二種抗原的結合位點的Fab片段組成。在另一種形式中，雙特異性融合蛋白是二價的，其例如由具有兩個對于一個抗原的結合位點的IgG和具有兩個對于第二種抗原的結合位點的兩個scFv組成。
連接兩個或更多個不同的單鏈抗體或抗體片段的雙特異性融合蛋白以簡單的方式產生。可以使用重組方法來產生多種融合蛋白。例如可以產生含有源自人源化單克隆抗CD20抗體的Fab片段和源自鼠類抗diDTPA的scFv的融合蛋白。易彎曲的連接體如GGGS將scFv與抗CD20抗體的重鏈恒定區相連接。作為另一種選擇，scFv可以與另一個人源化抗體的輕鏈恒定區相連接。將合適的對于重鏈Fd與scFv的框內連接所必需的連接體序列通過PCR反應導入VL和VK區域中。然后將編碼scFv的DNA片段連接入含有編碼CH1區域的DNA序列的分階段載體中。切除結果所得的scFv-CH1構建體，并將其連接入另一個載體中，該載體含有編碼抗CD20抗體的VH區域的DNA序列。
4.抗體片段的產生識別特異表位的抗體片段可以用已知的技術來產生。抗體片段為抗體的抗原結合部分，例如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv、sFv等等。其他抗體片段包括可以通過用胃蛋白酶消化抗體分子而產生的F(ab)′2片段，和可以通過還原F(ab)′2片段的二硫橋而產生的Fab′片段，但并不局限于此。作為另一種選擇，可以構建Fab′表達文庫(Huse等人，1989，Science，2461274-1281)以使得能夠快速和容易地鑒定具有所希望的特異性的單克隆Fab′片段。本發明包括抗體和抗體片段。
單鏈Fv分子(scFv)具有VL區域和VH區域。VL和VH區域聯合在一起而形成靶結合位點。這兩個區域進一步地用肽連接體(L)共價連接在一起。scFv分子在如果VL區域為scFv分子的N末端部分時標示為VL-L-VH，或者在如果VH區域為scFv分子的N末端部分時標示為VH-L-VL。用于制造scFv分子和設計合適的肽連接體的方法在下列文獻中進行了描述，即US專利號4，704，692；US專利號4,946,778；R.Raag和M.Whitlow，單鏈Fv(Single Chain Fvs)，FASEB Vol973-80(1995)；和R.E.Bird和B.W.Walker，單鏈抗體可變區(Single Chain Antibody Variable Regions)，TIBTECH Vol9132-137(1991)。在此處引用這些文獻作為參考。
抗體片段可以通過完整長度的抗體的蛋白酶水解或者通過在大腸桿菌(E.coli)或其他宿主中表達編碼該片段的DNA來制備。抗體片段可以常規方法通過完整長度的抗體的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化來獲得。例如，抗體片段可以此方式來產生，即用胃蛋白酶酶切抗體從而提供標示為F(ab′)2的5S片段。該片段可以進一步進行切割，此時使用硫醇還原試劑，和任選使用用于由于切割二硫鍵所產生的巰基的實心基團，從而產生3.5S Fab′單價片段。作為另一種選擇，使用木瓜蛋白酶的酶切直接產生兩個單價Fab片段和Fc片段。已經描述了這些方法，例如Goldenberg，U.S.專利號4,036,945和4,331,647和其中所包含的文獻，在此處以其整體引用這些專利作為參考。此外，見Nisonoff等人，Arch Biochem.Biophys.89230(1960)；Porter，Biochem.J.73119(1959)；Edelman等人，METHODS IN ENZYMOLOGYVol.1，422頁(Academic出版社1967)；和Coligan，2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4頁。
抗體片段的另一種形式為編碼單個互補決定區(CDR)的肽。CDR是抗體可變區的片段，其在結構上與抗體所結合的表位是互補的，并比可變區的其他部分更加具有可變性。因此，CDR有時稱為高變區。一個可變區具有三個CDR。可以通過構建編碼目標抗體的CDR的基因來獲得CDR肽。這種基因可用下列方法來制備，例如使用聚合酶鏈反應從產生抗體的細胞的RNA來合成可變區。見例如，Larrick等人，MethodsA Companion to Methods in Enzymology 2106 (1991)；Courtenay-Luck，單克隆抗體的遺傳操作(Genetic Manipulationof Monoclonal Antibodies)，MONOCLONAL ANTIBODIESPRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等人(編者)，166-179頁(劍橋大學出版社，1995)；和Ward等人，抗體的遺傳操作和表達(Genetic Manipulation and Expression of Antibodies)，MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等人(編者)，137-185頁(Wiley-Liss出版社，1995)。
其他切割抗體的方法例如重鏈從單價輕-重鏈片段中的分離、片段的進一步的切割或者其他酶、化學或遺傳技術也可以使用，只要片段可與完整抗體所識別的抗原結合。
5.多特異性和多價抗體也可以將此處描述的抗CD20抗體以及用于聯合治療的其他具有不同特異性的抗體制成多特異性抗體(具有至少一個對CD20表位或者抗原的結合位點，和至少一個對CD20上的另一個表位或者另一個抗原的結合位點)和多價抗體(具有多個對于同一個表位或抗原的結合位點)。多價靶結合蛋白在US系列號09/911,610(Leung等人)中進行了描述，在此處以其整體進行引用作為參考。
本發明提供了雙特異性抗體或抗體片段，其具有至少一個特異地與被定向的細胞標記相結合的結合區域，和至少一個特異地與可定向綴合物相結合的其他結合區域。可定向綴合物含有載體部分，該載體部分具有或帶有至少一個被至少一個雙特異性抗體或抗體片段的結合區域所識別的表位。
可以使用多種重組方法來產生上述的雙特異性抗體和抗體片段。
抗CD20多價抗體也在本發明的考慮之內。該多價靶結合蛋白通過締合第一種和第二種多肽來構建。第一種多肽含有第一種單鏈Fv分子，其共價地與優選為免疫球蛋白輕鏈可變區的第一種免疫球蛋白樣區域相連接。第二種多肽含有第二種單鏈Fv分子，其共價地與優選為免疫球蛋白重鏈可變區的第二種免疫球蛋白樣區域相連接。第一種和第二種單鏈Fv分子中的每一個形成一個靶結合位點，第一種和第二種免疫球蛋白樣區域締合形成第三個靶結合位點。
具有VL-L-VH構型(其中L是連接體)的單鏈Fv分子可以締合具有VH-L-VL構型的另一個單鏈Fv分子來形成二價二聚體。在這種情況下，第一種scFv分子的VL區域和第二種scFv分子的VH區域締合形成一個靶結合位點，而第一種scFv的VH區域和第二種scFv的VL區域締合形成另一個靶結合位點。
本發明的另一個實施方案為CD20雙特異性、三價定向蛋白，其含有兩條非共價連接的異源多肽鏈從而形成三個結合位點，其中的兩個結合位點對于一個目標具有親和性，第三個結合位點對于半抗原具有親和性，該半抗原可制造出來并附著于用于診斷和/治療試劑的載體上。優選地，結合蛋白具有兩個CD20結合位點和一個CD22結合位點。雙特異性、三價靶試劑具有兩個不同的scFv，一個scFv含有兩個VH區域，該VH區域來自一個通過短連接體與另一個抗體的VL區域相連的抗體，第二種scFv含有兩個VL區域，該VL區域來自通過短連接體與其他抗體的VH區域相連的第一種抗體。用于產生來自VH和VL區域的多價、多特異性試劑的方法提供了，在宿主生物體中從DNA質粒合成的單獨的鏈完全由VH區域組成(VH-鏈)或者完全由VL區域組成(VL-鏈)，以這種方式因此任何具有多價和多特異性的試劑可以通過一個VH-鏈和一個VL-鏈的非共價連接來產生。例如，為了形成三價、三特異性試劑，VH-鏈將由三個VH區域的氨基酸序列組成，每個VH區域來自具有不同特異性的抗體，并且它們用可變長度的肽連接體連接在一起；和VL-鏈將由互補的VL區域組成，它們用與用于VH-鏈的那些類似的肽連接體連接在一起。因為抗體的VH和VL區域以反平行的方式締合，因此本發明中的優選方法為VL-鏈中的VL區域以與VH-鏈中的VH區域相反的順序排列。
6.雙抗體、三抗體和四抗體本發明的抗CD20抗體也可以用于制備功能性雙特異性單鏈抗體(bscAb)，也稱為雙抗體，其可以在哺乳動物細胞中用重組方法來產生。見例如，Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，927021-7025，1995，此處引用了此文獻。例如，bscAb可通過此方法產生，即用重組方法通過甘氨酸-絲氨酸連接體來連接兩個單鏈Fv片段。用標準的PCR方法來分離兩個目標抗體的V輕鏈(VL)和V重鏈(VH)區域。然后連接從每個雜交瘤中獲得的VL和VHcDNA以在兩步融合PCR中形成單鏈片段。第一個PCR步驟導入(Gly4-Ser1)3連接體，第二個步驟連接VL和VH擴增子。然后將每個單鏈分子克隆進細菌表達載體中。在擴增之后，將一個單鏈分子切除并亞克隆進含有第二種目標單鏈分子的另一個載體中。將結果所得的bscAb片段亞克隆進真核生物表達載體中。功能蛋白的表達可以通過將載體轉染進中國倉鼠卵巢細胞中來獲得。雙特異性融合蛋白以類似的方式制備。雙特異性單鏈抗體和雙特異性融合蛋白包括在本發明的范圍之內。
例如，人源化、嵌合型或人抗CD20單克隆抗體可以用于產生抗原特異性雙抗體、三抗體和四抗體。單特異性雙抗體、三抗體和四抗體選擇性地結合靶抗原，由于分子上的結合位點的數量增加了，因此對于靶細胞的親和力增加了，并且在所期望的位置上觀察到更長的保留時間。對于雙抗體來說，使用這樣的兩條鏈，即其含有通過五個氨基酸殘基連接體與人源化CD20 MAb的VK多肽相連接的人源化CD20 MAb的VH多肽。每條鏈形成人源化CD20雙抗體的一半。在三抗體的情況下，使用這樣的三條鏈，即其含有不通過連接體與人源化CD20 MAb的VK多肽相連接的人源化CD20 MAb的VH多肽。每條鏈形成hCD20三抗體的三分之一。
此處描述的雙特異性雙抗體的最基本用途是預定向CD20陽性腫瘤，以便隨后特異地遞送診斷或治療試劑。這些雙抗體選擇性地結合靶抗原，這使得能夠增加親和力和在所希望位置上出現更長的保留時間。此外，將來結合抗原的雙抗體快速地從身體中清除，從而將正常組織的暴露減少至最小。用于增加清除率的雙特異性抗體的點突變可以在Qu等人的US臨時申請號60/361,037中找到，在此處以其整體進行引用作為參考。用于親和力增強的雙特異性雙抗體公開于US申請號10/270,071(Rossi等人)、10/270,073(Rossi等人)和10/328,190(Rossi等人)中，在此處以其整體進行引用作為參考。診斷和治療試劑可以包括同位素、藥物、毒素、細胞因子、激素、生長因子、綴合物、放射性核素和金屬。例如，用于磁共振成像(MRI)的釓金屬。放射性核素的例子為225Ac、18F、68Ga、67Ga、90Y、86Y、111In、131I、125I、123I、99mTc、94mTc、186Re、188Re、177Lu、62Cu、64Cu、67Cu、212Bi、213Bi、32P、11C、13N、15O、76Br和211At。其他放射性核素也可用作診斷和治療試劑，特別是那些在60-4,000 keV的能量范圍內的放射性核素。
更近來的一段時間，也報道了具有雙特異性的四價串聯雙抗體(稱為tandab)(Cochlovius等人，Cancer Research (2000) 604336-4341)。雙特異性tandab是兩個同樣的多肽的二聚體，每個多肽含有兩個不同抗體的四個可變區(VH1、VL1、VH2、VL2)，它們以這樣的方向進行連接，即使得在自締合時容易形成兩個對于兩個不同特異性中的每個特異性的潛在結合位點。
7.綴合的多價和多特異性抗CD20抗體在本發明的另一個實施方案中，為綴合的多價抗CD20抗體。附加的氨基酸殘基可以添加至第一種或第二種多肽的N-或C-末端。附加的氨基酸殘基可以含有肽標記、信號肽、細胞因子、酶(例如激活前體藥物的酶)、激素、肽毒素如假單胞菌外毒素、肽藥物、細胞毒性蛋白或其他功能蛋白。在此處使用時，功能蛋白是具有生物功能的蛋白質。
在一個實施方案中，藥物、毒素、放射性化合物、酶、激素、細胞毒性蛋白、螯合物、細胞因子和其他功能試劑可以與多價靶結合蛋白綴合，優選地通過與多價靶結合蛋白的氨基酸殘基側鏈的共價結合來進行，例如胺、羧基、苯基、硫醇或羥基基團。多種常規的連接體可以用于此目的，例如二異氰酸酯、二異硫氰酸酯、雙(羥基琥珀酰亞胺)酯、碳化二亞胺、馬來酰亞胺-羥基琥珀酰亞胺酯、戊二醛等等。試劑與多價蛋白質的綴合優選地不會明顯地影響蛋白質與其目標的結合特異性或親和性。在此處使用時，功能試劑是具有生物功能的試劑。優選的功能試劑為細胞毒性試劑。
在另外其他的實施方案中，由雙特異性抗體引導的治療劑或前體藥物聚合物向體內目標的遞送可以與放射性核素的雙特異性抗體遞送相聯合，因此獲得聯合的化療和放射免疫治療。每個治療劑可以與可定向的綴合物相綴合和同時施用，或者核素可以作為第一種可定向綴合物的一部分而給予，并且藥物可以作為第二種可定向綴合物的一部分而在后面的步驟中給予。
在另一個實施方案中，細胞毒性試劑可以與聚合物載體綴合，該聚合物載體可以隨后與多價靶結合蛋白綴合。對于此目的，見Ryser等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，753867-3870，1978；US專利號4,699,784；和US專利號4,046,722，此處引用這些文獻作為參考。綴合優選地不會明顯地影響多價結合蛋白的結合特異性和親和性。
