表達civps或內含肽修飾蛋白的轉基因植物及其制備方法

專利名稱：表達civps或內含肽修飾蛋白的轉基因植物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及表達CIVPS或內含肽修飾蛋白的轉基因植物，生產該轉基因植物的方法，在植物中表達CIVPS或內含肽修飾蛋白的方法，和包含表達CIVPS或內含肽修飾蛋白的轉基因植物的各種產品及其用途。
背景技術：
礦物燃料是一種不可再生的資源，因此必須保證在將來有足夠的能量和有機飼料供應。轉化可持續資源需要新的技術，以構建改良飼料，設計將飼料轉化為有用產品的有效方法，和/或設計能有效利用其他替代物質的產品。這種轉化有利于，例如減少源于能量生產和使用的污染、減少源于化學制備方法的污染、通過利用可再生自然資源和有機廢物而增加可持續性、減少對國外原材料的依賴性和促進與新物質生產有關的當地經濟和市場。
植物原料是一種可持續資源，能幫助滿足將來對飼料的需求。應用植物作為能源和有機飼料物質有利于現有的大規模農業生產，通過光合作用使用陽光中的能量而將二氧化碳吸收到植物中，并產生更少的環境有害副產品。通過應用光合作用，植物從空氣中排除二氧化碳，有利于能量、化學和農產品生產。尋找使這些碳以容易且經濟的可利用形式重新有效分布的方法仍然是一種挑戰。
用植物生產化學飼料和燃料還處于初級階段。例如，基于淀粉的原材料可用于生產日用化學品。引起生物轉化過程受阻的可用物質和菌株的匱乏，以及對已存在的和預想中的安全性的控制問題，和經濟上的不可能導致這些領域發展尤其慢。諸如玉米淀粉之類的非纖維型生物材料與礦物資源相比，在材質上更有優勢，但是價格昂貴。相反，纖維素物質，如速生白楊、松樹、柳枝、玉米桿、甘蔗渣、廢紙漿和城市固體廢物在質量和能量上都具有價格優勢。但是，由于其復雜結構，纖維質難以加工處理。目前，纖維質需要預處理，包括用強酸、強堿和/或其他用作燃料的物質，如乙醇，或者用作化學產品的物質，如紙產品處理。這些預處理能有效暴露纖維質中的單體亞單位、主要是己糖、戊糖和酚類成分，然后將其剪切并作為物質應用，但價格昂貴。另一個可選擇使用的物質是酶，盡管其價格便宜，但更不安全。
重組DNA技術已用于改變微生物以實現物質的低成本生物轉化，因此擴大了微生物的應用并增加產品的生產數量。例如已經構建了表達木質纖維素降解酶的植物細胞，雖然由于其結構成分分解，該植物細胞很難分化和生長為完整植物。但是在木質素和纖維素物質和酶的滴度都很低時，它們能分化為完整植物，該植物需要做進一步的處理。將生物物質的預處理和發酵相結合的嘗試也碰到了困難，部分原因是由于質量轉化限制和發酵有機物干擾。
CIVPS或者內含肽是位于框架內，自我剪切的多肽，其一般是較大前體蛋白分子的一部分。在很多基本方面，CIVPS或者內含肽不同于其他蛋白酶或酶原。與將自身或其他蛋白裂解為數量眾多的不連接多肽的其它蛋白酶不同，CIVPS或者內含肽具有在順式或反式構象中進行裂解和連接的能力。因此，與蛋白酶對蛋白質反應產生的末端裂解相反，CIVPS或者內含肽具有在多個位點裂解和連接生成的蛋白片段的能力。所述裂解需在特定條件下誘導，能應用分子生物學技術工程化。根據文獻描述，在啤酒酵母(Sacchromyces cervisiae)(Kane等，Science 250651；Hirata等，J.Bio.Chem.2656726(1990))、結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(Davis等，J.Bact.1735653(1991)；Davis等，Cell 711(1992))、Thermococcus litoralis(Perler等，PNAS 895577(1992))和其它有機體中存在CIVPS或者內含子。
因此，有必要提供一種新的方法以從更容易再生的原料中生產能量，例如通過某種方式修飾植物，使得該植物可以作為能量和化學飼料。
發明概述本發明提供了基因重組植物或植物部分、胚、種子、幼苗及其后代(總稱為“植物”)，所述植物包括單個或多個其中插入或融合了單個或多個CIVPS或內含肽序列的外源基因序列，或包含可控插入蛋白序列(Controllable Inter Vening Protein Sequence，CIVPS)或內含肽序列和任選的適于植物基因表達和轉化的調節序列的組合。該修飾基因可以在整個植物、特定組織或包含單個和多個CIVPS或者內含肽修飾基因的其任何組合中組成型地或短暫地表達。在本發明的不同具體實施方案中，任何修飾基因序列或修飾基因序列系列可以在任何或所有組織內組成型地表達或在特定時間表達。
本發明還涉及產生包含CIVPS或者內含肽修飾基因的轉基因植物的方法，例如，首先構建包含親本CIVPS或者內含肽修飾基因的DNA片段，然后用該構建體轉化植物。
本發明還涉及在轉基因植物中產生CIVPS或者內含肽修飾蛋白的方法。例如，用單個或多個CIVPS或者內含肽修飾基因序列轉化植物或植物細胞，表達CIVPS或者內含肽修飾蛋白。在一個優選具體實施方案中，該基因序列可以在任何時間表達。在另一個具體實施方案中，，蛋白剪接前最好具有完全不同的活性和/或結構特性。經剪接的蛋白的活性是顯露的，除非被與非CIVPS或者內含肽修飾蛋白親本序列相似的外加或內生分子抑制。CIVPS或者內含肽修飾基因產品可以大量表達，并從植物材料中回收。在可供選擇的情況下，所述植物和植物材料本身可作為一種CIVPS或者內含肽修飾基因產品來源。
本發明還提供了在植物中表達的CIVPS或者內含肽修飾基因產品用途，表達CIVPS或者內含肽修飾基因的轉基因植物在動物飼料中的用途，或所述轉基因植物在分批、半批或連續工業制備燃料、化學產品、動物食品或食品添加劑、藥物、造紙、紙產品的生產和疫苗釋放和廢材料的補救中的用途。
通過以下


和論述，本發明的其他目的、優勢和特征對于本領域技術人員來說是明顯的。
附圖簡要說明圖1顯示了通過構建CIVPS或者內含肽修飾蛋白編碼DNA序列而形成的CIVPS或者內含肽修飾蛋白編碼DNA序列構建體，所述的CIVPS或者內含肽修飾蛋白編碼DNA序列是通過將其融合到具有目標活性的蛋白的編碼序列的3`端、5`端或中間序列中而構建的。將任意三個圖1所示的生成的CIVPS或者內含肽修飾蛋白編碼序列進行組合可以構建其它變體。
圖2顯示生成的CIVPS或者內含肽修飾蛋白或其片斷的一種構象。該圖證明了單一CIVPS或者內含肽修飾蛋白的事實。然而多個天然蛋白序列可以與單一或多個CIVPS或者內含肽組合。
圖3顯示了CIVPS或者內含肽修飾蛋白或及片段的裂解，當予以合適裂解刺激劑時，該裂解可在胞內或胞外發生。此處圖表性的舉例顯示了單一CIVPS或者內含肽修飾蛋白裂解的過程。其他變體可以通過組合如圖所示CIVPS或者內含肽修飾蛋白構建而成。
