專利名稱：高效表達兩種不同類型肝細胞生長因子的雜合肝細胞生長因子基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及高效的肝細胞生長因子(HGF)，其同時表達兩種不同類型的HGF。
背景技術：
本發明涉及通過在HGF cDNA的外顯子4和5之間插入一個固有的或外源的內含子來制備雜合HGF基因，具有比HGF cDNA更高的表達效率并且同時表達兩種不同類型的HGF和dHGF(缺失突變的HGF)。
HGF是一種稱作分散因子的肝素結合糖蛋白。編碼HGF的基因位于染色體721.1上，包含18個外顯子和17個內含子，具有SEQ ID NO1的核苷酸序列(Seki T等，基因102213-219，1991)。從HGF基因中轉錄得到一個約6kb的轉錄本，然后由此合成由728個氨基酸組成的HGF前體多肽。同時，由HGF基因的另一種剪接還合成由723個氨基酸組成的dHGF前體多肽。無生物活性的前體被血清中的蛋白酶轉化成活性形式的二硫鍵連接的異二聚體。在異二聚體中，高分子量的α鏈形成四個三環域結構域和類似激活前(preactivated)的血纖維蛋白溶酶原的肽區域的N末端發卡環。三個二硫鍵環結構的三環結構域由約80個氨基酸組成，在蛋白-蛋白相互作用中起重要作用。低分子量的β鏈形成無活性的絲氨酸蛋白酶樣結構域。由723個氨基酸組成的dHGF是在α鏈的第一個三環域結構域中缺失5個氨基酸的多肽，即F、L、P、S和S。
最近報道，HGF和dHGF都具有一些生物學功能，如促進上皮細胞、黑素細胞和內皮細胞的生長和形態發生。但是，它們在免疫學和生物學特征方面是不同的。
例如，在促進人臍帶內皮細胞、動脈平滑肌細胞和NSF-60(鼠成髓細胞)的DNA合成方面，HGF的活性比dHGF分別高20倍、10倍和2倍。在促進LLC-PKI(豬腎臟上皮細胞)和OK(負鼠腎臟上皮細胞)和小鼠間質細胞的DNA合成方面，dHGF的活性比HGF分別高3倍和2倍。HGF在PBS的溶解性比dHGF高70倍。一些抗dHGF的單克隆抗體僅識別dHGF，而不識別HGF或還原形式的dHGF，這暗示HGF和dHGF的結構是不同的。因此，體內同時合成HGF和dHGF表明它們在生物學上相互影響(Shima，N.等，生物化學和生物物理學研究通訊(Biochemical and Biophysical Research Communications)200808-815，1994)。
由來自中胚層的細胞分泌的HGF具有多種生物學功能，如1)誘導上皮細胞形成管狀結構；2)在體內外刺激內皮細胞形成血管；3)由于其抗凋亡的活性，再生肝臟和腎臟；4)形成腎臟、卵巢和睪丸；5)控制骨生成；6)刺激造血前身紅細胞的生長和分化；和7)神經細胞萌發軸突(Stella，M.C.和Comoglio，P.M.，國際生物化學和細胞生物學雜志(The International Journal of Biochemistry & CellBiology)311357-1362，1999))。基于這些不同的功能，HGF或編碼HGF的基因可以被開發成用于治療缺血性的或肝臟的疾病的治療劑。實際上，體內HGF可能以HGF或dHGF形式存在，因此，共表達HGF和dHGF對于最大化治療效果來說是重要的。因此，本發明目的在于開發雜合HGF基因，能夠同時表達具有高度基因治療效果的HGF和dHGF。
發明概述因此，本發明的第一個目的在于提供同時表達兩種不同類型的HGF的雜合HGF基因。
按照本發明的一個方面，提供在HGF cDNA的外顯子4和5之間插入一個固有的或外源的內含子的雜合HGF。
本發明的另一個目的在于提供包含雜合HGF基因的重組載體和用上述載體轉化的微生物。
本發明還有一個目的在于提供一種用于治療或預防缺血性的或肝臟的疾病的藥物組合物，其包含HGF基因。
附圖描述當結合附隨的附圖，根據對發明的描述，本發明的上述和其他的目的及特征將是顯而易見的，這些附圖分別表示附
圖1說明基因片段的位置的HGF-X原型的示意圖，附圖2從HepG2基因組DNA中克隆基因片段的過程，附圖3從人胎盤cDNA中克隆基因片段的過程，附圖4A和4B制備表達載體pCK-HGF-X的過程，附圖5制備表達載體pCK-cHGF和pCK-dHGF的過程，附圖6制備表達載體pCP-HGF-X家族的過程，附圖7制備表達載體pCP-cHGF和pCP-dHGF的過程，附圖8pCP-cHGF、pCP-dHGF和pCP-HGF-X的基因表達水平，附圖9通過在12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳觀察pCP-cHGF、pCP-dHGF和pCP-HGF-X的基因表達模式，附圖10體內pCP-cHGF、pCP-dHGF和pCP-HGF-X7的基因表達水平，附圖11分別被施用pCP和pCP-HGF-X7的兩組兔子的大腦血管發生。