8.對于治療和診斷的人源化、嵌合型和人抗體的使用人源化、嵌合型和人單克隆抗體即此處描述的抗CD20 MAb和其他MAb，根據本發明它們適合用于治療方法和診斷方法。因此，本發明考慮了作為裸露的抗體單獨施用本發明的人源化、嵌合型和人抗體，或者作為多模式治療進行施用，這是在時間上依照給藥方案來完成的，而不是與治療試劑相綴合。裸露的抗CD20 MAb的效能可以通過下列方法來增強，也就是說通過補充一種或多種其他裸露的抗體，即對于特異抗原如CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、PlGF、癌基因、癌基因產物或其組合的MAb；用一種或多種抗CD20或對于這些所述抗原的抗體的免疫綴合物，它們綴合了治療試劑，包括藥物、毒素、免疫調節劑、激素、治療放射性核素等等；用一種或多種治療試劑，包括藥物、毒素、免疫調節劑、激素、治療放射性核素等等，其根據規定的給藥方案與MAb同時或順次施用。優選的B-細胞抗原包括那些等同于人CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD46、CD52、CD74、CD80和CD5抗原的抗原。優選的T-細胞抗原包括那些等同于人CD4、CD8和CD25(IL-2受體)抗原的抗原。等同于HLA-DR抗原的等同物可以用于治療B-細胞和T-細胞紊亂。特別優選的B-細胞抗原為那些等同于人CD19、CD22、CD21、CD23、CD74、CD80和HLA-DR抗原的抗原。特別優選的T-細胞抗原為那些等同于人CD4、CD8和CD25抗原的抗原。CD46是癌細胞表面上的抗原，其阻斷依賴補體的裂解(CDC)。
此外，本發明考慮了在B-細胞淋巴瘤和其他疾病或紊亂中施用免疫綴合物以用于診斷和治療。在此處使用時，免疫綴合物為含有抗體組分和治療或診斷試劑的分子，包括可以承載診斷或治療試劑的肽。免疫綴合物保持了抗體組分的免疫反應性，即抗體部分在綴合之后具有與綴合之前大致同樣的或輕微減弱的結合同類抗原的能力。
許多種診斷和治療試劑可以有利地與本發明的抗體綴合。此處所述的治療試劑是那些也可用于與上述裸露的抗體分開施用的試劑。治療試劑例如包括化療藥物如長春花生物堿、蒽環類、表鬼臼毒素、紫杉烷、抗代謝試劑、烷基化試劑、抗激酶試劑、抗生素、Cox-2抑制劑、抗有絲分裂試劑、抗血管生成試劑和細胞凋亡試劑，特別是阿霉素、氨甲蝶呤、紫杉醇、CPT-11、喜樹堿，和其他來自這些和其他類型的抗腫瘤試劑的試劑等等。其他可用于制備免疫綴合物和抗體融合蛋白的癌癥化療藥物包括氮芥、烷基磺酸酯、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、COX-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉑配位復合物、激素等等。合適的化療試劑描述于下列文獻中，即REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(Mack出版公司，1995)，和GOODMAN AND GILMAN’S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，第7版(MacMillan出版公司，1985)，以及這些出版物的修改版本。其他合適的化療試劑例如實驗藥物對于本領域的熟練技術人員來說是已知的。
另外，螯合劑例如DTPA、DOTA、TETA或NOTA或者合適的肽，在其上可以綴合可檢測的標記如熒光分子或者細胞毒性試劑如中金屬或放射性核素。例如，治療上有用的免疫綴合物可以通過將光活試劑或染料與抗體合成物綴合而獲得。熒光組合物，例如熒光染料和其他發色團或染料如對于可見光敏感的卟啉，它們已經用于通過將合適的光導向病灶來檢測和治療損傷。在治療上，這稱為光輻射、光治療或光動態治療(Jori等人(編者)，PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS ANDOTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985)；van den Bergh，Chem。Britain 22430(1986))。此外，單克隆抗體已經與光活化染料進行偶聯以獲得光治療。Mew等人，J.Immunol.1301473(1983)；同作者，Cancer Res.454380(1985)；Oseroff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838744(1986)；同作者，Photochem.Photobiol.4683(1987)；Hasan等人，Prog.Clin.Biol.Res.288471(1989)；Tatsuta等人，Lasers Surg.Med.9422(1989)；Pelegrin等人，Cancer 672529(1991)。可是，這些早期的研究沒有包括內窺鏡治療應用的使用，尤其是在使用抗體片段或亞片段的情況下。因此，本發明考慮了含有光活試劑或染料的免疫綴合物的治療使用。
本發明也考慮了使用放射性和非放射性試劑作為診斷試劑。合適的非放射性診斷試劑為適合于磁共振成像、計算斷層X射線照相法或者超聲波的造影劑。磁成像試劑例如包括非放射性金屬如錳、鐵和釓，當它們單獨與本發明的抗體一起使用時，它們以含有2-芐基-DTPA和其單甲基與環己基類似物的金屬-螯合劑組合形式進行復合。見在2001年10月10日提交的U.S.系列號09/921,290，在此處以其整體進行引用作為參考。
此外，放射性標記的抗體或免疫綴合物可以含有用于診斷成像的發射γ射線的放射性同位素或者正電子放射體。合適的放射性同位素特別是在60-4,000keV的能量范圍內的放射性同位素包括131I、123I、124I、86Y、62Cu、64Cu、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、18F、11C、13N、15O、75Br等等。見例如，標題為“用鎵-68標記定向試劑(LabelingTargeting Agents with Gallium-68)”的U.S.專利申請(U.S.臨時申請號60/342,104)，其發明者為G.L.Griffiths和W.J.McBride，此文獻公開了用于成像目的的正電子放射體如18F、68Ga、94mTc等等，在此處以其整體進行引用作為參考。特別有用的治療放射性核素包括32P、33P、47Sc、64Cu、67Cu、67Ga、90Y、111Ag、111In、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、177Lu、186Re、188Re、189Re、212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra和225Ac，但并不局限于此。特別有用的診斷/檢測放射性核素包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、111In、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、90Y、188Re和175Lu，但并不局限于此。
毒素例如假單胞菌外毒素也可以與本發明抗CD20抗體的抗體融合蛋白的治療試劑部分進行復合或形成治療試劑部分。在制備這種綴合物或其他融合蛋白中適合使用的其他毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內毒素。見例如，Pastan等人，Cell 47641(1986)；和Goldenberg等人，CA-A Cancer Journal for Clinicians 4443(1994)。另外適合于在本發明中使用的毒素對于本領域熟練技術人員來說是已知的，并公開于U.S.專利6,077,499之中，在此處以其整體進行引用作為參考。
免疫調節劑如細胞因子也可以與抗體融合蛋白的治療試劑部分進行綴合或形成治療試劑部分，或者與本發明的人源化抗CD20抗體一起施用。用于本發明的合適的細胞因子包括下述的干擾素和白細胞介素，但并不局限于此。
寡核苷酸，例如在U.S.5,734,033(Reed)中所述的抑制bc1-2表達的反義分子，在此處以其整體引用該文獻作為參考，這些寡核苷酸也可以與抗體融合蛋白的治療試劑部分進行綴合或形成治療試劑部分，或者與本發明的人源化抗CD20抗體一起施用。
9.免疫綴合物的制備任何本發明的抗體或抗體融合蛋白可以與一個或多個治療或診斷試劑綴合。一般地，一種治療或診斷試劑附著于每個抗體或抗體片段上，但多于一種的治療試劑或診斷試劑可以附著于同一個抗體或抗體片段上。本發明的抗體融合蛋白含有兩個或更多個抗體或其片段，每個構成該融合蛋白的抗體可以含有治療試劑或診斷試劑。另外，一個或多個抗體融合蛋白的抗體可以附著多于一種的治療或診斷試劑。此外，治療試劑不需要是同樣的，而可以是不同的治療試劑。例如，可以在同一個融合蛋白上附著藥物和放射性同位素。特別地，IgG可以用131I進行放射性標記并附著在藥物上。可以將131I引入IgG的酪氨酸中，和將藥物連接到IgG賴氨酸的ε氨基上。治療和診斷試劑也可以連接至還原的SH基團和糖側鏈上。
適合用于處理疾病組織的放射性核素基本上通過放射β-粒子來衰變，其包括32P、33P、47Sc、59Fe、64Cu、67Cu、75Se、77As、89Sr、90Y、99Mo、105Rh、109Pd、111Ag、125I、131I、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、161Tb、166Ho、169Er、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211Pb、212Pb和213Bi，但并不局限于此。有用的放射β-粒子的核素的最大衰變能量優選為20-5,000keV，更優選為100-4,000keV，最優選為500-2,500keV。基本上通過放射俄歇粒子進行衰變的核素也是優選的。例如，58Co、67Ga、80mBr、99mTc、103mRh、109Pt、111In、119Sb、125I、161Ho、189mOs和192Ir。有用的放射俄歇粒子的核素的衰變能量優選為＜1,000keV，更優選為＜100keV，最優選為＜70keV。基本上通過產生α-粒子來進行衰變的核素也是優選的。這種核素包括152Dy、211At、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、225Ac、221Fr、217At、213Bi和255Fm，但并不局限于此。有用的放射α-粒子的放射性核素的衰變能量優選為2,000-10,000keV，更優選為3,000-8,000keV，最優選為4,000-7,000keV。
利用γ-射線檢測而用作診斷試劑的放射性核素包括51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、67Ga、75Se、97Ru、99mTc、111In、114mIn、123I、125I、131I、169Yb、197Hg和201Tl，但并不局限于此。有用的發射γ-射線的放射性核素的衰變能量優選為20-2,000keV，更優選為60-600keV，最優選為100-300keV。
用于正電子放射型斷層X射線照相法的放射性核素包括18F、51Mn、52mMn、52Fe、55Co、62Cu、64Cu、68Ga、72As、75Br、76Br、82Rb、83Sr、86Y、89Zr、94mTc、110In、120I和124I，但并不局限于此。有用的發射正電子的放射性核素的總衰變能量優選為＜2,000keV，更優選為＜1,000keV，最優選為＜700keV。
本發明的雙特異性抗體可用于預定向方法中，其提供了一種優選的方式來將兩個治療試劑或兩個診斷試劑遞送給受試者。U.S.系列號09/382,186和09/337,756公開了用雙特異性抗體進行預定向的方法，其中雙特異性抗體用125I進行標記并遞送給受試者，隨后遞送用99mTc標記的二價肽，在此處以其整體進行引用作為參考。預定向方法也描述于下列文獻中，即US系列號09/823,746(Hansen等人)和10/150,654(Goldenberg等人)，以及2003年1月31日提交的US臨時申請，其標題為“用于治療和診斷試劑的施用的方法和組合物(Methods and Compositions for Administration of Therapeuticand Diagnostic Agents)”，代理記錄號018733/1103(McBride等人)，這些文獻也都在此處以其整體進行引用作為參考。遞送導致對于125I和99mTc的良好的腫瘤/正常組織比例，因此顯示出兩個診斷放射性同位素的效用。已知的治療試劑或診斷試劑的任何聯合可以用于標記抗體和抗體融合蛋白。MAb綴合物的抗體組分的結合特異性、治療試劑或診斷試劑的效能和抗體Fc部分的效應物活性可以通過綴合物的標準測試來測定。
本發明涉及用于在患有B-細胞淋巴瘤或白血病或者自身免疫病的患者中預定向細胞的方法，其包括(i)施用具有多特異性的抗體融合蛋白或其片段，其具有至少一個特異地結合細胞的臂和至少另一個特異地結合可定向綴合物的臂；(ii)任選，向患者施用清除組合物，從而使得能夠讓該組合物從循環系統中清除未結合抗原的抗體融合蛋白或其片段；和(iii)向患者施用含有載體部分的可定向綴合物，載體部分具有或帶有至少一個可被抗體融合蛋白或其片段的至少另一個臂所識別的表位，并將載體部分與至少一種第一治療或診斷試劑綴合。本發明的抗體融合蛋白應當是多特異性的抗體。在優選的實施方案中，抗體為雙特異性抗體，并可以為雙抗體。第一治療試劑選自放射性標記、免疫調節劑、激素、光活治療試劑、細胞毒性試劑、寡核苷酸及其組合，和其中的第一診斷試劑為放射性標記、光活診斷試劑或非放射性標記中的至少一種。抗體融合蛋白或其片段也可以與第二治療試劑綴合，例如至少一種放射性標記、免疫調節劑、激素、光活治療試劑、細胞毒性試劑、寡核苷酸及其組合，或者可以與第二診斷試劑綴合，例如放射性標記、光活診斷試劑或非放射性標記中的至少一種。在一個實施方案中，第一和第二治療試劑或診斷試劑是相同的。
