修飾的基因沉默rna及其用途的制作方法

專利名稱：修飾的基因沉默rna及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及有效下調真核細胞和生物中任何目的基因表達的方法和工具。為此，本發明提供了修飾的反義和有義RNA分子，編碼這種修飾的反義或有義RNA分子的嵌合基因和包含該修飾的反義和/或有義RNA分子或編碼的嵌合基因的真核生物，如植物、動物或真菌、酵母或霉菌。
背景技術：
近來，已經表明也稱作干擾RNA(RNAi)或發夾RNA的雙鏈RNA(dsRNA)的導入是將基因沉默導入大量真核生物，包括動物、真菌或植物的有效觸發事件。
已經證明dsRNA介導的基因沉默的定性水平(生物體內基因沉默的水平)和定量水平(群體內顯示出明顯水平基因沉默的生物數量)優于很多常規的反義RNA或有義RNA介導的基因沉默方法。
為了實踐的目的，產生反義RNA分子和編碼這種反義RNA的嵌合分子比產生dsRNA分子或其編碼基因更直接。實際上，嵌合核酸dsRNA分子或其編碼基因含有大的，較完美或較不完美的反轉重復結構，并且這種結構傾向于阻礙這些核酸在中間原核克隆宿主中的完整維持。以下描述的增加反義RNA調節基因沉默效率的方法和工具提供了如不同于實施方案和權利要求中所述的這個問題的解決方法。
US 5,190,131和EP 0 467 349 A1描述了調節或抑制細胞中基因表達的方法和工具，其通過將非天然核酸序列合并入或結合細胞的遺傳物質。所述序列轉錄產生的mRNA與由那個細胞的遺傳物質所產生的mRNA互補并且能夠與之結合。
EP 0 223 399 A1描述了在植物中引起有用的體細胞改變的方法，其通過引起實質上與目標RNA鏈互補的負RNA鏈在植物細胞中的轉錄。該目標RNA鏈可以是基因表達產生的mRNA轉錄物，病毒RNA，或植物細胞中存在的其它RNA。負RNA鏈與目標RNA鏈的至少一部分互補，以體內抑制其活性。
EP 0 240 208描述了調節植物細胞基因組中編碼的基因的表達的方法，其通過將基因整合在宿主中有功能的啟動子的轉錄控制下來完成。在這個方法中，轉錄的DNA鏈與從期望調節的內源基因轉錄的DNA鏈互補。
WO95/15394和US 5908779描述了通過被(小鼠)細胞中核反義RNA的抑制來調節基因表達的方法和構建體。該構建體含有啟動子、反義序列和不依賴聚腺苷酸機器而產生3’的順式或反式核酶且由此抑制該RNA分子轉運到細胞質。
WO98/05770公開了具有特殊二級結構的反義RNA，如(GC)n-回文-(GC)n或(AT)n-回文-(AT)n或(CG)n-回文(CG)n等。
WO 01/12824公開了降低真核細胞中，尤其是植物細胞中感興趣核酸表型表達的方法和工具，其通過對宿主細胞核提供異常的，優選未聚腺苷酸化的，目標特異性RNA。優選，該未聚腺苷酸化的目標特異性RNA通過嵌合基因轉錄來提供，該嵌合基因含有啟動子，編碼目標特異性RNA的DNA區域，自身剪接核酶和參與3’某端形成和聚腺苷酸化的DNA區域。
WO 02/10365提供了真核生物中基因抑制的方法，其通過用含有啟動子，待抑制基因的至少一個反義和/或有義核苷酸序列的重組構建體轉化，其中構建體轉錄產物的細胞核-質轉運被抑制。在一個實施方案中，正常3’UTR的缺乏抑制細胞核-質轉運。該構建體可任選包含至少一個自身切割核酶。該構建體也可以任選包含使用單一啟動子同時下調的多個基因的有義和/或反義序列。也公開了含有重組構建體的載體、植物、動物、精子、配子和胚胎。
Zhao et al.，J.Gen.Virology，82，1491-1497(2001)描述了基于馬鈴薯病毒X的載體在全植物試驗中證明馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(PSTVd)的核靶向作用的用途。
WO 02/00894涉及基因沉默方法，其中核酸構建體在轉錄區域包含由轉錄鏈中T堿基片段組成的DNA區域。
WO 02/00904涉及基因沉默方法，其中核酸構建體包含(或編碼)至少一個宿主表達的目標mRNA的同源物和在其附近的與宿主中任何內源RNA無關的兩個互補RNA區域。
發明簡述本發明的一個實施方案中，提供了下調真核生物細胞中目標基因表達的方法，包括步驟a)給真核生物細胞提供嵌合RNA分子，其中嵌合RNA分子包含i)一個目標基因特異性的區域和多個目標基因特異性的區域，其包含與來自目標基因核苷酸序列的19個連續核苷酸的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；可操作連接于ii)大部分雙鏈化的RNA區域，其包含來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(PSTVd)型類病毒的核定位信號，所述類病毒如馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒、柑橘類病毒III類、柑橘類病毒IV類、啤酒花潛伏類病毒(Hoplatent viroid)、澳大利亞葡萄樹類病毒、番茄planta macho類病毒、椰子萎縮病類病毒、番茄頂矮類病毒(Tomato apical stunt viroid)、椰子死亡類病毒(coconut cadang-cadang viroid)、柑橘裂皮病類病毒、Columnea潛伏類病毒、啤酒花矮病(Hop stunt)類病毒和柑橘彎葉類病毒，或大部分雙鏈化的RNA區域包含至少35個重復的三核苷酸CUG，CAG，GAC或GUC，如44到2000個重復的這些三核苷酸；和b)鑒定其中目標基因表達下調的那些真核生物。
嵌合RNA分子可以包含內含子序列。類病毒可以具有選自下列的基因組核苷酸序列SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQID N07和SEQ ID N08。該真核生物可以是包括選自擬南芥、苜蓿、大麥、菜豆、玉米、棉花、亞麻、豌豆、油菜、水稻、黑麥、紅花、高粱、大豆、向日葵、煙草、小麥、蘆筍、甜菜、椰菜、卷心菜、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、黃瓜、茄子、萵苣、洋蔥、油籽油菜、辣椒、馬鈴薯、南瓜(pumpkin)、小蘿卜、菠菜、南瓜(squash)、番茄、西葫蘆、杏仁、蘋果、杏、香蕉、黑莓、藍莓、可可、櫻桃、椰子、越橘、棗、葡萄、葡萄柚、番石榴、獼猴桃(kiwi)、檸檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、桔子、番瓜、西番蓮(passion fruit)、桃、花生、梨、菠蘿、阿月渾子、李子、覆盆子、草莓、柑橘、胡桃和西瓜的植物。該真核生物也可以是真菌、酵母或霉菌或動物，如人、哺乳動物、魚、牛、山羊、豬、綿羊、嚙齒動物、倉鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、靈長目動物、線蟲、甲殼類動物、對蝦、螃蟹、龍蝦、昆蟲、果蠅、鞘翅目昆蟲、雙翅目昆蟲、鱗翅目昆蟲和同翅目(Homeopteran)昆蟲。
本發明的一個目的是提供下調真核生物細胞中目標基因表達的嵌合RNA分子，其包含一個目標基因特異性的區域或多個目標基因特異性的區域，目標基因特異性區域包含與來自目標基因核苷酸序列的19個連續核苷酸的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；可操作連接于包含來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(PSTVd)型的類病毒的核定位信號的大部分雙鏈化的RNA區域，所述類病毒如馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒、柑橘類病毒III類、柑橘類病毒IV類、啤酒花潛伏類病毒、澳大利亞葡萄樹類病毒、番茄planta macho類病毒、椰子萎縮病類病毒、番茄頂矮類病毒、椰子死亡類病毒、柑橘裂皮病類病毒、Columnea潛伏類病毒、啤酒花矮病類病毒和柑橘彎葉類病毒，或者大部分雙鏈化的RNA區域包含至少35個重復的三核苷酸CUG，CAG，GAC或GUC，如44到2000個重復的這些三核苷酸，其中該嵌合RNA分子當提供給真核生物細胞時下調目標基因的表達。
本發明的另一個目的是提供降低真核生物細胞中目標基因表達的嵌合DNA分子，包括a)能夠在真核生物細胞中被RNA聚合酶識別的啟動子或啟動子區域；可操作連接b)DNA區域，當轉錄時產生RNA分子，該RNA分子包含i)一個目標基因特異性的區域或多個目標基因特異性的區域，其包含與來自目標基因核苷酸序列的19個連續核苷酸的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；可操作連接于ii)大部分雙鏈化的RNA區域，其包含來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(PSTVd)型的類病毒的核定位信號，所述類病毒如馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒、柑橘類病毒III類、柑橘類病毒IV類、啤酒花潛伏類病毒、澳大利亞葡萄樹類病毒、番茄planta macho類病毒、椰子萎縮病類病毒、番茄頂矮類病毒、椰子死亡類病毒、柑橘裂皮病類病毒、Columnea潛伏類病毒、啤酒花矮病類病毒和柑橘彎葉類病毒，或大部分雙鏈化的RNA區域包含至少35個重復的三核苷酸CUG、CAG、GAC或GUC，如44到2000個重復的三核苷酸CUG、CAG、GAC或GUC；和任選iii)進一步包含與編碼該RNA分子的DNA區域可操作連接的轉錄終止和聚腺苷酸化信號。
其中該嵌合DNA分子，當提供給真核生物細胞時降低目標基因的表達。
根據真核宿主生物，啟動子或啟動子區域可以是在動物中有功能的啟動子，在酵母、真菌或霉菌中起作用的啟動子或植物可表達的啟動子。該啟動子也可以是被單亞基噬菌體RNA聚合酶識別的啟動子或啟動子區域。
本發明也提供了來自包含根據本發明的嵌合DNA或RNA分子的真核生物的細胞，以及在其細胞中包含根據本發明的嵌合DNA或RNA分子的非人真核生物。
本發明的另一個目的是提供根據本發明的嵌合RNA或DNA分子在降低真核生物細胞中目標基因表達中的用途。
本發明也提供了制備轉基因真核生物的方法，其中該生物細胞中目標基因的表達降低，該方法包括步驟a)給該生物的一個或多個細胞提供根據本發明的嵌合DNA分子而產生轉基因細胞；和b)從該轉基因細胞生長或再生出轉基因真核生物。
本發明也提供了下調真核生物細胞中目標基因表達的方法，包括步驟a)給該真核生物的細胞提供第一和第二嵌合RNA分子，其中i)第一嵌合RNA分子，包含反義目標基因特異性RNA區域，該區域包含與來自目標基因的核苷酸序列的19個連續核苷酸的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；ii)第二嵌合RNA分子，包含有義目標基因特異性RNA區域，該區域包含與來自第一嵌合RNA分子的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；iii)第一和第二嵌合RNA分子至少在該第一嵌合RNA的19個連續核苷酸和該第二嵌合RNA的19個連續核苷酸之間能夠堿基配對；和iv)其中第一或第二嵌合RNA分子包含與反義目標基因特異性RNA區域或與有義目標基因特異性RNA區域可操作連接的大部分雙鏈化的RNA區域；和b)鑒定其中目標基因表達被下調的那些真核生物。
第一和第二嵌合RNA分子可以包含大量雙鏈化的區域。
本發明的另一個目的是提供來自真核生物的細胞，(以及包含這種細胞的非人真核生物)，包含第一和第二嵌合RNA分子，i)第一嵌合RNA分子，包含反義目標基因特異性RNA區域，該區域包含與來自目標基因核苷酸序列的19個連續核苷酸的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；ii)第二嵌合RNA分子，包含有義目標基因特異性RNA區域，該區域包含與來自第一嵌合RNA分子的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；iii)第一和第二嵌合RNA分子至少在該第一嵌合RNA的19個連續核苷酸和該第二嵌合RNA的19個連續核苷酸之間能夠堿基配對；和其中第一或第二嵌合RNA分子包含與反義目標基因特異性RNA區域或與有義目標基因特異性RNA區域可操作連接的大部分雙鏈化的RNA區域；和本發明進一步提供了用于協同嵌合反義RNA分子以降低真核生物細胞中目標基因表達的嵌合有義RNA分子或編碼這種嵌合有義RNA分子的嵌合DNA分子，其中嵌合有義RNA分子包含有義目標基因特異性RNA區域，包含與所述目標基因核苷酸具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；可操作連接于大部分雙鏈化的RNA區域。
附圖簡述

圖1使用Mfold軟件預測的不同PSTVd型類病毒二級結構的圖解表示。A.馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒；B.澳大利亞葡萄樹類病毒；C.椰子萎縮病類病毒；D.番茄planta macho類病毒；E.耐熱突變體T229的啤酒花潛伏類病毒；F.番茄頂矮類病毒。
圖2本申請的實施例1至3中使用的各種嵌合基因構建體的圖解表示。35S-PCaMV 35S啟動子；Pdk內含子Flaveria trinervia丙酮酸正磷酸二激酶2內含子2；cEIN2來自擬南芥的EIN2基因的cDNA拷貝(對乙烯敏感性所需的基因；Alonso et al.1999 Science 284，2148-2152)，這個區域對于啟動子的方向用箭頭表示；gEIN2來自擬南芥的EIN2基因的基因組拷貝；PSTVd馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒的cDNA拷貝；PSTVd*PSTVd的從核苷酸16至核苷酸355的部分序列，以與完整拷貝PSTVd的反方向克隆；OCS 3′根癌土壤桿菌的章魚肉堿合成酶基因的3′區域。
圖3在1-氨基環丙烷-1-羧酸(ACC)下萌芽的EIN2沉默的植物表型。A.在黑暗中；B.光條件下。Wt野生型植物。
圖4實施例4中使用的各種嵌合基因構建體的圖解表示。CMV啟動子巨細胞病毒啟動子；SV40多聚(A)來自SV40的轉錄終止和聚腺苷酸化區域；PSTVd馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒序列；CUGrep包含60個CUG序列重復的序列；humGFP人源化的綠色熒光蛋白編碼區域(修改為適于人基因的密碼子使用；這個區域相對于啟動子的方向用箭頭表示)；圖5pMBW491(A；采取幾乎野生型構型)和pMBW489中pSTVd的推定的二級結構的圖解表示，其中10個核苷酸缺失產生了與野生型構型不同的結構。
不同實施方案的詳細描述獲得增加反義RNA調節的基因表達下調的當前所述方法和工具是基于預料不到的觀察-目標基因特異性RNA序列與大部分雙鏈化的RNA區域的可操作連接，如包含馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒基因組的核苷酸序列的RNA區域，其包含RNA的核定位信號，當被導入宿主生物細胞時，如植物細胞，增加其中目標基因的基因表達下調的種系的數量，以及其中目標基因的基因表達顯著下調或甚至消失的種系的數量。
因此，在本發明的一個實施方案中，提供了下調真核生物細胞中目標基因表達的方法，包括步驟a)給該真核生物提供嵌合RNA分子，其中RNA分子包含i)目標基因特異性RNA區域，其包含與來自目標基因核苷酸序列的19個連續核苷酸的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列(“反義RNA”)；可操作連接于ii)大部分雙鏈化的RNA區域；和b)鑒定其中目標基因表達下調的那些真核生物。
