新型脫氫酶和編碼該脫氫酶的基因的制作方法

專利名稱：新型脫氫酶和編碼該脫氫酶的基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型脫氫酶、編碼該新型脫氫酶的DNA和利用其制備N-烷基氨基酸的方法。已知N-烷基氨基酸中，特別是N-甲基氨基酸以稱為ジデムニン(Didemnin)或ドラスタチン(dolastatin)的天然生理活性物質的結構的一部分存在(J.Am.Chem.Soc.1981，103號，p1857-1859；Tetrahedron 1993，49號p9151-9170)，是近年作為醫藥或農藥中間原料備受關注的有用物質。
背景技術：
已知的制備N-取代氨基酸類的方法，包括所謂通過疊氮基進行還原性烷基化的方法(J.Org.Chem.1995，60號，p4986-4987)，通過從噁唑烷衍生物進行還原性開環反應的方法(Tetrahedron Letter 39(1998)1985-1986)等化學反應。
另外，作為利用微生物的方法，雖然已知用脫氫酶或氨基轉移酶從2-氧代羧酸衍生物制備氨基酸類的方法，但這些主要只進行單獨的氨基化。作為使用取代氨基的方法，僅僅已知用假單胞菌屬(Pseudomonas)微生物從丙酮酸制備N-甲基丙氨酸的方法(J.Biol.Chem.，250號，p3746-3751(1975))，和利用紅球菌屬、節桿菌屬微生物的甲基氨基化方法(特開2001-190298號公報)等單純甲基氨基化。
作為參與上述反應的酶，J.Biol.Chem.，250號，p3746-3751(1975)中報告了假單胞菌MS ATCC25262產生的N-甲基丙氨酸脫氫酶的純化。

發明內容
然而，如上所述，公知的氨基酸脫氫酶和N-甲基氨基酸脫氫酶的底物特異性受到限定，例如對胺類或含有二羰基的化合物而言，而且它可以適用的應用范圍窄。并且，用上述的公知酶進行N-甲基氨基化時，不僅制備了N-甲基-氨基酸，還同時制備了沒有氨基取代基的普通氨基酸，因此不能說是工業上有利的方法。因此，期待獲得新型脫氫酶。即，本發明的課題是解決提供與公知脫氫酶具有不同性質的新型脫氫酶的問題。
本發明人為了解決上述課題進行悉心研究，結果成功地從惡臭假單胞菌ATCC12633株分離了新型脫氫酶，從而完成了本發明。
即，本發明提供具有以下理化性質的脫氫酶(1)作用以NADPH和/或NADH為輔酶，從丙酮酸和烷基胺或二烷基胺生成N-烷基-L-丙氨酸；(2)底物特異性對烷基胺或二烷基胺顯示活性，但對氨不顯示活性；(3)以苯丙酮酸與甲胺為底物時的最適pH為10左右；和，(4)在30℃處理30分鐘后，酶在pH5～10.5左右穩定。
本發明的另一方面提供下述任一項的多肽(1)包含序列號1所示的氨基酸序列的多肽；(2)包含在序列號1所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加一個至多個氨基酸所得的氨基酸序列，并且具有脫氫酶活性的多肽；或(3)包含與序列號1所示的氨基酸序列具有50％或50％以上同源性的氨基酸序列，并且具有脫氫酶活性的多肽；本發明另一方面提供編碼上述本發明多肽的DNA。
本發明的另一方面提供下述任一項的DNA(1)包含序列號2所示的堿基序列的DNA；(2)包含在序列號2所示的堿基序列中缺失、取代和/或添加一個至多個堿基所得的堿基序列，并且編碼具有脫氫酶活性的多肽的DNA；或(3)與包含序列號2所示的堿基序列的DNA在嚴緊條件下雜交，并且編碼具有脫氫酶活性的多肽的DNA；本發明另一方面提供含有上述本發明的DNA的重組載體。
本發明另一方面提供含有上述本發明的DNA或重組載體的轉化體。
本發明另一方面提供N-烷基-氨基酸衍生物的制備方法，該方法包括使下述通式(I)
(式中，R1表示氫原子或可以被取代的烷基，R2表示可以被取代的烷基或可以被取代的芳基)所示的含有二羰基的化合物和R3(R4)NH(式中，R3和R4分別獨立地表示氫原子或可以被取代的烷基，但R3和R4不同時為氫原子)所示的烷基取代胺類在本發明脫氫酶、多肽或轉化體的存在下反應。
優選R1為氫原子。
優選R3為可以被氨基取代的C1～C6直鏈、支鏈或環狀烷基，R4為氫原子。
優選式(I)所示化合物為丙酮酸、苯丙酮酸、β-氟代丙酮酸、2-氧代丁酸、2-酮基己酸或2-酮基正戊酸。
本發明另一方面提供N-烷基-氨基酸衍生物的制備方法，該方法包括使下述通式(II) (式中，R1表示氫原子或可以被取代的烷基，R2表示可以被取代的烷基或可以被取代的芳基)所示的氨基羧酸類與可以將通式(II)所示的氨基羧酸類轉化成通式(I) (式中，R1和R2與通式(II)中的定義相同)所示化合物的酶以及R3(R4)NH(式中，R3和R4分別獨立地表示氫原子或可以被取代的烷基，但R3和R4不同時為氫原子)所示的烷基取代胺類，在本發明脫氫酶、多肽或轉化體的存在下反應。
優選R3為可以被氨基取代的C1～C6直鏈、支鏈或環狀烷基，R4為氫原子。
優選通式(II)所示的氨基羧酸類為苯丙氨酸或蛋氨酸。
優選可以將式(II)所示的氨基羧酸類轉變成式(I)所示的烷基取代胺類的酶為D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脫氫酶、L-氨基酸脫氫酶、氨基酸轉移酶。
附圖簡述

圖1是表示本發明N-甲基-L-苯丙氨酸脫氫酶最適pH的曲線圖。
圖2是表示本發明N-甲基-L-苯丙氨酸脫氫酶最適溫度的曲線圖。
圖3是表示本發明N-甲基-L-苯丙氨酸脫氫酶pH穩定性的曲線圖。
圖4是表示本發明N-甲基-L-苯丙氨酸脫氫酶熱穩定性的曲線圖。
圖5是表示對本發明N-甲基-L-苯丙氨酸脫氫酶的pH影響的曲線圖。
圖6表示與D-氨基酸氧化酶共反應的產物的HPLC分析結果。
圖7表示對圖6的峰-1和峰-2進行質譜分析的結果。
發明的最佳實施形態以下詳細說明本發明的實施形態。
(I)本發明的脫氫酶和多肽本發明的脫氫酶具有下述理化性質(1)作用以NADPH和/或NADH為輔酶，從丙酮酸和烷基胺或二烷基胺生成N-烷基-L-丙氨酸；(2)底物特異性對烷基胺或二烷基胺顯示活性，但對氨不顯示活性；(3)以苯丙酮酸與甲胺為底物時的最適pH為10左右；和，(4)在30℃處理30分鐘后，酶在pH5～10.5左右穩定。
本發明的脫氫酶可以通過在例如苯丙酮酸等含有二羰基的化合物以及NADPH和/或NADH的存在下，用氨、烷基胺和二烷基胺進行篩選而獲得。
篩選時可以使用來自具有脫氫酶活性的微生物的培養物的增殖菌體、該菌體破碎物或通過常規操作從它們分離得到的粗制酶或純化酶。
另外，酶在pH5～10.5左右穩定，并且最適pH為10左右的特性是本發明脫氫酶的特性。
上述脫氫酶可以從例如屬于惡臭假單胞菌的微生物，特別優選從惡臭假單胞菌ATCC12633株分離。
上述脫氫酶的具體例子可以列舉序列號1記載的氨基酸序列所示的多肽及其同系物且具有脫氫酶活性的酶。
作為序列號1記載的氨基酸序列所示的脫氫酶的性質，除上述(1)～(4)所示的性質外，還表現以下特性(5)用Superose 12HR10/30(ァマシャムバィォサィェンス公司制)通過凝膠過濾法分析測定的分子量為約80～93千道爾頓，SDS-聚丙烯酰胺電泳中，顯示推定為至少約36千道爾頓的多肽的帶。
(6)通過以苯丙酮酸和甲胺為底物時的活性測定得到的最適溫度為35℃左右。
(7)在最適pH(以苯丙酮酸和甲胺為底物時為pH10)處理30分鐘后，在低于約30℃的溫度顯示熱穩定性。
(8)不僅對丙酮酸，還至少對2-酮基己酸、苯丙酮酸、2-氧代丁酸、β-氟代丙酮酸、2-酮基正戊酸也顯示活性。
(9)被0.01mM氯化汞(HgCl2)和0.01mM氯化銅(CuCl2)之類的二價重金屬抑制活性。
本發明脫氫酶的同系物可以列舉含有在序列號1所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加一個至多個(優選1～20個，更優選1～15個，進一步優選1～10個，進一步優選1～7個，特別優選1～5個左右)氨基酸所得的氨基酸序列，并具有脫氫酶活性的多肽；或與序列號1所示的氨基酸序列具有50％或50％以上，優選60％或60％以上，更優選70％或70％以上，更優選80％或80％以上，進一步優選90％或90％以上，進一步優選95％或95％以上，特別優選97％或97％以上的同源性，并且具有脫氫酶活性的多肽。
另外，上述多肽的同源性檢索可以在例如日本DNA數據庫(DDBJ)中，使用FASTA程序或BLAST程序等進行。
脫氫酶活性一般是催化脫氫反應的活性的總稱，在本發明中，是指通過參與氧化還原反應的輔酶如NADH或NADPH等和烷基胺類使羰基化合物烷基氨基化的活性。
獲得本發明脫氫酶的方法除了如上所述從具有脫氫酶活性的微生物的培養物進行分離·純化的方法外，如后所述，可以用以編碼本發明氨基酸序列的一部分或全部的堿基序列為基礎制備的探針，從具有脫氫酶活性的任意微生物分離編碼該還原酶的DNA，然后進行基因工程方法獲得。