治療或診斷試劑可以通過二硫鍵的形成而附著于還原的抗體組分的鉸鏈區。作為另一種選擇，這樣的肽可以通過使用異雙功能交聯劑而附著于抗體組分上，例如N-琥珀酰基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)。Yu等人，Int.J.Cancer 56244(1994)。用于這種綴合的一般性技術在本領域中是熟知的。見例如，Wong，CHEMISTRY OFPROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC出版社，1991)；Upeslacis等人，用化學方法修飾抗體(Modification ofAntibodies by Chemical Methods)，MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等人(編者)，187-230頁(Wiley-Liss公司，1995)；Price，合成肽來源的抗體的產生和表征(Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies)，MONOCLONAL ANTIBODIESPRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等人(編者)，60-84頁(劍橋大學出版社，1995)。作為另一種選擇，治療或診斷試劑可以通過抗體Fc區域中的糖部分進行綴合。糖基團可以用于增加與硫羥基結合的同樣肽的加載，或者糖部分可以用于結合不同的肽。
通過抗體糖部分將肽與抗體組分綴合的方法對于本領域熟練技術人員來說是熟知的。見例如，Shih等人，Int.J.Cancer 41832(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer 461101(1990)；和Shih等人，U.S.專利號5,057,313，所有這些文獻在此處以其整體進行引用作為參考。一般的方法包括將具有氧化的糖部分的抗體組分與載體聚合物反應，該載體聚合物具有至少一個游離胺功能基團并加載大量的肽。該反應導致起始的席夫堿(亞胺)鍵，其可以通過還原成二級胺而穩定下來，從而形成最終的綴合物。
如果用作免疫綴合物的抗體組分的抗體是抗體片段，那么Fc區域是不存在的。可是，向完整長度的抗體或抗體片段的輕鏈可變區中引入糖部分是可能的。見例如，Leung等人，J.Immunol.1545919(1995)；Hansen等人，U.S.專利號5,443,953(1995)；Leung等人，U.S.專利號6,254,868，所有這些文獻在此處以其整體進行引用作為參考。經工程改造的糖部分用于附著治療或診斷試劑。
10.可藥用的賦形劑將要遞送給受試者的人源化、嵌合型和人抗CD20MAb可以由單獨的MAb、免疫綴合物、融合蛋白組成，或者可以含有一種或多種藥物上合適的賦形劑、一種或多種附加成分或者這些的一些聯合。
本發明的免疫綴合物或裸露的抗體可以根據已知用于制備藥物上有用的組合物的方法來進行配制，其中將免疫綴合物或裸露的抗體結合入具有藥物上合適的賦形劑的混合物中。無菌磷酸鹽緩沖鹽水是藥物上合適的賦形劑的一個例子。其他合適的賦形劑對于本領域技術人員來說是熟知的。見例如，Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMSAND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第五版(Lea & Febiger 1990)；和Gennaro(編者)，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack出版公司，1990)；以及它們的修改版本。
本發明的免疫綴合物或裸露的抗體可以配制成用于通過例如快速注射或持續輸注的靜脈內施用。優選地，本發明的抗體在小于大約4小時的期間內進行輸注，更優選地在小于大約3小時的期間內進行輸注。例如，第一次25-50mg可以在30分鐘內進行輸注，優選地甚至在15分鐘內，剩余的在接下來的2-3小時內進行輸注。用于注射的配劑可以存在于單位劑量形式中，例如存在于安瓿或多次劑量容器中，其中具有添加的防腐劑。組合物可以采取這樣的形式，即在油性或含水載體中的懸浮液、溶液或乳濁液，并且可以含有配制試劑如懸浮劑、穩定劑和/分散劑。作為另一種選擇，活性成分可以存在于粉末形式中，并在使用之前與合適的載體如經滅菌的無熱原的水進行組合。
可以使用另外的藥學方法來控制治療或診斷試劑或者裸露的抗體的作用持續時間。可控釋放制劑可以通過使用聚合物來復合或吸收免疫綴合物或者裸露的抗體而進行制備。例如生物相容的聚合物包括聚(亞乙基-共-乙酸乙烯酯)的基質，和硬脂酸二聚體與癸二酸的聚酸酐共聚物的基質。Sherwood等人，Bio/Technology 101446(1992)。免疫綴合物或抗體從這種基質上的釋放速率取決于免疫綴合物或抗體的分子量、基質中免疫綴合物或抗體的數量和分散顆粒的大小。Saltzman等人，Biophys.J.55163(1989)；Sherwood等人，如上。其他固體的劑量形式描述于下列文獻中，即Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第五版(Lea & Febiger 1990)；和Gennaro(編者)，REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack出版公司，1990)；以及它們的修改版本。
免疫綴合物、抗體融合蛋白或裸露的抗體也可以經過皮下或者甚至經過其他腸胃外途徑施用于哺乳動物。此外，施用可以是持續的輸注或單次或多次快速注射。優選地，本發明的抗體在小于大約4小時的期間內進行輸注，更優選地在小于大約3小時的期間內進行輸注。這優選地通過在開始時緩慢地進行輸注來實施。例如，在15-30分鐘內輸注25-50mg的劑量，和在2-3小時以內的期間內輸注剩余的劑量。一般地，施用于人的免疫綴合物、融合蛋白或裸露的抗體的劑量會依賴于這些因素而變化，即患者的年齡、體重、身高、性別、通常的醫學狀況和以前的醫療史。通常地，希望提供接受一定劑量的免疫綴合物、融合蛋白或裸露的抗體的受體，該劑量在單次靜脈內輸注時位于大約1mg/kg-20mg/kg的范圍內，雖然當情況要求時更低或更高的劑量也是可以進行施用的。因此，對于70kg的患者施用1-20mg/kg的劑量，例如對于1.7m的患者施用70-1,400mg或41-824mg/m2的劑量。當需要時該劑量可以重復，例如，在4-10周內每周一次，優選地在8周內每周一次，更優選地在4周內每周一次。也可以更少的頻率進行施用，例如在幾個周內每隔一周一次。更特別地，本發明的抗體如裸露的抗CD20可以每2或3周一劑進行施用，并總共重復至少3劑。本發明的抗體可以在4-8周內每周施用一次，這也是優選的。換句話說也就是，如果劑量減少至大約200-300mg/m2(即對于1.7m的患者每劑有340mg，或者對于70kg的患者以4.9mg/kg進行施用)，可以在4-8周內每周施用一次。作為另一種選擇，劑量計劃表可以減少，即在2-3個月內每2或3周施用一次；例如，如果劑量為300-500mg/m2(即對于1.7m的患者施用510-850mg，或者對于70kg的患者以7.3-12mg/kg進行施用)。給藥計劃表可以任選以其他的間隔進行重復，劑量可以通過多種腸胃外途徑而給予，這是在伴隨著劑量和計劃表的適當調整的情況下進行的。
對于治療目的，將免疫綴合物、融合蛋白或裸露的抗體以治療有效量施用于哺乳動物。對于本發明合適的受試者通常是人，雖然非人的動物受試者也在考慮之內。如果所施用的數量在生理上是顯著的，那么將抗體制劑稱為以“以治療有效量”進行施用。如果一種試劑的存在導致受體哺乳動物生理上的可檢測的變化，那么該試劑在生理上是顯著的。特別地，如果本發明的抗體制劑的存在引起抗腫瘤反應或者減輕自身免疫病狀態的病征和癥狀，那么其在生理上是顯著的。生理上顯著的效應也可以是在受體哺乳動物中激發體液和/或細胞免疫反應。
l1.治療方法本發明考慮了將本發明的裸露的抗CD20抗體用作用于治療B-細胞紊亂和其他疾病的的主要組合物。特別地，此處描述的組合物對于治療下列疾病是特別有用的，即多種自身免疫病，以及無痛感形式的B-細胞淋巴瘤、侵染形式的B-細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病和Waldenstrm’s巨球蛋白血癥。例如，人源化抗CD20抗體組分和免疫綴合物可以用于治療無痛感和侵染形式的非Hodgkin’s淋巴瘤。
用于治療的組合物單獨含有至少一種人源化、嵌合型或人單克隆抗CD20抗體，或者還聯合含有其他抗體如其他人源化、嵌合型或人抗體、治療試劑或者免疫調節劑。特別地，用完整的人抗體進行聯合治療也在考慮之內，其是通過上述的方法來進行的。
對于相同或不同的表位或抗原的裸露或綴合的抗體也可以與一個或多個本發明的抗體聯合。例如，人源化、嵌合型或人裸露的抗CD20抗體可以與另一個裸露的人源化、裸露的嵌合型或裸露的人抗CD20抗體聯合，人源化、嵌合型或人裸露的抗CD20抗體可以與抗CD20免疫綴合物聯合，裸露的抗CD20抗體可以與抗CD22放射性綴合物聯合，或者裸露的抗CD22抗體可以與人源化、嵌合型或人抗CD20抗體聯合，該人源化、嵌合型或人抗CD20抗體綴合了同位素或者一個或多個化療試劑、細胞因子、毒素或其組合。在本發明中也可以使用人源化、嵌合型或人CD20抗體和毒素或免疫調節劑的融合蛋白，或者至少兩個不同的B-細胞抗體(例如CD20和CD22 MAb)的融合蛋白。上面已經列出了許多不同的抗體組合，它們指向至少兩個不同的B-細胞紊亂相關抗原，可以將它們以下列形式進行構建，即裸露的抗體或者部分裸露和部分與治療試劑或免疫調節劑綴合，或者只與另一個治療試劑聯合，例如細胞毒性藥物或具有放射性的試劑。
在此處使用時，術語“免疫調節劑”包括細胞因子、干細胞生長因子、淋巴毒素如腫瘤壞死因子(TNF)和造血因子如白細胞介素(例如白細胞介素-I(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-21和IL-18)、集落刺激因子(例如粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF))、干擾素(例如干擾素-α、-β和-γ)、稱為“S1因子”的干細胞生長因子、紅細胞生成素和血小板生成素。合適的免疫調節劑部分的例子包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素-γ、TNF-α等等。作為另一種選擇，受試者可以接受裸露的抗CD20抗體和分開施用的細胞因子，這些細胞因子可以在施用裸露的抗CD20抗體之前、同時或之后進行施用。正如上面所討論的，抗CD20抗體也可以與免疫調節劑綴合。免疫調節劑也可以與雜交抗體綴合，雜交抗體由一個或多個與不同的抗原結合的抗體組成。
本發明的多模式治療進一步包括使用裸露的抗CD20抗體的免疫治療，并通過以裸露的抗體、融合蛋白的形式或作為免疫綴合物來施用抗CD22、抗CD19、抗CD21、抗CD74、抗CD80、抗CD23、抗CD46或HLA-DR(包括不變鏈)抗體而加以補充。裸露的抗CD20抗體或其片段也可以用裸露的抗MUC1抗原的抗體來補充，MUC1抗原在某些B-細胞上表達。這些抗體包括多克隆、單克隆、嵌合型、人或人源化抗體，它們識別至少一個在這些抗原決定簇上的表位。抗CD19和抗CD20抗體對于本領域熟練技術人員來說是已知的。見例如，Ghetie等人，Cancer Res.482610(1988)；Hekman等人，Cancer Immunol.Immunother.32364(1991)；Longo，Curr.Opin.Oncol.8353(1996)和U.S.專利號5,798,554和6,187,287，在此處以其整體進行引用作為參考。
在另一種形式的多模式治療中，受試者聯合標準的癌癥化療而接受裸露的抗CD20抗體和/或免疫綴合物。例如，“CVB”(1.5g/m2環磷酰胺、200-400mg/m2表鬼臼毒素和150-200mg/m2亞硝基脲氮芥)為用于治療非Hodgkin’s淋巴瘤的方案。Patti等人，Eur.J.Haematol.5118(1993)。其他合適的聯合型化療方案對于本領域熟練技術人員來說是熟知的。見例如，Freedman等人，非Hodgkin’s淋巴瘤(Non-Hodgkin’s Lymphomas)，CANCER MEDICINE，VOL.2，第三版，Holland等人(編者)，2028-2068頁(Lea & Febiger 1993)。作為舉例說明，第一代用于治療中級非Hodgkin’s淋巴瘤(NHL)的化療方案包括C-MOPP(環磷酰胺、長春新堿、甲基芐肼和強的松)和CHOP(環磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強的松)。有用的第二代化療方案為m-BACOD(氨甲蝶呤、博來霉素、阿霉素、環磷酰胺、長春新堿、地塞米松和甲酰四氫葉酸)，而合適的第三代方案為MACOP-B(氨甲蝶呤、阿霉素、環磷酰胺、長春新堿、強的松、博來霉素和甲酰四氫葉酸)。另外的有用的藥物包括丁酸苯酯和brostatin-1。在優選的多模式治療中，化療藥物和細胞因子與根據本發明的抗體、免疫綴合物或融合蛋白進行共施用。細胞因子、化療藥物和抗體或免疫綴合物可以任何順序或一起進行施用。