優選實施例詳述根據本發明人的設想，本發明提供了一種從可再生資源，如植物材料或生物材料，中產生能源的新的方法并以低耗費的方式達到上述目的。發明者斷定使用與目標蛋白連接的CIVPS或者內含肽修飾蛋白來修飾植物生物材料是達到上述目的的有效方式。在本專利的上下文中，術語CIVPS或者內含肽也指相似產品，使用時可以互換。根據內含肽修飾蛋白在細胞中高效價表達，而活性大幅度降低的認識，發明者得出結論，如果將該蛋白克隆至植物中，其活性降低將使形成的轉基因植物細胞、植物片段或植物組織發育為產生內含肽修飾蛋白的完整植物。另外，他認為所述轉基因植物有不同的實施方法，例如，所產生的重組植物以如下方式表達所述修飾蛋白1)組成型或短暫型表達，2)通過植物生長周期中的化學或生物誘導，3)在整個植物或特定的植物組織，和/或4)具有或不具有亞細胞定位等等。如發明者所設想，在本發明的一個具體實施方案中，表達的內含肽修飾蛋白包括一個親本蛋白序列，其活性已知或通過從序列或者結構同源序列推知，和/或通過誘變或從頭合成而產生；每個親本序列插入或融合了一個內含肽序列。一旦插入，該修飾蛋白的內含肽部分在體內就失去親本蛋白的活性或結構效用。然而，如果通過內含肽剪接誘導，親本蛋白的原有活性可以完全恢復。例如，在一申請中，在植物收割后的物質預處理期間，可以誘導每個CIVPS自我剪接親本蛋白序列，于是親本蛋白就恢復原有活性。使用或不使用重組蛋白來剪接內含肽以產生功能活性的方法對于本領域技術人員來說是已知的，此處不需重復。這些方法包括改變光照、溫度、pH值和/或添加化學劑。
更為具體地說，本發明涉及含有表達構建體的重組植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔，所述構建體編碼至少一種含有靶蛋白或蛋白片斷的修飾蛋白，所述靶蛋白或蛋白片斷融合到可控插入蛋白序列或內含肽序列及其片段中間，或融合到上述序列或其片斷的氨基末端或羧基末端。在一個具體實施方式
中，每個該植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔的表達構建體包括可操縱性相互連接的編碼靶蛋白的第一核酸片段，編碼CIVPS或內含肽序列的第二核酸片段，任選的選擇性標記或報導基因和/或啟動子。需說明的是，在更具體的實施方案中這些序列可以直接融合或通過連接體融合，更優選在閱讀框內融合。修飾蛋白可以在植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔中組成型或誘導型表達。在后一種情況下，至少一種修飾蛋白的表達和/或剪接可以通過刺激激發或誘導。合適的刺激的例子包括pH改變、溫度或滲透壓改變、肥料添加、殺蟲劑、或化學物、或光照和/或聲音變化。植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔可以在植物生命周期中的預定點，或在一個或多個特定組織或其部分，和/或在至少一個特定的亞細胞器中表達修飾蛋白。在可被選擇的情況下，或者在與后者相關聯的條件下，修飾蛋白可以表達并分泌到細胞外。植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔的特定組織可以是種子、根、果實、莖、塊莖和/或葉，特定亞細胞器可以是細胞胞液、線粒體、質體、內質網、包含體、液泡和/或細胞核。然而本發明的限定范圍也包括其他的可變形式。
植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔還可以包括使其具備化學藥品抗性的選擇性標記。所述化學藥品的例子包括溴草腈、2，2-二氯丙酸、G418、甘磷酸、合氯氟(haloxyfop)、潮霉素、咪唑啉、卡那霉素、氨甲蝶呤、新霉素、膦絲菌素、稀禾定、2，2-二氯丙酸、甘磷酸、潮霉素、trichothecne、磺酰脲、s-三嗪和/或三唑嘧啶。然而也可以應用其他化學物質。在CIVPS或內含肽修飾蛋白多核苷酸序列之前可以包含啟動子。在許多情況下，植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔對常規劇毒量的所選化學物具有耐受性或抗性。在另一些情況下中，植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔是能繁殖的，含有至少一種可遺傳的修飾蛋白編碼多核苷酸序列。然而它也可以是不能繁殖的。而且，如上所示，本發明的部分內容關于同系繁殖和雜交的基因重組植物，或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔，其或者可以通過本發明所述方法產生，或者不能。其中特別令人感興趣的是植物部分，植物種子、植物幼苗和植物原生質體，它們具有相當重要的商業意義，其次，植物、植物組織、植物細胞和亞細胞部分也引起商業的和其他的興趣。剪接蛋白能改變一種或多種植物成分的含量或活性。在一個實施例中，植物組分如葡萄糖、果糖、甘油、甘氨酸三甲內鹽、蔗糖、乳糖、麥芽糖、半乳糖、氨基酸、脂、維生素和淀粉等的含量可以發生改變，例如減少。在另一實施例中，植物組分如纖維素、半纖維素、木質素、淀粉、膠質和/或脂等的活性發生改變，如下降。一方面，CIVPS或內含肽序列和靶蛋白及其片段形成至少一個與靶蛋白的剪接連接。在理想的具體實施方案中，該剪接連接的羧基端氨基酸殘基帶有羥基或巰基側鏈。在另一個特別有用的具體實施方案中，該剪接連接位于CIVPS或內含肽序列及其片段的下游，可以含有氨基酸殘基，例如，在靶蛋白及其片段的氨基端的缺乏羥基或巰基側鏈的殘基。在其他重要的變異體中，剪接連接位于CIVPS或內含肽序列或其片段的上游，可以含有在CIVPS或內含肽序列或其片斷的氨基端的帶有羥基或巰基側鏈的氨基酸殘基。另一種重要可能性是剪接連接位于CIVPS或內含肽序列及其片段的上游，包含半胱氨酸。再一種重要的變異體是剪接連接位于CIVPS或內含肽序列及其片段的下游，在CIVPS或內含肽序列及其片段的羧基端具有His-Asn殘基，和/或在靶蛋白連接區的氨基端帶有羥基或巰基側鏈。在另一種令人感興趣的變異體中，該剪接連接位于CIVPS或內含肽序列及其片段的下游，在CIVPS或內含肽序列及其片段的羧基端具有Asp殘基，和/或在靶蛋白及其片段連接區的氨基端帶有羥基或巰基側鏈。進一步的修飾是羧基端的Asp被無羧基或氨基側鏈的氨基酸取代，并且CIVPS或內含肽序列及其片段含有外部可控的CIVPS或內含肽序列及其片段，所述可控的CIVPS或內含肽序列及其片段可以來自于其他物種，即酵母屬(Saccharomyces)真菌，或更具體地是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)真菌。在本發明的產品中適合插入的其他構建體是這樣的一些構建體，在這些構建體中CIVPS或內含肽序列及其片段插入到靶蛋白及其片段的Ser、Thr或Cys殘基前并與后者緊鄰，其中該CIVPS或內含肽的氨基或羧基端含有Ser、Thr或Cys等殘基。正如以下更詳細的描述所述，蛋白可以在如細菌等微生物中表達，這是本領域公知的。可以應用的微生物的例子是蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)或島生商陸(phytolacca insularis)。一種優選的靶蛋白是蘇云金芽孢桿菌內毒素，它以蘇云金芽孢桿菌內毒素的修飾形式表達。另一個具體實施方案包括通過病毒表達修飾蛋白。盡管所有病毒都能應用，但舉例而言可以是馬鈴薯病毒Y(potato virus Y)、雙生病毒、不孕病毒2b(aspermy virus 2b)、黃瓜花葉病毒(cucumber mosaicvirus)等。