或者，本發明的脫氫酶也可以通過Fmoc法(芴基甲基氧基(ォキシ)羰基法)、tBoc法(叔丁基氧基羰基法)等化學合成方法制備。另外，也可以利用桑和貿易(美國Advanced Chem Tech公司制)、パ一キンェルマ一ジャバン(美國Perkin Elmer公司制)、ァマシャムファルマシァバィォテク(AmershamPharmacia Biotech公司制)、ァロカ(美國Protein Technology Instrument公司制)、クラボゥ(美國Synthecell-Vega公司制)、日本パ一セプティブ·リミテッド(美國PerSeptive公司制)、島津制作所等的肽合成儀進行化學合成。
(II)本發明的DNA本發明提供編碼上述脫氫酶的DNA或其同系物。
編碼上述脫氫酶的DNA可以列舉例如包含序列號2所示的堿基序列的DNA。
編碼本發明脫氫酶的DNA的同系物可以列舉具有在序列號2所示的堿基序列中缺失、取代和/或添加一個至多個(優選1～60個，更優選1～30個，進一步優選1～20個，進一步優選1～10個，特別優選1～5個左右)堿基所得的堿基序列，并編碼具有脫氫酶活性的多肽的DNA；或與具有序列號2所示的堿基序列的DNA在嚴緊條件下雜交，并編碼具有脫氫酶活性的多肽的DNA。
本領域技術人員可以通過用定點誘變法(Nucleic Acid Res.10，pp.6487(1982)，Methodsin Enzymol.100，pp.448(1983)，Molecular Cloning 2ndEdt.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)(以下簡稱為″モレキュラ一クロ一ニング第2版″)，PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991))等，在序列號2記載的DNA中適當導入取代、缺失、插入和/或添加變異，由此獲得所需的同系物。
本說明書中“在嚴緊條件下雜交的DNA”是指用DNA作為探針，通過使用集落雜交法、蝕斑雜交法或Southern印跡雜交法等獲得的DNA堿基序列，例如，可以列舉能通過下述方法鑒定的DNA等用固定了來自集落或蝕斑的DNA或該DNA的片斷的濾膜，在0.7～1.0M的NACl的存在下于65℃進行雜交后，用0.1～2×SSC溶液(1×SSC的組成為150mM氯化鈉，15mM枸櫞酸鈉)在65℃的條件下洗滌濾膜。
雜交可以根據モレキュラ一クロ一ニング第2版等中記載的方法進行。
作為上述DNA的同系物，可以列舉與具有序列號2記載的堿基序列的DNA有60％或60％以上，優選70％或70％以上，更優選80％或80％以上，特別優選90％或90％以上同源性的DNA。
編碼本發明脫氫酶的DNA可以通過例如下述方法分離。
首先，可以將本發明的脫氫酶純化，然后分析N末端氨基酸序列，然后用PCR克隆等常規基因工程學分析方法，從染色體DNA分離編碼目的脫氫酶的基因，分析其堿基序列。另外，根據本發明，由于堿基序列已經明確，因此可以以該堿基序列為基礎設定引物來克隆目的基因，也可以通過DNA合成儀來合成目的基因。
(III)本發明的重組載體和轉化體上述(II)中獲得的編碼本發明脫氫酶的DNA通過插入到公知的表達載體，可以提供脫氫酶表達載體。另外，通過培養用該表達載體進行轉化得到的轉化體，可以從該轉化體獲得脫氫酶。
作為使本發明脫氫酶表達的轉化對象的微生物沒有特別限制，只要宿主本身對此反應沒有不良影響，具體可以列舉以下所示的微生物。
埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)屬等開發出了宿主載體系統的細菌；紅球菌屬(Rhodococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)等開發出了宿主載體系統的放線菌；糖酵母屬(Saccharomyces)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、Yarrowia屬、絲孢酵母屬(Trichosporon)、紅冬孢屬(Rhodosporidium)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、念珠菌屬(Candida)屬等開發出了宿主載體系統的酵母；鏈孢霉屬(Neurospora)、曲霉屬(Aspergillus)、頭孢屬(Cephalosporium)、木霉屬(Trichoderma)等開發出了宿主載體系統的霉菌。
上述微生物中，作為宿主優選埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒桿菌屬，特別優選埃希氏菌屬、棒桿菌屬。
制備轉化體的程序以及適合于宿主的重組載體的構建可以根據分子生物學、生物工程學、基因工程學領域中慣用的技術進行(例如，參照モレキュラ一クロ一ニング第2版等)。
具體地，往微生物中穩定存在的質粒載體或噬菌體載體中導入本發明的DNA，或者，直接往宿主基因組中導入本發明的DNA，必須轉錄、翻譯其遺傳信息。
此時，優選將啟動子整合到本發明DNA鏈的5’-側上游，更優選將終止子整合到3’-側下游。可以用于本發明的啟動子和終止子沒有特殊限制，只要是在用作宿主的微生物中功能已知的啟動子和終止子。有關上述各種微生物中可以利用的載體、啟動子和終止子等，在例如《微生物學基礎講座8基因工學·共立出版》，特に酵母に関しては，Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)，Yeast 8，423-488(1992)等中進行了詳細描述。
具體地，例如埃希氏菌屬，特別是大腸埃希氏菌中，作為質粒載體，可以列舉pBR、pUC系列的質粒，可以列舉來自lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操縱子)、tac、trc(lac、trp的融合)、λ噬菌體PL、PR等的啟動子等。另外，作為終止子，可以列舉來自trpA、來自噬菌體、來自rrnB核糖體RNA的終止子等。
芽孢桿菌屬中，作為載體，可以列舉pUB110質粒、pC194質粒等。另外，還可以整合到染色體中。作為啟動子和終止子，可以利用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等酶基因的啟動子或終止子等。
假單胞菌屬中，作為載體，可以列舉開發用于惡臭假單胞菌、蔥頭假單胞菌(Pseudomonas cepacia)等的普通宿主載體系統，或以參與甲苯化合物分解的質粒TOL為基礎的廣宿主域載體pKT240(包括來自RSF1010等的自主復制所必需的基因)。
短桿菌屬，特別是乳發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)中，作為載體，可以列舉pAJ43(Gene 39，281(1985))等質粒載體。作為啟動子和終止子，可以使用大腸埃希氏菌中使用的各種啟動子和終止子。
棒桿菌屬，特別是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)中，作為載體，可以列舉pCS11(特開昭57-183799號公報)、pCB101(Mol.Gen.Genet.196，175(1984)等質粒載體。
糖酵母屬，特別是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，作為載體，可以列舉YRp系列、YEp系列、YCp系列、YIp系列質粒。另外，可以利用醇脫氫酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、酸性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶等各種酶基因的啟動子、終止子。
裂殖糖酵母屬中，作為載體，可以列舉來自Mol.Cell.Biol.6，80(1986)記載的粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的質粒載體，特別是可以容易地利用寶酒造市售的pAUR224。
曲霉屬中，黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)等是真菌中研究最深的曲霉，可以利用向質粒或染色體中的整合，可以利用來自胞外蛋白酶或淀粉酶的啟動子(Trends in Biotechnology 7，283-287(1989))。
另外，除上述以外，開發了適應于各種微生物的其它宿主載體系統，可以適當地使用這些。
另外，除微生物以外，開發了植物、動物中的各種宿主·載體系統，特別是開發了在使用蠶的昆蟲(Nature 315，592-594(1985))或在油菜籽、玉米、馬鈴薯等植物中大量表達異種蛋白的體系，以及采用大腸埃希氏菌無細胞提取液或小麥胚芽等的無細胞蛋白質合成體系的系統，可以適當地利用它們。
可以通過公知的方法培養含有本發明DNA的轉化體，并從培養物分離和純化本發明的脫氫酶。
培養含有本發明DNA的轉化體的方法可以按照宿主培養所用的常規方法進行。