發明詳述本發明的雜合肝細胞生長因子(HGF)基因包含對應于外顯子1-18和在其外顯子4和5之間插入固有的或外源的內含子cDNA的cDNA。該內含子包含固有的內含子片段或者重組序列。
本發明的包含固有內含子的雜合HGF基因的一個實施方案長7112bp，具有SEQ ID NO2的序列。雜合HGF基因同時表達HGF和dHGF，具有比HGF cDNA更高的表達效率。密碼子簡并性使得本發明的雜合HGF基因的編碼區和/或非編碼區能夠被修飾或改變，而不改變蛋白質的氨基酸序列和基因的表達。
因此，與SEQ ID NO2的雜合HGF基因實質上相同的多核苷酸及其片段落入本發明的保護范圍內。“實質上相同”是指序列同源性不低于80％，優選不低于90％，和更加優選的不低于95％。
雜合HGF基因可能包含可選擇地具有被插入到HGF cDNA的外顯子4和5之間的小重組序列的固有內含子片段。在此，這種包含固有內含子片段的雜合HGF基因命名為“HGF-X”。分別具有SEQ ID No19-21的HGFX-6、HGF-X7和HGF-X8是優選的。
按照已知的遺傳工程方法，本發明的雜合HGF基因被合成和插入到表達載體中。然后該載體被導入到合適的宿主細胞如大腸桿菌和酵母中。例如，大腸桿菌ToplOF用本發明的HGF-X7基因轉染。然后得到的大腸桿菌ToplOF’pCK-HGFX7和大腸桿菌ToplOF’pCP-HGFX7在2002年3月12日被保藏，保藏號分別為KCCM-10361和KCCM-10362。
采用被轉化的細胞，高水平地制備本發明的基因及其編碼的蛋白質。
根據宿主細胞，本發明的載體可選擇性地包含調控基因表達的序列如啟動子或終止子、自我復制序列和分泌信號。
此外，本發明包含用于治療或預防缺血性和肝臟疾病的藥物組合物，其包含作為活性成分的雜合HGF基因或包含該基因的載體。優選地，該組合物被配制成用于注射。
本發明的組合物還包含藥學上可接受的載體。制藥領域中的任何常規操作被用于制備口服制劑如片劑、膠囊、藥丸、顆粒、懸浮液和溶液；注射劑型如溶液、懸浮液、或注射前與蒸餾水混合的干粉；局部應用制劑如藥膏、面霜和洗液；以及其他制劑。
通常用于制藥領域的載體可以被應用于本發明的組合物中。例如，口服施用的制劑包括黏合劑、乳化劑、分解劑、賦形劑、溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮劑、著色劑和香味劑。注射制劑包括防腐劑、拮抗劑(unagonizing agents)、溶解劑或穩定劑。制備局部施用的制劑包括堿、賦形劑、滑潤劑或防腐劑。任何本領域知曉的適宜制劑(雷名頓藥物科學(最新版)，Mack出版公司，Eaton PA))可被用于本發明。
本發明的組合物可以作為多種口服和胃腸外制劑在臨床中應用。適宜的制劑可以采用這種賦形劑如添加劑、加強劑、黏合劑、潤濕劑、分解劑和表面活性劑或稀釋劑來制備。用于口服施用的固體制劑包括藥丸、片劑、隔離劑、顆粒和膠囊。這些固體制劑可以通過將一種或多種賦形劑如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖和凝膠與二苯基丁基化的(dibenzylbuthyllacton)木脂體衍生物混合來制備。另外，本發明的制劑中包括滑潤劑如硬脂酸鎂和滑石粉。用于口服施用的液體制劑包括懸浮液、溶液、乳劑和糖漿。除了常規的簡單稀釋劑如水和液體石蠟外，這些制劑可以含有潤濕劑、甜味劑、芳香劑和防腐劑。胃腸外施用的制劑包括滅菌的水溶液、懸浮液、乳劑、可選擇的凍干處理和栓劑。不溶液水的賦形劑和懸浮劑包括植物油如丙二醇、聚乙二醇和橄欖油和可注射的酯如乙基油酸鹽。Witepsole、Macrogol、Tween61、可可油、甘油月桂酸酯和甘油明膠可以用作栓劑的基礎。
本發明的組合物可以口服施用或者通過胃腸外途徑如靜脈內、肌肉內、皮下、腹腔內、動脈內注射或灌注施用或者局部地通過直腸、鼻內、呼吸或眼內施用。