植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔生產方法，包括
提供表達構建體，所述構建體編碼至少一種含有靶蛋白或其片段的修飾蛋白，該靶蛋白在融合到CIVPS或內含肽序列或其片段中間，或上述序列或片斷的氨基或羧基末端；用該表達構建體轉化植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔；從至少編碼至少一種修飾蛋白的轉化植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔中再生基因重組植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔。
所述轉化方法特別優選一種穩定的轉化方法。但是也可以用一些具有暫時穩定性的轉化方法。再生步驟可以是培育重組植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔，或將基因重組植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔與非基因重組植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔雜交，和/或將兩種基因重組植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔回交。在這種方法中使用的表達構建體可以包括一個或多個啟動子、選擇性標記、抗性標記、可遺傳性標記、聚腺苷酸序列、抑制子、增強子、定位序列、和/或信號序列。在本申請中，可用的重組技術是已知的，在下文的實施例或其它地方有舉例。該方法的一個重要方面是用上述表達構建體通過病毒轉化、DNA包裹微粒轟擊、脂質體基因轉化、細菌基因轉移、電穿孔、或基因化學轉化，或其組合來轉化植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔。如上所述，植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔可以通過細菌如根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(盡管其他細菌亦可)轉化。在本方法中，轉化通過基因化學轉化法完成，可以有如磷酸鈣，和/或聚乙二醇或其他在現有技術中記載的適合于本發明目的的化合物的協助。篩選通過選擇性標記、抗性標記或表達至少一種編碼CIVPS或內含肽修飾蛋白的核酸來完成。在本發明方法中，從轉化胚組織、植物原生質體、未成熟胚衍生細胞或轉化種子等中再生基因重組植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔。
本專利還提供另一種方法，所述方法適合從表達蛋白或其片段的重組轉化植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔中生產修飾蛋白或其片段。該方法包括實施如上所述的方法，然后從轉化植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔中收集修飾蛋白或其片段。該方法還可以包括純化修飾蛋白步驟，該步驟可以用已知的技術完成。如本文所述，該方法能產生含有CIVPS或內含肽修飾蛋白或其片段的修飾蛋白或其片段。
本發明還提供了生產含有靶蛋白或其片段的修飾蛋白的方法，該靶蛋白融合到CIVPS或內含肽序列或其片段中間，或融合到上述序列或其片斷的氨基末端或羧基末端，所述方法包括獲得編碼靶蛋白的表達構建體，該靶蛋白在框架內，或其氨基或羧基端，有融合的CIVPS或內含肽序列或其片段；用表達構建體轉化宿主植物細胞；和在適合修飾蛋白表達的條件下培養轉化的植物宿主細胞。
一個優選的情況是，在表達構建體中，至少有一個編碼CIVPS或內含肽序列或其片段的第一核苷酸融合到編碼靶蛋白或其片段的第二核苷酸序列的5`端。其他可選擇的情況是，在表達構建體中，編碼CIVPS或內含肽序列或其片段的第一核苷酸可以融合到編碼靶蛋白或其片段的第二核苷酸序列的3`端。尤其適合實施本發明方法的是酵母菌CIVPS或內含肽序列或其片段，因已知其能對剪切、裂解、連接、剪切-連接、裂解-連接、和/或環化的步驟產生順式或反式的作用。當應用CIVPS或內含肽或其片段誘導蛋白剪接時，可以通過以下方式誘導光照、溫度、pH變化，添加/去除有利/抑制剪接或裂解的化學劑，氨基酸去磷酸化或去糖基化，或接觸或去除能夠對剪接或裂解過程產生激活或阻斷作用的肽或模擬肽。誘導蛋白剪接的其他方法是在體內或體外接觸或去除能夠對剪接或裂解過程產生激活或阻斷作用的肽或模擬肽試劑。一些令人感興趣的能產生優良效果的改變是CIVPS或內含肽及其片段的氨基或羧基端包含Ser、Thr或Cys殘基，或CIVPS或內含肽及其片段的羧基端在靶蛋白的Ser，Thr或Cys前含有Asp。然而，利用現有技術中已知的改變也是可以的，例如，將美國專利US5,834,247公開的原核生物和真核生物領域的一些方法學理論用于本發明以產生包含有用特性的雜種植物。在本方法中，表達構建體還可以含有啟動子、選擇性標記、抗性標記、可遺傳標記、聚腺苷酸序列、抑制子、增強子、定位序列和/或信號序列中的至少一種。另外，本發明的方法還包括含有表達構建體的植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔的轉化體，該轉化體通過病毒轉化、DNA包裹微粒轟擊、脂質體基因轉化、細菌基因轉移、電穿孔、或基因化學轉化，或其他已知或發展的技術轉化。如上所述，用于轉化表達構建體的細菌可以是根瘤土壤桿菌；用于轉化的化合物可以是磷酸鈣或聚乙二醇；轉化植物細胞、植物部分、植物等可以通過表達選擇標記、抗性標記來篩選；轉化的植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔可通過表達修飾蛋白基因序列來篩選；再生基因重組植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔可以從胚組織、未成熟胚衍生細胞或轉化種子等中獲得。
本發明還公開了生產表達修飾蛋白的種子的方法，所述方法包括獲得基因重組植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔；培養或培育基因重組植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔；和獲得表達修飾蛋白的植物種子。
本發明的另一方法是使用表達修飾蛋白的植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔來生產化合物，該方法包括根據本發明的教導，收集本發明的重組植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔；機械加工所述植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔；以大于或等于零的重組非重組比例將機械加工的植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔與非基因重組植物組合；和在能有效獲得化合物的條件下化學加工上述植物或特定植物部分。