本發明的轉化體為大腸菌等原核生物、酵母菌等真核生物時，培養這些微生物的培養基可以是天然培養基、合成培養基中的任意一種，只要是含有該微生物能利用的碳源、氮源、無機鹽類等，能有效進行轉化體培養的培養基，培養優選在振蕩培養或深部通氣攪拌培養等好氣條件下進行，培養溫度通常為15～40℃，培養時間通常為16小時～7天。培養過程中pH保持在3.0～9.0。pH調整用無機酸或有機酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣和氨水等進行。另外，根據需要，可以在培養中添加氨芐西林或四環素等抗生素。
作為培養以動物細胞為宿主細胞獲得的轉化體的培養基，使用常用的RPMI1640培養基[The Journal of the American Medical Association，199，519(1967)]、Eagle MEM培養基[Science，122，501(1952)]、DMEM培養基[Virology，8，396(1959)]、199培養基[Proceeding of the Society for theBiological Medicine，73，1(1950)]或往這些培養基中加入胎牛血清等獲得的培養基等。培養通常在pH＝6～8、30～40℃、5％CO2存在下等條件下進行1～7天。另外，根據需要，可在培養中添加卡那霉素，青霉素等抗生素。
從轉化體培養物分離并純化本發明的脫氫酶時，可以使用常規的蛋白質分離、純化法。
例如，本發明的脫氫酶在細胞內以溶解狀態表達時，培養結束后，通過離心分離回收細胞并懸浮于水系緩沖液中，然后用超聲破碎機、弗式壓碎機(フレンチプレス)、Manton-Gaulin勻漿機(マントンガゥリンホモゲナイザ一)、ダィノミル等使細胞破碎，得到無細胞提取液。將該無細胞提取液離心分離，從所得的上清通過常規的蛋白質分離純化法，即，溶劑提取法、利用硫酸銨等的鹽析法、脫鹽法、利用有機溶劑的沉淀法、利用二乙基氨基乙基(DEAE)Sepharose、DIAION HPA-75(三菱化學社制)等樹脂的陰離子交換色譜法、利用S-Sepharose FF(ファルマシァ公司制)等樹脂的陽離子交換色譜法、利用丁基Sepharose、苯基Sepharose等樹脂的疏水色譜法、利用分子篩的凝膠過濾法、親和層析法、層析聚焦法(クロマトフォ一カシング法)、等電聚焦等電泳法等，這些方法可以單獨或組合使用，從而可以得到純化的樣品。
另外，本發明的脫氫酶在細胞內以不溶物形成表達時，同樣回收細胞后進行破碎，通過離心分離得到沉淀級分，從該沉淀級分通過常規方法回收所述脫氫酶后，用蛋白質變性劑使該脫氫酶的不溶物溶解。將該可溶性液體稀釋到不含蛋白質變性劑或蛋白質變性劑的濃度低到不使脫氫酶變性的程度的稀溶液，或進行透析，使該脫氫酶形成正常的立體結構后，通過與上述相同的分離及純化法可以獲得純化的樣品。
(IV)利用本發明的脫氫酶制備N-烷基-氨基酸衍生物進一步地，本發明涉及N-烷基-氨基酸衍生物的制備方法，該方法包括下述通式(I) 使(式中，R1表示氫原子或可以被取代的烷基，R2表示可以被取代的烷基或可以被取代的芳基)所示的含有二羰基的化合物與R3(R4)NH(式中，R3和R4分別獨立地表示氫原子或可以被取代的烷基，但R3與R4不同時為氫原子。)所示的烷基取代胺類在上述本發明的脫氫酶或轉化體的存在下反應；和，N-烷基-氨基酸衍生物的制備方法，該方法包括使下述通式(II) (式中，R1表示氫原子或可以被取代的烷基，R2表示可以被取代的烷基或可以被取代的芳基)所示的氨基羧酸類與可以將通式(II)所示的氨基羧酸類變成通式(I) (式中，R1和R2與通式(II)中的定義相同)所示的化合物的酶，以及R3(R4U)NH(式中，R3和R4分別獨立地表示氫原子或可以被取代的烷基，但R3與R4不同時為氫原子。)所示的烷基取代胺類在本發明的脫氫酶、多肽或轉化體的存在下反應。
上述通式(I)中R1的烷基是可以被鹵原子、芳基等對反應惰性的基團取代的直鏈、支鏈或環狀烷基，具體例子可以列舉甲基、乙基、正丙基、異丙基、三氟甲基、芐基等。其中，優選碳原子數為1～10的烷基，更優選碳原子數為1～4烷基。
上述R1優選氫原子或直鏈烷基，特別優選氫原子。
上述R2的烷基是可以被鹵原子、羥基、芳基等對反應惰性的基團取代的直鏈、支鏈或環狀烷基，具體例子可以列舉甲基、乙基、正丙基、異丙基、氟代甲基、三氟甲基、羥甲基和芐基等。
上述R2的芳基是可以被鹵原子、羥基、烷基、芳基等對反應惰性的基團取代的芳基，具體例子可以列舉苯基、甲苯基、氟代苯基和羥苯基等。
上述可取代的烷基和芳基優選碳原子數為1～10的基團。
上述R2優選烷基、鹵代烷基、芳烷基，其中，特別優選直鏈狀的基團。
通式(I)所示化合物的優選具體例子可以列舉丙酮酸、羥基丙酮酸，苯丙酮酸、β-氟代丙酮酸、2-酮基己酸、2-酮基異己酸、2-氧代丁酸、2-酮基辛酸或2-酮基正戊酸，特別優選丙酮酸、苯丙酮酸，β-氟代丙酮酸、2-氧代丁酸、2-酮基己酸或2-酮基正戊酸。
通式(II)所示化合物的優選具體例子為苯丙氨酸、蛋氨酸。
本反應所用的胺類為R3(R4)NH所示的胺類。
此處，上述R3和R4分別獨立地為氫原子或可以被取代的烷基，這里可以被取代的烷基是可以被鹵原子、羥基、氨基、芳基等對反應惰性的基團取代的直鏈、支鏈或環狀烷基。
上述可以被取代的烷基的具體例子可以列舉甲基、乙基、正丙基、異丙基、氟代甲基、三氟甲基、羥甲基、氨基甲基、芐基等，其中優選直鏈狀的烷基或氨基烷基。
另外，上述可以被取代的烷基優選碳原子數為1～6的烷基，更優選碳原子數為1～4的烷基。
上述胺類的優選具體例子可以列舉甲胺、乙胺、正丙胺、異丙胺、二氨基甲烷、二甲胺和環己胺等，更優選伯胺類，特別優選甲胺。
本反應中，作為反應底物的含二羰基的化合物通常以底物濃度為0.01～90％w/v，優選0.1～30％w/v的范圍使用。這些可以在反應開始時一并添加，但從減少酶的任何底物抑制效應或提高產物的蓄積濃度的方面考慮，優選連續或間歇性地添加。
本反應中，作為反應底物的氨基羧酸類通常在底物濃度為0.01～90％w/v，優選0.1～30％w/v的范圍使用。
另外，胺類的用量為含二羰基的化合物和氨基羧酸類的等摩爾量或等摩爾量以上，優選1.5摩爾倍或1.5摩爾倍以上。只要是上述范圍，通常可以在考慮系統內的pH和成本等因素后任意使用，但通常為50摩爾倍或50摩爾倍以下，優選20摩爾倍或20摩爾倍以下。
本反應中，使上述轉化體作用于含有二羰基的化合物和氨基羧酸類時，可以直接使用該轉化體、或將該轉化體用丙酮、DMSO、甲苯等有機溶劑或表面活性劑處理后再用、或使用經凍干處理的物質、進行物理性破碎或酶破碎所得到的物質等菌體處理物，將該轉化體中的本發明的酶級分以粗制物或純化物的形式取出所得的物質，以及將這些固定到諸如聚丙烯酰胺凝膠、角叉菜膠凝膠(カラギ一ナンゲル)等載體上所得的物質。
另外，本反應中，優選添加輔酶NAD+或NADP+(以下簡稱為NAD(P))或NADH或NADPH(以下簡稱為NAD(P)H)，并且通常添加0.001mM～100mM，優選0.01～10mM。
添加上述輔酶時，使由NAD(P)H生成的NAD(P)+再生成NAD(P)H對于提高生產效率是優選的，作為再生方法，可以列舉1)利用宿主微生物自身的NAD(P)+還原能力的方法，2)往反應體系中添加微生物或酶的方法，所述微生物是具有由NAD(P)+生成NAD(P)H的能力的微生物或其處理物，所述酶如葡萄糖脫氫酶、甲酸脫氫酶、醇脫氫酶、氨基酸脫氫酶、有機酸脫氫酶(蘋果酸脫氫酶等)等可用于NAD(P)H的再生的酶(再生酶)，3)制備轉化體時，將作為可以用于NAD(P)H再生的上述再生酶類的基因與本發明DNA同時導入宿主的方法。
其中，上述1)的方法中，優選往反應體系中添加葡萄糖或乙醇、甲酸等。
另外，上述2)的方法中，可以使用包含上述再生酶類的微生物、將該微生物菌體進行丙酮處理所得的物質、冷凍干燥處理所得的物質、物理性破碎或酶性破碎所得的物質等、將該酶級分以粗制物或純化物形式取出的物質，以及將這些物質固定到諸如聚丙烯酰胺凝膠、角叉菜膠凝膠等載體上所得的物質等，也可以使用市售的酶。
此時，上述再生酶的用量具體例如是本發明脫氫酶的酶活性的0.01～100倍，優選0.5～20倍左右。
另外還需要添加化合物作為上述再生酶的底物，例如，利用葡萄糖脫氫酶時的底物葡萄糖、利用甲酸脫氫酶時的底物甲酸、利用醇脫氫酶時的底物乙醇或異丙醇等，其添加量是作為反應原料的含二羰基化合物的0.1～20摩爾倍量，優選添加1～5摩爾倍量。
上述3)的方法中，可以使用將本發明的DNA與上述再生酶類的DNA整合到染色體中的方法，往單一載體中導入兩種DNA并用其轉化宿主的方法，和將兩種DNA分別導入其不同載體然后轉化宿主的方法，但使用將兩種DNA分別導入不同載體然后轉化宿主的方法時，必須在考慮兩種載體彼此不相容性的基礎上選擇載體。
往單一載體中導入多個基因時，可以使用將啟動子和終止子等參與表達控制的區域連結到各自的基因的方法，也可以以包含多個順反子的操縱子如乳糖操縱子的形式表達。
本反應在包含反應底物和本發明轉化體以及根據需要添加的各種輔酶及其再生系統的水性介質中或該水性介質與有機溶劑的混合物中進行。