在優選的實施方案中，用下列方法治療NHL或自身免疫病，即以每周200-400mg/m2的劑量每周4次輸注人源化抗CD20抗體，并持續4個連續的周(靜脈注射2-6小時)，如果需要在接下來的月/年中進行重復。優選地，人源化抗CD20抗體以200-300mg/m2的劑量和以每隔一周一次的方式進行施用，持續4-8次注射。同樣也是優選的為，通過如上述每周4次注射或者頻率更少的注射來治療NHL，但是在同樣的這些天中以360mg/m2的劑量聯合施用epratuzuMAb(抗CD22人源化抗體)，epratuzuMAb是在抗CD20單克隆抗體輸注之前、期間或之后通過靜脈輸注1小時來給予的。或者，在聯合治療中所使用的抗體也可以交替的順序進行輸注，因此在不同的周中交替進行輸注，這導致對于4-8或更多個劑量單位中的每一個的總注射順序來說每個劑量單位每隔一周給予一次。然后將這些給藥計劃表以不同的間隔進行重復，例如3-6周，這取決于患者的臨床狀態和對于每個治療方案的反應。更優選的是，通過如上述每周4次輸注抗CD20抗體或者頻率更少的輸注來治療NHL，其聯合了一次或多次注射用治療性同位素如釔-90(總劑量為5-35mCi/m2的Y-90，在幾個周或幾個月的時間內進行一次或多次注射)進行放射性標記的CD22 MAb。US系列號09/590,284(Goldenberg等人)公開了使用抗CD22抗體的自身免疫紊亂的免疫療法，在此處以其整體進行引用作為參考。
另外，本發明的治療組合物可以含有裸露的單克隆抗CD20抗體的混合物或雜交分子，這些抗CD20抗體導向不同的、非實心的CD20表位。因此，本發明考慮了這樣的治療組合物，其含有與至少兩個CD20表位結合的單克隆抗CD20抗體的混合物。另外，此處所描述的治療組合物可以含有具有變化的CDR序列的抗CD20抗體的混合物。
雖然裸露的抗CD20抗體是用于治療B-細胞淋巴瘤和自身免疫病的主要治療組合物，但是這種抗體治療的效能可以通過使用補充的試劑來對于裸露的抗體進行補充而得到增強，例如免疫調節劑，如干擾素包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ，白細胞介素包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21，和細胞因子包括G-CSF和GM-CSF。因此，CD20抗體不僅可以與抗體和細胞因子聯合，這是以與抗CD20抗體的混合物(分開給予或者以某一預定的給藥方案來給予)或者綴合物或融合蛋白的形式來進行的，而且可以與藥物的聯合形式來給予。例如，抗CD20抗體可以與CHOP聯合而作為4種藥物化療方案。另外，裸露的抗CD20抗體可以與裸露的抗CD22抗體和CHOP或氟達拉濱聯合而作為用于NHL治療的藥物聯合。使用抗CD22抗體的B-細胞惡性腫瘤的免疫療法描述于US專利號6,183,744(Goldenberg等人)和US系列號09/307,816(Goldenberg等人)，在此處以其整體進行引用作為參考。補充的治療組合物可以在施用抗CD20抗體之前、同時或之后進行施用。
正如上面所討論的，本發明的抗體可以用于治療B-細胞淋巴瘤和白血病以及其他的B-細胞疾病或紊亂。例如，抗CD20抗體可以用于治療B-細胞相關的自身免疫病，包括III型自身免疫病，例如免疫介導的血小板減少癥如急性特發性血小板減少性紫癜和慢性特發性血小板減少性紫癜、皮肌炎、干燥綜合征、多發性硬化癥、Sydenham’s舞蹈病、重癥肌無力、系統性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、風濕熱、類風濕性關節炎、多腺綜合征、大皰性類天皰瘡、糖尿病、Henoch-Schonlein紫癜、鏈球菌感染后腎炎、結節性紅斑、Takayasu’s動脈炎、Addison’s病、類風濕性關節炎、結節病、潰瘍性結腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結節性多動脈炎、強直性脊柱炎、Goodpasture’s綜合征、血栓閉塞性脈管炎、原發性膽汁性肝硬化、橋本氏甲狀腺炎、甲狀腺毒癥、硬皮病、慢性活動性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常型天皰瘡、Wegener’s內芽腫病、膜性腎病、肌萎縮側索硬化、脊髓癆、巨細胞動脈炎/多肌痛、惡性貧血、快速進展性腎小球腎炎和纖維化肺泡炎。
抗CD20抗體也可以在表達CD20抗原的細胞中引起凋亡。在文獻中提供了這一誘導的證據。例如，證明了用這樣的淋巴樣細胞可以引起凋亡，即該淋巴樣細胞具有與交聯CD20 MAb的IgG1-Fc反應的Fc受體。見Shan等人，Cancer Immunol.Immunother.48(12)673-683(2000)。此外，還報道了嵌合型CD20 MAb的凝集體即同聚合體可引起凋亡。見Ghetie等人，Blood 97(5)1392-1398(2000)；和Ghetie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(14)7509-7514(1997)。
可以將對于B一細胞的CD20表面抗原具有特異性的抗體注射入哺乳動物受試者中，然后這些抗體與正常的和惡性的B-細胞的CD20細胞表面抗原結合。哺乳動物受試者包括人和家養動物，包括寵物如狗和貓。當存在對于CD20抗原的物種交叉反應時，本發明的即人源化、嵌合型、人、狗源化和貓源化的抗CD20 MAb和甚至是鼠類抗CD20 MAb可以用于治療非人哺乳動物受試者。見下面的施例10和11。在人中具有免疫原性的鼠類MAb在非人哺乳動物受試者中通常具有較弱的免疫原性。與CD20表面抗原結合的抗CD20抗體導致成瘤性B-細胞的破壞和清除。因為正常的和惡性的B-細胞都表達CD20抗原，因此抗CD20抗體將會導致B-細胞死亡。可是，只有正常的B-細胞會再增殖，而惡性的B-細胞會被根除或者明顯地減少。另外，可以將具有破壞腫瘤的潛在能力的化學試劑或放射性標記與抗CD20抗體綴合，從而這些試劑特異地定向于成瘤性B-細胞。
12.表達載體將編碼人源化、嵌合型或人抗CD20 MAt的DNA序列通過重組工程而置于多種已知的提供核酸復制的宿主載體中。可以用已知的方法來設計這些載體從而含有對于在其遞送進的細胞中指導核酸的轉錄、翻譯或兩者所必需的元件。可以使用已知的方法學來產生表達構建體，其具有可操作地與合適的轉錄/翻譯控制信號相連接的編碼蛋白質的序列。這些方法包括體外重組DNA技術和合成技術。例如，見Sambrook等人，1989，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，冷泉港實驗室(New York)；Ausubel等人，1997，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons(New York)。在本發明中也提供了不與載體相聯系的載體的遞送。
適合在本發明中使用的載體可以是病毒的或非病毒的。病毒載體的特殊例子包括腺病毒、AAV、單純皰疹病毒、慢病毒、和逆轉錄病毒。非病毒載體的例子為質粒。在優選的實施方案中，載體為質粒。
在此處使用時，表達載體為含有在宿主細胞中表達的基因的多核苷酸。通常地，將基因表達置于某些調節元件的控制之下，包括組成型或可誘導的啟動子、組織特異性調節元件和增強子。這樣的基因被稱為“可操作地”與調節元件相連。
優選地，本發明的表達載體含有編碼人源化、嵌合型或人抗CD20MAb的DNA序列，該抗CD20 MAb包含有重鏈和輕鏈可變區和恒定區。可是，可以使用兩個表達載體，一個具有重鏈可變區和恒定區，另一個具有輕鏈可變區和恒定區。更優選地，表達載體進一步含有啟動子。因為可以使用任何強的啟動子，因此可以含有編碼分泌信號肽的DNA序列、編碼人IgG1重鏈恒定區的基因組序列、Ig增強子元件和至少一個編碼選擇標記的DNA序列。
在此處也考慮了表達人源化抗CD20 MAb的方法，其包括(i)使至少一種含有編碼人源化、嵌合型或人抗CD20 MAb的DNA序列線性化，(ii)用至少一種該線性化載體轉染哺乳動物細胞，(iii)挑選出表達標記基因的經轉染的細胞，和(iv)鑒定從轉染細胞中分泌人源化抗CD20MAb的細胞。
13.制備抗CD20抗體的方法一般地，抗CD20 MAb的Vκ(可變輕鏈)和VH(可變重鏈)序列可以通過多種分子克隆程序如RT-PCR、5’-RACE和cDNA文庫篩選來獲得。特別地，抗CD20 MAb的V基因可以通過PCR擴增而從表達鼠類或嵌合型抗CD20 MAb的細胞中獲得，并進行測序。為了確定它們的真實性，可以如Orlandi等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833(1989))所述將經克隆的VL和VH基因在細胞培養物中表達為嵌合型Ab，此處引用該文獻作為參考。基于V基因序列，然后可以如Leung等人所述(Mol.Immunol.321413(1995))設計和構建人源化抗CD20 MAb，此處引用該文獻作為參考。可以通過通常的分子克隆技術(Sambrook等人，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，第二版(1989))從任何已知的產生鼠類或嵌合型抗CD20 MAb的雜交瘤系或轉染細胞系中制備出cDNA。MAb的Vκ序列可以用引物VK1BACK和VK1FOR(Orlandi等人，1989)或Leung等人(Biotechniques，15286(1993))所描述的延生引物組來擴增，此處引用這些文獻作為參考，而VH序列可以用引物對VH1BACK/VH1FOR(Orlandi等人，1989，上述)或Leung等人(Hybridoma，13469(1994))所描述的與鼠類IgG恒定區退火的引物來擴增，此處引用這些文獻作為參考。PCR反應混合物含有10μl第一條鏈cDNA產物、10μl 10×PCR緩沖液[500mM KCl、100mM Tris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl2和0.01％(w/v)明膠](PerkinElmer Cetus，Norwalk，CT)、250μM每種dNTP、200nM引物和5個單位Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)，將該PCR反應混合物進行30個循環的PCR。每個PCR循環優選地由下列步驟組成，即于94℃變性1分鐘、于50℃退火1.5分鐘和于72℃聚合化1.5分鐘。擴增出的Vκ和VH片段可以在2％的瓊脂糖(BioRad，Richmond，CA)上進行純化。類似地，如Leung等人(Mol.Immunol.321413(1995))所述，人源化V基因可以通過將長寡核苷酸模板合成和PCR擴增聯合而進行構建。在實施例3中可見在自動RNA/DNA合成儀(AppliedBiosystems，foster City，CA)上合成寡聚體A和聚體B以用于構建人源化V基因的方法。
對于Vκ的PCR產物可以亞克隆進分階段載體中，例如基于pBR327的分階段載體VKpBR，其含有Ig啟動子、信號肽序列和方便的用于使得VκPCR產物的框內連接變得容易的限制位點。對于VH的PCR產物可以亞克隆進類似的分階段載體中，如基于pBluescript的VHpBS。含有各自PCR產物的單個克隆可以用例如Sanger等人的方法來進行測序(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463(1977))，此處引用此文獻作為參考。
此處描述的DNA序列將會被認為是包括了其所有的等位基因、突變體和變異體，而不論它們是天然發生的還是誘導產生的。
含有Vκ和VH以及啟動子與信號肽序列的表達盒可以分別從VKpBR和VHpBS中切除，這是通過雙限制酶切消化為HindIII-BamHI片段而進行的。然后可以將Vκ和VH表達盒分別連接入合適的表達載體中，例如pKh和pGlg(Leung等人，Hybridoma，13469(1994))。表達載體可以共轉染進合適的細胞中，例如骨髓瘤Sp2/0-Ag14(ATCC，VA)，這是由潮霉素抗性所選擇出的集落，并對上清液進行監測以確定嵌合型或人源化抗CD20 MAb的產生，例如通過ELISA測定，這在下面進行了描述。作為另一種選擇，可以將Vκ和VH表達盒分別裝配入經修飾的分階段載體VKpBR2和VHpBS2中，然后分別作為XbaI/BamHI和XhoI/BamHI片段而切除，并亞克隆進單個表達載體如pdHL2中，這些Gilles等人(J.Immunol.Methods 125191(1989))進行了描述，以及還在Losman等人，Cancer，802660(1997)中顯示了Sp2/0-Ag14細胞中的表達。在本發明中有用的另一種載體為Barnes等人，Cytotechnology 32109-123(2000)所描述的GS載體，其優選地在NSO細胞系和CHO細胞中表達。其他合適的哺乳動物表達系統描述于Werner等人，Arzneim.-Forsch./Drug Res.48(II)，Nr.8，870-880(1998)之中。
共轉染和用ELISA測定分泌抗體的克隆可以如下所述來進行。根據Co等人，J.I mmunol.，1481149(1992)所述，大約10μg的VKpKh(輕鏈表達載體)和20μg的VHpGlg(重鏈表達載體)可以用于通過電穿孔(BioRad，Richmond，CA)轉染5×106的SP2/0骨髓瘤細胞，此處引用該文獻作為參考。在轉染之后可以讓細胞于37℃和5％CO2的條件下在96孔微量滴定板中并于完全HSFM培養基(LifeTechnologies公司，Grand Island，NY)中進行生長。選擇程序可以在添加潮霉素終濃度為500單位/ml的潮霉素選擇性培養基(Calbiochem，San Diego，CA)之后兩天開始進行。集落通常在電穿孔之后2-3個周出現。然后可以讓培養物進行擴展以用于進一步分析。