這個方法通過對所述植物，或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔進行下述的機械加工處理來實施，即擠出、碾磨、切碎、覆蓋、碎裂、切塊、壓縮、爆散、和/或撕破。然而其他加工方法也適用。該組合成分的化學加工可以用不同技術或其組合來實現，其中包括蒸處理，稀酸/濃酸處理，氨爆炸，滅菌，水浸泡，溶劑混合，pH、溫度或滲透壓改變，暴露于或改變光照，無機物和/或酶催化，糖化，脫色，摩擦，發酵，蒸餾，層析，吸收和/或添加化合物。當然，其他方法也可以使用。各種有用的操作步驟如下預處理可以包括對組合產物進行以殺菌為目的的蒸處理；化學加工包括用至少一種硫酸、鹽酸、磷酸或羧酸預處理，或在大于或等于20℃的溫度中浸泡、和/或將組合物與至少一種水或有機或無機溶劑混合。正如已經解釋的那樣，外部刺激物能用于誘導修飾蛋白及其片段的剪接。外部刺激的例子包括pH、滲透壓或溫度變化，暴露于聲音、光照中、或添加化合物。在有些情況下，剪接的蛋白及其片段的活性可變，例如相對于原始靶蛋白，其分解代謝或合成代謝活性改變。剪接蛋白及其片段的例子包括能降解淀粉、糊精、膠質、脂、甲殼素、木質素、纖維素、或半纖維素、或修飾木質素，或具有糖化活性的蛋白。因此，剪接蛋白能夠產生葡萄糖、果糖、木糖、酚、甘油、甘露糖、乳酸、乙酸、乙烯、丙烯、甲苯、苯乙烷、苯乙烯、二甲苯、乙二醇、丁二烯、甲醛、異丙醇、丙酮、丁二醇、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙二醇、維生素、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、苯、和/或生物高聚體等等。在一個預處理的特定具體實施方案中，糖化和發酵可以在一個步驟中進行，利用能產生乳酸、乙酸、乙烯、丙烯、甲苯、苯乙烷、苯乙烯、二甲苯、乙二醇、丁二烯、甲醛、異丙醇、丙酮、丁二醇、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙二醇、維生素、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、苯、和/或生物高聚體等等的原核或真核微生物進行發酵。
本發明還包括生產動物飼料，該飼料含有營養有效量的本發明的植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔。本發明的飼料經動物消化后，修飾蛋白及其片段經動物體內的刺激誘導剪接。內部刺激的例子是，動物的唾液、膽汁、糜蛋白酶、胰島素、重碳酸鹽、鹽酸、胃部pH和溫度等等。本發明的飼料包括的剪接蛋白可以是肌醇六磷酸酶、內纖維素酶、外纖維素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、膠質酶、脂酶或生長激素。然而其他蛋白也可以。
另一方面，本發明還提供上述飼料在制造免疫反應促進組合物中的用途，其中剪接蛋白及其片段至少含有一個重組免疫原，該免疫原可以包括一個或多個病毒或細菌免疫原，可以有多種合適劑型。優選劑型是口服、跨粘膜、胃腸(G.I.)道吸收劑型。然而該組合物的劑型可以包括任何適合動物全身或局部給藥的劑型，包括添加到動物飼料中。
本發明的動物飼料生產，首先是實施上述的步驟以獲得基因重組植物或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔，然后在能有效獲得動物可消化飼料的條件下，加工上述生成的遺傳修飾植物或植物部分。
本發明產品還可以用于促進動物生長，例如通過生產包含生長促進產品的飼料，讓動物進食所述修飾飼料。本發明產品還可以用于提高動物免疫反應，動物服用治療量的本發明的提高免疫反應的組合物。
本發明還包括生產靶蛋白及其片段的方法，所述方法包括制備第一修飾蛋白及其片段，其中通過如上所述方法將CIVPS或內含肽序列及其片段的氨基端融合到靶蛋白及其片段的羧基端；制備包含CIVPS或內含肽序列片段的第二修飾蛋白；和在有利于第二修飾蛋白反式裂解CIVPS或內含肽序列及其片段的條件下將第一和第二修飾蛋白接觸。
生產上述靶蛋白的其他方法包括制備第一修飾蛋白及其片段，其中通過上述方法將CIVPS或內含肽序列及其片段的羧基端融合到靶蛋白及其片段的氨基端；類似地產生包含CIVPS或內含肽序列片段的第二修飾蛋白及其片段；和在有利于反式裂解第一修飾蛋白的CIVPS或內含肽序列及其片段的條件下，將第一和第二修飾蛋白接觸。所述剪接的誘導條件可以是光照、溫度、pH變化，添加/去除有利/抑制剪接或裂解的化學劑，氨基酸去磷酸化或去糖基化，或接觸/去除對剪接/裂解過程有激活/阻斷作用的肽或模擬肽等。
因此，本發明涉及轉基因植物，在本發明中，該術語與包含CIVPS修飾蛋白基因的基因重組植物、種子子代植物、或任何植物部分、組織、細胞等含義相同。本發明進一步涉及產生CIVPS修飾蛋白的轉基因植物的生產方法，在植物中產生內含肽修飾蛋白的方法，上述植物在燃料、化學、動物食品或食品添加劑、造紙和藥物產品中的用途。本發明還考慮到轉基因植物生產可以作為結構或催化組分的來源、或純化內含肽修飾蛋白后分別作為結構或催化蛋白。轉基因植物是多細胞植物，他們表達單個或多個外源基因及其相關蛋白(或核酸)活性。然而，在本發明中，具體引用的基因或酶類并不是對本發明的限定。可以理解，當提及特定的種類時，僅僅是為了確定具體分類中的任一基因或酶。CIVPS或內含肽的序列存在于親本蛋白序列內部或與其比鄰，可以在羧基和/或氨基端自發的自我剪接，合適時能選擇性地連接生成的外顯肽片斷。例如參見Perler等，Nucl.AcidsRes.，221125-1127(1994)；Wallace，C.J.，Protein Sci.，2697-705(1993)；Xu，等，Cell，751371-1377(1993)；Pietrokovski，S.，Protein Sci.，2697-705(1994)。因此認為CIVPS是閱讀框內的自我剪接多肽，其一般是作為前體蛋白分子的一部分。CIVPS或內含肽在一些基本的方面上不同于其他蛋白酶或酶原。與其他蛋白酶將自身或其它蛋白裂解多個不連接的多肽不同，內含肽具有在順式或反式構象中進行裂解和連接的能力。因此，與蛋白酶對蛋白質反應產生的末端裂解相反，CIVPS或者內含肽具有在多個位點裂解和連接生成的蛋白片段的能力。所述裂解需在特定條件下誘導，可以應用分子生物學的已知技術進行。不同來源的內含肽，它們的序列、特征和功能在文獻中都有描述，參考Kane等，Science，250651(1990)；Hirata等，J.Bact，1735653(1991)，Davis等，Cell 711(1992)(結核桿菌)；Perler等，PNAS 895577(1992)Thermococcus litoralis)。如圖1所示，CIVPS與某種活性或結構作用的蛋白結合產生內含肽修飾蛋白，蛋白活性或結構功能可以完全改變。