這里使用的“嵌合基因”或“嵌合核酸”指特定真核物種中正常不存在的任何基因或任何核酸，或者其中啟動子實際上不結合該轉錄DNA區域部分或全部或該基因的至少一個其它調節區域的任何基因。
這里使用的“反義RNA”是指包含大部分與生物活性RNA(通常不排除從目標基因轉錄的mRNA)的核苷酸序列的一部分互補的核苷酸序列的RNA分子。
這里使用表達“目標基因”來指真核細胞中存在和轉錄為生物活性RNA的任何核酸。該目標基因可以是內源基因，它可以是通過人為干預導入該真核細胞祖先的轉基因，或它可以是通過傳染性生物，如土壤桿菌菌株或逆轉錄病毒導入該細胞基因組的基因。該目標基因也可以是病毒來源的。此外，至少19個核苷酸的片段可以選自啟動子區域、5′UTR、編碼區域或3′UTR。
這里使用“基因表達”或“核酸的表達”來指一種過程，其中基因或核酸，當導入合適宿主細胞時，可以轉錄(或復制)而產生RNA，和/或翻譯而產生那個宿主細胞的多肽或蛋白。
這里使用的“基因表達下調”是指在本發明的RNA或嵌合基因存在下，真核細胞中目的目標基因或核酸的表達與不存在本發明的RNA或嵌合基因時，目的目標基因或核酸的表達的比較。本發明的嵌合RNA存在下，目標基因表達因此應該低于不存在時的表達，如僅為嵌合RNA不存在時表型表達的大約50％或25％或大約10％或大約5％。對于很多申請，為了所有實踐目的，該表達應該被嵌合RNA或編碼這種RNA的嵌合基因的存在完全抑制。
這里使用的“包含”解釋為說明所指出的所述特征、整體、步驟或成分的存在，但是不排除一個或更多特征、整體、步驟或成分，或其組合的存在或添加。因此，如包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白，可以包含比實際應用的那個的更多核苷酸或氨基酸，即內含于更大的核酸或蛋白中。包含功能或結構限定的DNA區域的嵌合基因，可以包含另外的DNA區域等。
因此將清楚大約19nt的目標基因特異性RNA區域的有義RNA的最小核苷酸序列可以包含在較大RNA分子內，大小從19nt至等于目標基因大小的長度變化，序列等同性總體程度具有變化。
為了本發明的目的，兩個相關核苷酸或氨基序列的“序列等同性”，以百分比表示，是指兩個最佳比對的序列中具有等同殘基的位置數量(×100)除以相比較的位置數量。缺口，即比對中的一個位置，在這里一個序列存在一個殘基，但是另一個不存在，被認為是具有不等同殘基的位置。用Needleman和Wunsch算法(Needleman and Wunsch 1970)實施兩個序列的比對。使用標準軟件程序如GAP，它是Wisconsin軟件包10.1版本(Genetics Computer Group，Madision，Wisconsin，USA)的一部分，可以方便地實施上述計算機輔助序列比對。使用缺省計分矩陣，缺口產生懲罰是50和缺口延伸懲罰是3。當這種序列具有至少大約75％的序列等同性，尤其是至少大約80％，更尤其至少大約85％，十分尤其大約90％，特別是大約95％，更特別是大約100％時，序列表示為“基本類似”，十分特別是等同。很清楚當RNA序列與DNA序列基本類似或具有某種程度的序列等同性時，認為DNA序列中的胸腺嘧啶(T)等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，當在本申請中陳述19個連續核苷酸的序列與19個核苷酸的序列具有94％序列等同性時，這意味著第一個序列的19個核苷酸中至少18個與第二個序列的19個核苷酸中的18個等同。
因此提及的反義核苷酸區域長度可以是大約21nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt、2000nt或甚至大約5000nt或更長，每一個具有大約40％或50％或60％或70％或80％或90％或100％的總體序列等同性。序列越長，總體序列等同性的要求越不嚴格。
此外，與目標基因的核苷酸序列的互補序列具有序列等同性的多個序列(多個目標基因特異性RNA區域)可以存在于一個RNA分子中。而且，與幾個目標基因的核苷酸序列的互補序列具有序列等同性的多個序列可以存在于一個RNA分子中。
“目標基因特異性”不解釋為這種意義-根據本發明的嵌合核酸僅可用于下調那個特殊目標基因。實際上，當目標基因特異性RNA區域和另一個基因之間存在足夠的同源性時，或當其它基因具有相同的19個核苷酸片段(如屬于所謂的基因家族的基因)時，那些其它基因的表達也可以被下調。
這里使用的“大部分雙鏈化的RNA區域”是指通過內部堿基配對能夠折疊成棒樣結構的RNA分子和其中所產生的棒樣結構不包含與那個RNA分子內19個其它連續核苷酸的另一個片段的互補序列具有94％序列等同性的任何19個連續核苷酸的片段，該RNA分子當折疊成棒樣結構時能夠形成雙鏈區域。換言之，大部分雙鏈化的RNA區域折疊后不含有其中最多有一個錯配的至少19bp的雙鏈RNA區域，至少不是能量最良好的棒樣構象。這種結構的非限制性實施例在圖1中表示。
盡管不意欲將本發明限于具體實施方式
，但是認為這種大部分雙鏈化的RNA區域涉及它們所結合的反義RNA分子的核定位。其結果是，反義RNA分子的濃度在核中可以增加，允許通過與反義RNA對應的有義RNA堿基配對而更有效形成序列特異性dSRNA。
這里使用的關于RNA分子的術語“能夠折疊成棒樣結構”是指二級結構，優選RNA分子被內部堿基配對而改變和具有長棒的總體外觀。棒樣結構可以包括分支和凸出(在那里沒有配對的核苷酸凸出到總體結構外)和可以是較大二級結構的一部分(該較大二級結構可以是或可以不是棒樣)。能夠折疊成棒樣結構的RNA分子的實例在圖1中表示。
改變的特殊二級結構將由RNA分子的自由能確定，并可以使用適當軟件如FOLDRNA(Zuker和Stiegler，1981)或MFOLD結構預測軟件包GCG(Genetics Computing Group；Zuker 1989，Science 244，48-52)預測不同情況。
在本發明的一個實施方案中，可操作連接反義RNA分子的大部分雙鏈化的RNA區域是來自PSTVd型類病毒的核定位信號，如PSTVd(馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒)，能夠在宿主細胞或植物宿主細胞的核中復制。
在本發明的一個實施方案中，大部分雙鏈化的RNA區域包含PSTVD株RG1的全長序列，它可以通過使用具有5′-CGCAGATCTCGGAACTAAACTCGTGGTTC-3′[SEQ ID N01]和5′GCGAGATCTAGGAACCAACTGCGGTTC-3′[SEQ ID N02])的核苷酸序列的寡核苷酸引物擴增該病毒RNA基因組的cDNA拷貝而方便地獲得，如SEQ IDN03所示的核苷酸序列。
人們理解對于插入RNA分子，需要另外步驟將DNA分子轉變為對應的RNA分子。這種轉變可以通過轉錄完成，如使用單亞基噬菌體RNA聚合酶體外轉錄。
也清楚當RNA序列被述為表示序列表的條目或基本類似于或與序列表中表示的DNA序列具有某種程度序列等同性時，RNA序列的參考對應于條目中序列，除了DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被RNA序列中的尿嘧啶(U)取代。根據本文將立即明顯清楚所指是RNA還是DNA序列。
在PSTVd型其它核復制類病毒(或根據Bussière et al.1996分類的B組)的基因組內也發現了類似的大部分雙鏈化的RNA結構，并且這些RNA序列可以用于類似的作用。PSTVd的其它核復制類病毒組包括柑橘類病毒III類、柑橘類病毒IV類、彩葉草類病毒、啤酒花潛伏類病毒(SEQ ID N07)、澳大利亞葡萄樹類病毒(SEQ ID N04)、番茄plantamacho類病毒(SEQ ID N06)、椰子萎縮病類病毒(SEQ ID N05)、番茄頂矮類病毒(SEQ ID N08)、椰子死亡類病毒、柑橘裂皮病類病毒、Columnea潛伏類病毒、啤酒花矮病類病毒和柑橘彎葉類病毒。這些類病毒的特征也是缺乏自身剪接活性，當缺乏催化基序如錘頭基序(Busière et al.Nuc.Acids Res.24，1793-1798，1996)時變得明顯。所有PSTVd型類病毒中完美dsRNA結構的最長片段長度是11個堿基對。錯配通常分布十分平均。
這些類病毒的核苷酸序列已經匯編在通過互聯網(http://www.callisto.si.usherb.ca/～jpperra或http://nt.ars-grin.gov/subviral/)可進入的數據庫中并且包括下列馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(PSTVd)[PSTVd.1(登記號J02287(gb)，M1 6826(gb)，V01465(emb1)；333351(gi)，333352(gi)和62283(gi))；PSTVd.2(登記號M38345(gb)，333354(gi))；PSTVd.3(登記號M36163(gb)，333356(gi))；PSTVd.4(登記號M14814(gb)，333357(gi))；PSTVd.5(株S.commersonii)(登記號M25199(gb)，333355(gi))；PSTVd.6(株番茄栽培種Rutgers，分離物KF440-2)(登記號X58388(emb1)，61 366(gi))；PSTVd.7(輕度株KF6-M)(登記號M88681(gb)，333358(gi))；PSTVd.8(株Burdock)(登記號M88678(gb)，333360(gi))；PSTVd.9(株Wisconsin(WB))(登記號M88677(gb)，333359(gi))；PSTVd.10(株PSTVd-N(Naaldwijk))(登記號X17268(emb1)，60649(gi))；PSTVd.11(輕度株變異體A，WA-M分離物)(登記號X52036(emb1)，61365(gi))；PSTVd.12(輕度株，F-M分離物)(登記號X52037(emb1)，61367(gi))；PSTVd.13(中等嚴重株，F-IS分離物)(登記號X52039(emb1)，61369(gi))；PSTVd.14(嚴重致死株，F-SL分離物)(登記號X52038(emb1)，61368(gi))；PSTVd.15(中等嚴重株，F88-1S分離物)如發表于Herold，T等人，Plant Mol.Biot.19，329-333(1992)；PSTVd.16(變異體F88或S88)(登記號X52040(emb1)，61370(gi))；PSTVd.17(獨立分離物kf5)(登記號M93685(gb)，333353(gi))；PSTVd.18(分離物KF5)(登記號554933(gb)，265593(gi))；PSTVd.19(株S-XII，變種s27)(登記號X76845(emb1)，639994(gi))；PSTVd.20(株S-XIII，變種s23)(登記號X76846(emb1)，639993(gi))；PSTVd.21(株M(輕度))(登記號X76844(emb1)，639992(gi))；PSTVd.22(株1-818，變種14)(登記號X76848(emb1)，639991(gi))；PSTVd.23(株1-818，變種13)(登記號X76847(emb1)，639990(gi))；PSTVd.24(株PSTVd-341)(登記號Z34272(emb1)，499191(gi))；PSTVd.25(株QF B)(登記號U23060(gb)，755586(gi))PSTVd.26(株QF A)(登記號U23059(gb)，755585(gi))；PSTVd.27(株RG1)(登記號U23058(gb)，755584(gi))；PSTVd.28(登記號U51 895(gb)，1272375(gi))；PSTVd.29(馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒)(登記號X97387(emb1)，1769438(gi))；PSTVd.30(株S27-VI-24)(登記號Y09382(emb)，2154945(gi))；PSTVd.31(株S27-VI-19)(登記號Y09383(emb)，2154944(gi))；PSTVd.32(株SXIII)(登記號Y08852(emb)，2154943(gi))；PSTVd.33(株S27-1-8)(登記號Y09381(emb)，2154942(gi))；PSTVd.34(株PSTV M-VI-15)(登記號Y09577(emb)，2154941(gi))；PSTVd.35(株PSTV M-1-40)(登記號Y09576(emb)，2154940(gi))；PSTVd.36(株PSTV M-1-17)(登記號Y09575(emb)，2154939(gi))；PSTVd.37(株PSTV M-1-10)(登記號Y09574(emb)，2154938(gi))；PSTVd.38(變異體14-1-42)(登記號Y09889(emb)，2154937(gi))；PSTVd.39(變異體PSTVd 12-VI-27)(登記號Y09888(emb)，2154936(gi))；PSTVd.40(變異體PSTVd12-VI-25)(登記號Y09887(emb)，2154935(gi))；PSTVd.41(變異體PSTVd12-VI-16)(登記號Y09886(emb)，2154934(gi))；PSTVd.42(變異體PSTVd 14-1-10)(登記號Y09890(emb)，2154933(gi))；PSTVd.43(變異體PSTVd 12-1-14)(登記號Y09891(emb)，2154932(gi))PSTVd.44(分離物KF7)(登記號AJ007489(emb)，3367737(gi))；PSTVd.45(登記號AF369530，14133876(gi)]；柑橘類病毒III類(CVd-III)[CVd-III.1(登記號S76452(gb)，913161(gi))；CVd-III.2(澳大利亞新南威爾士分離物)(登記號S75465(gb)和S76454(gb)，914078(gi)和913162(gi))；CVd-III.3(登記號AF 123879，G17105753)；CVd-III.4(登記號AFi 23878，GI71 05752)CVd-III.5(登記號AF 123877，GI7105751)；CVd-III.6(登記號AF 123876，GI7105750)；CVd-III.7(登記號AF123875，GI7105749)；CVd-III.8(登記號AF 123874，G17105748)；CVd-III.9(登記號AF 123873，G17105747)；CVd-III.10(登記號AF 123872，GI7105746)；CVdIII.11(登記號AF123871，GI7105745)；CVd-III.12(登記號AF 123870，GI7105744)；CVd-III.13(登記號AF 123869，GI7105743)；CVd-III.14(登記號AF123868，GI7105742)；CVdIII.15(登記號AF123867，GI7105741)；CVd-III.16(登記號AF 123866，GI7105740)；CVd-III.17(登記號AF 123865，G17105739)；CVd-III.18(登記號AF 123864，G17105738)CVdIII.19(登記號AF 123863，GI7105737)；CVd-III.20(登記號AF 123860，GI7105736)；CVd-III.21(登記號AF 123859，GI71 05735)；CVd-III.22(登記號AF 123858，G17105734)；CVdIII.23(登記號AB054619，G113537479)；CVd-III.24(登記號AB054620，GI13537480)；CVd-III.25(登記號AB054621，GI13537481)；CVd-III.26(登記號AB054622，GI13537482)；CVd-III.27(登記號AB054623，GI13537483)；CVd-III.28(登記號AB054624，GI13537484)；CVd-III.29(登記號AB054625，GI13537485)；CVd-III.30(登記號AB054626，GI13537486)；CVd-III.31(登記號AB054627，GI13537487)；CVd-III.32(登記號AB054628，G113537488)；CVd-III.33(登記號AB054629，GI13537489)；CVd-III.34(登記號AB054630，GI13537490)；CVd-III.35(登記號AB054631，GI13537491)；CVd-III.36(登記號AB054632，GI13537492)；CVd-III.37(登記號AF416552，GI15811643)；CVd-III.38(登記號AF416553，GI15811644)；CVd-III.39(登記號AF416374，GI15788948)；CVdIII.40(登記號AF434680)]；柑橘類病毒IV類(CVdIV)[CVdIV.1(登記號X14638(emb1)，59042(gi))]彩葉草-1類病毒(CbVd-1)[CbVd.1(彩葉草類病毒1(CbVd1)，栽培株Bienvenue，德國分離物)(登記號X52960(emb1)，58844(gi))；CbVd.2(彩葉草黃類病毒(CYVd)，巴西分離物)(登記號X69293(emb1)，59053(gi))；CbVd.3(彩葉草類病毒1-RG莖-環RNA.)