對于嵌合型或人源化重鏈的分泌呈陽性的轉染瘤克隆可以通過ELISA測定來鑒定。簡短地說就是，將來自轉染瘤培養物的上清液樣品(約100μl)分三次加入到用山羊抗人(GAH)-IgG、F(ab′)2片段特異性抗體(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)預包裹的ELISA微量滴定板中。將平板于室溫溫育1小時。通過用洗滌緩沖液(含有0.05％聚山梨酸酯20的PBS)洗滌三次來去除未結合的蛋白質。向孔中加入與GAH-IgG、Fc片段特異性抗體(Jackson ImmunoResearch)綴合的辣根過氧化物酶(HRP)，(將100μl的抗體原料稀釋104倍，并用未綴合的抗體補充至1.0μg/ml的終濃度)。在溫育1小時之后，洗滌平板，一般是三次。向孔中加入反應溶液[100μl，其在PBS中含有167μg的鄰苯二胺(OPD)(Sigma，St.Louis，MO)、0.025％過氧化氫]。在暗處進行成色30分鐘。在自動ELISA閱讀器(Bio-Tek儀器，Winooski，VT)中測量490nm的吸收之前，通過向每個孔中添加50μl的4NHCl溶液來終止反應。然后，相對于不相關的嵌合型抗體標準(可從Scotgen有限公司，Edinburg，Scotland獲得)來測定結合的嵌合型抗體。
抗體可以如下述從細胞培養物中分離出來。使轉染瘤培養物適合于無血清培養基。為了產生嵌合型抗體，讓細胞在滾瓶中用HSFM以500ml培養物進行生長。將培養物離心，并將上清液通過0.2μ的膜進行過濾。將經過濾的培養基以1ml/分鐘的流速通過A蛋白柱(1×3cm)。然后用大約10個柱體積的PBS洗滌樹脂，隨后用含有10mM EDTA的0.1M甘氨酸緩沖液(pH3.5)從柱上洗脫下A蛋白結合的抗體。在含有10μl的3M Tris(pH 8.6)的管中收集1.0ml的組分，并由在280/260nm的吸收來測定蛋白質濃度。匯集峰組分并逆PBS進行透析，然后例如用Centricon 30(Amicon，Beverly，MA)來濃縮抗體。如前述用ELISA來測定抗體濃度，并用PBS將其濃度調整至大約1mg/ml。向樣品中適宜地加入0.01％(w/v)疊氮化鈉作為防腐劑。
下面是用于制備抗CD20抗體的引物的核苷酸序列hA20VKA5’-CATCTCTGAG CGCATCTGTT GGAGATAGGG TCACTATGACTTGTAGGGCC AGCTCAAGTG TAAGTTACAT CCACTGGTTCCAGCAGAAAC CAGGGAAAGC ACCTAAACCC TGGATTTATG-3’hA20VKB5’-GGTGTCCCTG TCCGATTCTC TGGCAGCGGA TCTGGGACAGATTACACTTT CACCATCAGC TCTCTTCAAC CAGAAGACATTGCAACATAT TATTGTCAGC AGTGGACTAG TAACCCACCCACGTTCGGTG-3’hA20VKA-反向5’-CAGCTGACCC AGTCTCCATC ATCTCTGAGC GCATCTGTTG-3’hA20VKA-正向5’-AGGTTCGAAG TGGCATAAAT CCAGGGTTTA GGTGCT-3’hA20VKB-反向5’-CACTTCGAAC CTGGCTTCTG GTGTCCCTGT CCGATTCTC-3’hA20VKB-正向5’-ACGTTAGATC TCCAGCTTGG TCCCTCCACC GAACGTGGGT GGGTTA-3’hA20VHA
5’-CTGAAGTCAA GAAACCTGGG TCATCGGTGA AGGTCTCCTGCAAGGCTTCT GGCTACACCT TTACTAGTTA CAATATGCACTGGGTCAAGC AGGCACCTGG ACAGGGTCTG GAATGGATTGG-3’hA20VHB5’-ATCAGAAGTT CAAGGGTAAA GCCACACTGA CTGCCGACGAATCCACCAAT ACAGCCTACA TGGAGCTGAG CAGCCTGAGGTCTGAGGACA CGGCATTTTA TTACTGTGCA AGATCGACTTACTACGGCGG TGACTGGTAC TTCGATGTCTG-3’hA20VHA-反向5’-CAGCTGCAGC AATCAGGGGC TGAAGTCAAG AAACCTGGG-3’hA20VHA-正向5’-TTCCGGGATA AATAGCTCCA ATCCATTCCA GACCCTG-3’hA20VHB-反向5’-ATCCCGGAAA TGGTGATACT TCCTACAATC AGAAGTTCAAGGGTAAAGCCA-3’hA20VHB-正向5’-GGAGACGGTG ACCGTGGTGC CTTGGCCCCA GACATCGAAG TACCAG-3’hA20VH2A5’-CTGAAGTCAA GAAACCTGGG TCATCAGTGA AGGTCTCCTGCAAGGCTTCT GGCTACACCT TTAGTAGTTA CAATATGCACTGGGTCAGAC AGGCACCTGG ACAGGGTCTG GAATGGATGGG-3’hA20VH2B5’-ATCAGAAGTT CAAGGGTAGA GCCACAATAA CTGCCGACGAATCCACCAAT ACAGCCTACA TGGAGCTGAG CAGCCTGAGGTCTGAGGACA CGGCATTTTA TTTTTGTGCA AGATCGACTTACTACGGCGG TGACTGGTAC TTCGATGTCTG-3’hA20VH2A-正向
5’-TTCCGGGATA AATAGCTCCC ATCCATICCA GACCCTG-3’hA20VH2B-反向5’-ATCCCGGAAA TGGTGATACT TCCTACAATC AGAAGTTCAAGGGTAGAGCCA-3’通過下面的實施例而對本發明作進一步的描述，提供這些實施例只是用于舉例說明。本發明并不局限于這些實施例，而是應當包括明顯來自此處提供的教導的所有變化形式。
實施例實施例1.人源化抗CD20抗體的構建分別使用Orlandi等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833(1989))所描述的引物對VH1BACK/VH1FOR和VK1BACK/VK1FOR而通過RT-PCR來獲得抗CD20抗體A20的VH和Vκ基因。對多個獨立的克隆進行測序以排除由于PCR反應所產生的可能錯誤。將作為最終PCR產物的克隆鼠類VH和Vκ序列分別標示為A20Vk(圖1A)和A20VH(圖1B)。構建出嵌合型A20(cA20)抗體，并在Sp2/0細胞中進行表達。cA20的Vk和VH序列顯示在圖2中。讓cA20抗體與Raji細胞結合，并與從雜交瘤細胞培養物上清液中純化出的放射性標記的A20進行競爭(圖3)。該結果進一步證實了所克隆的V基因的真實性。
設計和構建編碼人源化抗hCD20(hA20)抗體的單個輕鏈和兩個重鏈可變區序列。人REI框架序列用于Vκ(圖1A)，EU與NEWM框架序列的聯合用于VH(圖1B)。當與起始人抗體框架相比較時，在CDR區域之外的每條鏈中有許多氨基酸改變。與人EU框架相比，hA20、hA2 0VH1的重鏈有9個改變，而hA20VH2有3個改變(圖4A)。hA20VH2是優選的，因為其比hA20VH1含有更多的來自人抗體構架區的氨基酸。與人REI框架相比，hA20、hA20Vκ的輕鏈有7個氨基酸改變(圖4B)。
實施例2.hA20抗體的構建方法每條可變鏈以兩部分進行構建，即5’-和3’-半個部分，分別標示為“A”和“B”。每半個部分通過使用Taq聚合酶對于合成的單鏈寡核苷酸模板與兩個短側翼引物進行PCR擴增而產生出來。首先將擴增出的片段克隆進來自Invitrogen(Carlsbad，CA)的pCR4 TA克隆載體中，并進行DNA測序。模板和引物對列于下面模板 引物VKAVkA-反向/VkA-正向VKBVkB-反向/VkB-正向VH1A VHA-反向/VH1A-正向VH1B VH1B-反向/VHB-正向VH2A VHA-反向/VH2A-正向VH2B VH2B-反向/VHB-正向輕鏈為了構建人源化Vκ序列的全長DNA，在自動RNA/DNA合成儀(Applied Biosystems)上合成寡聚體hA20VKA(120聚體)和hA20VKB(130聚體)。hA20VKA和B分別代表了hA20Vκ的核苷酸26-145和166-195(見圖5A)。將寡聚體hA20VKA和B從支持物上切除，并通過用濃縮的氫氧化銨處理而去保護。在將樣品進行真空干燥并重懸于100μl水中之后，通過經過ChormaSpin-100柱(Clontech，Palo Alto，CA)進行離心而去除不完整的寡聚體(小于100聚體)。所有側翼引物類似地進行制備，只是使用ChormaSpin-30柱來去除合成的副產物。將1μl用ChormaSpin柱純化的hA20VKA以100μl反應體積進行PCR擴增，該反應體系含有10×PCR緩沖液[500mM KCl、100mMTris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl2和0.01％(W/v)明膠](PerkinElmerCetus，Norwalk，CT)、250μM每種dNTP、200nM VkA-反向與VkA-正向和5個單位Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)。將該反應混合物進行30個循環的由下列步驟組成的PCR反應，即于94℃變性1分鐘、于50℃退火1.5分鐘和于72℃聚合化1.5分鐘。hA20VKB在類似的條件下用引物對VkB-反向和VkB-正向進行PCR擴增。擴增出的VKA和VKB片段在2％瓊脂糖(BioRad，Richmond，CA)上進行純化。在每個片段的末端設計唯一的限制位點以便能夠容易地通過DNA連接而連接在一起。擴增出的VKA片段在其5’-末端含有PvuII限制位點即CAGCTG，和在3’-末端含有BstBI限制位點即TTCGAA。擴增出的VKB片段在其5’-末端含有BstBI限制位點，和在3’-末端含有BglII限制位點即AGATCT。全長Vκ鏈的裝配通過下列步驟來完成，即用合適的5’-和3’-酶對于每個片段進行限制性內切酶酶切消化，然后連接入預先用PvuII和BclI(BclI消化的末端與BglII消化的末端相匹配)消化的VKpBR2載體中。結果所得的連接產物含有與PvuII位點相連接的A片段、與BclI位點相連接的B片段和在BstBI位點連接在一起的A與B片段(圖5A)。VKpBR2是VKpBR的經修飾的分階段載體(Leung等人，Hybridoma 13469(1994))，在其中于翻譯起始密碼子上游14個堿基處導入了XbaI限制位點。通過DNA測序來確認正確的可讀框，將完整的鏈作為XbaI-BamHI片段從VKpBR2中切除，并連接入pdHL2表達載體中。將只含有Vκ序列的載體標示為hA20VκpdHL2。pdHL2含有表達盒，該表達盒包括在IgH增強子和MT1啟動子控制之下的人IgG1 C1、C2、C3和鉸鏈區(圖7A)以及人κ鏈Ck(圖7B)，還包括由弱SV40啟動子控制的小鼠dhfr基因，其作為用于轉染子的選擇和轉基因的共擴增的標記(Gillies等人，J.Immunol.Methods 125191(1989)；Losman等人，Cancer，802660(1997))。通過置換pdHL2的Vκ和VH片段可以表達出不同的嵌合型或人源化Ab。
重鏈為了構建hA20VH1，如上所述合成寡聚體VH1A(121聚體)和VH1B(151聚體)，它們分別代表了核苷酸23-143和179-329(見圖5B)。類似地，對于hA20VH2，制備寡聚體VH2A和VH2B。這些寡聚體用實施例2中所列出的它們各自的引物對來進行PCR擴增。對于VH的兩種類型施行與對于Vκ所施行的同樣的構建方法，但具有下列修飾A片段的5’-末端限制位點為PstI(CTGCAG)和B片段的3’-末端限制位點為BstEII(GGTCACC)。將這些片段連接在一起并于共同的NciI位點(CCCGG)連接入VHpBS2載體中，從而導致形成全長VH序列(圖5B和5C)，并通過DNA測序進行確認。VHpBS2是VHpBS的經修飾的分階段載體(Leung等人，Hybridoma 13469(1994))，在其中于翻譯起始密碼子上游16個堿基處導入了XhoI限制位點。將裝配出的VH基因作為XhoI-BamHI限制片段亞克隆進含有Vκ序列的表達載體hA20VκpdHL2中。因為pdHL2的重鏈區域缺乏BamHI限制位點，因此該連接需要使用HNB連接體來在可變鏈的BamHI位點和存在于pdHL2載體中的HindIII位點之間提供一個橋。將結果產生的表達載體標示為hA20-1pdHL2和hA20-2pdHL2。
HNB連接體5’-AGCTTGCGGCCGC-3’3’-ACGCCGGCGCTAG-5’實施例3.hA20抗體的轉染和表達將大約30μg用于hA20的表達載體通過用SalI消化而線性化，并通過電穿孔(450V和25μF)而轉染進Sp2/0-Agl4細胞中。將經轉染的細胞置于96孔平板中2天，然后通過以0.025μM的終濃度向培養基中添加MTX而用藥物抗性進行選擇。MTX抗性集落于2-3周之后在孔中出現。來自在選擇中存活的集落的上清液通過ELISA測定而對于人Ab分泌進行篩選。簡短地說就是，將100μl上清液加入到用GAH-IgG、F(ab′)2片段特異性Ab預包裹的微量滴定板的孔中，并于室溫溫育1小時。通過用洗滌緩沖液(含有0.05％多山梨酸酯20的PBS)洗滌三次來去除未結合的蛋白質。向孔中加入綴合HRP的GAH-IgG、Fc片段特異性Ab。在溫育1小時之后，洗滌平板。在添加含有4mM OPD和0.04％H2O2的底物溶液之后，通過讀取A490nm而揭示出結合的綴合HRP的Ab。讓陽性細胞克隆進行擴展，并從細胞培養物上清液中通過在A蛋白柱上進行親和層析而純化出hA20-1和hA20-2。