表達CIVPS修飾蛋白(從相關內含肽修飾基因)的轉基因植物是對以前轉基因植物的一種改進，因為親本內含肽修飾蛋白能有兩個完全不同的狀態，可控地由內含肽裂解介導。該裂解可能與或不與目標蛋白序列的重組有關。本發明可以通過任何單一或多重蛋白與CIVPS的組合后再和任何一種植物組合而形成。植物種類可以包括，但不僅限于白楊、樺樹、香柏、松樹、落葉樹、針葉樹、大豆、柳樹、玉米、煙草、苜蓿、甘蔗、花椰菜、香蕉、蘋果、櫻桃、黃瓜、萵苣、葡萄、檸檬、甜瓜、堅果、橘子、大米、橙、桃、梨、藍莓、草莓、西紅柿、胡蘿卜、大白菜、土豆、菊苣、韭、菠菜、雜草、葛、甜菜根、胡蘿卜、甜瓜、蕪菁、薯蕷、 填土豆、小麥、大麥、大豆、豆子、油菜籽、粟、向日葵、燕麥、豌豆、塊莖、竹、海藻、藻類和其他物種。蛋白可以包括任何已知的、純化的、修飾的和從頭合成的蛋白。雖然天然蛋白的選擇并不嚴格，但優選地包括木質纖維素降解蛋白(纖維素酶、木質素酶、淀粉酶)，淀粉降解酶(淀粉酶、葡聚糖酶)，在燃料和化合物生產、細菌或病毒抗原生物合成途徑中所需要的酶，在維生素和其他食品添加劑生物合成途徑中所需要的酶(肌醇六磷酸酶、纖維素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、膠質酶、脂酶或生長激素)，具害蟲或昆蟲抗性的蛋白，與疾病發病機理有關的治療性蛋白。用于修飾在目標植物中表達的融合體的蛋白的CIVPS或內含肽的選擇也沒有限定。相對于所需的目標蛋白，任何單一或多重CIVPS或內含肽在任何構型下都可應用。CIVPS或內含肽應具備在某些刺激下被單端或雙端剪接的能力，并允許(或不允許)已融合了單一或多重的CIVPS或內含肽的目標蛋白的連接。
生產表達CIVPS或內含肽修飾蛋白的轉基因植物，和在轉基因植物中生產CIVPS或內含肽修飾蛋白可以通過組合本領域已知方法(Ausbel等)來實現。一般地，這些方法包括，DNA構建，該DNA含有CIVPS或內含肽修飾的目標蛋白和其表達、擴增必須的調節元件；篩選構建的DNA；轉化目標植物種；再生并篩選合適的轉化植物種。假如需要，純化天然或裂解形式的CIVPS或內含肽修飾蛋白。無論是生產表達CIVPS或內含肽修飾蛋白的轉基因植物，還是在轉基因植物中生產CIVPS或內含肽修飾蛋白都構成本發明的一部分。對于生產轉基因植物或在轉基因植物中生產CIVPS或內含肽修飾蛋白而言，必須構建CIVPS或內含肽修飾蛋白序列。這也很容易完成克隆具有目標活性和目標內含肽序列的基因序列到大腸桿菌(E.coli)或其他任何合適宿主(例如，有時候酵母也可以，或在哺乳動物或植物細胞中表達，用或不用病毒或非病毒載體)中。一旦克隆了基因和內含肽編碼序列，他們必須被連成所需的構型。選擇的內含肽序列應該能夠實現期望的功能，如在外加刺激(如光照、pH變化，溫度、壓力、內含肽修飾蛋白周圍的局部化合成分發生變化)下的剪接功能，假如需要，使融合蛋白連接。用已知方法很容易將CIVPS或內含肽DNA序列和蛋白的DNA序列連接，產生CIVPS或內含肽修飾蛋白的DNA編碼序列或其組合，如圖1所示。如上文所述，CIVPS或內含肽修飾蛋白是將CIVPS或內含肽融合到天然蛋白及其片段的羧基端、氨基端或中間的蛋白。盡管存在很多可選擇的方法，但是使CIVPS或內含肽與目標蛋白編碼序列融合的方法之一是純化編碼目標蛋白序列DNA，用限制酶在內含肽的目標插入點切割蛋白編碼序列，然后將內含肽編碼序列連接到限制性位點。可以將多核苷酸或其片段直接克隆到合適的調控和/或篩選序列中，或通過載體克隆。調控片段的例子有調控CIVPS或內含肽修飾蛋白瞬時表達的啟動子、復制起始序列，和/或調控CIVPS或內含肽修飾蛋白在特定植物組織和/或特定亞細胞器中的體內空間分布的信號序列。篩選元件的例子有除草劑或抗菌基因、熒光標記、染料標記、和其他合適的選擇標記。生成的多核苷酸和載體含有CIVPS或內含肽修飾蛋白編碼多核苷酸和任選的任何目標調控和篩選元件，將其擴增獲得大量產品，該產品可用于隨后的目標植物種的轉化。任何修飾和上述所有步驟都有可能促進特異性定位和任何目標CIVPS或內含肽蛋白與蛋白之間的融合，利用本領域已知的方法可以完成。編碼序列和/或CIVPS或內含肽蛋白編碼序列的改變，及這些序列的連接用本領域已知的技術也很容易完成，例如定點突變、隨機突變、PCR、易錯PCR和/或其他本領域技術人員能想到的合適常規方法。這些技術有利于大量連接序列的替換，可以使用任何期望的和合適的組合。同樣，任何調控和篩選元件的組合和定位都可用于本發明。基因調節元件如啟動子(Guilley等，Higgins，T.J.Y.，Coruzzi等，Tingey等，Ryan等，Rocha-gosa等，Wenzler等，Eird等)、增強子(Brederode等)、RNA剪接位點、核糖體連接位點、糖基化位點、蛋白剪接位點、亞細胞信號序列(Smeekens等，van denEroeck等，Schreier等，Tague等)、分泌信號序列(Yon Heijne，G.，Sijmons等)等都有利于調節CIVPS或內含肽修飾蛋白濃度的時間和空間上的分布、和在轉化植物體內的活性。使用這些元件意欲促進內含肽修飾蛋白在轉基因植物中的生產和加工。內含肽修飾蛋白的表達可以是組成型或誘導型的方式，為了實現任一模式，任何一種在本發明中敘述的、或已被公知的、或以后可能實施的方法都可應用。外界刺激物可以協助誘導蛋白表達，例如暴露于殺蟲劑、光照、溫度變化、和/或聲音。然而其他刺激物也可以。另外，重組植物可以表達任何一個或多個選擇標記基因或上述提到的報導基因。
如果構建了CIVPS或內含肽修飾蛋白DNA序列，并與目標調控和篩選DNA序列連接，成功克隆和篩選的話，那么接著就需要轉化目標植物種并再生為完全植物。轉化目標植物種并再生完全植物的方法可以通過已知方法來完成(Draper等，Potrykus等)。轉化技術包括但不限于根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導的基因轉化、毛根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)介導的基因轉化、直接將基因轉化到植物原生質、Ti質粒介導的基因轉化(有或無質粒輔助)、生物彈或顆粒轟擊的植物轉化、微注射和纖維介導的轉化、組織電穿孔(Shimamoto等)。基因轉化可以發生在整個植物、植物外植體(如但不限于根外植體)、植物部分(如但不限于植物葉片部分、種子、或種子部分)、植物原生質或質外體、單個或多個植物細胞中。各種不同方法在現有技術中已有詳細描述。篩選適合轉化植物的方法也是公知的。在包含CIVPS或內含肽修飾蛋白的轉化DNA中包含選擇性標記能促進篩選，例如抗性基因、編碼有顏色的化合物產品的基因、編碼熒光化合物產品的基因或其他任何合適方法。另外，可以分離轉化植物的DNA并對其進行測序以確認目標CIVPS或內含肽修飾蛋白編碼序列存在。其他合適方法也可用于篩選步驟的確認，如PCR、限制性消化分析、或southern分析。任何可以確認目標轉基因植物的篩選方法都可以應用。如果植物被CIVPS或內含肽修飾蛋白和目標調控和篩選元件轉化，則整個植物就能用本領域的公知方法再生(Horsch等)。