上述水性介質可以列舉水或緩沖液，另外，有機溶劑可以使用乙醇、丙醇、四氫呋喃、二甲亞砜等水溶性有機溶劑或乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷等非水溶性有機溶劑等反應底物溶解度高的適當溶劑。
本反應通常在4～50℃，優選10～40℃的反應溫度，pH通常為6～11、優選pH為7～11的條件下進行。
另外，也可以利用膜反應器等進行。
并且，本反應中，用通式(I)所示化合物中的羧酸酯類作為反應原料時，可以使市售的水解酶在系統內共存，在系統內繼續轉變成R1為氫原子的羧酸類，并進行N-烷基氨基化。
另外，本反應中，使用上述通式(I)對應的氨基羧酸類，即通式(II)所示化合物(R2CH(NH2)COOR1)作為反應原料，通過使可以作用于通式(II)所示化合物并使其轉變成通式(I)所示化合物的酶共存，由此也可以在系統中生成上述通式(I)所示的化合物，并繼續通過本脫氫酶進行N-烷基氨基化。
只要是可以作用于通式(II)所示的化合物并使其轉變成通式(I)所示的化合物的酶，則沒有特別限制，具體可以列舉氨基酸氧化酶、氨基酸脫氫酶或氨基酸轉移酶。優選底物特異性廣的酶。具體可以列舉Enzyme and MicrobialTechnology vol.31(2002)p77-87中記載的L-氨基酸氧化酶、シグマ公司的D-氨基酸氧化酶等。所用的氨基酸氧化酶、氨基酸脫氫酶或氨基酸轉移酶優選僅與氨基酸反應并且對應于本反應所用的輔酶，以便代替輔酶再生系統。即，本反應的N-烷基氨基化中，用NAD(P)H作為輔酶時，NAD(P)H通過本反應的N-烷基氨基化變成NADP+，而由氨基羧酸類制備上述通式(I)所示的化合物時，該NADP+被利用并被轉變成NAD(P)H。另外，當能作用于通式(II)所示的化合物并使其轉變成通式(I)所示化合物的酶僅對羧基上沒有取代基的氨基酸起作用時，也可以允許另一種將該氨基羧酸水解成氨基酸的酶共存，在生成該氨基酸后進行反應。
本反應生成的N-烷基-氨基酸衍生物可以在反應結束后通過將反應液中的細胞或蛋白質離心分離和膜處理等進行分離，再用乙酸乙酯、甲苯等有機溶劑進行提取、蒸餾、柱層析法和結晶等操作，或將這些適當組合進行。
以下，通過實施例更詳細地說明本發明，但本分明不受這些實施例的限制。
實施例本實施例的酶活性通過下述方法測定。
往作為測定對象的粗制酶液中加入苯丙酮酸鈉(最終濃度15mM)、甲胺-硫酸緩沖液(pH＝10)(最終濃度400mM)和NADPH(最終濃度10mM)，使其總量為50μL。在37℃反應1小時。反應結束后，加入5μL的10％三氯乙酸溶液，以13000rpM離心5分鐘。將離心上清10μL用40μL高效液相色譜(以下簡稱為HPLC)洗脫液稀釋，用0.45μm的過濾器過濾后通過高效液相色譜(以下簡稱為HPLC)進行分析。
HPLC條件如下柱Ultron ESPh-CD(信和化工株式會社)溫度40℃洗脫液20％乙腈，80％20mM KH2PO4、H3PO40.4ml/L(pH＝3)流速0.85ml/min檢測器UV檢測器(210nm)用Sigma公司的試劑作為標準樣品。
將酶的活性單位1個單位規定為每分鐘能生成1μ摩爾N-甲基苯丙氨酸的酶量。
實施例1酶的純化(1-1)往無菌液體培養基100ml(包含甲胺鹽酸鹽5g/L、葡萄糖1g/L、酵母提取物5g/L、磷酸氫二鉀7g/L、磷酸二氫鉀3g/L、硫酸鎂七水合物0.1g/L)×2瓶(500ml坡口燒瓶(Sakaguchi flask))中接種惡臭假單胞菌ATCC12633株，在28℃好氣性振蕩培養18小時(更前培養)。然后，在相同組成的無菌液體培養基500ml×4瓶(2L坡口燒瓶)中接種更前培養所得的培養液，各2L坡口燒瓶每瓶接種50ml。在28℃、好氣條件下振蕩培養8小時(前培養)。將添加了1％聚胨(ナカラィテスク公司制)、0.5％酵母提取物(ナカラィテスク公司制)、1％氯化鈉(ナカラィテスク公司制)的培養基(以下簡稱為LB培養基)200L進行滅菌，然后將前培養所得的培養液2200ml全部接種，在28℃下好氣性培養16小時(主培養)。培養后將所得的培養液離心分離，得到2.5kg濕菌體。將該菌體懸浮于5L的20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH＝7.0)中，通過超聲破碎得到5.9L粗制酶液。
對粗制酶進行硫酸銨分級分離，結果表明硫酸銨濃度為20～60％的級分有活性。收集該級分，并用15L的20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH＝7.0)透析5次。酶液的量為3100ml。
(1-2)用SuperQ-TOYOPEARL(TOSOH公司制)進行純化往用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH＝7.0)平衡過的SuperQ-TOYOPEARL(TOSOH公司制)700mL中，加入硫酸銨20～60％飽和的級分3100mL。然后用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH＝7.0)4900mL進行洗滌。洗滌級分中未檢測出活性。
進行上述洗滌后，用含有0.2M氯化鈉的20mM Tris-鹽酸緩沖液3500mL洗脫。在該條件下，具有活性的蛋白質被洗脫。然后用含有0.5M氯化鈉的20mM Tris-鹽酸緩沖液3500mL洗脫，該級分中未檢測出活性。
回收用上述含有0.2M氯化鈉的20mM Tris-鹽酸緩沖液洗脫的級分，測定蛋白量和酶活性。將顯示活性的溶液3900mL用含有20％飽和硫酸銨的20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH＝7.0)透析3次，每次12L。透析后的酶液為3000mL。
(1-3)通過Butyl-TOYOPEARL(TOSOH公司制)進行純化將上述(1-2)中得到的酶液3000mL倒入用含有20％飽和硫酸銨的20mMTris-鹽酸緩沖液(pH＝7.0)平衡過的Butyl-TOYOPEARL(TOSOH社制)500mL中。然后用該含有20％飽和硫酸銨的20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH＝7.0)2800mL洗滌。測定洗滌級分的蛋白量和酶活性，結果在該級分中檢測出活性。往洗滌所得的酶液中直接加入硫酸銨，得到濃度為5～20％的飽和硫酸銨級分，并再次倒入Butyl-TOYOPEARL中。
(1-4)通過Butyl-TOYOPEARL(TOSOH社制)的第二輪純化將從硫酸銨級分所得的酶液5700mL倒入用含有30％飽和硫酸銨的20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)平衡過的Butyl-TOYOPEARL(TOSOH社制)500mL中。然后，用含有30％飽和硫酸銨的20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)2300mL洗滌。測定洗滌級分的蛋白量和酶活性，結果在該級分中檢測出活性。然后，將該柱用含有15％飽和硫酸銨的20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)洗脫。結果，洗脫液中也檢測出活性。回收顯示活性的上述兩個級分，加入3070g硫酸銨使達到60％飽和濃度，攪拌、濃縮。結果酶液變成600mL。將其用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)14L透析3次，所得的酶液變成1000mL。
(1-5)通過DEAE-TOYOPEARL(TOSOH公司制)進行純化將上述(1-4)中透析所得的酶液1000mL加入已用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)平衡過的DEAE-TOYOPEARL(TOSOH公司制)600mL中。然后用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)4000mL洗滌。洗滌級分中未發現活性。然后用含有0.1M氯化鈉的20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)2500mL洗脫。結果在該級分中幾乎沒有檢測到活性。然后用濃度為0.1～0.3M的氯化鈉梯度洗脫蛋白質。回收具有酶活性的級分，得到1700mL酶液。往該酶液中加入760g硫酸銨并攪拌、濃縮。結果酶液變成60mL。將其用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)8L透析2次。透析后酶液變成100mL。