應當理解，本發明的組合物的常規日劑量應該根據不同的相關因素包括治療的疾病、選擇的施用路徑、年齡、性別和各個患者的體重、患者癥狀的嚴重程度來確定，可以一次施用或者分開施用。因此，日劑量無論如何不應當被解釋為對本發明的保護范圍的限制。
下面的實施例被給出僅僅用于說明的目的，而不是用于限定本發明的保護范圍。
實施例1制備編碼人HGF的雜合基因構建體(1)得自基因組DNA的HGF基因片段的克隆將人HepG2細胞(ATCC保藏號HB-8065)懸浮在TES緩沖液中(10mM Tris-HCl；1mM EDTA；0.7％SDS)，并在50℃下用400μg/ml的蛋白酶K處理1h。接著按照本領域常規方法，通過苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀，從細胞懸浮液中提取基因組DNA。
在PCR擴增中，被提取的基因組DNA用作模板DNA。作為引物對，采用合成的SEQ ID NO3和4的核苷酸來獲得DNA片段，其分別含有HGF基因片段2(HGF-F2)，SEQ ID NO3和5；HGF-F3，SEQ ID NO6和7；HGF-F5，SEQ ID NO8和7；HGF-F7，SEQ ID NO9和7；HGF-F8，SEQ IDNO10和7；HGF-F6，(附圖1)。通過將1μl模板DNA、1μl各種引物(10pmol/1μl)、10μl dNTP(10mM)、3.5單位擴增高保真酶(GibcoBRL，美國)和10μl酶緩沖液混合，并用蒸餾水將最終體積調節到100μl來制備PCR擴增混合物。進行30個循環的PCR擴增，每個循環由94℃下1min、55℃下1min和72℃下30sec組成。在此所用的引物和由此得到的被擴增的基因片段示于表1中。
表1
被擴增的HGF-F2包含范圍在SEQ ID NO2的人HGF cDNA原型(HGF-X1；由外顯子1到4-內含子4-外顯子5到18構成)的從392到2247的序列；HGF-F3是范圍在從392到727的序列；HGF-5是范圍在從2229到5471的序列；HGF-F6是范圍從5117到5471的序列；HGF-F7是范圍從3167到5471的序列；和HGF-F8是范圍從4167到5471的序列。
每個被擴增的HGF基因片段被插入到pGEM-T easy載體(Promega，威斯康星州，美國)的多個克隆位點上來分別得到pGEM-Teasy-HGF-F2、pGEM-T easy-HGF-F3、pGEM-T easy-HGF-F5、pGEM-T easy-HGF-F6、pGEM-T easy-HGF-F7和pGEM-Teasy-HGF-F8(附圖2)。通過序列分析來確認被擴增的HGF基因片段的核苷酸序列。
(2)得自cDNA的HGF基因片段的克隆在PCR擴增中，在與實施例1所描述的相同條件下，人胎盤cDNA(Clontech，CA，美國)被用作模板DNA。作為引物對，合成的SEQ IDNO11和12，和SEQ ID NO13和14的寡核苷酸分別用來獲得包含在HGF-F1和HGF-F4中的DNA片段。此外，HGF基因(cHGF)和缺失的HGF基因(dHGF)的cDNAs含有的DNA片段分別用合成的SEQ ID NO15和16的寡核苷酸作為引物對進行擴增。dHGF基因是缺失5個堿基序列的HGF基因。
在此所用的引物和由此得到擴增基因片段示于表2中。
表2
被擴增的HGF-F1和HGF-F4分別包含SEQ ID NO2的人HGFcDNA原型范圍在從1到402和從6533到7113的核苷酸序列。HGF基因cDNA包含SEQ ID NO1的人HGF基因的范圍在從1-2184的核苷酸序列，而dHGF基因cDNA除了缺失范圍在從483到495的序列外，具有與HGF基因cDNA相同的序列。
每個HGF基因的擴增片段被插入到pGEM-T easy載體(Promega，威斯康星州，美國)的多個克隆位點上來分別得到pGEM-T easy-HGF-F1、pGEM-T easy-HGF-F4、pGEM-T easy-cHGF和pGEM-T easy-dHGF(附圖3)。通過序列分析來確認人HGF基因片段、HGF基因cDNA和dHGF基因cDNA的核苷酸序列。
(3)制備雜合HGF基因構建體通過如下將步驟(1)和(2)中克隆的HGF基因片段組合來制備基因組DNA和cDNA的雜合HGF基因構建體(附圖4A和4B)。
質粒pGEM-T-easy-HGF-F1用HindIII/BamHI處理來獲得HGF-F1。質粒pCK(見PCT國際
發明者金種默, 樸銀珍, 韓熊, 柳承信, 金善榮 申請人:百療醫株式會社