大部分方法都包括在合適培養基和合適的光照、溫度條件下培養轉化的植物細胞、外植體、組織、部分和整個植物。再生植株的方法并不對本發明產生限制，任何有效方法都可以使用。生成的轉基因植物應該產生完全如前文所述的CIVPS或內含肽修飾蛋白，或圖2所示物質的組合。一旦篩選出整個轉基因植物，就能監控CIVPS或內含肽修飾蛋白的表達。在培育表達CIVPS或內含肽修飾蛋白的轉基因植物時，這并不要求；但要慎重確認已經得到表達CIVPS或內含肽修飾蛋白的目標轉基因植物，且其表達受所用的目標調控元件正確調控。監控CIVPS或內含肽修飾蛋白的表達對于純化剪接或未剪接CIVPS或內含肽修飾蛋白是必需的，如圖3所示，整個內含肽修飾蛋白或其成分包括圖3所示元件的組合。通過western分析、二維凝膠電泳(并著色)、質譜測定植物提取液或純化轉基因蛋白片段可以監控內含肽修飾蛋白表達。另外，一些純化蛋白或轉基因植物本身應該暴露在內含肽裂解刺激劑中，暴露后，CIVPS或內含肽修飾蛋白和CIVPS或內含肽裂解生成的蛋白可通過western分析和其他方法確認合適蛋白的存在，以及CIVPS或內含肽修飾蛋白和生成的蛋白活性的差別。必須做活性分析以便于監控目標蛋白的活性，且分析對與該活性應該是特異的，不易于受競爭干擾。可使用一種標準對照來比較蛋白的天然活性與內含肽修飾蛋白、生成的剪接蛋白的活性。使用表達CIVPS或內含肽修飾蛋白的轉基因植物的方法和加工包括將植物作為燃料生產物質(包括但不限于可燃生物材料、乙醇、甲醇、丙醇、丙酮、丙烷、甲烷或辛烷生產)，消費化學產品(包括但不限于乳酸、乙醇、葡萄糖、和其他己糖、戊糖、丙二醇、乙烯、乙醇、乙烯、酚類化合物、氨基酸、紙漿、殺害蟲劑、殺昆蟲劑、其他醇類、醚類、酯類)，食品和食品添加劑(包括但不限于氨基酸、糖、維生素、纖維和家畜飼料)，將植物用于疫苗釋放、造紙和廢材料補救。任何成批、半成批或連續地加工表達內含肽修飾蛋白的轉基因植物以生產上述任一用途物質均屬本專利保護的范圍。這些加工方法包括但不限于，收集表達內含肽修飾蛋白的轉基因植物，運用內含肽剪接刺激劑，將轉基因植物與其他物質按≥0的配比混合，然后以化學、酶學或生物學方法轉化為上述產品。
以下實施例闡述了本發明的加工方法、表達CIVPS或內含肽修飾纖維素酶的轉基因植物的制備，及其生成的植物。在這些植物中，纖維素酶通過調節元件調控CIVPS或內含肽修飾基因而表達。體內纖維素酶活性在融合蛋白插入天然纖維素酶后大幅度下降。這使得植物在沒有或幾乎沒有受纖維素酶活性所抑制下生長。收集植物，運用內含肽剪接刺激劑，如暴露在一定的光波、與硫磺或改變pH的化合物混合、與鹽和其他化合物混合、使溫度變化。在這種情況下，CIVPS或內含肽被裂解，纖維素酶活性恢復并隨后催化裂解纖維素和/或木質素。此時裂解蛋白植物糊狀物以任意比例，優選以大于等于零的比例與其他植物物質、化學物質、城市垃圾、生產副產品、酶和/或原核或真核細胞等混合，以幫助上述物質轉化為目標產品，如燃料、消費化合物、人類和動物消費食品、食品添加劑、紙漿、疫苗抗原等等。值得注意的是，本發明并不僅限于生產加工或機械加工，本發明應用的非限制性的例子有釋放疫苗、激素、治療性蛋白，在這種情況下內含肽修飾蛋白可以含有治療活性蛋白和/或蛋白抗原、潛在保護性蛋白序列與轉基因植物如香蕉植株表達的CIVPS或內含肽的組合。釋放可以實現，例如，通過人類或非人類動物消化植物產品。然后該植物在口腔中被嚼碎、暴露在體內胃部的刺激劑中，于是依次啟動或誘導CIVPS或內含肽剪接。對于人，如果需要，刺激可以是胃部pH下降，其誘導抗原或治療性蛋白的CIVPS或內含肽剪接并提供合適的連接。然后治療性蛋白和抗原流入十二指腸或小腸，此時pH呈中性化，蛋白產品就被吸收到血液中。
下述實施例信息背景本領域技術人員都明知，下述實施例1技術方案的很多不同變化也適合于實施本發明。一般地，構建編碼CIVPS或內含肽修飾蛋白的DNA序列，并將其組裝到合適的載體中，用該載體轉化植物材料(不管其是否在懸浮液中單細胞生長)、原生質體、植物片段或部分、整個植物或本發明所描述其它的合適形式，然后再生出完整植物、種子或本發明描述的其它合適形式。實施例1顯示本發明方法的一個具體實施方案，可用于生產轉基因樹，如表達內含肽修飾纖維素酶的白楊的改變方案也可以實施，然而要根據轉基因植物物種的可能應用來選擇目標蛋白。可以用天然蛋白、從頭合成蛋白或演化蛋白，例如通過基因重組、易錯PCR或其他類似方法制備的蛋白。纖維素酶催化裂解植物的一種化學成分，即纖維素，在構建其他表達纖維素酶的植物時，該酶通常瞬時表達或隱蔽在細胞部分中，因而不會破壞植物組織分化和發育。例如，參考Ziegler等(2000)；Dai等(a).(2000)；Dai等(b).(2000)；Montalvo-Rodriguez等(2000)。因此，假如纖維素酶活性沒有由局部的或短暫的表達所控制，那么整個植物通常很難再生，或纖維素酶活性通常太低以至于沒有作用。通過使用內含肽修飾纖維素酶，整個植物能再生，因為整個植物產生較低活性，但效價很高的內含肽修飾纖維素酶。參考Aspergen等，Molecular breeding191-99(1995)。該酶隨后可以被活化，通過內含肽的自我剪接能力產生比內含肽修飾纖維素酶更高活性的纖維素酶。值得注意的是，任何天然蛋白都符合本發明的要求，蛋白選擇依賴于植物的目標用途。本發明中，能誘導自身纖維素解聚的白楊品種將在以生物材料為原料的乙醇生產中或作為其他化合物發酵制備的底物時顯示有用性。
CIVPS或內含肽修飾蛋白的構建各種重組DNA技術都可組合用于構建編碼修飾蛋白DNA的載體，最容易和直接的方法是利用PCR將編碼內含肽修飾蛋白核酸序列組裝到有利于目標載體連接的合適互補端。此處利用PCR方法。為了達到同一的目的，其他方法也可以使用，有些方法依賴于目標蛋白和內含肽編碼序列的特異性限制和連接，但仍然包括PCR步驟。進行該反應的PCR試劑盒很容易得到(Epicentre，madison WI)。對引物的唯一要求是一種與待擴增的正義鏈5`端相匹配，另一種與反義鏈5`端相匹配；相關序列具有唯一性是有利的。
從凝膠中回收和純化通過電洗脫、酚提取、瓊脂酶消化、玻璃珠提取和商業可得到的試劑盒，從凝膠中純化DNA。QIA快速凝膠提取試劑盒(QiagenValencia，CA)和相關方法就是一實施例。
根據目標用途選擇內含肽該步驟具有兩個重要特征CIVPS或內含肽具備誘導有利于轉基因植物用于目標用途的最佳化剪接，和將內含肽置于編碼靶蛋白的核苷酸序列中的性能。任何自我剪接蛋白，如內含肽編碼序列都可用于本發明。http//blocks.fhcrc.org/～pietro/intein/中給出了一些已知內含肽，還在繼續發現其他內含肽，通過序列分析、DNA擴增重組還會創造出新的內含肽。對于目標轉基因白楊品種，實施例1的內含肽是有益處的，因為內含肽剪接后產生處于優勢連接態的天然蛋白(75％)；并且內含肽對溫度敏感其剪接在＜30℃時被抑制，直到50℃才基本恢復，且在此溫度下非裂解蛋白的半衰期小于2小時。