(1-6)通過Green-Sepharose CL-4B進行純化將市售的經膨脹的SepharoseCL-4B凝膠150ml置于玻璃過濾器上，用1L蒸餾水進行空吸洗滌。并將其轉移到2L坡口燒瓶中。往其中加入ReactiveGreen 19(Sigma公司制)0.75g(7.5mg色素/mL凝膠的比例)的水(150mL)溶液。進一步加入22％的氯化鈉水溶液15mL(最終濃度約2％)，以凝膠和色素充分混合的程度振蕩攪拌約30分鐘。加入1.5g結晶碳酸鈉，在50℃振蕩攪拌過夜。反應結束后，將凝膠懸浮液轉移到玻璃過濾器上，依次用水(約1.5L)、1M氯化鈉水溶液(約1.5L)、水(約3L)洗滌色素凝膠至看不見濾液的染色，由此制備Green-sepharose CL-4B。
將通過上述方法制備的Green sepharose CL-4B 450mL用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)平衡后，加入上述(1-5)所得的酶液100mL。
然后，用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)3000mL洗滌。洗滌級分中檢測到上述(1-5)所得的酶液總活性的15％左右的活性。然后用濃度為0～3M的氯化鈉梯度洗脫蛋白質。回收具有酶活性的級分，得到231mL的酶液。往其中加入硫酸銨109g使達到70％飽和濃度，使蛋白質沉淀。將沉淀懸浮到20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)3mL中，用含有20％飽和硫酸銨的20mMTris-鹽酸緩沖液(pH 7.0)9L透析8小時。透析后，試管內發現沉淀物，因此加入與透析相同的緩沖液8.5mL進行懸浮。即使用該操作沉淀物也不溶解，因此離心分離沉淀物和上清。活性基本上在上清中被發現，因此將上清13mL用RESOURCE PHE(ァマシャムバィォサィェンス社制)純化。用含有20mL的20％飽和硫酸銨的20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)和20mL的20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)梯度洗脫蛋白質。
將回收的酶液19mL通過超濾濃縮至5mL后，用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)透析，結果酶液變成6.5mL。
(1-7)通過Blue-sepharose 4B(ァマシャムバィォサィェンス公司制)的純化將Blue-sepharose 4B(ァマシャムバィォサィェンス公司制)5mL用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)平衡后加入上述(1-6)所得的酶液6.5mL。然后用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)50mL洗滌。接著用50mL的1M氯化鈉水溶液與50mL的20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)以0～1M的氯化鈉濃度梯度洗脫活性級分。
上述(1-1)～(1-7)各純化步驟中的酶級分的比活性等總結示于表1。
表1


實施例2SDS-PAGE和部分氨基酸序列的分析將各酶純化步驟的樣品全部進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
有一條約35-40KDa的帶隨著純化程度的提高其量也增加，通過常規方法切出此帶，用蛋白測序儀通過Edman法進行氨基酸序列分析，確定N末端的氨基酸序列。將該序列示于序列表序列號3。
通過BLAST檢索結果提示，該蛋白質是與蘋果酸脫氫酶同源性高的蛋白質。
實施例3酶基因的克隆由將惡臭假單胞菌ATCC12633株用LB培養基培養所得的菌體用DNeasy Tissue Kit(Qiagen公司制)處理，制備染色體DNA。
以編碼實施例2確定的N末端氨基酸序列和BLAST檢索中發現的氨基酸序列的堿基序列為基礎合成引物。各自的堿基序列示于序列表的序列號4(NMPDHf)和5(NMPDHr1)。
以惡臭假單胞菌ATCC12633株的染色體DNA為模板，用NMPDHf，NMPDHr1作引物，進行PCR(98℃，20秒，68℃，3分鐘)30個循環，得到特異性擴增樣品。
將上述所得的DNA片斷根據常法導入克隆載體pET21a(寶酒造社制))中。(將該質粒定為pENMadh)然后轉化大腸埃希氏菌BL21(DE3)(Novagen公司)。
使轉化株在含有氨芐西林(100μg/mL)的LB培養基平皿(LB培養基+2％瓊脂)上于37℃繁殖。將出現的數個白色菌落進行培養，在常規條件下進行質粒的提取。獲得的質粒用制限酶NdeI和HindIII消化(37℃，3小時)后，通過瓊脂糖電泳確認目的DNA片斷是否插入到質粒中。
將被認為插入了目的DNA片斷的菌落用含有氨芐西林的液體LB培養基培養，在培養的第14小時添加IPTG，使其濃度達到0.1mM，繼續培養3小時，收集菌體。將菌體進行超聲破碎，得到粗制酶。
測定所得的粗制酶的活性，確認目的蛋白的表達。
經確認，使用由攜帶目的片斷的菌落獲得的粗制酶，生成了N-甲基-苯丙氨酸，而僅用質粒轉化的菌體破碎物中未發現N-甲基-苯丙氨酸生成。
分析確認了活性的質粒中的插入片斷的堿基序列。該基因的堿基序列示于序列表的序列號2，編碼該基因的蛋白質的氨基酸序列示于序列表的序列號1。
實施例4利用轉化體的無細胞提取液合成N-甲基-苯丙氨酸往試管中加入LB培養基5mL，在121℃進行20分鐘蒸氣殺菌，變成室溫后加入100mg/ml的氨芐西林水溶液5μL。用接種環往其中無菌接種實施例3所得的大腸埃希氏菌克隆株的菌落，在37℃振蕩培養24小時(前培養)。然后將LB培養基50mL加入到500mL坡口燒瓶并殺菌，變成室溫后加入100mg/ml氨芐西林水溶液50μL。往其中接種前培養所得的大腸埃希氏菌克隆株的培養液0.5mL，在37℃振蕩培養10小時。在這一階段加入1M的IPTG水溶液50μL，進一步在37℃振蕩培養3小時。培養后，通過離心分離收集菌體，用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)洗滌2次。將所得的菌體0.37g懸浮在20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)8.0mL中，用超聲波將菌體破碎。通過離心分離除去菌體碎片，得到8.0mL無細胞提取液。
在50mL的燒杯中，往包含苯丙酮酸鈉60mg、NADPH 2.3mg、葡萄糖脫氫酶35U、葡萄糖1g的40mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)5.88ml中加入用硫酸調至pH＝8.0的240mM甲胺5.88mL、上述無細胞提取液3.25mL，在30℃進行反應。反應在一邊用1當量的氫氧化鈉水溶液調至pH＝8.0，一邊攪拌中進行。用HPLC定期分析反應液的一部分，底物苯丙酮酸鈉枯竭時，進一步補加30mg使反應繼續進行。重復該操作8次，反應24小時。反應結束后的N-甲基苯丙氨酸生成量為146mg。
實施例5從轉化體純化酶往試管中加入LB培養基5mL，在121℃進行20分鐘蒸氣殺菌，變成室溫后加入100mg/ml的氨芐西林水溶液5μL。用接種環往其中無菌接種實施例3中所得的大腸埃希氏菌克隆株的菌落，在37℃振蕩培養24小時(前培養)。然后將LB培養基500mL加入到2L的坡口燒瓶并殺菌，變成室溫后加入100mg/ml的氨芐西林水溶液500μL。往其中接種前培養所得的大腸埃希氏菌克隆株的培養液0.5mL，在37℃振蕩培養14小時。在這一階段加入1M的IPTG水溶液500μL，進一步在37℃振蕩培養3小時。培養后，通過離心分離收集菌體，用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)洗滌2次。將所得的菌體3.3g懸浮在20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)28mL中(總量30ml)，用超聲波破碎菌體。通過離心分離除去菌體碎片，得到29mL無細胞提取液。然后用實施例1中所用的Green sepharose CL-4B進行純化。
將Green sepharose CL-4B(樹脂100ml量)用Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)平衡后，倒入上述無細胞提取液。
然后用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)800mL洗滌。用濃度為0～1M氯化鈉溶液梯度從洗滌級分中洗脫蛋白質。回收具有酶活性的級分，將其用Centriprep(ァマシャムバィォサィェンス公司制)濃縮，并用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)將其透析8小時。透析后，酶液量變成59ml。
然后用DEAE-TOYOPEARL(TOSOH公司制)進行純化。