實施例4.抗CD20抗體的結合活性施行競爭性細胞結合測定以評測hA20相對于親代cA20和抗CD20Ab c2B8的免疫反應性。在存在濃度變化(0.2-700nM)的hA20-1、-2、鼠類A20、cA20、或c2B8的情況下，將恒定數量的125I標記的鼠類A20或c2B8(100,000cpm，約10μCi/μg)與Raji細胞于4℃溫育1-2小時。通過在PBS中洗滌細胞而去除未結合的Ab。在洗滌之后測定與細胞相關的放射活性。如圖6中所示，當和125I-A20或125I-c2B8與Raji細胞的結合進行競爭時，人源化A20 MAb、hA20-1和hA20-2顯示出可與A20、鼠類抗CD20 MAb、cA20和c2B8(嵌合型抗CD20 MAb)相比較的結合活性。
通過放射性標記的MAb與Raji細胞的直接結合和Scatchard制圖分析，與對于C2B8的3.9nM的解離常數相比，測量到對于cA20和hA20的解離常數分別為2.9和4.2nM。用山羊抗人IgG、Fc片段特異性抗體與這些抗體進行復合的體外交聯實驗顯示出在cA20和hA20以及C2B8之間的類似的Raji NHL細胞殺傷力。
實施例5.患有復發性中級非Hodgkin’s淋巴瘤的患者的治療患有中級非Hodgkin’s淋巴瘤的患者已經對于前面的侵襲性化療沒有反應了，該化療由下面的部分組成，即CHOP×6，其導致完全地緩解4個月；另一個CHOP×6過程，其導致進一步的改善；D-MOPP×2，其導致穩定疾病3個月；和與外周干細胞移植一起的CVB，其導致部分緩解5個月。患者在頸部淋巴結中呈現出復發性淋巴瘤，其可以通過計算機化斷層X射線照相法和觸診來測量。
患者在第0、14、28和42天用450mg人源化CD20單克隆抗體A20于3小時之內進行輸注，而沒有在輸注期間或緊接著之后注意到嚴重的反作用。8個周之后，頸部淋巴結增大的觸診顯示出可測量到的大約50％的減少。在治療之后20周所進行的繼續測量沒有在頸部和其他任何地方之中顯示出疾病的跡象，這一點也由身體的計算斷層X射線照相法研究進行了確認。因為在其他地方沒有檢測到新疾病，所以認為患者的病情得到了完全的緩解。每10-12周進行繼續的研究以確認在治療之后至少10個月的完全緩解。
實施例6.患有慢性原發性血小板減少性紫癜的患者的治療一位患有慢性原發性血小板減少性紫瘢的45歲女性已經用強的松、γ球蛋白和高劑量的地塞米松進行了治療，但是疾病仍在發展。她經過了脾切除術，但還是不能穩定疾病。她的血小板跌至小于30,000/μl，并且出血事件的頻率增加了。然后患者用人源化CD20A20MAb進行治療，在第一周于靜脈內施用500mg，隨后每隔一周一次給予250mg，并總共進行4次注射。在最后一次給予A20之后10周，觀察到血小板數量的顯著增加至150,000/μl，并且出血事件消失了。在最后一次抗體輸注之后5個月，疾病得到了緩解。
實施例7.患有進展性類風濕性關節炎的患者的治療患有嚴重的指關節、腕和肘進展性類風濕性關節炎的一位70歲女性對于用氨甲蝶呤的治療已經沒有反應了，當進行Enbrel治療時只獲得較小的緩解。然后該患者用A20人源化CD20 MAb進行治療，其每個周于靜脈內施用300mg，并持續4周。在3個月之后，在疾病活動度的測量中觀察到40％的改善并保持了5個月。患者再次用A20以同樣的劑量和頻率進行治療。患者繼續得到改善，并在第二次A20 MAb治療之后6個周觀察到60％的改善。在A20治療期間或之后的任何時候沒有觀察到人抗A20抗體。雖然從血液中去除了正常的B-細胞，但是沒有觀察到感染并發癥或者其他藥物相關的嚴重毒性。
實施例8.患有重癥肌無力的患者的治療一位65歲的男性已經對于用于重癥肌無力的常規療法沒有了反應，并被送進了神經學重癥治療病室中。通過血漿交換和靜脈內給予免疫球蛋白來減少抗乙酰膽堿受體抗體的滴度而穩定了患者的病情。患者繼續臥床不起，然后用A20人源化CD20 MAb進行治療，其每隔一周一次于靜脈內施用400mg，并持續10周。在最后一次給予A20之后1周，沒有能夠檢測到血液B-細胞，并觀察到抗乙酰膽堿抗體的滴度的顯著降低。在最后一次施用A20 MAb之后4個月，患者可以活動了并出了院。
實施例9.在淋巴結和骨髓中患有侵襲性非Hodgkin’s B-細胞淋巴瘤的狗的治療一只65磅重、7歲大的雄性金毛獵犬被診斷為患有擴散性大細胞侵襲性淋巴瘤。將該狗進行使用長春新堿、環磷酰胺、強的松和阿霉素的聯合化療，其具有良好的反應。可是，狗隨后表現出這樣的特征，即具有進展性淋巴結病，并在此之后7個月被發現具有骨髓的擴展性淋巴瘤滲透，和頸部、胸部、腹部、骨盆的淋巴結病，以及肝脾大。
給予該狗使用1F5嵌合型單克隆抗體的治療。狗用120mg 1F5抗體進行靜脈內輸注，并在該起始治療之后于4周內每周重復這一治療。在最后一次給予1F5之后4個月，患畜的計算機化斷層X射線照相法掃描沒有顯示出淋巴瘤的跡象，并且疾病的所有病征和癥狀不明顯了。
實施例10.患有復發性中級非Hodgkin’s淋巴瘤的狗的治療一只78磅重、9歲大的患有中級非Hodgkin’s淋巴瘤的德國牧羊犬接受化療，其起初導致完全緩解5個月，隨后進行另一個化療過程，其導致穩定疾病6個月。然后狗在胸部和頸部淋巴結中表現出復發性淋巴瘤，它們可以分別通過計算機化斷層X射線照相法和觸診而進行測量。
患畜在2周內每周用90Y標記的L243(HLA-DR)單克隆抗體的免疫綴合物進行輸注，其放射劑量為50mg抗體蛋白中有8mCi，并聯合地以每次100mg的劑量每周輸注A20人源化CD20抗體。3周之后，頸部淋巴結增大的觸診顯示出可測量的減少，而重復的胸部計算機化斷層X射線照相法掃描顯示出腫瘤的明顯減少。于治療之后10周進行的繼續測量顯示出在頸部或胸部中疾病減少了大約60％的證據。因為在其他地方沒有檢測到新疾病，所以認為患畜的病情得到了部分的緩解。每10-12周進行繼續的研究以確認在治療之后至少7個月的部分緩解。
實施例11.患有復發性淋巴瘤的貓的治療一只10磅重、12歲大的家養短毛貓表現出單個下頜下淋巴結的增大。在切除之后，在6個月時病灶重新出現了。再次切除病灶，但是隨后在6個月之后其又出現了。然后在4周內每周用131I標記的抗CD20B1單克隆抗體的免疫綴合物治療貓，其放射劑量為45mg抗體蛋白中有15mCi。在3個月之后重復進行治療。當在最后一次治療之后3個月進行檢查時，可以觸摸到明顯的減小。在1年的時間內沒有觀察到疾病的復發。
實施例12.在培養的或者異種移植入SCID小鼠的人NHL細胞中評測嵌合型和人源化抗CD20 MAb。
嵌合型(cA20)和人源化(hA20)CD20抗體的特性在NHL細胞系中進行評測。結果證實cA20和hA20與rituximab類似地起作用，其沾染了多于99％的Raji、Ramos、RL、Daudi和Su-DHL-6細胞，和與大約5％的淋巴細胞(所希望的B-細胞百分數)進行反應。在所有的B-細胞系中，用MAb看到了特異的生長抑制，但是抑制水平在細胞系之間變化，Su-DHL是最敏感的。在不存在交聯的情況下，鼠類抗CD20、cA20、hA20和rituximab都產生77-90％的抑制。在有交聯的情況下，增殖的抑制在94-98％的范圍內變化。在存在有交聯了第二種單克隆抗體的情況下，rituximab、cA20和hA20在它們于Raji細胞中誘導凋亡的能力上也是類似的。
此外，在第0天，SCID小鼠用2.5×106的Raji細胞進行靜脈內注射。在第1天，開始注射鼠類、嵌合型和人源化抗CD20抗體以及cA20F(a b′)2片段，其數量為每次注射100#g完整抗體或者每次注射67#gF(ab′)2片段，并在2周內每周注射5次，然后在3周內每周注射2次。在一項研究中，對照小鼠以腫瘤接種之后15天這一中間存活時間死于播散性疾病，但是中間存活時間對于用cA20處理的小鼠延長至38天、對于用hA20處理的小鼠延長至22.5天和對于用鼠類抗CD20處理的小鼠延長至21天(所有這些數據通過對數分級分析是統計學顯著的(p＜0.005))。在另一項研究中，對照小鼠以腫瘤接種之后16.5天這一中間存活時間死于表現為CNS麻痹的播散性疾病，但是中間存活時間對于用cA20處理的小鼠延長至105天、對于用hA20處理的小鼠延長至70天和對于用rituximab處理的小鼠延長至98天(所有這些數據通過對數分級分析是統計學顯著的(p＜0.0001)，圖11)。
實施例13.競爭性細胞表面結合測定人源化抗CD20 Ab(cA20、hA20和c1F5，通過A蛋白柱上的親和層析而純化)的Ag結合特異性和親和性研究通過與鼠類2B8和rituximab(IDEC制藥公司，San Diego，CA)的細胞表面競爭性結合測定來進行評測。簡短地說就是，在存在濃度變化(0.2-700nM)的競爭Ab(cA20、hA20、m2B8、c1F5或rituximab)的情況下，將恒定數量(100,000cpm，約10 ìCi/ìg)的125I標記的(A)m2B8或(B)rituximab與Raji細胞于4℃溫育1-2小時。通過用PBS洗滌細胞而去除未結合的Ab。在洗滌之后測定與細胞相關的放射活性。圖8(A)為cA20(正方形)、hA20-2(三角形)和hA20-1(圓形)與m2B8(菱形)的結合活性的比較；圖8(B)比較了cA20(正方形)、c1F5(三角形)和rituximab(菱形)的結合活性。
在另一項研究中，通過細胞表面競爭性結合測定比較了hA20與其他的抗CD20 Ab、rituximab和鼠類B1的結合活性。簡短地說就是，在存在濃度變化(0.2-700nM)的競爭Ab即hA20(三角形)、mB1(倒三角形)或rituximab(正方形)的情況下，將恒定數量(100,000cpm，約10ìCi/ìg)的125I標記的rituximab與Raji細胞于4℃溫育1-2小時。通過用PBS洗滌細胞而去除未結合的Ab。在洗滌之后測定與細胞相關的放射活性。計算出對于這三個抗體的IC50值分別為6.8、34和5。
實施例14.交聯的hA20和其他CD20 Ab對于培養的淋巴瘤細胞的細胞毒性效應在存在交聯劑(抗人IgG、Fc片段特異性抗體)的情況下，用多種CD20Ab處理Raji細胞以復合CD20抗體(圖10)。在使用20ìg/ml交聯劑(紅色)、不使用交聯劑(橙色)或者使用抗小鼠IgG、Fc片段特異性抗體(藍色)的情況下，將終濃度為5ìg/ml的hA20、cA20、rituximab或陽性對照Ab hLL1與Raji細胞溫育48小時。通過(A)錐蟲藍染色和細胞計數或者(B)MTT測定來測量總細胞和存活細胞群體。數據顯示出hA20和rituximab對于Raji NHL細胞的存活具有相似的效應，并且該細胞毒性取決于抗體的特異性交聯。
實施例15.使用hA20和hLL2的體內療法將Raji細胞通過靜脈注射而施用于SCID小鼠，其數量為2.5×106細胞/100μl/小鼠(圖12)。在第1-11天通過腹腔注射而施用MAb，隨后每周注射兩次MAb并持續大約3周。每周測量動物的體重，直至研究結束。每天檢查動物后腿的麻痹。當麻痹出現時，處死動物并進行尸體剖檢以便肉眼檢查播散性腫瘤結節(特別是在肺、腎和卵巢中)。用對照人源化IgG1 Ab即hMN-14(抗CEA抗體)處理的對照小鼠死于表現為CNS麻痹的播散性疾病。中間存活時間為腫瘤靜脈注射接種之后13天。在用hA20處理的組中的中間存活時間延長至大約25天。該值表示了大約2倍于hA20的中間存活時間的增加。雖然單獨用hLL2處理的組顯示出與對照小鼠相比同樣的中間存活時間，但是聯合hA20和hLL2進行治療可將小鼠的中間存活時間增加至大約30天。
權利要求
1.含有至少一種鼠類抗CD20MAb可變區的互補決定區(CDR)和至少一種人MAb可變區的構架區(FR)的人源化抗CD20(hCD20)單克隆抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗CD20MAb或其片段基本上保持了該鼠類抗CD20MAb對B-細胞和B-細胞淋巴瘤以及白血病細胞的定向。
2.權利要求1的人源化抗體或其片段，其中該可變區含有輕鏈可變區。
3.權利要求1的人源化抗體或其片段，其中該可變區含有重鏈可變區。
4.權利要求1的人源化抗體或其片段，其中該可變區含有輕鏈和重鏈可變區。
5.權利要求4的人源化抗體或其片段，其進一步含有至少一種人抗體的輕鏈和重鏈恒定區。
6.權利要求2的人源化抗體或其片段，其中該輕鏈可變區具有含有選自RASSSVSYIH、RASSSLSFMH和RASSSVSYMH的氨基酸序列的CDR1；含有ATSNLAS氨基酸序列的CDR2；和含有選自QQWTSNPPT、HQWSSNPLT和QQSFSNPPT的氨基酸序列的CDR3。
7.權利要求3的人源化抗體或其片段，其中該重鏈可變區具有含有SYNMH氨基酸序列的CDR1；含有AIYPGNGDTSYNQKFKG氨基酸序列的CDR2；和含有選自STYYGGDWYFDV、STYYGGDWYFNV、SHYGSNYVDYFDV和VVYYSNSYWYFDV的氨基酸序列的CDR3。
8.權利要求4的人源化抗體或其片段，其中該輕鏈可變區具有含有選自RASSSVSYIH、RASSSLSFMH和RASSSVSYMH的氨基酸序列的CDR1；含有ATSNLAS氨基酸序列的CDR2；和含有選自QQWTSNPPT、HQWSSNPLT和QQSFSNPPT的氨基酸序列的CDR3；并且該重鏈可變區具有含有SYNMH氨基酸序列的CDR1；含有AIYPGNGDTSYNQKFKG氨基酸序列的CDR2；和含有選自STYYGGDWYFDV、STYYGGDWYFNV、SHYGSNYVDYFDV和VVYYSNSYWYFDV的氨基酸序列的CDR3。
9.權利要求8的人源化抗體或其片段，其進一步含有人抗體輕鏈和重鏈恒定區的FR。