內含肽修飾蛋白的構建為了確保正確的內含肽剪接，實施例1中，內含肽插入到天然靶蛋白的序列框內，緊鄰絲氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸。這使得天然靶蛋白的絲氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸位于內含肽的組氨酸和天冬氨酸(即末端536和537氨基酸位點)保守殘基的羧基側。根據內含肽剪接所需要的目標刺激物和機制，也可應用其他末端殘基。如果需要，外顯肽-內含肽連接區的密碼子可以改變以有利于這些需求。建議在改變功能連接區密碼子時要小心，以使內含肽修飾蛋白可以如期望的那樣裂解，讓生成的產品具有合適的活性。位于天然靶蛋白中的該內含肽位點可以完全地改變得到的內含肽修飾蛋白的活性，大部分情況下，任何在活性位點內或附近的插入都能達到上述目的。如果絲氨酸殘基臨近天然蛋白編碼序列的唯一限制位點，則很容易將擴增的內含肽序列和擴增的天然蛋白序列結合。相反，通過幾個PCR很容易將內含肽編碼序列插入到天然蛋白的任意期望的位置。優選的PCR方法如下優選應用50個核苷的寡核苷酸引物。也可以應用較短的引物，但相同長度的引物更好，盡管這并不是必須的。C-外顯肽的正義引物可以與C-外顯肽和內含肽序列在連接區雜交，以促進擴增序列在隨后的PCR中融合。對于內含肽擴增，所有引物優選與各自期望臨近的外顯肽序列交迭，以促進內含肽和外顯肽在隨后的PCR擴增中融合。PCR優選使用上述標準技術方案進行，但也可以優化。典型的優化參數是混合物中加入的模板和引物DNA的量(通常加入的引物DNA的量大大超過模板DNA)，反應循環的溫度和時間、循環次數、MgCl2濃度。使用的引物長度和組成可以變化以生產有效的內含肽修飾蛋白，只要空間限制允許。商業可得到的試劑盒含有所有必需試劑TaqDNA聚合酶、MgCl2、25mMdNTP混合物(包括等摩爾數的dATP、dCTP、/dGTP、dTTP)，反應緩沖液和水。
這時，開始下一個PCR循環以融合外顯肽和內含肽序列。本例中，內含肽片段優選和等摩爾C-外顯肽混合，這些片段的連接有賴于所需的模板和引物(交迭區)。需要加入反應緩沖液、25mMdNTP、MgCl2和TaqDNA聚合酶，改變溫度循環。該反應擴增優選分別添加下列正義和反義引物，和E.coli DNA連接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)，然而該添加也并非必需，依賴于實際反應條件，并不一定導致產量增加。
SEQ ID NO15`-ACAGAATGGGGAACGAGCGATGCTAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3`SEQ ID NO25`-CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTGTCGTGA-3`一旦完成，PCR產物最好再次進行瓊脂糖凝膠電泳，從膠中純化2665核苷酸長的合適條帶，根據上述方法進行分析。少量純化反應產品優選在UV光譜儀上260和280nm波長處進行吸收定量測定。為了完成裝配，將剛構建的等摩爾融合的C-外顯肽和內含肽與在先純化的N-外顯肽片段連接，對內含肽修飾纖維素酶編碼序列進行PCR反應。加入反應緩沖液、25mM dNTP、MgCl2和TaqDNA聚合酶，優選使用與原來相同的溫度循環。該反應擴增優選分別添加下列正義和反義引物，和E.coli DNA連接酶(New Enland Biolabs，Beverly，MA)，然而該添加也并非必需，依賴于實際反應條件，并不一定導致產量增加。
5`-AGCATTCAGACCTCCCATTTCATACGAAAAGAGGAAATAATAGTTTTC-3`(SEQ ID NO3)5`-CGTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGACGAATTGTGGTGA-3`(SEQ ID NO4)載體構建實施例1中，其他元件也可以包括在表達盒中，例如細胞外分泌信號蛋白、細胞內定位信號序列、其他可誘導啟動子等等。由于載體包含在到重組根瘤土壤桿菌中，因此將上述基因轉化到白楊種中就依賴于細菌的特定輸送系統。其他基因轉化方法也可以使用。挑選合適的轉化方法依賴于植物材料的來源，例如，原生質和單個植物細胞可以直接通過電穿孔、CaCl2、生物粒子轟擊(Bio-Rad，Hercules，CA)用重組pTiBo542質粒轉化。相反，植物結節、植物片段或整個植株在適當的時候可以作為起始材料，當孵育時間和培養基細胞濃度達到最佳時，能產生有效的基因轉化。
實施例1的轉基因白楊的優勢和應用生成的轉基因白楊雖然產生高效價地內含肽修飾蛋白纖維素酶，但是能無限制地生長和傳代。隨后通過收集植物、機械碎裂或碾碎以增加暴露面積、然后在較高溫度(優選30-50℃)或較低pH值(小于等于6.5)條件下，在桶或罐中孵育生成的糊狀物使得纖維素酶活性活化。暴露在較高溫度或較低PH值條件下，將能誘導內含肽剪接，并產生活性完全增加的天然纖維素酶。該條件下，纖維素酶催化纖維素裂解從而經濟地產生可以隨后發酵為乙醇或其他化合體的物質。另外，該植物能作為內含肽修飾的纖維素酶或剪接后復性的天然纖維素酶的來源。兩種情況下，蛋白最好使用已知方法從上述植物中純化，其方法包括沉淀、膜過濾、層析(包括親和層析)、提取等。
產生內含肽修飾蛋白的轉基因植物的用途相對于以前報導的轉基因植物有兩個好處。由于內含肽修飾蛋白比天然蛋白活性低很多，所以它可以高效價表達，并定位在植物的任意部位。以前的關于表達纖維素酶的轉基因植物的報道已經揭示了去除分泌信號能使該纖維素酶保留在細胞溶質中。這對于內含肽修飾蛋白并不需要。內含肽修飾蛋白能夠與其底物近距離接觸而不發生催化反應(直至需要時才催化)，這是一種很大的改進。另外這些植物有著更高的環境安全度，因為轉化基因編碼的蛋白在生理條件下活性較低，物種間基因水平轉移而產生任何被選擇優勢的可能性較低。因此，不可能出現轉基因植物比野生天然植物優越的情況或因基因轉移產生傾向于轉化種群的被選擇優勢。
實施例2顯示本發明的廣泛用途。實施例2敘述一種由實施例1變更得到的方法，該方法用來產生表達內含肽修飾木質素過氧化物酶的轉基因花旗松種。何種特定靶蛋白被選擇取決于該轉基因植物的目標用途。在本實施例中，被選擇的是一個能易化木材的一種化學成分——木質素的催化降解的木質素過氧化物酶基因。應用被內含肽修飾的木質素過氧化物酶時整株植物雖然在各個局部均以所需高效價產生非活化內含肽修飾木質素過氧化物酶，它仍能夠再生。該酶隨后可以通過內含肽的自我剪接能力被活化，產生比內含肽修飾木質素過氧化物酶更高活性的木質素過氧化物酶。這能夠增強對不需要的木質素過氧化物酶的活性的調控。在生產紙漿、動物飼料、其它加工底物，改進機械制漿，生物漂白紙漿、改良通過降紙漿處理的廢物、和產生具有用單一屬性的生物聚合體方面，這些轉基因植物物種是有價值的。
基因和內含肽修飾蛋白的構建如上所示，任何天然蛋白都適合作為靶蛋白，靶蛋白選擇依賴于植物的目標用途。例如，花旗松木質素修飾后，將其作為不同紙漿加工的底物是有益的。有益的編碼蛋白的核酸可從phanerochaetechrysosporium中分離(GenBank Accession #M37701)。一個引物優選與擴增的正義鏈的5`末端相匹配，另一個與互補DNA鏈的5`末端相匹配，相關序列具有唯一性是有利的。