將上述透析所得的酶液供給到用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)平衡過的DEAE-TOYOPEARL(TOSOH公司制)(樹脂60mL)中。然后，用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)500mL洗滌。接著，用濃度為0～0.35M的氯化鈉溶液梯度洗脫蛋白質。回收具有酶活性的級分，用Centriprep(ァマシャムバィォサィェンス公司制)濃縮后，用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)進行透析。透析后酶液變成6mL。
上述各純化步驟中酶級分的比活性比總結示于表2。
表2

實施例6本發明酶的底物特異性用與實施例5相同的方法從大腸埃希氏菌克隆株獲得純化的本發明酶。
往其中加入表3所示的各種酮酸(最終濃度10mM)、NADPH(最終濃度0.2mM)、用硫酸調至pH＝10的甲胺(最終濃度60mM)，測定所得反應液在340nm處的吸光度變化，由此測定酶活性。測定時的反應溫度為37℃。以β-苯丙酮酸作為底物時的活性定為100％，相對活性的測定結果如表3所示。
表3

實施例7最適pH的測定用與實施例5相同的方法從大腸埃希氏菌克隆株獲得純化的本發明酶。
往其中加入β-苯丙酮酸(最終濃度10mM)、NADPH(最終濃度0.2mM)、用硫酸調至各pH的甲胺(最終濃度60mM)，測定所得的反應液在340nm處的吸光度變化，由此測定酶活性。測定時的反應溫度為37℃。將一分鐘內與1微摩爾β-苯丙酮酸反應的酶量定為1個單位，每份蛋白量的單位數(u/mg)與pH的關系結果如圖1所示。反應的最適pH為10.0。
實施例8酶作用的最適溫度采用與實施例6相同的反應條件并用甲胺-硫酸(pH＝10)測定活性，不同僅在于溫度。結果如圖2所示。最適溫度為30～40℃。
實施例9pH穩定性將實施例5中所得的純化酶用緩沖液在不同pH值，在30℃保溫3分鐘，測定殘留活性。反應條件與實施例7相同，用甲胺-硫酸(pH＝10)、在37℃進行。將未處理的酶活性作為100，結果以殘留活性表示，如圖3所示。本發明的酶在pH＝6～9中最穩定。
實施例10酶的溫度穩定性將實施例5所得純化酶在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃的溫度放置30分鐘后，與實施例7同法測定活性。將未處理(冰中放置)的酶活性作為100，結果以殘留活性表示，如圖4所示。本發明的酶一直到30℃都顯示100％的殘留活性。
實施例11用NADH作為輔酶時本發明酶的底物特異性用與實施例5相同的方法從大腸埃希氏菌克隆株獲得純化的本發明酶。
往其中加入表4所示的各種酮酸(最終濃度40mM(但其中β-苯丙酮酸為30mM)、NADH(最終濃度0.3mM)、bis-Tris丙烷緩沖液(pH10.0)(最終濃度100mM)、甲胺(最終濃度180mM)，測定所得反應液在340nm處的吸光度變化，由此測定酶活性。測定時的反應溫度為37℃。將以丙酮酸為底物時的活性定為100％，相對活性結果如表4所示。
表4

實施例12以NADH為輔酶時的最適pH的測定用與實施例5相同的方法從大腸埃希氏菌克隆株獲得純化的本發明酶。
往其中加入丙酮酸(最終濃度80mM)、NADH(最終濃度0.3mM)、用硫酸調至不同pH的甲胺(最終濃度180mM)，測定所得反應液在340nm處的吸光度變化，由此測定酶活性。測定時的反應溫度為37℃。將一分鐘內與1微摩爾丙酮酸反應的酶量定為1個單位，每份蛋白量的單位數(u/mg)與pH的關系結果如圖5所示。反應的最適pH為9.5。
實施例13以NAD為輔酶時的逆反應的研究用與實施例5相同的方法從大腸埃希氏菌克隆株獲得純化的本發明酶。
測定加入了N-甲基-L-丙氨酸(最終濃度50mM)、NAD(最終濃度10mM)、bis-Tris丙烷緩沖液(pH10.0)(最終濃度100mM)的反應液在340nm處的吸光度變化，由此測定酶活性。測定時的反應溫度為37℃。活性為7.8×10-3(u/mg蛋白)。
實施例14以NADPH為輔酶時本發明酶的底物特異性用與實施例5相同的方法從大腸埃希氏菌克隆株獲得純化的本發明酶。
往其中加入表5所示的各種胺類(最終濃度60mM)、NADPH(最終濃度0.2mM)、β-苯丙酮酸(最終濃度10mM)，測定所得反應液在340nm處的吸光度變化，由此測定酶活性。測定時的反應溫度為37℃。將以甲胺作為底物時的活性定為100％，相對活性的結果如表5所示。
表5

實施例15從枯草芽孢桿菌純化DNA將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis株)在LB培養基上進行培養，制備細胞。由細胞制備染色體DNA時用Qiagen試劑盒(Qiagen公司制)，根據隨附的指南中記載的方法進行。
實施例16從枯草芽孢桿菌克隆葡萄糖脫氫酶基因為了進行NADPH的再生，進行文獻(J.Bacteriol.166，238-243(1986))記載的來自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶(以下簡稱為GDH)基因的克隆。僅對GDH基因的可讀框部分進行PCR克隆，為此，以文獻記載的堿基序列為基礎，根據結構基因的5’-末端、3’-末端序列合成引物BsuG_S(序列號6)、BsuG_A(序列號7)。以實施例17中制備的枯草芽孢桿菌染色體DNA為模板，進行PCR(94℃，30秒，54℃，30秒，72℃1分鐘)30個循環，得到特異性擴增DNA。將所得的DNA片斷用EcoRI和HindIII兩種限制酶消化。將質粒載體pKK223-3(ァマシャム-ファルマシァ公司制)用EcoRI和HindIII消化，將上述PCR擴增DNA片斷用T4 DNA連接酶連結，得到pKK223-3GDH。分析插入片斷的堿基序列，結果與數據庫(DDBJ登錄號M12276)中收錄的堿基序列完全一致。所得的GDH基因的堿基序列如序列號8所示。
實施例17可以與pENMadh[往pET21a中插入本發明脫氫酶的DNA片斷所得的質粒]共表達的GDH質粒pSTV28-GDH的構建將實施例16中構建的pKK223-3GDH用EcoRI、PstI兩種限制酶消化，制備包含枯草芽孢桿菌GDH基因的片斷。將質粒載體pSTV28(TAKARA社制)用EcoRI、PstI消化，將包含上述GDH的片斷用T4 DNA連接酶連結，得到pSTV28-GDH。
實施例18來自枯草芽孢桿菌的GDH與本發明脫氫酶在大腸埃希氏菌中的共表達將攜帶pENMadh的大腸埃希氏菌BL21(DE3)克隆株用pSTV28-GDH轉化。將重組大腸埃希氏菌接種到包含100ug/mL氨芐西林、25ug/mL氯霉素的液體LB培養基中，培養17小時后，添加1mM IPTG，進一步培養3小時。收集細胞后，懸浮在20mM Tris-HCL(pH7.0)中，測定通過超聲破碎所得的細胞粗提取液的酶活性。
(1)本發明脫氫酶活性的測定本發明脫氫酶活性的測定在包含100mM bis-Tris丙烷緩沖液(pH10.0)、0.2mM NADPH、30mM甲胺、10mM丙酮酸鈉的反應液中在30℃進行。1U定為在上述反應條件下在1分鐘內氧化1μmol NADPH的酶量。結果為6.6U/mg蛋白。
(2)葡萄糖脫氫酶活性的測定往粗制酶10μl中加入葡萄糖(最終濃度100mM)、NADP(最終濃度2mM)、Tris-鹽酸緩沖液(pH9.0)(最終濃度100mM)，測定所得反應液1ml在340nm處的吸光度變化，由此測定酶活性。測定時的反應溫度為30℃。將一分鐘內與1微摩爾葡萄糖反應的酶量定為1個單位，計算每份蛋白量的單位數(u/mg)。結果每1mg蛋白為3.4U。
實施例19用葡萄糖脫氫酶共表達轉化體合成N-甲基-苯丙氨酸將實施例18中所得的大腸埃希氏菌與實施例17同法培養，得到培養液100ml。培養后通過離心分離收集菌體，用包含0.85％氯化鈉的20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)40ml洗滌2次，得到靜止期細胞。
往所得的靜止期細胞中加入包含苯丙酮酸鈉(最終濃度100mM)、NADP(最終濃度0.2mM)、葡萄糖(最終濃度100mM)和甲胺-鹽酸(pH9)(最終濃度700mM)的反應液，使細胞濁度變成20(660nm的吸光度)。在30℃攪拌進行反應。反應在一邊用10當量的氫氧化鈉水溶液調至pH＝8～9，一邊攪拌下進行。24小時反應后的N-甲基苯丙氨酸生成量為13.4g/L(反應收率75％)。
實施例20與D-氨基酸氧化酶的共反應(1)用與實施例10相同的方法獲得大腸埃希氏菌克隆株的純化的本發明酶。
往其中加入D-苯丙氨酸(最終濃度50mM)、NADPH(最終濃度10mM)、用硫酸調至pH＝10的甲胺(最終濃度60mM)、Tris-鹽酸緩沖液(pH9)(最終濃度100mM)，往所得的反應液100μl中加入D-氨基酸氧化酶(シグマ公司制，來自豬腎)0.052單位。此時反應液中本發明酶的蛋白量變成26.5μg。測定時的反應溫度為30℃。
900分鐘后往反應液中加入三氯乙酸25μl使其最終濃度為2％，使反應終止。將反應液通過下述條件的HPLC進行分析。