10.權利要求8的人源化抗體或其片段，其中該重鏈可變區的CDR3不含有STYYGGDWYFNV。
11.權利要求8的人源化抗體或其片段，其中當該輕鏈可變區的CDR3含有HQWSSNPLT并且該重鏈可變區的CDR3含有SHYGSNYVDYFDV時，該輕鏈可變區的CDR1不含有RASSSLSFMH。
12.權利要求8的人源化抗體或其片段，其中當該輕鏈可變區的CDR1含有RASSSLSFMH并且該重鏈可變區的CDR3含有SHYGSNYVDYFDV時，該輕鏈可變區的CDR3不含有HQWSSNPLT。
13.權利要求8的人源化抗體或其片段，其中當該輕鏈可變區的CDR1含有RASSSLSFMH并且該輕鏈可變區的CDR3含有HQWSSNPLT時，該重鏈可變區的CDR3不含有SHYGSNYVDYFDV。
14.權利要求8的人源化抗體或其片段，其中當該輕鏈可變區的CDR3含有QQSFSNPPT并且該重鏈可變區的CDR3含有VVYYSNSYWYFDV時，該輕鏈可變區的CDR1不含有RASSSVSYMH。
15.權利要求8的人源化抗體或其片段，其中當該輕鏈可變區的CDR1含有RASSSVSYMH并且該重鏈可變區的CDR3含有VVYYSNSYWYFDV時，該輕鏈可變區的CDR3不含有QQSFSNPPT。
16.權利要求8的人源化抗體或其片段，其中當該輕鏈可變區的CDR1含有RASSSVSYMH并且該輕鏈可變區的CDR3含有QQSFSNPPT時，該重鏈可變區的CDR3不含有VVYYSNSYWYFDV。
17.含有至少一種鼠類抗CD20MAb的互補決定區(CDR)和人抗體輕鏈和重鏈可變區的構架區(FR)的人源化抗CD20(hCD20)單克隆抗體(MAb)或其片段，其中該人源化抗CD20MAb或其片段基本上保持了該鼠類抗CD20MAb對B-細胞和B-細胞淋巴瘤細胞以及白血病細胞的定向，并且其中鼠類抗CD20MAb的輕鏈可變區的CDR具有含有RASSSVSYIH氨基酸序列的CDR1，含有ATSNLAS氨基酸序列的CDR2，和含有QQWTSNPPT氨基酸序列的CDR3，并且鼠類抗CD20MAb的重鏈可變區的CDR具有含有SYNMH氨基酸序列的CDR1，含有AIYPGNGDTSYNQKFKG氨基酸序列的CDR2，和含有STYYGGDWYFDV氨基酸序列的CDR3。
18.權利要求1的人源化抗體或其片段，其中該人源化抗體的輕鏈和重鏈可變區的該FR含有至少一個從該鼠類MAb的該相應FR進行取代的氨基酸。
19.權利要求18的人源化抗體或其片段，其中來自該鼠類MAb的該氨基酸為至少一個選自下組的氨基酸，即圖4A中鼠類重鏈可變區hA20VH1或hA20VH2氨基酸序列的1、5、27、30、38、48、67、68、70、95、155和116位氨基酸殘基。
20.權利要求19的人源化抗體或其片段，其中該鼠類氨基酸為至少一個選自下組的氨基酸，即圖4B中鼠類輕鏈可變區hA20Vk序列的4、21、35、38、45、46、59、99、104和106位氨基酸殘基。
21.權利要求18的人源化抗體或其片段，其中該鼠類氨基酸為至少一個選自下組的氨基酸，即圖4B中鼠類輕鏈可變區hA20Vk序列的4、21、35、38、45、46、59、99、104和106位氨基酸殘基。
22.含有圖4B的hA20Vk和圖4A的hA20VH1的人源化抗體或其片段。
23.含有圖4B的hA20Vk和圖4A的hA20VH2的人源化抗體或其片段。
24.權利要求1的人源化MAb和其片段，其中該片段選自F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv和sFv。
25.含有至少一種鼠類抗CD20MAb可變區的互補決定區(CDR)和至少一種鼠類抗CD20MAb可變區的構架區(FR)的嵌合型抗CD20(CCD20)單克隆抗體(MAb)或其片段，其中該嵌含型抗CD20MAb或其片段基本上保持了該鼠類抗CD20MAb對B-細胞和B-細胞淋巴瘤以及白血病細胞的定向，其中嵌合型抗CD20MAb的輕鏈可變區的CDR具有含有選自RASSSVSYIH、RASSSLSFMH和RASSSVSYMH的氨基酸序列的CDR1；含有ATSNLAS氨基酸序列的CDR2；和含有選自QQWTSNPPT、HQWSSNPLT和QQSFSNPPT的氨基酸序列的CDR3；并且嵌合型抗CD20MAb的重鏈可變區的CDR具有含有SYNMH氨基酸序列的CDR1；含有AIYPGNGDTSYNQKFKG氨基酸序列的CDR2；和含有選自STYYGGDWYFDV、STYYGGDWYFNV、SHYGSNYVDYFDV和VVYYSNSYWYFDV的氨基酸序列的CDR3，前提是，(a)其中當該輕鏈可變區的CDR1含有氨基酸RASSSVSYIH，輕鏈可變區的CDR2含有氨基酸ATSNLAS，輕鏈可變區的CDR3含有氨基酸QQWTSNPPT，重鏈可變區的CDR1含有氨基酸SYNMH，并且重鏈可變區的CDR2含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG時，該重鏈可變區的CDR3不含有STYYGGDWYFNV；(b)其中當該輕鏈可變區的CDR1含有氨基酸RASSSLSFMH，輕鏈可變區的CDR2含有氨基酸ATSNLAS，輕鏈可變區的CDR3含有氨基酸HQWSSNPLT，重鏈可變區的CDR1含有氨基酸SYNMH，并且重鏈可變區的CDR2含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG時，該重鏈可變區的CDR3不含有SHYGSNYVDYFDV；和(c)其中當該輕鏈可變區的CDR1含有氨基酸RASSSVSYMH，輕鏈可變區的CDR2含有氨基酸ATSNLAS，輕鏈可變區的CDR3含有氨基酸QQSFSNPPT，重鏈可變區的CDR1含有氨基酸SYNMH，并且重鏈可變區的CDR2含有氨基酸AIYPGNGDTSYNQKFKG時，該重鏈可變區的CDR3不含有VVYYSNSYWYFDV。
26.權利要求25的嵌合型抗體或其片段，其進一步含有至少一種人抗體的輕鏈和重鏈恒定區。
27.含有鼠類抗CD20MAb可變區的互補決定區(CDR)的嵌合型抗CD20(cCD20)單克隆抗體(MAb)或其片段，其中該嵌合型抗CD20MAb或其片段基本上保持了該鼠類抗CD20MAb對B-細胞和B-細胞淋巴瘤以及白血病細胞的定向，其中抗CD20MAb的輕鏈可變區的CDR具有含有RASSSVSYIH氨基酸序列的CDR1，含有ATSNLAS氨基酸序列的CDR2，和含有QQWTSNPPT氨基酸序列的CDR3；并且嵌合型抗CD20MAb的重鏈可變區的CDR具有含有SYNMH氨基酸序列的CDR1，含有AIYPGNGDTSYNQKFKG氨基酸序列的CDR2，和含有STYYGGDWYFDV氨基酸序列的CDR3。
28.權利要求27的嵌合型抗體或其片段，其進一步含有至少一種人抗體的輕鏈和重鏈恒定區。
29.含有鼠類抗CD20MAb的輕鏈和重鏈可變區的嵌合型抗CD20(cCD20)單克隆抗體(MAb)或其片段，其中該cCD20MAb基本上保持了該鼠類抗CD20MAb對B-細胞和B-細胞淋巴瘤以及白血病細胞的定向和細胞結合特性，其中該cCD20含有在圖4B中所提到的并標示為cA20Vk的輕鏈可變區和在圖4A中所提到的并標示為cA20VH的重鏈可變區。
30.含有人抗體的輕鏈和重鏈可變區的人抗CD20(huCD20)單克隆抗體(MAb)或其片段，其中該huCD20MAb基本上保持了鼠類抗CD20MAb對B-細胞和B-細胞淋巴瘤以及白血病細胞的定向和細胞結合特性，其中人抗CD20MAb的輕鏈可變區的CDR具有含有選自RASSSVSYIH、RASSSLSFMH和RASSSVSYMH的氨基酸序列的CDR1；含有ATSNLAS氨基酸序列的CDR2；和含有選自QQWTSNPPT、HQWSSNPLT和QQSFSNPPT的氨基酸序列的CDR3；并且人抗CD20MAb的重鏈可變區的CDR具有含有SYNMH氨基酸序列的CDR1；含有AIYPGNGDTSYNQKFKG氨基酸序列的CDR2；和含有選自STYYGGDWYFDV、STYYGGDWYFNV、SHYGSNYVDYFDV和VVYYSNSYWYFDV的氨基酸序列的CDR3。
31.權利要求30的嵌合型抗體或其片段，其進一步含有至少一種人抗體的輕鏈和重鏈恒定區。
32.含有至少兩種MAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段，其中該MAb選自權利要求1-31中任何一項的所述抗CD20MAb。
33.抗體融合蛋白或其片段，其含有至少一種權利要求1-31中任何一項的第一種抗CD20MAb或其片段，和至少一種除了權利要求1-31中任何一項的抗CD20MAb或其片段之外的第二種MAb或其片段。
34.權利要求33的抗體融合蛋白或其片段，其中該第二種MAb選自與CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產物及其組合反應的MAb。
35.含有編碼MAb或其片段的核酸的DNA序列，該MAb或其片段選自(a)權利要求1-31中任何一項的抗CD20MAb或其片段；(b)含有至少兩個該抗CD20MAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段；(c)抗體融合蛋白或其片段，其含有至少一種含有權利要求1-31中任何一項的所述抗CD20MAb或其片段的第一種MAb或其片段，和至少一種除了權利要求1-31中任何一項的抗CD20MAb或其片段之外的第二種MAb或其片段；和(d)抗體融合蛋白或其片段，其含有至少一種含有權利要求1-31中任何一項的所述抗CD20MAb或其片段的第一種MAb或其片段，和至少一種除了權利要求1-31中任何一項的抗CD20MAb或其片段之外的第二種MAb或其片段，其中該第二種MAb選自與CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產物或其組合及其組合反應的MAb。
36.含有權利要求35的DNA序列的表達載體。
37.權利要求36的表達載體，其中載體為pdHL2或GS。
38.權利要求37的表達載體，其中當用于表達嵌合型、人源化或人IgG時，pdHL2或GS載體編碼IgG1的重鏈和輕鏈恒定區以及鉸鏈區。
39.權利要求38的表達載體，其中該重鏈恒定區和鉸鏈區顯示于圖7A中，該輕鏈恒定區顯示于圖7B中，其中任選將同種異型位置上的至少一個氨基酸轉變為在不同IgG1同種異型中存在的氨基酸，并且其中EU的重鏈的253位氨基酸任選可以用丙氨酸取代。
40.含有權利要求35的DNA序列的宿主細胞。
41.權利要求40的宿主細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
42.權利要求41的宿主細胞，其中該哺乳動物細胞為淋巴細胞。
43.權利要求42的宿主細胞，其中該淋巴細胞為骨髓瘤細胞。
44.含有權利要求38的表達載體的宿主細胞。
45.權利要求44的宿主細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
46.權利要求45的宿主細胞，其中該哺乳動物細胞為淋巴細胞。
47.權利要求46的宿主細胞，其中該淋巴細胞為骨髓瘤細胞。
48.含有權利要求39的DNA序列的宿主細胞。
49.權利要求48的宿主細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
50.權利要求49的宿主細胞，其中該哺乳動物細胞為淋巴細胞。
51.權利要求50的宿主細胞，其中該淋巴細胞為骨髓瘤細胞。
52.表達抗CD20MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的方法，其包括(a)用權利要求35的DNA序列轉染哺乳動物細胞；和(b)培養分泌該抗CD20MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的該細胞。
53.表達抗CD20MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的方法，其包括(a)用權利要求38的DNA序列轉染哺乳動物細胞；和(b)培養分泌該抗CD20MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的該細胞。
54.表達抗CD20MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的方法，其包括(a)用權利要求39的DNA序列轉染哺乳動物細胞；和(b)培養分泌該抗CD20MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的該細胞。
55.定向于B淋巴瘤與白血病細胞的診斷或治療綴合物，其具有含有權利要求1-34中任何一項的與所述細胞結合的抗CD20MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段的抗體組分，其中該抗體組分與至少一種診斷或至少一種治療試劑結合。
56.根據權利要求55所述的診斷綴合物，其中該診斷試劑包括至少一種光活診斷試劑。
57.權利要求56的診斷綴合物，其中該診斷試劑為具有60-4,000keV的能量的放射性標記。
58.權利要求57的診斷綴合物，其中該放射性標記為發射γ射線、β射線或正電子的同位素。
59.權利要求58的診斷綴合物，其中該放射性標記選自125I、131I、123I、124I、86Y、186Re、188Re、62Cu、64Cu、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、18F、11C、13N、15O和76Br。
60.權利要求55的診斷綴合物，其中該診斷試劑為造影劑。
61.權利要求60的診斷綴合物，其中該造影劑為包括錳、鐵或釓的金屬。