(登記號X95291(emb1)，1770104(gi))；CbVd.4(彩葉草類病毒1-RLRNA)(登記號X95366(emb1)，1770106(gi))J彩葉草-2類病毒(CbVd-2)[CbVd.1(彩葉草類病毒2-RL RNA)(登記號X95365(emb1)，1770107(gi))；CbVd.2(彩葉草類病毒CbVd 4-1RNA)(登記號X97202(emb1)，1770109(gi))]彩葉草-3類病毒(CbVd-3)[CbVd.1(彩葉草類病毒3-RL)(登記號X95364(emb1)，1770108(gi))；CbVd.2(來自彩葉草cultivar′Fairway Ruby′的彩葉草類病毒8)(登記號X57294(emb1)，780766(gi))；CbVd.3(彩葉草類病毒3-FR莖-環RNA，來自彩葉草栽培種′Fairway Ruby′)(登記號X95290(emb1)，1770105(gi))啤酒花潛伏類病毒(HLVd)[HLVd.1(登記號X07397(emb1)，60259(gi))；HLVd.2(′耐熱突變體′T 15)(登記號AJ290404(gb)，13872743(gi))；HLVd.3(′耐熱突變體′T40)(登記號AJ290405.1(gb)，13872744(gi))；HLVd.4(′耐熱突變體′T50)(登記號AJ290406(gb)，13872745(gi))；HLVd.5(′耐熱突變體′T59)(登記號AJ290406(gb)，13872746(gi))；HLVd.6(′耐熱突變體′T61)(登記號AJ290408(gb)13872747(gi))；HLVd.7(′耐熱突變體′T75)(登記號J290409(gb)，13872748(gi))；HLVd.8(′耐熱突變體′T92)(登記號AJ290410(gb)，13872749(gi))；HLVd.9(′耐熱突變體′T218)(登記號AJ290411(gb)，13872750(gi))；HLVd.10(′耐熱突變體′T229)(登記號AJ290412(gb)，13872751(gi))]澳大利亞葡萄樹類病毒(AGVd)[AGVd.1(登記號X17101(emb1)，58574(gi))]番茄planta macho類病毒(TPMVd)[TPMVd.1(登記號K00817(gb))]椰子萎縮病類病毒(CTiVd)[CTiVd.1(登記號M20731(gb)，323414(gi))]番茄頂矮類病毒(TASVd)[TASVd.1(登記號K00818(gb)，335155(gi))；TASVd.2(株印尼)(登記號X06390(emb1)，60650(gi))；TASVd.3(番茄頂矮類病毒-S莖-環RNA.)(登記號X95293(emb1)，1771788(gi))]椰子死亡類病毒(CCCVd)[CCCVd.1(分離物baao 54，ccRNA1快)(登記號J02049(gb)，323275(gi))；CCCVd.2(分離物baao54，ccRNA1快)(登記號J02050(gb)，323276(gi))；CCCVd.3(分離物baao 54，ccRNA 1慢)(登記號J02051(gb)，323277(gi))；CCCVd.4(分離物sLigao 14B，620C，191 D和Ti，ccRNA 1快)(Haseloff等人Nature 299，316-321(1982))CCCVd.5(分離物Ligao Ti，ccRNA 1慢)(Haseloff等人Nature 299，316-321(1982))；CCCVd.6(分離物Ligao 14B，ccRNA1慢)(Haseloff等人Nature 299，316-321(1982))；CCCVd.7(分離物San Nasciso，ccRNA 1慢)(Haseloff等人Nature 299，316-321(1982))]柑橘裂皮病類病毒(CEVd)[CEVd.1(來自三七草的cev)(登記號J02053(gb)，323302(gi))；CEVd.2(株A)(登記號M34917(gb)，323305(gi))；CEVd.3(株de25)(登記號K00964(gb)，323303(gi))；CEVd.4(株de26)(登記號K00965(gb)，323304(gi))；CEVd.5(CEV-JB)(登記號M30870(gb)，484119(gi))；CEVd.6(CEV-JA)(登記號M30869(gb)，484118(gi))；CEVd.7(登記號M30871(gb)，484117(gi))；CEVd.8(CEVA)(登記號M30868(gb)，484116(gi))；CEVd.9(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))CEVd.10(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.11(Visvader，J.E.和Symons，R.H.NucleicAcids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.12(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.13(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic AcidsRes.13，2907-2920(1985))；CEVd.14(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.15(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.16(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.17(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Fes.13，2907-2920(1985))；CEVd.18(Visvader，J.E.和Symons，R.H.NucleicAcids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.19(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.20(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Res.13，2907-2920(1985))；CEVd.21(cev-j classe B)(Visvader，J.E.和Symons，R.H.Nucleic Acids Fes.13，2907-2920(1985))；CEVd.22(葡萄樹類病毒(GV))(登記號Y00328(emb1)，60645(gi))；CEVd.23(CEVd-t)(登記號X53716(emb1)，433503(gi))；CEVd.24(CEVcIs，番茄雜種愈合組織分離物)(登記號567446(gb)，141247(gi))；CEVd.25(0EV D-92)(登記號S67442(gb)，141248(gi))；CEVd.26(CEVt，番茄雜種分離物)(登記號S67441(gb)，141246(gi))；CEVd.27(C EVt，番茄分離物)(登記號S67440(gb)，141245(gi))；CEVd.28(CEVg，三七草分離物)(登記號S67438(gb)，41244(gi))；CEVd.29(CEVc，香緣分離物)(登記號S67437(gb)，141243(gi))CEVd.30(株CEVd-225)(登記號U21126(gb)，710360(gi))；CEVd.31(大菜豆分離物，蠶豆)(登記號S79831(gb)，1 181910(gi))；CEVd.32(cevd.31接種番茄后獲得的變異體)(Fagoaga等人.J.Gen.Virol.76，2271-2277(1995))；CEVd.33(Fagoaga等人J.Gen.Virol.76，2271-2277(1995))；CEVd.34(登記號AF298177，15419885(gi))；CEVd.35(登記號AF2981 78，15419886(gi))；CEVd.36(登記號AF428058)(柑橘裂皮病類病毒分離物205-E-1 Uy，完整基因組.)；CEVd.37(登記號AF428059)(柑橘裂皮病類病毒分離物205-E-2 Uy，完整基因組.)；CEVd.38(登記號AF428060)(柑橘裂皮病類病毒分離物205-E-5 Uy，完整基因組.)；CEVd.39(登記號AF428061)(相橘裂皮病類病毒分離物205-E-7 Uy，完整基因組.)；CEVd.40(登記號AF428062)(柑橘裂皮病類病毒分離物54-E-1 Uy，完整基因組.)；CEVd.41(登記號AF428063)(柑橘裂皮病類病毒分離物54-E-3 Uy，完整基因組.)；CEVd.42(登記號AF428064)(柑橘裂皮病類病毒分離物54-E-18 Uy，完整基因組.)；CEVd.43(登記號AF434678)(柑橘裂皮病類病毒，完整基因組.)]Columnea潛伏類病毒(CLVd)[CLVd.1(登記號X15663(emb1)，58886(gi))；.CLVd.2(CLVd-N，獨立分離物Nematanthus)(登記號M93686(gb)，323335(gi))；CLVd.3(Columnea潛伏類病毒-B莖-環RNA)(登記號X95292(emb1)，1770174(gi))]柑橘彎葉類病毒(CBLVd)[CBLVd.1(CVd-1b)(登記號M74065(gb)，323413(gi))；CBLVd.2(株CBLVd-225)(登記號U21125(gb)，710359(gi))；CBLVd.3(類病毒Ia基因組RNA，分離物Jp)(登記號AB006734(dbj)，2815403(gi))；CBLVd.4(類病毒1b基因組RNA，分離物P2)(登記號AB006735(dbj)，2815401(gi))；CBLVd.5(類病毒Ia基因組RNA)(登記號AB006736(dbj)，2815402(gi))；CBLVd.6(柑橘類病毒Ia克隆17)(登記號AF040721(gb)，3273626(gi))；CBLVd.7(柑橘類病毒Ia克隆18)(登記號AF040722(gb)，3273627(gi))；CBLVd.8(柑橘彎葉類病毒分離物201-1-1Uy，完整基因組.)(登記號AF428052)；CBLVd.9(柑橘彎葉類病毒分離物201-1-2 Uy，完整基因組.)(登記號AF428053)；CBLVd.10(柑橘彎葉類病毒分離物201-1-5 Uy，完整基因組.)(登記號AF428054)；CBLVd.11(柑橘彎葉類病毒分離物205-1-1 Uy，完整基因組.)(登記號AF428055)；CBLVd.12(柑橘彎葉類病毒分離物205-1-3Uy，完整基因組.)(登記號AF428056)；CBLVd.13(柑橘彎葉類病毒分離物205-1-4 Uy，完整基因組.)(登記號AF428057)]啤酒花矮病類病毒(HSVd)[HSVd.h1(日本型株)(登記號X00009(emb1)，60684(gi))；HSVd.h2(日本株，變異體2)(Lee等人Nucleic Acids Res.16，8708-8708(1988))；HSVd.h3(韓國株)(登記號X12537(emb1)，60421(gi))；HSVd.g1(葡萄樹類病毒(GVVd)，分離物SHV-g(GV))(登記號M35717(gb)，325405(gi))；HSVd.g2(株德國栽培種Riesling)(登記號X06873(emb1)，60422(gi))；HSVd.g3(株分離自Vitis vinifera Rootstock 5BB)(登記號X15330(emb1)，60648(gi))；HSVd.g4(葡萄樹分離物(HSVdg)，變異體Ia)(登記號X87924(emb1)，897764(gi))；HSVd.g5(分葡萄樹離株(HSVdg)，變異體Ib)(登記號X87923(emb1)，897765(gi))；HSVd.g6(葡萄樹分離物(HSVdg)，變異體Ic)(登記號X87925(emb1)，897766(gi))；HSVd.g7(葡萄樹分離物(HSVdg)，變異體1d)(登記號X87926(emb1)，897767(gi))；HSVd.g8(葡萄樹分離物(HSVdg)，變異體1e)(登記號X87927(emb1)，897768(gi))；HSVd.g9(葡萄樹分離物(HSVdg)，變異體IIa)(登記號X87928(emb1)，897769(gi))；HSVd.cit1(變異體1，分離物HSV-cit)(登記號X06718(emb1)，60646(gi))；HSVd.cit2(變異體2，分離物HSV-cit)(登記號X06719(emb1)，60647(gi))；HSVd.cit3(HSV.