色譜柱ODS柱UK-C18 250×4.6mm(imtakt公司制)洗脫液水100％流速0.5ml/min溫度40℃
檢測UV210nm測定結果表明生成了N-甲基苯丙氨酸0.46g/L，殘留的苯丙氨酸為1.06g/L。
實施例21與D-氨基酸氧化酶的共反應(2)除用D-蛋氨酸代替苯丙氨酸外，其他與實施例20同樣進行。HPLC色譜如圖6所示。蛋氨酸的HPLC保留時間為10.6分鐘，14.1分鐘的峰估計是隨著反應生成的N-甲基蛋氨酸。于是用相同分析柱進行下述條件的LC-質譜。質譜結果如圖7所示。推定為N-甲基蛋氨酸的峰的分子量為163，與N-甲基蛋氨酸的分子量一致。
LC-MASS條件裝置Waters2690型セパレ一ションモジュ一ル和micromass ZMD型質譜儀色譜柱ODS柱UK-C18 250×4.6mm(imtakt公司制)洗脫液水100％流速0.5ml/min溫度40℃檢測UV210nm離子化法ェレクトロスプレ一離子化法(ESI)正離子檢測質譜掃描條件m/z60-500 1sec外加電壓3.6kV錐體(コ一ン)電壓10V實施例22與L-苯丙氨酸脫氫酶的共反應除了用L-苯丙氨酸脫氫酶(シグマ公司制)代替D-氨基酸氧化酶和用L-苯丙氨酸代替D-苯丙氨酸外，其它與實施例20同樣進行反應。
結果生成N-甲基苯丙氨酸0.21g/L，殘留的L-苯丙氨酸為2.75g/L。
實施例23用與實施例10相同的方法從大腸埃希氏菌克隆株獲得純化的本發明酶。
往14μg酶中加入甲基丙酮酸(最終濃度30mM)、NADPH(最終濃度10mM)、用硫酸調至pH＝10的甲胺(最終濃度60mM)、磷酸緩沖液(pH7)(最終濃度100mM)，使所得反應液100μl在反應溫度30℃下反應4小時。反應結束后用下述條件的HPLC進行分析。
色譜柱CHIRALPAK WH 250×4.6mm(ダィセル公司制)洗脫液2mM CuSO4流速0.5ml/min溫度50℃檢測UV254nm結果生成N-甲基丙氨酸0.1g/L。
產業適用性本發明提供與公知的脫氫酶具有不同性質的新型脫氫酶。通過使用本發明的脫氫酶，可以制備能用作醫藥或農藥中間原料的N-烷基氨基酸。
序列表<110>三菱化學株式會社(Mitsubishi Chemical Corporation)<120>新型脫氫酶和編碼該脫氫酶的基因<130>A31107A<160>8<210>1<211>341<212>PRT<213>惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)<400>1Met Ser Ala Pro Ser Thr Ser Thr Val Val Arg Val Pro Phe Thr Glu1 5 10 15Leu Gln Ser Leu Leu Gln Ala Ile Phe Gln Arg His Gly Cys Ser Glu20 25 30Ala Val Ala Arg Val Leu Ala His Asn Cys Ala Ser Ala Gln Arg Asp35 40 45Gly Ala His Ser His Gly Val Phe Arg Met Pro Gly Tyr Val Ser Thr50 55 60Leu Ala Ser Gly Trp Val Asp Gly Gln Ala Thr Pro Gln Val Ser Asp65 70 75 80Val Ala Ala Gly Tyr Val Arg Val Asp Ala Ala Gly Gly Phe Ala Gln85 90 95Pro Ala Leu Ala Ala Ala Arg Glu Leu Leu Val Ala Lys Ala Arg Ser100 105 110Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile His Asn Ser His His Phe Ala Ala115 120 125
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340<210>2<211>1026<212>DNA<213>惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)<400>2atg tcc gca cct tcc acc agc acc gtt gtg cgc gtg cct ttt acc gag48Met Ser Ala Pro Ser Thr Ser Thr Val Val Arg Val Pro Phe Thr Glu1 5 10 15ctg caa agc ctg ttg cag gcc att ttc cag cgc cat ggg tgc agc gag96Leu Gln Ser Leu Leu Gln Ala Ile Phe Gln Arg His Gly Cys Ser Glu20 25 30gcc gtg gcc cgg gtg ctg gcc cac aac tgc gcc agc gcc cag cgt gat144Ala Val Ala Arg Val Leu Ala His Asn Cys Ala Ser Ala Gln Arg Asp35 40 45ggc gcc cat agc cat ggg gtg ttc cgc atg ccc ggt tat gtc tcg acc192Gly Ala His Ser His Gly Val Phe Arg Met Pro Gly Tyr Val Ser Thr50 55 60ttg gcc agc ggc tgg gtc gat ggc cag gcc acg cca cag gtc agc gac240Leu Ala Ser Gly Trp Val Asp Gly Gln Ala Thr Pro Gln Val Ser Asp65 70 75 80gtg gcc gcc ggc tat gtg cgt gtc gat gct gcg ggc ggt ttt gcc cag288Val Ala Ala Gly Tyr Val Arg Val Asp Ala Ala Gly Gly Phe Ala Gln85 90 95cea gca ctg gcg gcg gcc cgt gag ctg ttg gtg gcg aag gcg cgc agc336Pro Ala Leu Ala Ala Ala Arg Glu Leu Leu Val Ala Lys Ala Arg Ser
100 105 110gca ggc att gcc gtg ctg gcg atc cac aac tcg cac cac ttc gcc gcg384Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile His Asn Ser His His Phe Ala Ala115 120 125cta tgg ccg gat gtc gag ccg ttc gcc gaa gag ggc ctg gta gcc ctc432Leu Trp Pro Asp Val Glu Pro Phe Ala Glu Glu Gly Leu Val Ala Leu130 135 140agc gtg gtc aac agc atg acc tgc gtg gtg ccg cat ggt gca cgc aag480Ser Val Val Asn Ser Met Thr Cys Val Val Pro His Gly Ala Arg Lys145 150 155 160ccg ctg ttc ggt acc aac ccc atc gct ttt gct gcg cct tgc gcc gag528Pro Leu Phe Gly Thr Asn Pro Ile Ala Phe Ala Ala Pro Cys Ala Glu165 170 175cat gac ccg atc gtt ttc gac atg gcc acc agt gcc atg gcc cat ggc576His Asp Pro Ile Val Phe Asp Met Ala Thr Ser Ala Met Ala His Gly180 185 190gat gtg cag att gcc gcg cgc gcc ggc cag caa ttg ccg gag ggc atg624Asp Val Gln Ile Ala Ala Arg Ala Gly Gln Gln Leu Pro Glu Gly Met195 200 205ggg gtg gat gcc gat ggc cag ccg acc acc gac ccg aag gcg atc ctg672Gly Val Asp Ala Asp Gly Gln Pro Thr Thr Asp Pro Lys Ala Ile Leu210 215 220gaa ggc ggc gcc ctg ctg cca ttt ggc ggg cac aag ggc tcg gcg ttg720Glu Gly Gly Ala Leu Leu Pro Phe Gly Gly His Lys Gly Ser Ala Leu225 230 235 240tcg atg atg gtc gag ctg ctg gcg gcg gcg ctg acc ggc ggt cat ttc768Ser Met Met Val Glu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Thr Gly Gly His Phe