62.權利要求55的治療綴合物，其中該抗體組分為抗體融合蛋白或其片段，其中該MAb或其片段中的每一個與至少一種治療試劑結合。
63.權利要求55或62的治療綴合物，其中該治療試劑選自放射性標記、免疫調節劑、激素、光活治療試劑、細胞毒性試劑及其組合。
64.權利要求63的治療綴合物，其中該細胞毒性試劑為藥物或毒素。
65.權利要求63的治療綴合物，其中該寡核苷酸為反義寡核苷酸。
66.權利要求64的治療綴合物，其中該藥物具有選自下組的藥物特性抗有絲分裂、烷基化、抗代謝、抗血管生成、細胞凋亡、生物堿、抗激酶和抗生素試劑、紫杉烷以及其組合。
67.權利要求64的治療綴合物，其中該藥物選自氮芥、氮丙啶衍生物、烷基磺酸酯、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、蒽環類、紫杉烷、COX-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗生素、酶、表鬼臼毒素、鉑配位復合物、長春花生物堿、取代的脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質抑制劑、拮抗劑、內他丁、紫杉醇、喜樹堿、阿霉素和它們的類似物以及其組合。
68.權利要求64的治療綴合物，其中該毒素選自蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內毒素。
69.權利要求63的治療綴合物，其中該免疫調節劑選自細胞因子、干細胞生長因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、干細胞生長因子、紅細胞生成素、血小板生成素及其組合。
70.權利要求69的治療綴合物，其中該淋巴毒素為腫瘤壞死因子(TNF)，該造血因子為白細胞介素(IL)，該集落刺激因子為粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，該干擾素為干擾素-α、-β或-γ，并且該干細胞生長因子稱為“S1因子”。
71.權利要求69的治療綴合物，其中該免疫調節劑包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素-γ、TNF-α或其組合。
72.權利要求63的治療綴合物，其中該放射性標記具有60-700keV的能量。
73.權利要求72的治療綴合物，其中該放射性標記選自225Ac、67Ga、90Y、111In、131I、125I、186Re、188Re、177Lu、64Cu、67Cu、212Bi、213Bi、211At、32P及其組合。
74.權利要求63的治療綴合物，其中該光活治療試劑為發色團或染料。
75.在受試者中治療B-細胞淋巴瘤或白血病或者自身免疫病的方法，其包括向該受試者施用治療有效量的權利要求1-20中任何一項的抗CD20MAb或其片段，它們配制在可藥用的載體之中。
76.權利要求75的方法，其進一步包括向該受試者同時或順次施用治療有效量的至少一種選自下組的人源化、嵌合型、人或鼠類MAb與CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產物及其組合反應的MAb，它們配制在可藥用的載體之中。
77.權利要求75的方法，其進一步包括向該受試者同時或順次施用治療有效量的至少一種治療試劑，它們配制在可藥用的載體之中。
78.權利要求77的方法，其中該治療試劑包括細胞毒性試劑、放射性標記、免疫調節劑、激素、酶、寡核苷酸、光活治療試劑或其組合，它們配制在可藥用的載體之中。
79.權利要求78的方法，其中該寡核苷酸為反義寡核苷酸。
80.權利要求76的方法，其進一步包括向該受試者同時或順次施用治療有效量的至少一種治療試劑，它們配制在可藥用的載體之中。
81.權利要求80的方法，其中該治療試劑包括細胞毒性試劑、放射性標記、免疫調節劑、激素、光活治療試劑、寡核苷酸或其組合，它們配制在可藥用的載體之中。
82.權利要求81的方法，其中該寡核苷酸為反義寡核苷酸。
83.權利要求75的方法，其進一步包括向該受試者同時或順次施用治療有效量的含有至少一種與至少一種治療試劑結合的MAb的治療綴合物，其中該MAb包括至少一種選自下組的人源化、嵌合型、人或鼠類MAb與CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產物及其組合反應的MAb，它們配制在可藥用的載體之中。
84.權利要求83的方法，其中該治療試劑包括細胞毒性試劑、放射性標記、免疫調節劑、激素、酶、寡核苷酸、光活治療試劑或其組合，它們配制在可藥用的載體之中。
85.權利要求84的方法，其中該寡核苷酸為反義寡核苷酸。
86.權利要求76的方法，其進一步包括向該受試者同時或順次施用治療有效量的含有至少一種與至少一種治療試劑結合的MAb的治療綴合物，其中該MAb包括至少一種選自下組的人源化、嵌合型、人或鼠類MAb與CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產物及其組合反應的MAb，它們配制在可藥用的載體之中。
87.權利要求86的方法，其中該治療試劑包括細胞毒性試劑、放射性標記、免疫調節劑、激素、酶、寡核苷酸、光活治療試劑或其組合，它們配制在可藥用的載體之中。
88.權利要求86的方法，其中該寡核苷酸為反義寡核苷酸。
89.在受試者中治療B-細胞淋巴瘤或白血病或者自身免疫病的方法，其包括向該受試者施用治療有效量的含有至少兩種MAb或其片段的抗體融合蛋白或其片段，其中該MAb選自權利要求1-31中任何一項的MAb，或者含有至少一種權利要求1-31中任何一項的MAb或其片段和至少一種選自下組的MAb與CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產物及其組合反應的MAb，它們配制在可藥用的載體之中。
90.權利要求89的方法，其進一步包括向該受試者同時或順次施用治療有效量的至少一種治療試劑，它們配制在可藥用的載體之中。
91.權利要求90的方法，其進一步包括細胞毒性試劑、放射性標記、免疫調節劑、激素、光活治療試劑、寡核苷酸或其組合，它們配制在可藥用的載體之中。
92.權利要求91的方法，其中該寡核苷酸為反義寡核苷酸。
93.權利要求77的方法，其進一步包括向該受試者同時或順次施用治療有效量的含有至少一種與至少一種治療試劑結合的MAb的治療綴合物，其中該MAb包括至少一種選自下組的人源化、嵌合型、人或鼠類MAb與CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、Ia、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、VEGF、P1GF、癌基因、癌基因產物及其組合反應的MAb，它們配制在可藥用的載體之中。
94.權利要求93的方法，其中該治療試劑包括細胞毒性試劑、放射性標記、免疫調節劑、激素、酶、寡核苷酸、光活治療試劑或其組合，它們配制在可藥用的載體之中。
95.權利要求94的方法，其中該寡核苷酸為反義寡核苷酸。
96.在受試者中治療B-細胞淋巴瘤或白血病或者自身免疫病的方法，其包括向該受試者施用治療有效量的治療綴合物，該治療綴合物含有與所述細胞結合的權利要求1-31中任何一項的抗CD20MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段，其中該抗CD20MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段與至少一種治療試劑結合，它們配制在可藥用的載體之中。
97.權利要求96的方法，其中該治療試劑包括細胞毒性試劑、放射性標記、免疫調節劑、激素、酶、寡核苷酸、光活治療試劑或其組合，它們配制在可藥用的載體之中。
98.權利要求78、81、84、87、91、94或97中任何一項的方法，其中該細胞毒性試劑為藥物或毒素。
99.權利要求98的方法，其中該藥物具有選自下組的藥物特性抗有絲分裂、烷基化、抗代謝、抗血管生成、細胞凋亡、抗激酶和生物堿試劑、紫杉烷以及其組合。
100.權利要求98的方法，其中該藥物選自氮芥、氮丙啶衍生物、烷基磺酸酯、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、COX-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗生素、酶、表鬼臼毒素、鉑配位復合物、長春花生物堿、取代的脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質抑制劑、拮抗劑、內他丁、紫杉醇、喜樹堿、蒽環類和它們的類似物以及其組合。
101.權利要求98的方法，其中該毒素選自蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內毒素。
102.權利要求78、81、84、87、91、94或97中任何一項的方法，其中該免疫調節劑選自細胞因子、干細胞生長因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、干細胞生長因子、紅細胞生成素、血小板生成素及其組合。
103.權利要求102的方法，其中該淋巴毒素為腫瘤壞死因子(TNF)，該造血因子為白細胞介素(IL)，該集落刺激因子為粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，該干擾素為干擾素-α、-β或-γ，和該干細胞生長因子稱為“S1因子”。
104.權利要求102的方法，其中該免疫調節劑包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素-γ、TNF-α或其組合。
105.權利要求78、81、84、87、91、94或97中任何一項的方法，其中該放射性標記具有60-4,000keV的能量。
106.權利要求105的方法，其中該放射性標記選自225Ac、67Ga、90Y、111In、131I、125I、186Re、188Re、177Lu、64Cu、67Cu、212Bi、213Bi、211At、32P及其組合。
107.權利要求80、83、86、89、93、96或98中任何一項的方法，其中該光活治療試劑為發色團或染料。
108.權利要求75-107中任何一項的方法，其中該受試者為哺乳動物。
109.權利要求108的方法，其中該哺乳動物為人、狗或貓。
110.在受試者中診斷B-細胞淋巴瘤或白血病或者自身免疫病的方法，其包括向該受試者施用診斷綴合物，該診斷綴合物含有與所述細胞結合的權利要求1-34中任何一項的抗CD20MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段，其中該抗CD20MAb或其片段或者抗體融合蛋白或其片段與至少一種治診斷試劑結合，它們配制在可藥用的載體之中。
111.權利要求110的方法，其中該診斷試劑包括至少一種放射性標記、光活診斷試劑或非放射性標記。
112.權利要求111的方法，其中該放射性標記選自發射γ射線、β射線或正電子的同位素。
113.權利要求112的方法，其中該放射性標記具有60-700keV的能量。
114.權利要求112的方法，其中該放射性標記選自125I、131I、123I、86Y、186Re、188Re、62Cu、64Cu、67Cu、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、18F、11C、13N、15O和76Br。
115.權利要求111的方法，其中該非放射性標記為造影劑或非放射性金屬。
116.權利要求115的方法，其中該放射性標記為順磁性離子。
117.權利要求111的方法，其中該非放射性標記為釓、錳或鐵。
118.在患有B-細胞淋巴瘤或白血病或者自身免疫病的患者中預定向細胞的方法，其包括(i)施用權利要求31-33中任何一項的抗體融合蛋白或其片段，其具有至少一個特異地結合所述細胞的臂和至少另一個特異地結合可定向綴合物的臂；(ii)任選向該患者施用清除組合物，從而使得能夠讓該組合物從循環系統中清除未結合抗原的抗體融合蛋白或其片段；和(iii)向該患者施用含有載體部分的可定向綴合物，該載體部分具有或帶有至少一個可被該抗體融合蛋白或其片段的該至少另一個臂所識別的表位，并與至少一種第一治療或診斷試劑綴合。
119.權利要求118的方法，其中該抗體融合蛋白或其片段為雙特異性抗體或其片段。
120.權利要求119的方法，其中該雙特異性抗體為雙抗體。
121.權利要求118-120中任何一項的方法，其中該第一治療試劑選自放射性標記、免疫調節劑、激素、光活治療試劑、細胞毒性試劑、寡核苷酸及其組合，并且其中該第一診斷試劑為放射性標記、光活診斷試劑或非放射性標記中的至少一種。
122.權利要求118-121中任何一項的方法，其中該抗體融合蛋白或其片段與第二治療或診斷試劑綴合。
123.權利要求122的方法，其中該第二治療試劑選自放射性標記、免疫調節劑、激素、光活治療試劑、細胞毒性試劑、寡核苷酸及其組合，和其中該第二診斷試劑為放射性標記、光活診斷試劑或非放射性標記中的至少一種。
124.權利要求122或123的方法，其中該第一和第二治療試劑或診斷試劑是相同的。
全文摘要
本發明提供了人源化、嵌合型和人抗CD20抗體以及CD20抗體融合蛋白，它們與被稱為CD20的B－細胞標記結合，該B－細胞標記可用于B－細胞紊亂如B－細胞惡性腫瘤和自身免疫病的治療和診斷，并且提供了治療和診斷的方法。
文檔編號C12N15/13GK1662557SQ03808357
公開日2005年8月31日 申請日期2003年2月14日 優先權日2002年2月14日
發明者H·漢森, Z·屈, D·M·戈登伯格 申請人:免疫醫療公司