柑橘)(登記號X13838(emb1)，60418(gi))；HSVd.cit4(登記號U02527(gb)，409021(gi))；HSVd.cit5(Hsu等人Virus Genes 9，193-195(1995))；HSVd.cit6 cit5(Hsu等人VirusGenes 9，193-195(1995))；HSVd.cit7(分離物CVd-11a或E819)(登記號AF131248(gb))；HSVd.cit8(分離物CVd-11b或Ca902)(登記號AF131249(gb))；HSVd.cit9(分離物CVd-11c or Ca905)(登記號AF131250(gb))；HSVd.cit10(分離物Ca903)(登記號AF131251(gb))；HSVd.cit11(分離物CA909)(登記號AF131252(gb))；HSVd.cit12(cachexia分離物X-701-M)(登記號AF21 3483(gb)，12082502(gi))；HSVd.cit13(cachexia分離物X-701-1)(登記號AF213484(gb)，12082503(gi))；HSVd.cit14(cachexia分離物X-701-2)(登記號AF213485(gb)，12082504(gi))；HSVd.cit15(cachexia分離物X-701-3)(登記號AF213486(gb)，12082505(gi))；HSVd.cit16(cachexia分離物X-704-M)(登記號AF213487(gb)，12082506(gi))；HSVd.cit17(cachexia分離物X-704-1)(登記號AF213488(gb)，12082507(gi))；HSVd.cit18(cachexia分離物X-704-2)(登記號AF213489(gb)，12082508(gi))；HSVd.cit19(cachexia分離物X-704-3)(登記號AF213490(gb)，12082509(gi))；HSVd.cit20(cachexia分離物X-707-M)(登記號AF213491(gb)，12082510(gi))；HSVd.cit21(cachexia分離物X-707-1)(登記號AF213492(gb)，12082511(gi))；HSVd.cit22(cachexia分離物X-707-2)(登記號AF213493(gb)，12082512(gi))；HSVd.cit23(cachexia分離物X-707-3)(登記號AF213494(gb)，12082513(gi))；HSVd.cit24(cachexia分離物X-707-4)(登記號AF213495(gb)，12082514(gi))；HSVd.cit25(cachexia分離物X-712-M)(登記號AF213496(gb)，12082515(gi))；HSVd.cit26(cachexia分離物X-712-1)(登記號AF213497(gb)，12082516(gi))；HSVd.cit27(cachexia分離物X-712-2)(登記號AF213498(gb)，12082517(gi))；HSVd.cit28(cachexia分離物X-712-3)(登記號AF213499(gb)，12082518(gi))；HSVd.cit29(cachexia分離物X-715-M)(登記號AF213500(gb)，12082519(gi))；HSVd.cit30(cachexia分離物X-715-1)(登記號AF213501(gb)，12082520(gi))；HSVd.cit31(cachexia分離物X-715-2)(登記號AF213502(gb)，12082521(gi))；HSVd.cit32(CVd-lia(117))(登記號AF213503(gb)，12082522(gi))；HSVd.cit33(分離物CVd-11a 17uy)(登記號AF359276(gb)，13991644(gi))；HSVd.cit34(分離物CVd-11a 11uy)(登記號AF359275(gb)，13991643(gi))；HSVd.cit35(分離物CVd-11a 10 uy)(登記號AF359274(gb)，13991642(gi))；HSVd.cit36(分離物CVd-1b 10uy)(登記號AF359273(gb)，13991641(gi))；HSVd.cit37(分離物CVd-1b 5uy)(登記號AF359272(gb)，13991640(gi))；HSVd.cit38(分離物CVd-1b 3uy)(登記號AF359271(gb)，13991639(gi))；HSVd.cit39(分離物CVd1b 2uy)(登記號AF359270(gb)，13991638(gi))；HSVd.cit40(分離物CVd-11a)(登記號X69519(emb1)，2369773(gi))；HSVd.cit41(分離物CVd-11b)(登記號X69518(emb1)，2369774(gi))；HSVd.cit42(分離物CVd-11a54-2-1)(登記號AF416554，15811 645(gi))；HSVd.cit43(分離物CVd-11a 54-2-2)(登記號AF41 6555，15811 646(gi))；HSVd.cit44(分離物CVd-11a 205-2-4)(登記號AF416556，15811647(gi))；HSVd.cit45(分離物CVd-11a 205-2-1)(登記號AF416557，15811648(gi))；HSVd.p1(HSV-桃(A9))(登記號D13765(dbj)，221254(gi))；HSVd.p2(HSV-李子和HSV-桃(AF)分離物)(登記號D13764(dbj)，221255(gi))；HSVd.p3(來自西班牙的栽培種JeronimoJ-16)(登記號Y09352(emb1)，1684696(gi))；HSVd.apr1(來自法國的栽培種Rouge de Roussillon)(登記號Y08438(emb1)，2462494(gi))；HSVd.apr2(來自西班牙的未知栽培種)(登記號Y08437(emb1)，2462495(gi))；HSVd.apr3(來自西班牙的栽培種Bulida)(登記號Y09345(emb1)，1684690(gi))；HSVd.apr4(來自西班牙的栽培種Bulida)(登記號Y09346(emb1)，1684691(gi))；HSVd.apr5(來自西班牙的栽培種Bulida d′Arques)(登記號Y09344(emb1)，1684692(gi))；HSVd.apr6(來自西班牙的栽培種Pepito del Rubio)(登記號Y09347(emb1)，1684697(gi))；HSVd.apr7(來自西班牙的栽培種Pepitodel Rubio)(登記號09348(emb1)，1684699(gi))；HSVd.apr8(來自西班牙的栽培種Pepito del Rubio)(登記號Y09349(emb1)，684698(gi))；HSVd.apr9(來自摩洛哥的栽培種Canino)(登記號AJ297825(gb)，10944963(gi))；HSVd.aprlo(來自摩洛哥的cv.Canino)(登記號AJ297826(gb)，10944964(gi))；HSVd.apr11(來自摩洛哥的栽培種Canino)(登記號AJ297827(gb)，10944965(gi))；HSVd.apr12(來自摩洛哥的栽培種Canino)(登記號AJ297828(gb)，10944966(gi))；HSVd.apr13(來自摩洛哥的栽培種Canino)(登記號AJ297829(gb)，10944967(gi))；HSVd.apr14(來自土耳其的栽培種Septik)(登記號AJ297830(gb)，10944968(gi))；HSVd.apr15(來自塞浦路斯的栽培種Monaco bello)(登記號AJ297831(gb)，10944969(gi))；HSVd.apr16(來自塞浦路斯的栽培種Cafona)(登記號AJ297832(gb)，10944970(gi))；HSVd.apr17(來自塞浦路斯的栽培種Cafona)(登記號AJ297833(gb)，10944971(gi))；HSVd.apr18(來自塞浦路斯的栽培種Boccuccia spinosa)(登記號AJ297834(gb)，10944972(gi))；HSVd.apr19(來自塞浦路斯的栽培種Palumella)(登記號AJ297835(gb)，10944973(gi))；HSVd.apr20(來自塞浦路斯的栽培種Palumella)(登記號AJ297836(gb)，10944974(gi))；HSVd.apr21(來自塞浦路斯的栽培種Canino)(登記號AJ297837(gb)，10944975(gi))；HSVd.apr22(來自希臘的栽培種Kolioponlou)(登記號AJ297838(gb)，10944976(gi))；HSVd.apr23(來自希臘的栽培種Bebecou Paros)(登記號AJ297839(gb)，10944977(gi))；HSVd.apr24(來自希臘的栽培種Bebecou Paros)(登記號AJ297840(gb)，10944978(gi))；HSVd.c1(黃瓜白果類病毒(CPFVd)，分離物HSV-黃瓜)(登記號X00524(emb1)，60644(gi))；HSVd.c2(黃瓜白果類病毒(CPFVd))(登記號X07405(emb1)，5901 5(gi))；HSVd.alm1(登記號AJO11813(emb)，3738118(gi))；HSVd.a1m2(登記號AJO11814(emb)，3738119(gi))；HSVd.柑橘類病毒II，完整基因組(登記號AF434679)]。所有這些核苷酸序列并入這里作為參考。
如上表立刻明顯，類病毒非常傾向于序列變異，這種自然變異體葉可以用于當前描述的方法和工具，特別是如果它們保留了連同任何可操作連接的RNA被轉運到核的能力。
除了類病毒核苷酸序列中的天然變異，變異體可以通過特定核苷酸的置換、缺失或添加而獲得，這種變異體也可適合當前描述的方法和工具，尤其是如果它們保留了連同任何可操作連接的RNA被轉運到核的能力。
此外，得自類病毒核苷酸序列的較小RNA區域及其變異體可以用于本發明，它們能夠連同任何可操作連接的RNA轉運到核。
得自類病毒核苷酸序列的較小區域和變異體被轉運到宿主細胞如植物細胞的核的能力，可以使用Zhou等人2001，J.Gen Virology，82，1491-1497所述試驗來確定。簡言之，該試驗包括依靠在宿主細胞細胞質中復制的病毒RNA載體將標記基因編碼區域中包含插入序列的標記編碼區域如GFP導入宿主細胞。當導入有功能的核定位信號(方便地插于插入序列中的)時，包含標記基因的病毒RNA載體進入核中，在那里可以去除內含子并且剪接的RNA返回細胞質。可以通過翻譯為GFP蛋白，以及通過RNA分析方法(如RT-PCR)檢測剪接的RNA以證實剪接的RNA分子缺乏內含子。
此外，人肝炎δRNA是與PSTVd型類病毒很相似的1700nt單鏈環狀RNA，因為位于核中，形成棒樣結構，并且也可以根據本發明使用。
在本發明的另一個實施方案中，大部分雙鏈化的RNA區域包含CUG、CAG、GAC或GUC重復。這里使用的“三核苷酸”重復或CUG、CAG、GAC或GUC重復是包含很多CUG、CAG、GAC或GUC三核苷酸的RNA分子。優選，CUG三核苷酸重復且不含插入序列，盡管在CUG三核苷酸重復之間可以偶爾存在不是由CUG三核苷酸組成的1至20-30核苷酸的短區域。優選，CUG重復包含超過35個拷貝或44個拷貝的很多CUG三核苷酸，如50和2000個拷貝之間的任何數量。方便地，CUG三聯體的拷貝數量應該不超過100或150。期望CAG、GAC或GUC重復可以用于類似作用。
不意欲將本發明限于具體實施方式
，據教導這種三核苷酸重復通過不完美的堿基配對形成棒樣結構，起著核保留信號的作用，可能通過空間位阻RNA通過核控輸出，以及活化雙鏈RNA依賴性蛋白激酶PKR(Daviset al，1997 Proc.NatI.Acad.Sci.94，7388-7393；Tian et al.2000RNA 6，79-87；Koch和Lefert 1998 J.Theor.Biol.192，505-514)。
當包含這種CUG重復的RNA分子可以傳遞到宿主細胞核時，如通過如這里所述的編碼這種RNA的嵌合基因轉錄，CUG重復可能特別適合于增加反義調節的基因沉默效率。
盡管大部分雙鏈化的RNA區域，如PSTVd型類病毒衍生的核定位信號或三核苷酸重復可方便地定位于目標特異性反義RNA的3′末端，預期大部分雙鏈化的RNA的位置不很重要。因此，大部分雙鏈化的RNA區域也可以位于RNA分子的5′末端，優選在3′末端，或甚至在這種RNA分子的中間。
也出乎意料地發現提供給宿主細胞的RNA分子中含入內含子序列可進一步增加反義調節的基因表達下調的效率，其中反義RNA可操作連接大部分雙鏈化的RNA區域。再次，RNA分子中內含子對于目標特異性核苷酸序列以及大部分雙鏈化的RNA區域的位置預期對效率具有微小作用。事實上，預期大部分雙鏈化的RNA區域可以位于內含子序列中。
這里使用的“內含子“或插入序列用于指較大的被轉錄DNA區域內的DNA區域，它在核中轉錄產生，是較大RNA一部分的RNA區域，然而，當轉移到細胞質時，從較大RNA中除去所述對應于內含子序列的RNA區域。相應的RNA也稱作內含子或插入序列。內含子序列兩側連接剪接位點，且合成內含子可以通過將適當剪接位點連接具有適當分支點的基本上任何區域來產生。可以使用位于5′UTR、編碼區或3′UTR中的內含子或插入序列。
優選插入序列或內含子能夠在真核生物細胞中被剪接，盡管可能不再被剪接的插入序列的存在，如因為它們的引導序列已經改變或突變，甚至可以進一步增加嵌合RNA分子下調目標基因表達的效率。在本發明的一個實施方案中，內含子基本上與Flaveria trine的丙酮酸正磷酸二激酶2內含子2(pdk2內含子)序列等同，并且可以包含SEQ ID NO 9的序列。植物內含子的其它實例包括來自蓖麻子的過氧化氫酶內含子(登記號AF274974)，來自棉花的δ12去飽和酶(Fad2)內含子(登記號AF331 163)，來自擬南芥的δ12去飽和酶(Fad2)內含子(登記號AC 069473)，來自玉米的泛素內含子(登記號594464)，來自水稻的肌動蛋白內含子。哺乳動物病毒內含子的其它實例包括來自SV40的內含子。真菌內含子的實例包括來自曲霉屬的丙糖磷酸異構酶的內含子。
也出乎意料地發現導入具有相應于真核生物細胞中已經存在的反義RNA分子的目標基因特異性區域的目標基因特異性區域的有義RNA分子，進一步增加目標基因表達的下調效率。如果提供這里所述的帶有大部分雙鏈化的RNA區域的有義RNA分子可以觀察到相同的目標基因表達下調效率。有義RNA分子提供給真核宿主生物細胞，所述細胞同時具有通過與有義RNA分子堿基配對能夠形成雙鏈RNA的反義RNA分子。
因此，本發明的另一個實施方案中，提供了下調真核生物細胞中目標基因表達的方法，包括步驟a)給真核生物細胞提供第一和第二嵌合RNA分子，其中i)第一嵌合RNA分子，包含反義目標基因特異性RNA區域，該區域包含與來自目標基因核苷酸序列的19個連續核苷酸的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；ii)第二嵌合RNA分子，包含有義目標基因特異性RNA區域，該區域包含與來自第一嵌合RNA分子的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；iii)第一和第二嵌合RNA分子至少在第一嵌合RNA的19個連續核苷酸和第二嵌合RNA的19個連續核苷酸之間能夠堿基配對；和iv)其中第一或第二嵌合RNA分子包含與反義目標基因特異性RNA區域或與有義目標基因特異性RNA區域可操作連接的大部分雙鏈化的RNA區域；和b)鑒定其中目標基因表達下調的那些真核生物。
在另一個具體實施方案中，第一和第二嵌合RNA分子包含大量雙鏈區域。該大部分雙鏈化的RNA區域和目標基因特異性反義RNA的具體實施方案如本申請別處所述。有義RNA區域的具體實施方案類似于反義RNA區域的具體實施方案。