245 250 255tcc tgg gag ttc gat tgg tcc ggg cat ccg ggg gcg aaa acg cca tgg816Ser Trp Glu Phe Asp Trp Ser Gly His Pro Gly Ala Lys Thr Pro Trp260 265 270acc ggg cag ttg atc atc gtc atc aac cca ggc aag gcc gag ggc gag864Thr Gly Gln Leu Ile Ile Val Ile Asn Pro Gly Lys Ala Glu Gly Glu275 280 285cgc ttt gcc cag cgc agc cgc gag ctg gtg gag cac atg cag gcg gtg912Arg Phe Ala Gln Arg Ser Arg Glu Leu Val Glu His Met Gln Ala Val290 295 300ggg ctg acg cgc atg ccg ggc gag cgg cgc tac cgt gag cgc gag gtg960Gly Leu Thr Arg Met Pro Gly Glu Arg Arg Tyr Arg Glu Arg Glu Val305 310 315 320gcc gag gag gag ggg gtg gcg gtg acc gag cag gag ttg caa ggc ctg1008Ala Glu Glu Glu Gly Val Ala Val Thr Glu Gln Glu Leu Gln Gly Leu325 330 335aaa gag ctg ctt ggc tga1026Lys Glu Leu Leu Gly340<210>3<211>16<212>PRT<213>惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)<400>3Ala Phe Ser Thr Ser Thr Val Val Arg Val Pro Phe Thr Glu Lys Gln1 5 10 15
<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>4ggaattccat atgtccgcac cttccaccag caccg35<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>5gggaagcttt cagccaagca gctctttcag g31<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>6cggaattcat gtatccggat ttaaaagg28
<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>7gcaagcttat taaccgcggc ctg23<210>8<211>783<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>8atg tat ccg gat tta aaa gga aaa gtc gtc gct att aca gga gct gct48Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala1 5 10 15tca ggg ctc gga aag gcg atg gcc att cgc ttc ggc aag gag cag gca96Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala20 25 30aaa gtg gtt atc aac tat tat agt aat aaa caa gat ccg aac gag gta144Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val35 40 45aaa gaa gag gtc atc aag gcg ggc ggt gaa gct gtt gtc gtc caa gga192Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly50 55 60
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權利要求
1.一種具有以下理化性質的脫氫酶(1)作用用NADPH和/或NADH作為輔酶由丙酮酸與烷基胺或二烷基胺生成N-烷基-L-丙氨酸；(2)底物特異性對烷基胺或二烷基胺顯示活性，但對氨不顯示活性；(3)以苯丙酮酸和甲胺為底物時的最適pH為10左右；和，(4)在30℃處理30分鐘后，酶在pH5～10.5左右穩定。
2.下述任意一項的多肽(1)包含序列號1所示的氨基酸序列的多肽；(2)包含在序列號1所示的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加一個至多個氨基酸所得的氨基酸序列，并且具有脫氫酶活性的多肽；或(3)包含與序列號1所示的氨基酸序列具有50％或50％以上同源性的氨基酸序列，并且具有脫氫酶活性的多肽。
3.編碼權利要求2所述的多肽的DNA。
4.下述任意一項的DNA(1)包含序列號2所示的堿基序列的DNA；(2)包含在序列號2所示的堿基序列中缺失、取代和/或添加一個至多個堿基所得的堿基序列，并且編碼具有脫氫酶活性的多肽的DNA；或(3)與包含序列號2所示的堿基序列的DNA在嚴緊條件下雜交，并且編碼具有脫氫酶活性的多肽的DNA。
5.包含權利要求3或4所述的DNA的重組載體。
6.一種轉化體，其包含權利要求3或4所述的DNA或權利要求5所述的重組載體。
7.N-烷基-氨基酸衍生物的制備方法，該方法包括使下述通式(I)所示的含有二羰基的化合物與R3(R4)NH(式中，R3和R4分別獨立地表示氫原子或可以被取代的烷基，但R3與R4不同時為氫原子)所示的烷基取代胺類，在權利要求1所述的脫氫酶、權利要求2所述的多肽或權利要求6所述的轉化體的存在下進行反應 (式中，R1表示氫原子或可以被取代的烷基，R2表示可以被取代的烷基或可以被取代的芳基)。
8.權利要求7所述的制備方法，其中R1為氫原子。
9.權利要求7或8所述的制備方法，其中R3為可以被氨基取代的C1～C6直鏈、支鏈或環狀烷基，R4為氫原子。
10.權利要求7～9中任意一項所述的制備方法，其中式(I)所示的含有二羰基的化合物為丙酮酸、苯丙酮酸、β-氟代丙酮酸、2-氧代丁酸、2-酮基己酸或2-酮基正戊酸。
11.N-烷基-氨基酸衍生物的制備方法，該方法包括使下述通式(II)所示的氨基羧酸類、與可以將通式(II)所示的氨基羧酸類轉變成通式(I)所示化合物的酶、以及R3(R4)NH(式中，R3和R4分別獨立地表示氫原子或可以被取代的烷基，但R3與R4不同時為氫原子)所示的烷基取代胺類，在權利要求1所述的脫氫酶、權利要求2所述的多肽或權利要求6所述的轉化體的存在下進行反應 (式中，R1表示氫原子或可以被取代的烷基，R2表示可以被取代的烷基或可以被取代的芳基)； (式中，R1和R2與通式(II)中的定義相同)。
12.權利要求11所述的制備方法，其中R3為可以被氨基取代的C1～C6直鏈、支鏈或環狀烷基，R4為氫原子。
13.權利要求11或12所述的制備方法，其中通式(II)所示的氨基羧酸類為苯丙氨酸或蛋氨酸。
14.權利要求11～13中任意一項所述的制備方法，其中可以將式(II)所示的氨基羧酸類轉變成式(I)所示的烷基取代胺類的酶為D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脫氫酶、L-氨基酸脫氫酶、氨基酸轉移酶。
全文摘要
本發明的目的是提供與公知脫氫酶具有不同性質的新型脫氫酶。根據本發明，提供具有以下理化性質的脫氫酶(1)作用以NADPH和/或NADH為輔酶由丙酮酸和烷基胺或二烷基胺生成N－烷基－L－丙氨酸；(2)底物特異性對烷基胺或二烷基胺顯示活性，而對氨不顯示活性；(3)以苯丙酮酸和甲胺為底物時的最適pH為10左右；和，(4)在30℃處理30分鐘后，酶在pH5～10.5左右穩定。
文檔編號C12N15/31GK1639328SQ0380486
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月27日 優先權日2002年2月28日
發明者江崎信芳, 三原久明, 原磨理, 上田誠 申請人:三菱化學株式會社