方便地，包含如這里所述的大部分雙鏈化的RNA區域的反義或有義RNA分子可以通過導入和可能的整合其轉錄產生這種反義或有義RNA的嵌合基因而提供給真核宿主細胞或生物。因此，本發明也旨在提供這種嵌合基因，它包含-能夠在目的真核生物細胞中表達的啟動子或啟動子區域，可操作連接于轉錄時產生反義RNA分子的DNA區域，該RNA包含-與來自目標基因核苷酸序列的19個連續核苷酸的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的目標基因特異性反義核苷酸序列；或-與來自目標基因核苷酸序列的19個連續核苷酸具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的目標基因特異性有義核苷酸序列；可操作連接于-這里所述的大部分雙鏈化的RNA區域；和任選-適合選擇的真核細胞的轉錄終止和聚腺苷酸化區域。
這里使用的術語“啟動子”表示轉錄起始過程中被DNA依賴性RNA聚合酶識別和結合(直接或間接)的任何DNA。啟動子包括轉錄起始位點，和轉錄起始因子及RNA聚合酶結合位點，并且可以包含各種其它位點(如增強子)，在該位點，可以結合基因表達調節蛋白。
這里使用的術語“調節區域”是指參與驅動轉錄和控制(即調節)給定DNA序列，如編碼蛋白或多肽的DNA的轉錄時間和水平的任何DNA。例如，5’調節區域(“啟動子區域”)是位于編碼序列上游(即5’)的DNA序列，且其包括啟動子和5’非翻譯引導序列。3’調節區域是位于編碼序列下游(即3’)的DNA序列，且其包括合適的轉錄終止(和/或調節)信號，該信號包括一個或多個聚腺苷酸化信號。
在本發明的一個實施方案中，啟動子是組成型啟動子。在本發明的另一個實施方案中，通過外部或內部刺激物(誘導型啟動子)增加啟動子活性，刺激物如但不限于激素、化學化合物、機械脈沖、非生物或生物性壓力條件。也可以時間或空間模式調節啟動子的活性(組織特異性啟動子；發育調節的啟動子)。
在本發明的一個特定實施方案中，啟動子是植物可表達的啟動子。這里使用的術語“植物可表達的啟動子”是指能夠在植物細胞中控制(啟動)轉錄的DNA序列。這包括植物來源的任何啟動子，但也包括能夠在植物細胞中指導轉錄的非植物來源的任何啟動子，即某些病毒或細菌來源的啟動子，如CaMV35S(Hapster et al.，1988)，地下三葉草病毒啟動子4或7(WO9606932)，或T-DNA基因啟動子，也包括組織特異性或器官特異性啟動子，包括但不限于種子特異性啟動子(如WO89/03887)，器官原基特異性啟動子(An et al.，1996)，莖特異性啟動子(Keller et al.，1988)，葉特異性啟動子(Hudspeth et al.，1989)，葉肉特異性啟動子(如光誘導型Rubisco啟動子)，根特異性啟動子(Keller et al.，1989)，塊莖特異性啟動子(Keil et al.，1989)，脈管組織特異性啟動子(Pelemanet al.，1989)，雄蕊選擇性啟動子(WO 89/10396，WO 92/13956)，裂開帶(dehiscence zone)特異性啟動子(WO 97/13865)等等。
在本發明的另一個特定實施方案中，啟動子是真菌表達型啟動子。這里使用的術語“真菌表達型啟動子”是指能夠在真菌細胞中控制(啟動)轉錄的DNA序列，例如但不限于構巢曲霉trpC基因啟動子，或啤酒酵母GAL4誘導型啟動子。
在本發明的另一個特定實施方案中，啟動子是動物表達型啟動子。這里使用的術語“動物表達型啟動子”是指能夠在動物細胞中控制(啟動)轉錄的DNA序列，包括但不限于SV40晚期和早期啟動子，巨細胞病毒CMV-IE啟動子，RSV-LTR啟動子，SCSV啟動子，SCBV啟動子等等。
用于本發明的反義或有義RNA分子也可以通過體外轉錄產生。為此，根據本發明的嵌合基因的啟動子可以是噬菌體單亞基RNA聚合酶識別的啟動子，噬菌體單亞基RNA聚合酶如來源于大腸桿菌噬菌體T7，T3，1，11，W31，H，Y，A1，122，cro，C21，C22和C2；惡臭假單胞菌噬菌體gh-1；鼠傷寒桿菌噬菌體SP6；粘質沙雷氏菌噬菌體IV；檸檬酸桿菌噬菌體ViIII；和克雷白氏桿菌噬菌體11的RNA聚合酶[Hausmann，CurrentTopics in Microbiology and Immunology，7577-109(1976)；Korstenet al.，J.Gen Virol.4357-73(1975)；Dunn et al.，Nature NewBiology，23094-96(1971)；Towle et al.，J.Biol.Chem.2501723-1733(1975)；Butler and Chamberlin，J.Biol.Chem.，2575772-5778(1982)]。這種啟動子的實例分別是T3 RNA聚合酶特異性啟動子和T7 RNA聚合酶特異性啟動子。在CIG用作第一啟動子的T3啟動子可以是McGraw et al，NucI.Acid Res.136753-6766(1985)所述的任何T3基因啟動子。或者，T3啟動子可以是為了被T3 RNA聚合酶識別而在核苷酸位置-10，-11和-12被修飾的T7啟動子[(Klement et al.，J.Mol.Biol.215，21-29(1990)]。優選的T3啟動子是具有“一致”序列的T3啟動子，如美國專利5,037,745所述。根據本發明可以與T7 RNA聚合酶聯合使用的T7啟動子，包含Dunn和Studier，J.Mol.Biol.166477-535(1983)所述的T7基因之一的啟動子。優選的T7啟動子是具有“一致”序列的T7啟動子，如Dunn和Studier(前述)所述。
通過在本領域技術人員熟知的條件下，通過接受載體DNA接觸適當噬菌體單亞基RNA聚合酶可大量產生反義或有義RNA。所產生的反義或有義RNA接著可以用于傳遞給傾向于基因沉默的細胞，如植物細胞、真菌細胞或動物細胞。反義RNA可以通過脂質體或其它轉染試劑(如來自ClonTech的Clofection轉染試劑或CalPhos哺乳動物轉染試劑盒)導入動物細胞并可以通過使適當目標基因沉默而用于治療包括人的動物的方法。反義或有義RNA可以以多種不同方法導入細胞。例如，可以通過顯微注射、用被該反義或有義RNA包裹的微粒轟擊、細胞或生物浸透于反義或有義RNA的溶液、在反義或有義RNA存在下電穿孔細胞膜、脂質體介導的反義或有義RNA傳遞和化學試劑如磷酸鈣介導的轉染、病毒感染、轉化等等給予反義或有義RNA。反義或有義RNA可以連同增加細胞攝入RNA、穩定退火鏈或增加目標基因抑制的成分一起導入。在完整動物的情況下，通過注射或灌注到生物的體腔或間隙腔，或通過口服、局部、腸胃外(包括皮下、肌內、靜脈內給予)、鞘內、直腸、鼻內、眼或腹膜內系統給予可以方便地導入反義或有義RNA。也可以通過可植入的延長釋放裝置給予反義或有義RNA。
根據本發明的能夠產生反義或有義RNA的嵌合基因也可以裝配適合在特定原核宿主中表達反義或有義RNA的原核啟動子。該原核宿主可以用作反義和/或有義RNA的來源，如通過將它喂給動物，如線蟲或昆蟲，其中通過報道基因表達降低來顯現和監測目標基因的沉默。在這種情況下，將清楚目標基因和報道基因應該是目標真核生物細胞而非原核宿主生物中存在的基因。因此可以在一個宿主生物中產生根據本發明的反義或有義RNA或能夠產生這種反義或有義RNA分子的嵌合基因，可以給予另一個目標生物(如飼喂作為裸DNA或RNA分子或囊包在脂質體中，病毒顆粒中或減毒病毒顆粒中，或惰性顆粒等中通過口服給予)并引起目標基因或另一個生物中基因的基因表達降低。
合適的轉錄終止和聚腺苷酸化區域包括但不限于SV40聚腺苷酸信號，HSV TK聚腺苷酸化信號，根癌土壤桿菌的胭脂氨酸合酶基因終止子，CaMV 35S轉錄物的終止子，地下三葉草病毒的終止子，構巢曲霉(Aspergillus nidulans)trpC基因的終止子等等。
本發明也旨在提供反義或有義RNA，它可以通過從這些嵌合基因轉錄而獲得，并且用于根據本發明的方法。
本發明的另一個目的是提供含有本發明的反義RNA分子，或含有能夠產生本發明的反義RNA分子的嵌合基因的真核細胞，和非人真核生物。在優選實施方案中，嵌合基因穩定整合到真核生物細胞的基因組中。
提供同時含有有義和反義RNA分子，其中一個或兩個RNA分子都包含大部分雙鏈化的RNA區域，或含有編碼這種RNA分子的嵌合基因的真核細胞和非人真核生物也是本發明的一個目的。
在另一個實施方案中，本發明的嵌合基因可以在能夠在真核生物細胞中自主復制的DNA分子上提供，如病毒載體。該嵌合基因或有義或反義RNA也可以短暫提供給真核生物細胞。
嵌合基因(或RNA分子)導入宿主細胞可以通過各種方法來完成，包括磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、電穿孔、微粒轟擊、顯微注射到核等等。
嵌合基因導入植物細胞的方法是本領域熟知的，包括土壤桿菌介導的轉染、微粒槍傳遞、顯微注射、完整細胞電穿孔、聚乙二醇介導的原生質體轉化、原生質體電穿孔、脂質體介導的轉化、硅晶介導的轉化等。這種方法獲得的轉化細胞接著可以再生為成熟的可育植物。
通過將嵌合基因注射到受精卵母細胞的原核，通過將細胞，優選未分化細胞移植到發育的胚胎中而產生嵌合胚胎，通過將來自重組細胞的核移植到去核胚胎或活化卵母細胞等等，可以產生轉基因動物。本領域已經很好建立了轉基因動物的產生方法，包括美國專利4,873,191；Rudolph et al.1999(Trends Biotechnology 17367-374)；Dalrympleet al.(1998)Biotechnol.Genet.Eng.Rev.1533-49；Colman(1998)Bioch.Soc.Symp.63141-147；Wilmut et al.(1997)Nature 385810-813，Wilmute et al.(1998)Reprod.Fertil.Dev.10639-643；Perry et al.(1993)Transgenic Res.2125-133；Hogan et al.Manipulating the Mouse Embryo，2nd ed.Cold Spring HarborLaboratory press，1994和這里引用的參考文獻。
通過常規繁育方法產生的包含本發明嵌合基因的植物或動物的配子、種子、胚、子代、雜種也包括在本發明的范圍內。
這里描述的方法和工具可以應用于其中發生基因沉默的任何真核生物，包括但不限于植物(如玉米、小麥、向日葵、草坪草、大麥、黑麥、番茄、甘蔗、紅花、棉花、擬南芥、水稻、芥屬植物、蔬菜、大豆、煙草、樹、亞麻、棕櫚樹、花生、菜豆等)、無脊椎動物(如昆蟲、貝類動物、軟體動物、甲殼類動物如螃蟹、龍蝦和對蝦)、脊椎動物(魚、鳥類動物、哺乳動物、人)、酵母和真菌和其它。
下列非限制性實施例描述了增加反義RNA調節的真核生物細胞中目標基因表達沉默或有義/反義RNA聯合調節的目標基因沉默的方法和工具。
除非在實施例中反向指出，根據標準方案實施所有重組DNA技術，如Sambrook et aL(1989)Molecular CloningA Laboratoty Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY and inVolumes 1 and 2 of Ausubel et al.(1994)Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols，USA所述。R.D.D.Croy的PlantMolecular Biology Lab fax(1993)中描述了植物分子工作的標準材料和方法，BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和BlackwellScientific Publications聯合發表，UK。標準分子生物學技術的其它參考文獻包括Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning.′A′Laboratoiy Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY，Volumes I and II of Brown(1998)Molecular BiologyLabFax，Second Edition，Academic Press(UK)。在Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR PrimerA Laborato，y Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，和McPherson at al.(2000)PCR-BasicsFrom Background to Bench，First Edition，Springer Verlag，Germany中可以找到聚合酶鏈式反應的標準方法。
貫穿說明書和實施例，對下列序列作出參考資料SEQ ID N01擴增RG1 PSTVd的寡核苷酸引物SEQ ID N02擴增RG1 PSTVd的寡核苷酸引物SEQ ID N03PSTVd RG1基因組的核苷酸序列SEQ ID N04澳大利亞葡萄樹類病毒基因組的核苷酸序列SEQ ID N05椰子萎縮病類病毒基因組的核苷酸序列SEQ ID N06番茄planta macho類病毒基因組的核苷酸序列SEQ ID N07啤酒花潛伏類病毒基因組的核苷酸序列SEQ ID N08番茄頂矮類病毒基因組的核苷酸序列SEQ ID N09pdk2內含子的核苷酸序列SEQ ID N010EIN2 cDNA的核苷酸序列SEQ ID N011基因組EIN2克隆的核苷酸序列SEQ ID N012實施例構建體中使用的擴增部分EIN2的寡核苷酸引物1SEQ ID N013實施例構建體中使用的擴增部分EIN2的寡核苷酸引物2SEQ ID N014pMBW491中pTSVd的序列SEQ ID N015pMBW489中pTSVd的序列(具有10nt缺失)實施例實施例1含有所用的不同嵌合基因的不同植物系的構建作為用各種構建體下調表達的目標基因實例，選擇來自擬南芥的EIN2基因。種子在MS-ACC培養基(含有氨基環丙烷-1-羧酸(ACC))上萌芽并在黑暗或光照下培養可容易地看到EIN2基因表達的下調。在黑暗中生長培養EIN2沉默幼苗與野生型幼苗相比具有更長的下胚軸和發育更多的根系統，而在光照下生長的EIN2沉默幼苗可以通過它們更大的子葉大小與野生型幼苗區分開來。
使用具有SEQ ID N012和13表示的核苷酸序列的寡核苷酸引物，使用基因組DNA(見SEQ ID N011的核苷酸序列)或cDNA(見SEQ ID N010的核苷酸序列)作為模板DNA，通過PCR以有義或反義方向擴增不同構建體中使用的EIN2核苷酸序列。基因組EIN2序列部分(gEIN2)的擴增產生了具有SEQ ID N011的核苷酸序列從核苷酸位置538至核苷酸位置1123的PCR片段并且含有EIN2基因的兩個天然內含子。
gEIN2片段作為Kpn1/Cla1片段克隆進入pART7(Gleave，1992 Plant.Mol.Biol.201203-1207)，產生pMBW313，且35S啟動子-gE1N2有義-OCS3′表達盒在NotI位點克隆進入pART27(Gleave 1992前述)產生pMBW353。
使用EIN2 cDNA(SEQ ID N010)作為模板及與gEIN2相同的引物用PCR擴增類似的片段(cEIN2)。用BamH1/Clal消化cEIN2片段并在相同位點克隆進入pSHUTTLE(Wang et al.，1998 Acta Hort.461401-407)，得到pMBW310。接著用Xba1從pMBW310切出cEIN2片段并克隆進入pART7的Xba1位點，形成pMBW351。從這個中間載體切出35S-EIN2反義-OCS3’并在NotI位點克隆進入pWBVec2A(Wang et al.1998，前述)，產生pMBW360。
使用具有SEQ ID N01和SEQ ID N02的核苷酸序列的寡核苷酸從cDNA擴增PSTVd株RG1(SEQ ID N03)的全長序列。用BgIII消化所產生的PCR片段并克隆進入pMBW313的BamHI位點，產生pMBW345，從它切出35S-gEIN2-PSTVd-OCS3’表達盒并在NotI位點克隆進入pART27，產生pMBW355。
對于pMBW359，用BgIII消化PCR擴增的PSTVd序列并克隆進入pMBW310的BamHI位點，得到pMBW346，用Xba1從中切出cE1N2反義-PSTVd序列并克隆進入pHANNIBAL(Wesley et al.2001)的Xba1位點，形成pMBW349。35S-pdk2-cEIN2反義-PSTVd-OCS3’表達盒接著在NotI位點克隆進入pWBVec2a，形成pMBW359。cEIN2反義PSTVd片段也克隆進入pWBVec2a而產生pMBW357。
用EcoRV/BamH1從pMBW310切出EIN2 cDNA片段，用Pfu處理平末端化并連接進入pKANNIBAL(Wesley et al.2001)的BamHI位點(也用Pfu處理過)。回收對于35S啟動子2個方向都含cEIN2的質粒并命名為pMWB401(反義)和pMBW404(有義方向)。
對于pLMW37、pLMW38、pLMW39和pLMW40，在反轉重復PSTVd序列上游或下游以有義或反義方向插入cEIN2片段。為此，在pdk內含子上游以對于完整拷貝PSTVd基因組相反的方向克隆部分PSTVd序列(SEQ ID N03的從位置16的核苷酸至位置355的核苷酸)。
圖2中圖示了不同的構建體。
實施例2在包含實施例1的不同嵌合基因的轉基因擬南芥系中分析EIN2基因的表達使用常規方法將圖2中表示的嵌合構建體導入根癌土壤桿菌，所產生的土壤桿菌株用于通過浸漬方法將嵌合基因導入擬南芥生態型Landsberg erecta。在作為選擇試劑的15mg/L潮霉素或50mg/L卡那霉素上選擇轉基因系。收集T1 opr F1種子并檢測EIN2沉默。
為此，種子鋪在含50μM ACC的MS培養基中。用石蠟緊緊密封該板并保持在光下或黑暗中。通過觀察根和子葉的大小(光下培養)或通過觀察根和下胚軸的大小(黑暗中培養)給沉默打分。在EIN2沉默系中，根或下胚軸明顯長于，和子葉明顯大于在相同條件下生長的野生系。
來自原代轉化體的種子鋪在MS-ACC培養基上，用石蠟密封，4℃保持過夜0-2次，接著移至生長室并保持在光下或黑暗中。通過檢測根和子葉大小(對于在光下萌芽的那些)或下胚軸大小(對于黑暗中的那些)給EIN2基因的沉默打分。顯著或強烈沉默是指根或下胚軸長，而弱沉默是指子葉較大但根或下胚軸短。表1總結了結果。
表1各種EIN2構建體轉化的擬南芥植物中EIN2沉默效率的總結

實施例3包含實施例1的不同嵌合基因的轉基因擬南芥系雜交獲得的擬南芥系中EIN2基因表達的分析通過擬南芥系MBW353，MBW355，MBW359，MBW360之間交叉授粉，獲得了同時含有有義和反義EIN2構建體的新系。以與實施例2中所述相同的方法分析這些新系。表2總結了結果。其中至少一個轉基因含有PSTVd序列的植物高效沉默。
表2含有有義和反義EIN2構建體不同組合的擬南芥植物中EIN2沉默的效率總結


實施例4調節哺乳動物細胞中GFP基因沉默的不同嵌合基因的構建和CHO細胞中的分析作為在哺乳動物細胞中表達下調的目標基因實例，選擇了在CMV啟動子區域控制下表達，后跟隨SV40聚腺苷酸化信號的人源化的GFP編碼區域。
構建不同實驗沉默構建體，它含有相對于CMV啟動子區域有義(如pMBW493，pMBW494和pMBW497中)或反義方向(如pMBW489，pMBW491或pMBW496中)的GFP編碼區域。
質粒pMBW493和pMBW489在GFP編碼區域下游，但在SV40聚腺苷酸化信號上游含有相當于PSTVd序列的核苷酸序列，但含有10nt缺失(SEQ IDNo 15)。這種缺失對推定的二級結構有影響(見圖5)。
質粒pMBW494和pMBW491在GFP編碼區域下游，但在SV40聚腺苷酸化信號上游含有相當于SEQ ID No 14的PSTVd序列的核苷酸序列，不含有10nt缺失。
質粒pMBW497和pMBW496在GFP編碼區域下游，但在SV40聚腺苷酸化信號上游含有包含60CUG三核苷酸重復的核苷酸序列。
不同的實驗質粒(以不同濃度)聯合包含表達GFP的嵌合基因的質粒導入CHO細胞(表3；條目1-18)。由于GFP構建體是有義構建體中的功能序列，所以含有義GFP，不含額外表達GFP的嵌合基因的實驗構建體也被導入；來估計單獨這些構建體的GFP表達(表3；條目19-30)。而且，以不同濃度向CHO細胞導入聯合的反義和有義實驗構建體(表3；條目31-42)。作為對照，嵌合GFP表達構建體(pCi-GFP)單獨導入CHO細胞。
24小時或48小時后，檢測細胞的GFP表達。表3表示了平均量和標準差。
攜帶pTSVd或CUG重復序列的反義GFP構建體pMBW491，pMBW496和pMBW489的GFP基因表達顯著降低。
有趣的是，PSTVd序列含有10nt缺失的pMWB489產生了比含有完整PSTVd序列的pMWB491更慢且更低程度的GFP沉默。

表3.不同實驗構建體轉化的CHO細胞中GFP的表達總結。

序列表<110>Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization<120>修飾的基因沉默RNA及其用途<130>BROLGA-WO1<150>60/363851<151>2002-03-14<160>15<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>29<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR擴增PSTVd RG1基因組的寡核苷酸引物PSTVd RG1<400>1cgcagatctc ggaactaaac tcgtggttc 29<210>2<211>27<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR擴增PSTVd RG1基因組的寡核苷酸引物PSTVd RG1<400>2gcgagatcta ggaaccaact gcggttc27<210>3<211>359<212>DNA
<213>馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒<400>3cggaactaaa ctcgtggttc ctgtggttca cacctgacct cctgacaaga aaagaaaaaa60gaaggcggct cggaggagcg cttcagggat ccccggggaa acctggagcg aactggcaaa120aaaggacggt ggggagtgcc cagcggccga caggagtaat tcccgccgaa acagggtttt180cacccttcct ttcttcgggt gtccttcctc gcgcccgcag gaccacccct cgcccccttt240gcgctgtcgc ttcggctact acccggtgga aacaactgaa gctcccgaga accgcttttt300ctctatctta cttgctccgg ggcgagggtg tttagccctt ggaaccgcag ttggttcct 359<210>4<211>369<212>DNA<213>澳大利亞葡萄樹類病毒<400>4tgggcaccaa ctagaggttc ctgtggtact caccgaaggc cgcgaacgta ggaaagaaaa 60agatagaaaa gctgggtaag actcacctgg cgactcgtcg tcgacgaagg gtcctcagca120gagcaccggc aggaggcgct atgcaggaac gctaggggtc ctccagcgga ggactgaaga180aactccggtt tcttctttca ctctgtagct ggaatccctg ttgcgcttgc tggcgaaacc240tgcagggaag ctagctgggt cccgctagtc gagcggactc gtcccagcgg tcccaaccag300ttttctttat cctatttttc ctgcgggcgc ccggtcgtgg ttaccctgga gctccctgtt360tggaggccc369<210>5<211>254<212>DNA<213>椰子萎縮病類病毒<400>5ctggggaatt cccacggctc ggcaaaataa aagcacaaga gcgactgcta gagggatccc 60cggggaaacc cctagcaacc gaggtaggga gcgtacctgg tgtcgccgat tcgtgctggt120tgggcttcgt cccttccgag cttcgatccg acgcccggcc gcttcctcgc cgaagctgct180acggagacta cccggtggat acaactcttt gcagcgccct gtgtaataaa agctcgagtc240cggtttgcgc ccct 254<210>6<211>360<212>DNA<213>番茄planta macho類病毒<400>6cgggatcttt tccttgtggt tcctgtggta cacacctgac ctcctgacca gaaaagaaaa 60
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<223>pdk2內含子的核苷酸序列<400>9aagcttggta aggaaataat tattttcttt tttcctttta gtataaaata gttaagtgat 60gttaattagt atgattataa taatatagtt gttataattg tgaaaaaata atttataaat120atattgttta cataaacaac atagtaatgt aaaaaaatat gacaagtgat gtgtaagacg180
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權利要求
1.一種下調真核生物細胞中目標基因表達的方法，包括步驟a)給真核生物細胞提供嵌合RNA分子，其中所述嵌合RNA分子包含i)目標基因特異的RNA區域，包含與來自目標基因核苷酸序列的19個連續核苷酸的互補序列具有至少大約9 4％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；可操作連接于ii)大部分雙鏈化的RNA區域；和b)鑒定其中目標基因表達下調的那些真核生物。
2.根據權利要求1的方法，其中大部分雙鏈化的RNA區域包含來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(PSTVd)型類病毒的核定位信號。
3.根據權利要求2的方法，其中所述核定位信號來自選自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒、柑橘類病毒III類、柑橘類病毒IV類、啤酒花潛伏類病毒(Hop latent viroid)、澳大利亞葡萄樹類病毒、番茄planta macho類病毒、椰子萎縮病類病毒(coconut tinangaja viroid)、番茄頂矮類病毒(Toma to apical stunt viroid)、椰子死亡類病毒、柑橘裂皮病類病毒、Columnea潛伏類病毒、啤酒花矮化類病毒和柑橘彎葉類病毒的類病毒。
4.根據權利要求3的方法，其中所述類病毒具有選自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08的基因組核苷酸序列。
5.根據權利要求2至4任一項的方法，其中所述的核定位信號來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒。
6.根據權利要求2至5任一項的方法，其中所述的核定位信號來自馬鈴薯紡錘類病毒株RG1。
7.根據權利要求2至6任一項的方法，其中所述核定位信號包含發揮選自SEQ ID N03的核苷酸序列的核定位信號的功能的核苷酸序列。
8.根據權利要求2或3的方法，其中所述大部分雙鏈化的RNA包含類病毒基因組核苷酸序列，所述類病毒基因組核苷酸序列選自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒的基因組核苷酸序列、柑橘類病毒III類的基因組核苷酸序列、柑橘類病毒IV類的基因組核苷酸序列、啤酒花潛伏類病毒的基因組核苷酸序列、澳大利亞葡萄樹類病毒的基因組核苷酸序列、番茄plantamacho病類病毒的基因組核苷酸序列、椰子萎縮病類病毒的基因組核苷酸序列、番茄頂矮類病毒的基因組核苷酸序列、椰子死亡類病毒的基因組核苷酸序列、柑橘裂皮病類病毒的基因組核苷酸序列、Columnea潛伏類病毒的基因組核苷酸序列、啤酒花矮病類病毒的基因組核苷酸序列和柑橘彎葉類病毒的基因組核苷酸序列。
9.根據權利要求8的方法，其中所述類病毒基因組核苷酸序列選自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ IDN08。
10.根據權利要求2至9任一項的方法，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒基因組核苷酸序列。
11.根據權利要求10的方法，其中所述的類病毒基因組核苷酸序列是馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒株RG1的基因組核苷酸序列。
12.權利要求11的方法，其中所述的基因組核苷酸序列具有SEQ IDN03的核苷酸序列。
13.根據權利要求1的方法，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含至少35個重復的三核苷酸CUG。
14.根據權利要求13的方法，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含44到2000個重復的三核苷酸CUG。
15.根據權利要求1至14任一項的方法，其中所述的RNA分子包含多個目標基因特異性區域。
16.根據權利要求1至15任一項的方法，其中所述的RNA分子包含內含子序列。
17.根據權利要求16的方法，其中所述的內含子序列選自pdk2內含子、來自蓖麻子的過氧化氫酶內含子、來自棉花的δ12去飽和酶內含子、來自擬南芥的δ12去飽和酶內含子、來自玉米的泛素內含子、來自水稻的肌動蛋白內含子、來自曲霉菌的丙糖磷酸異構酶內含子和來自SV40的內含子。
18.根據權利要求1至17任一項的方法，其中所述的真核生物是植物。
19.根據權利要求18的方法，其中所述的植物選自擬南芥、苜蓿、大麥、菜豆、玉米、棉花、亞麻、豌豆、油菜、水稻、黑麥、紅花、高粱、大豆、向日葵、煙草、小麥、蘆筍、甜菜、椰菜、卷心菜、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、黃瓜、茄子、萵苣、洋蔥、油籽油菜、辣椒、馬鈴薯、南瓜(pumpkin)、小蘿卜、菠菜、南瓜(squash)、番茄、西葫蘆、杏仁、蘋果、杏、香蕉、黑莓、藍莓、可可、櫻桃、椰子、越橘、棗、葡萄、葡萄柚、番石榴、獼猴桃(kiwi)、檸檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、桔子、番瓜、西番蓮、桃、花生、梨、菠蘿、阿月渾子、李子、覆盆子、草莓、柑橘、胡桃和西瓜。
20.根據權利要求1至17任一項的方法，其中所述的真核生物是真菌、酵母或霉菌。
21.根據權利要求1至17任一項的方法，其中所述的真核生物是動物。
22.根據權利要求21的方法，其中所述的動物是人、哺乳動物、魚、牛、山羊、豬、綿羊、嚙齒動物、倉鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、靈長目動物、線蟲、甲殼類動物、對蝦、螃蟹、龍蝦、昆蟲、果蠅、鞘翅目昆蟲、雙翅目昆蟲、鱗翅目昆蟲和同翅目(homeopteran)昆蟲。
23.根據權利要求1至22任一項的方法，其中所述的嵌合RNA通過從嵌合DNA分子轉錄產生。
24.下調真核生物細胞中目標基因表達的嵌合RNA分子，包含a)目標基因特異性的RNA區域，其包含與來自所述真核生物的所述細胞的所述目標基因核苷酸序列的19個連續核苷酸的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；可操作連接于b)大部分雙鏈化的RNA區域；其中所述的嵌合RNA分子，當提供給所述真核生物的細胞時下調所述目標基因的表達。
25.根據權利要求24的嵌合RNA分子，其中大部分雙鏈化的RNA區域包含來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(PSTVd)型的類病毒的核定位信號。
26.根據權利要求25的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信號來自類病毒，其選自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒、柑橘類病毒III類、柑橘類病毒IV類、啤酒花潛伏類病毒、澳大利亞葡萄樹類病毒、番茄planta macho類病毒、椰子萎縮病類病毒、番茄頂矮類病毒、椰子死亡類病毒、柑橘裂皮病類病毒、Columnea潛伏類病毒、啤酒花矮病類病毒和柑橘彎葉類病毒。
27.根據權利要求25或26的嵌合RNA分子，其中所述的類病毒具有選自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08的基因組核苷酸序列。
28.根據權利要求25或26任一項的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信號來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒。
29.根據權利要求25或26任一項的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信號來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒株RG1。
30.根據25至29任一項的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信號包含作用如選自SEQ ID N03的核定位信號的核苷酸序列。
31.根據權利要求25或26的嵌合RNA分子，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含類病毒基因組核苷酸序列，所述類病毒基因組核苷酸序列選自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒的基因組核苷酸序列、柑橘類病毒III類的基因組核苷酸序列、柑橘類病毒IV類的基因組核苷酸序列、啤酒花潛伏類病毒的基因組核苷酸序列、澳大利亞葡萄樹類病毒的基因組核苷酸序列、番茄planta macho類病毒的基因組核苷酸序列、椰子萎縮病類病毒的基因組核苷酸序列、番茄頂矮類病毒的基因組核苷酸序列、椰子死亡類病毒的基因組核苷酸序列、柑橘裂皮病類病毒的基因組核苷酸序列、Columnea潛伏類病毒的基因組核苷酸序列、啤酒花矮病類病毒的基因組核苷酸序列和柑橘彎葉類病毒的基因組核苷酸序列。
32.根據權利要求31的嵌合RNA分子，其中所述的類病毒基因組核苷酸序列選自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQID N07和SEQ ID N08。
33.根據權利要求25至32任一項的嵌合RNA分子，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒的基因組核苷酸序列。
34.根據權利要求33的嵌合RNA分子，其中所述的類病毒基因組核苷酸序列是馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒株RG1的基因組核苷酸序列。
35.根據權利要求34的嵌合RNA分子，其中所述的基因組核苷酸序列具有SEQ ID N03的核苷酸序列。
36.根據權利要求24的嵌合RNA分子，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含至少35個重復的三核苷酸CUG。
37.根據權利要求36的嵌合RNA分子，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含44到2000個重復的三核苷酸CUG。
38.根據權利要求24至37任一項的嵌合RNA分子，其中所述的RNA分子包含多個目標基因特異性區域。
39.根據權利要求24至38任一項的嵌合RNA分子，其中所述的RNA分子包含內含子序列。
40.根據權利要求39的嵌合RNA分子，其中所述的內含子序列選自pdk2內含子、來自蓖麻子的過氧化氫酶內含子、來自棉花的δ12去飽和酶內含子、來自擬南芥的δ12去飽和酶內含子、來自玉米的泛素內含子、來自水稻的肌動蛋白內含子、來自曲霉菌的丙糖磷酸異構酶內含子和來自SV40的內含子。
41.降低真核生物細胞中目標基因表達的嵌合RNA分子，包含a)能夠被所述真核生物的所述細胞中的RNA聚合酶識別的啟動子或啟動子區域；可操作連接于b)DNA區域，當它被轉錄時產生RNA分子，所述RNA分子包含i)目標基因特異性的RNA區域，其包含與來自所述真核生物的所述細胞的所述目標基因核苷酸序列的19個連續核苷酸的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；可操作連接于ii)大部分雙鏈化的RNA區域；其中所述的嵌合DNA分子，當提供給所述真核生物的細胞時降低所述目標基因的表達。
42.根據權利要求41的嵌合DNA分子，其中大部分雙鏈化的RNA區域包含來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒型的類病毒的核定位信號。
43.根據權利要求42的嵌合DNA分子，其中所述的核定位信號來自選自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒、柑橘類病毒III類、柑橘類病毒IV類、啤酒花潛伏類病毒、澳大利亞葡萄樹類病毒、番茄planta macho類病毒、椰子萎縮病類病毒、番茄頂矮類病毒、椰子死亡類病毒、柑橘裂皮病類病毒、Columnea潛伏類病毒、啤酒花矮病類病毒和柑橘彎葉類病毒的類病毒。
44.根據權利要求42或43的嵌合DNA分子，其中所述的類病毒具有選自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08的基因組核苷酸序列。
45.根據權利要求42至44任一項的嵌合DNA分子，其中所述的核定位信號來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒。
46.根據權利要求45的嵌合DNA分子，其中所述的核定位信號來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒株RG1。
47.根據權利要求42至46任一項的嵌合DNA分子，其中所述的核定位信號包含作用如選自SEQ ID N03的核定位信號的核苷酸序列。
48.根據權利要求42或43的嵌合DNA分子，其中所述的大部分雙鏈化的RNA包含類病毒基因組核苷酸序列，所述類病毒基因組核苷酸序列選自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒的基因組核苷酸序列、柑橘類病毒III類的基因組核苷酸序列、柑橘類病毒IV類的基因組核苷酸序列、啤酒花潛伏類病毒的基因組核苷酸序列、澳大利亞葡萄樹類病毒的基因組核苷酸序列、番茄planta macho類病毒的基因組核苷酸序列、椰子萎縮病類病毒的基因組核苷酸序列、番茄頂矮類病毒的基因組核苷酸序列、椰子死亡類病毒的基因組核苷酸序列、柑橘裂皮病類病毒的基因組核苷酸序列、Columnea潛伏類病毒的基因組核苷酸序列、啤酒花矮病類病毒的基因組核苷酸序列和柑橘彎葉類病毒的基因組核苷酸序列。
49.根據權利要求48的嵌合DNA分子，其中所述的類病毒基因組核苷酸序列選自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQID N07和SEQ ID N08。
50.根據權利要求42至49任一項的嵌合DNA分子，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒的基因組核苷酸序列。
51.根據權利要求50的嵌合DNA分子，其中所述的類病毒基因組核苷酸序列是馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒株RG1的基因組核苷酸序列。
52.根據權利要求51的嵌合DNA分子，其中所述的基因組核苷酸序列具有SEQ ID N03的核苷酸序列。
53.根據權利要求41的嵌合DNA分子，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含至少35個重復的三核苷酸CUG。
54.根據權利要求53的嵌合DNA分子，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含44到2000個重復的三核苷酸CUG。
55.根據權利要求41至54任一項的嵌合DNA分子，其中所述的RNA分子包含多個目標基因特異性區域。
56.根據權利要求41至55任一項的嵌合DNA分子，其中所述的RNA分子包含內含子序列。
57.根據權利要求56的嵌合DNA分子，其中所述的內含子序列選自pdk2內含子、來自蓖麻子的過氧化氫酶內含子、來自棉花的δ12去飽和酶內含子、來自擬南芥的δ12去飽和酶內含子、來自玉米的泛素內含子、來自水稻的肌動蛋白內含子、來自曲霉菌的丙糖磷酸異構酶內含子和來自SV40的內含子。
58.根據權利要求41至56任一項的嵌合DNA分子，進一步包含與編碼所述RNA分子的所述DNA區域可操作連接的轉錄終止和聚腺苷酸化信號。
59.根據權利要求41至58任一項的嵌合DNA分子，其中所述啟動子或啟動子區域是植物可表達的啟動子。
60.根據權利要求41至58任一項的嵌合DNA分子，其中所述啟動子或啟動子區域是在動物中有功能的啟動子。
61.根據權利要求41至58任一項的嵌合DNA分子，其中所述的啟動子或啟動子區域是在酵母、真菌或霉菌中有功能的啟動子。
62.根據權利要求41至58任一項的嵌合DNA分子，其中所述的啟動子或啟動子區域是單亞基噬菌體RNA聚合酶識別的啟動子。
63.來自包含根據權利要求41至62任一項的嵌合DNA分子的真核生物的細胞。
64.包含根據權利要求24至40任一項的嵌合RNA分子的真核細胞。
65.根據權利要求63或權利要求64的細胞，其中所述的真核生物是植物。
66.根據權利要求65的細胞，其中所述植物選自擬南芥、苜蓿、大麥、菜豆、玉米、棉花、亞麻、豌豆、油菜、水稻、黑麥、紅花、高粱、大豆、向日葵、煙草、小麥、蘆筍、甜菜、椰菜、卷心菜、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、黃瓜、茄子、萵苣、洋蔥、油籽油菜、辣椒、馬鈴薯、南瓜(pumpkin)、小蘿卜、菠菜、南瓜(squash)、番茄、西葫蘆、杏仁、蘋果、杏、香蕉、黑莓、藍莓、可可、櫻桃、椰子、越橘、棗、葡萄、葡萄柚、番石榴、獼猴桃、檸檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、桔子、番瓜、西番蓮、桃、花生、梨、菠蘿、阿月渾子、李子、覆盆子、草莓、柑橘、胡桃和西瓜。
67.根據權利要求63或權利要求64的細胞，其中所述的真核生物是真菌、酵母或霉菌。
68.根據權利要求63或權利要求64的細胞，其中所述的真核生物是動物。
69.根據權利要求68的細胞，其中所述的動物是人、哺乳動物、魚、牛、山羊、豬、綿羊、嚙齒動物、倉鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、靈長目動物、線蟲、甲殼類動物、對蝦、螃蟹、龍蝦、昆蟲、果蠅、鞘翅目昆蟲、雙翅目昆蟲、鱗翅目昆蟲和同翅目昆蟲。
70.非人真核生物，在它的細胞中包含根據權利要求41至62任一項的嵌合DNA分子。
71.非人真核生物，在它的細胞中包含根據權利要求24至40任一項的嵌合RNA分子。
72.根據權利要求70或權利要求71的非人真核生物，其中所述真核生物是植物。
73.根據權利要求72的非人真核生物，其中所述的植物選自擬南芥、苜蓿、大麥、菜豆、玉米、棉花、亞麻、豌豆、油菜、水稻、黑麥、紅花、高粱、大豆、向日葵、煙草、小麥、蘆筍、甜菜、椰菜、卷心菜、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、黃瓜、茄子、萵苣、洋蔥、油籽油菜、辣椒、馬鈴薯、南瓜(pumpkin)、小蘿卜、菠菜、南瓜(squash)、番茄、西葫蘆、杏仁、蘋果、杏、香蕉、黑莓、藍莓、可可、櫻桃、椰子、越橘、棗、葡萄、葡萄柚、番石榴、獼猴桃、檸檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、桔子、番瓜、西番蓮、桃、花生、梨、菠蘿、阿月渾子、李子、覆盆子、草莓、柑橘、胡桃和西瓜。
74.根據權利要求70或權利要求71的非人真核生物，其中所述真核生物是真菌、酵母或霉菌。
75.根據權利要求70或權利要求71的非人真核生物，其中所述真核生物是動物。
76.根據權利要求75的非人真核生物，其中所述的動物是人、哺乳動物、魚、牛、山羊、豬、綿羊、嚙齒動物、倉鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、靈長目動物、線蟲、甲殼類動物、對蝦、螃蟹、龍蝦、昆蟲、果蠅、鞘翅目昆蟲、雙翅目昆蟲、鱗翅目昆蟲和同翅目昆蟲。
77.根據權利要求24至40任一項的嵌合RNA分子降低真核生物細胞中目標基因表達的用途。
78.根據權利要求41至62任一項的嵌合DNA分子降低真核生物細胞中目標基因表達的用途。
79.一種產生轉基因真核生物的方法，其中所述生物的細胞中目標基因的表達被降低，所述方法包括步驟a)給所述生物的一或多個細胞提供根據權利要求41至62任一項的嵌合DNA分子而產生轉基因細胞；b)由所述轉基因細胞生長或再生出轉基因真核生物。
80.一種下調真核生物細胞中目標基因表達的方法，包括步驟a)給真核生物細胞提供第一和第二嵌合RNA分子，i)所述第一嵌合RNA分子包含反義目標基因特異性的RNA區域，該區域包含與來自目標基因核苷酸序列的19個連續核苷酸的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；ii)所述第二嵌合RNA分子包含有義目標基因特異性的RNA區域，該區域包含與所述第一嵌合RNA分子的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；iii)所述第一和第二嵌合RNA至少在所述第一嵌合RNA的所述19個連續核苷酸和所述第二嵌合RNA的所述19個連續核苷酸之間能夠堿基配對；和iv)其中所述第一或所述第二嵌合RNA分子包含與所述反義目標基因特異性RNA區域或與所述有義目標基因特異性RNA區域可操作連接的大部分雙鏈化的RNA區域；和b)鑒定其中目標基因表達下調的那些真核生物。
81.根據權利要求80的方法，其中所述第一和所述第二嵌合RNA分子包含大部分雙鏈化的RNA區域。
82.根據權利要求81的方法，其中所述第一和所述第二嵌合RNA分子包含相同的大部分雙鏈化的RNA區域。
83.根據權利要求80至82任一項的方法，其中大部分雙鏈化的RNA區域包含來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(PSTVd)型的類病毒的核定位信號。
84.根據權利要求83的方法，其中所述的核定位信號來自類病毒，其選自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒、柑橘類病毒III類、柑橘類病毒IV類、啤酒花潛伏類病毒、澳大利亞葡萄樹類病毒、番茄planta macho類病毒、椰子萎縮病類病毒、番茄頂矮類病毒、椰子死亡類病毒、柑橘裂皮病類病毒、Columnea潛伏類病毒、啤酒花矮病類病毒和柑橘彎葉類病毒。
85.根據權利要求83的方法，其中所述的類病毒具有選自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08組成的組的基因組核苷酸序列。
86.根據權利要求83至85任一項的方法，其中所述的核定位信號來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒。
87.根據權利要求83至86任一項的方法，其中所述的核定位信號來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒株RG1。
88.根據權利要求83至87任一項的方法，其中所述的核定位信號包含作用如選自SEQ ID N03核苷酸序列的核定位信號的核苷酸序列。
89.根據權利要求83或84的方法，其中所述的大部分雙鏈化的RNA包含類病毒基因組核苷酸序列，所述類病毒基因組核苷酸序列選自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒的基因組核苷酸序列、柑橘類病毒III類的基因組核苷酸序列、柑橘類病毒IV類的基因組核苷酸序列、啤酒花潛伏類病毒的基因組核苷酸序列、澳大利亞葡萄樹類病毒的基因組核苷酸序列、番茄planta macho類病毒的基因組核苷酸序列、椰子萎縮病類病毒的基因組核苷酸序列、番茄頂矮類病毒的基因組核苷酸序列、椰子死亡類病毒的基因組核苷酸序列、柑橘裂皮病類病毒的基因組核苷酸序列、Columnea潛伏類病毒的基因組核苷酸序列、啤酒花矮病類病毒的基因組核苷酸序列和柑橘彎葉類病毒的基因組核苷酸序列。
90.根據權利要求89的方法，其中所述的類病毒基因組核苷酸序列選自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08。
91.根據權利要求83至90任一項的方法，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒的基因組核苷酸序列。
92.根據權利要求91的方法，其中所述的類病毒基因組核苷酸序列是馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒株RG1的基因組核苷酸序列。
93.根據權利要求92的方法，其中所述的基因組核苷酸序列具有SEQ ID N03的核苷酸序列。
94.根據權利要求80至82任一項的方法，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含至少35個重復的三核苷酸CUG。
95.根據權利要求94的方法，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含44到2000個重復的三核苷酸CUG。
96.根據權利要求80至95任一項的方法，其中所述的RNA分子包含多個目標基因特異性區域。
97.根據權利要求80至96任一項的方法，其中所述的RNA分子包含內含子序列。
98.根據權利要求97的方法，其中所述的內含子序列選自pdk2內含子、來自蓖麻子的過氧化氫酶內含子、來自棉花的δ12去飽和酶內含子、來自擬南芥的δ12去飽和酶內含子、來自玉米的泛素內含子、來自水稻的肌動蛋白內含子、來自曲霉菌的丙糖磷酸異構酶內含子和來自SV40的內含子。
99.根據權利要求80至98任一項的方法，其中所述的第一和第二嵌合RNA分子從第一和第二嵌合基因轉錄而來。
100.包含第一和第二嵌合RNA分子的真核生物細胞，i)所述第一嵌合RNA分子包含反義目標基因特異性的RNA區域，該區域包含與來自目標基因核苷酸序列的19個連續核苷酸的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；ii)所述第二嵌合RNA分子包含有義目標基因特異性的RNA區域，該區域包含與所述第一嵌合RNA分子的互補序列具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；iii)所述第一和第二嵌合RNA至少在所述第一嵌合RNA的所述19個連續核苷酸和所述第二嵌合RNA的所述19個連續核苷酸之間能夠堿基配對；和iv)其中所述第一或所述第二嵌合RNA分子包含與所述反義目標基因特異性RNA區域或與所述有義目標基因特異性RNA區域可操作連接的大部分雙鏈化的RNA區域。
101.根據權利要求100的細胞，其中所述第一和所述第二嵌合RNA分子包含大部分雙鏈化的RNA區域。
102.權利要求101的細胞，其中所述第一和第二嵌合RNA分子包含相同的大部分雙鏈化的RNA區域。
103.根據權利要求100至102任一項的細胞，其中大部分雙鏈化的RNA區域包含來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(PSTVd)型的類病毒的核定位信號。
104.根據權利要求103的細胞，其中所述的核定位信號來自類病毒，其選自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒、柑橘類病毒III類、柑橘類病毒IV類、啤酒花潛伏類病毒、澳大利亞葡萄樹類病毒、番茄planta macho類病毒、椰子萎縮病類病毒、番茄頂矮類病毒、椰子死亡類病毒、柑橘裂皮病類病毒、Columnea潛伏類病毒、啤酒花矮病類病毒和柑橘彎葉類病毒。
105.根據權利要求103的細胞，其中所述的類病毒具有選自SEQ IDN03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08的基因組核苷酸序列。
106.根據權利要求103至105任一項的細胞，其中所述的核定位信號來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒。
107.根據權利要求103至106任一項的細胞，其中所述的核定位信號來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒株RG1。
108.根據權利要求103至107任一項的細胞，其中所述的核定位信號包含作用如選自SEQ ID N03核苷酸序列的核定位信號的核苷酸序列。
109.根據權利要求103或104的細胞，其中所述的大部分雙鏈化的RNA包含類病毒基因組核苷酸序列，所述類病毒基因組核苷酸序列選自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒的基因組核苷酸序列、柑橘類病毒III類的基因組核苷酸序列、柑橘類病毒IV類的基因組核苷酸序列、啤酒花潛伏類病毒的基因組核苷酸序列、澳大利亞葡萄樹類病毒的基因組核苷酸序列、番茄planta macho類病毒的基因組核苷酸序列、椰子萎縮病類病毒的基因組核苷酸序列、番茄頂矮類病毒的基因組核苷酸序列、椰子死亡類病毒的基因組核苷酸序列、柑橘裂皮病類病毒的基因組核苷酸序列、Columnea潛伏類病毒的基因組核苷酸序列、啤酒花矮病類病毒的基因組核苷酸序列和柑橘彎葉類病毒的基因組核苷酸序列。
110.根據權利要求109的細胞，其中所述類病毒的基因組核苷酸序列選自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08。
111.根據權利要求103至109任一項的細胞，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒的基因組核苷酸序列。
112.根據權利要求111的細胞，其中所述的類病毒基因組核苷酸序列是馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒株RG1的基因組核苷酸序列。
113.權利要求112的細胞，其中所述的基因組核苷酸序列具有SEQID N03的核苷酸序列。
114.根據權利要求100至102任一項的細胞，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含至少35個重復的三核苷酸CUG。
115.根據權利要求114的細胞，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含44到2000個重復的三核苷酸CUG。
116.根據權利要求100至115任一項的細胞，其中所述的RNA分子包含多個目標基因特異性區域。
117.根據權利要求100至116任一項的細胞，其中所述的RNA分子包含內含子序列。
118.根據權利要求117的細胞，其中所述的內含子序列選自pdk2內含子、來自蓖麻子的過氧化氫酶內含子、來自棉花的δ12去飽和酶內含子、來自擬南芥的δ12去飽和酶內含子、來自玉米的泛素內含子、來自水稻的肌動蛋白內含子、來自曲霉菌的丙糖磷酸異構酶內含子和來自SV40的內含子。
119.根據權利要求100至118任一項的細胞，其中所述的第一和第二嵌合RNA分子從第一和第二嵌合基因轉錄而來。
120.包含根據權利要求100至權利要求119任一項的細胞的非人真核生物。
121.嵌合有義RNA分子，其與嵌合反義RNA分子協作以降低真核生物細胞中目標基因表達，所述嵌合有義RNA分子包含a)有義目標基因特異性的RNA區域，該區域包含與所述目標基因核苷酸具有至少大約94％序列等同性的至少大約19個連續核苷酸的核苷酸序列；可操作連接于b)大部分雙鏈化的RNA區域。
122.根據權利要求121的嵌合RNA分子，其中大部分雙鏈化的RNA區域包含來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(PSTVd)型的類病毒的核定位信號。
123.根據權利要求122的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信號來自類病毒，其選自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒、柑橘類病毒III類、柑橘類病毒IV類、啤酒花潛伏類病毒、澳大利亞葡萄樹類病毒、番茄plantamacho類病毒、椰子萎縮病類病毒、番茄頂矮類病毒、椰子死亡類病毒、柑橘裂皮病類病毒、Columnea潛伏類病毒、啤酒花矮病類病毒和柑橘彎葉類病毒。
124.根據權利要求123的嵌合RNA分子，其中所述的類病毒具有選自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQ ID N07和SEQ ID N08的基因組核苷酸序列。
125.根據權利要求122至124任一項的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信號來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒。
126.根據權利要求122至125任一項的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信號來自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒株RG1。
127.根據權利要求122至126任一項的嵌合RNA分子，其中所述的核定位信號包含作用如選自SEQ ID N03核苷酸序列的核定位信號的核苷酸序列。
128.根據權利要求122或123的嵌合RNA分子，其中所述的大部分雙鏈化的RNA包含類病毒基因組核苷酸序列，所述類病毒基因組核苷酸序列選自馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒的基因組核苷酸序列、柑橘類病毒III類的基因組核苷酸序列、柑橘類病毒IV類的基因組核苷酸序列、啤酒花潛伏類病毒的基因組核苷酸序列、澳大利亞葡萄樹類病毒的基因組核苷酸序列、番茄planta macho類病毒的基因組核苷酸序列、椰子萎縮病類病毒的基因組核苷酸序列、番茄頂矮類病毒的基因組核苷酸序列、椰子死亡類病毒的基因組核苷酸序列、柑橘裂皮病類病毒的基因組核苷酸序列、Columnea潛伏類病毒的基因組核苷酸序列、啤酒花矮病類病毒的基因組核苷酸序列和柑橘彎葉類病毒的基因組核苷酸序列。
129.根據權利要求128的嵌合RNA分子，其中所述的類病毒基因組核苷酸序列選自SEQ ID N03，SEQ ID N04，SEQ ID N05，SEQ ID N06，SEQID N07和SEQ ID N08。
130.根據權利要求122至129任一項的嵌合RNA分子，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒的基因組核苷酸序列。
131.根據權利要求130的嵌合RNA分子，其中所述的類病毒基因組核苷酸序列是馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒株RG1的基因組核苷酸序列。
132.根據權利要求131的嵌合RNA分子，其中所述的基因組核苷酸序列具有SEQ ID N03的核苷酸序列。
133.根據權利要求121的嵌合RNA分子，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含至少35個重復的三核苷酸CUG。
134.根據權利要求133的嵌合RNA分子，其中所述的大部分雙鏈化的RNA區域包含44到2000個重復的三核苷酸CUG。
135.根據權利要求121至134任一項的嵌合RNA分子，其中所述的RNA分子包含多個目標基因特異性區域。
136.根據權利要求121至135任一項的嵌合RNA分子，其中所述的RNA分子包含內含子序列。
137.根據權利要求136的嵌合RNA分子，其中所述的內含子序列選自pdk2內含子、來自蓖麻子的過氧化氫酶內含子、來自棉花的δ12去飽和酶內含子、來自擬南芥的δ12去飽和酶內含子、來自玉米的泛素內含子、來自水稻的肌動蛋白內含子、來自曲霉菌的丙糖磷酸異構酶內含子和來自SV40的內含子。
138.降低真核生物細胞中目標基因表達的嵌合DNA分子，包含a)能夠被所述真核生物的所述細胞中的RNA聚合酶識別的啟動子或啟動子區域；可操作連接于b)DNA區域，當它被轉錄時產生如權利要求121至137任一項所述的嵌合有義RNA分子。
全文摘要
本申請提供了有效下調真核細胞和生物中任何目的基因表達的方法和工具。為此，本發明提供了修飾的反義和有義RNA分子，編碼這種修飾的反義或有義RNA分子的嵌合基因和包含該修飾的反義和/或有義RNA分子或編碼的嵌合基因的真核生物，如植物、動物或真菌、酵母或霉菌。
文檔編號C12N15/09GK1646687SQ03808255
公開日2005年7月27日 申請日期2003年3月12日 優先權日2002年3月14日
發明者王明波, P·沃特豪斯 申請人:聯邦科學和工業研究組織