從凝膠中純化PCR片段通過電洗脫、酚提取、瓊脂酶消化、玻璃珠提取或商業可得到的試劑盒，從凝膠中純化核酸。優選使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen Valencia，CA)。
內含肽的選擇內含肽的選擇完全取決于植物的目標用途和內含肽修飾蛋白。可使用存在的多種不同內含肽。在本實施例中，與實施例1具有相同性能的內含肽對實現花旗松物種的目標用途有益。因此，優選使用來自Pyrrococcus spp的Psp pol內含肽突變體(GenBank Accession#PSU00707)。該內含肽的優勢在于它通過剪接產生處于優勢連接態的天然蛋白(＞75％)，并且它的剪接對溫度敏感，即在＜30℃時可被抑制、50℃才恢復，此溫度下非裂解蛋白的半衰期小于2小時。在體外，pH變化誘導剪接，因而增加了后續加工轉基因植物的靈活性。
載體的轉化使用包含在重組根瘤土壤桿菌中的載體，依賴細菌的特定輸送系統基因轉化花旗松。其他基因轉化方法也可以，根據植物材料的來源和其應用的容易程度選擇合適的轉化方法，轉化參數的某些改進和優化通常是必需的。
重組樹的應用實施例2的樹可用作材料來源來純化木質素過氧化物酶或內含肽修飾木質素過氧化物酶。另外，它本身還可以在許多應用中用于生產木漿，例如紙產品、動物飼料、復合材料等等。實施例1和2都表明了樹的用途，當然根據本發明的目標用途，其它植物也是可用的選擇。在許多地區，這種樹生長得并不很好，而草、蔓藤、海草或其他植物生產得很好，可以同樣使用。另外，很多水果和蔬菜也可以從內含肽修飾蛋白技術中獲利，如誘導成熟、害蟲抗性或其他用途。因此，宿主植物的選擇使沒有限制的。通過使用本發明的CIVPS或內含肽修飾蛋白技術將促進植物作為重組蛋白來源的應用。所得的植物能表達任意數量的融合蛋白，其中融合部分包含一種不能促進融合蛋白外顯肽的重組反而使目標蛋白與親和層析純化用蛋白結合的內含肽。在這種情況下，目標蛋白在體內可以或不具備完全活性。如果融合蛋白在植物中表達，就將其洗脫到親和柱上，使融合蛋白的結合部分結合到柱上。然后處理柱，誘導內含肽剪接，沖洗目標蛋白，然后回收。本發明有醫學用途的另一種變體是融合蛋白，其含有通過內含肽與保護性蛋白基團融合的治療性蛋白或疫苗。這些治療性蛋白在植物中表達并被人或動物食用(如在動物免疫時或激素治療時)。于是，依賴于胃部的pH變化或由第三化合物的吸收誘導的硫醇梯度，在患者或動物體內發生內含肽剪接。剪接去除保護性蛋白基團，產生天然的治療性蛋白或疫苗，然后在腸道中吸收。
實施例1或2的表達內含肽修飾蛋白的轉基因植物能有效地用于大規模工業加工，如實施例3所示。通過對花旗松種進行與實施例2相似的修飾可以提高其自身的制漿過程。
樹加工使木質纖維素物質降解的一般預處理方法包括濃酸(通常是硫酸)預處理，稀酸預處理、氨氣爆炸預處理和熱水預處理。其他預處理方法也可以。如果需要，優化表達內含肽修飾蛋白的轉基因樹的設計以充分利用預處理方法。內含肽剪接可以在容器中通過任何已知的方法，其示例包括但不限于改變pH值、改變溫度、光照暴露、聲音刺激或添加任何外源化合物。
目標用途和加工方法變化實施例3加工方法的優選變更包括將預處理、剪接、消化和發酵步驟合并。這種優選的加工方法合并可以發生在任一步驟之間，然而優選在單個單元操作中同時合并所有步驟。這種優選組合方式通過減少資金支出和損耗、降低物質成本和減少加工過程中投入的能量和化合物成本而節約成本。另外，由于與制造相同產品的競爭性化學加工方法相反，通過減少排放和有毒廢物再生對環境有利。在實施例3中，產品的選擇依賴實現目標生物轉化的發酵所使用的微生物。能降解纖維素的微生物都可以有效的產生目標產品。因此，可制備的終產品范圍將非常廣泛。本發明的內含肽修飾蛋白承載植物使物質具有易于處理屬性，從該物質獲利的應用包括但不僅限于燃料生產、化合物生產、紡織品生產、二聚體生產、食品生產和糖化作用。盡管實施例3主要是被降解的轉基因植物的發酵過程，但內含肽修飾植物也可用傳統化學方法加工。例如，實施例2的植物優選用于紙漿。在該加工方法中，好處源于減少了用于漂白木材的粗化合物。這將可能使化合物投入的費用減少、產生危險材料和污染減少和在處理過程中的一些潛在合并。另一種用途是用于棉花洗滌的果膠酶或用于紡織產品加工的纖維素酶的用途。在這種情況下，能通過更多的傳統化學加工方法獲得終產品，但是與通常使用的正常粗化學處理情景不同，利用內含肽修飾蛋白植物物質將更有利。
動物飼料通常添加以各種酶，以增加飼料的營養價值并減輕因動物肥料在周邊場所大量堆積而經受的環境負擔。通過純化酶作用于植物聚合物使營養價值增加，幫助動物消化飼料，于是更多的有益飼料成分得到利用。通過限制添加的礦物量，如無機磷的量，使環境負擔減輕；因為在活性酶存在時能從植物本身獲得無機磷酸鹽。與非修飾蛋白不同，使用內含肽修飾蛋白的好處是引起多蛋白高水平表達，這不會干擾植物再生，但會使酶在胃部產生目標剪接活性。與其外源性生產和加入到食物不同，輸送酶到食物自身中能減少飼料成本。另外，在體內使用接近失活的蛋白的編碼基因的其它好處在于它提供的技術平臺不可能涉及一些與基因水平轉移至天然植物物種相關的環境風險。這種有利的環境效果，不管它已經實現或者尚在設想中，適用于所有的內含肽修飾蛋白植物產品。實施例4闡述了在油菜籽中構建內含肽修飾肌醇六磷酸酶，以作為動物飼料。
用途和變更肌醇六磷酸酶是一種將動物食品內的肌醇磷酸轉化為無機磷酸的酶。減少動物飼料生產所需要的磷酸輔料，以及降低動物肥料中帶來當地水質污染的磷酸含量將帶來經濟方面的效果。盡管下述實施例4闡述了在油菜籽中構建內含肽修飾肌醇六磷酸酶和作為動物飼料的用途，但也同樣可以用一些其他有價值的天然蛋白，例如，可以用纖維素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、膠質酶、脂酶或生長激素或免疫抗原等替代肌醇六磷酸酶，或添加到后者之上。每種酶在用于動物飼料輔料方面都具有潛在價值。
實施例5闡述了本發明的一個優選具體實施方案。構建轉基因玉米，作為乙醇加工物質。本例中，再次應用實施例1中的內含肽修飾基因序列僅僅是為了證明的目的。然而，在一個優選的具體實施方案中，幾個內含肽修飾蛋白可同時表達，以優化目標植物用于發酵加工過程的降解加工特性。靶酶可以選自一般的公知酶，如纖維素酶(E.C.3.2.1.4)、外纖維素生物水解酶(E.C.3.2.1.19)、葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)，這些酶可以與酶分類中3.2.1.x項下的任何酶，或所需的其它種類的酶一起表達。除了多個內含肽修飾蛋白同時表達外，本具體實施方案優選能夠再生和具有穩定基因遺傳性的可育植物。
轉化信息大粒子被用來加速微粒子，后者進入植物細胞。
現在已經對本發明進行了一般性描述，參考具體的實施例將會更好地理解本發明，這些實施例僅是說明的目的，而不對本發明或其任何具體實施方案產生限制，除非另有特別聲明。
實施例實施例1表達內含肽修飾纖維素酶的轉基因白楊的生產本實施例應用纖維素酶。首先組裝載體，所述載體包含內含肽修飾蛋白DNA編碼序列。為了構建該載體，首先制備一個內含肽修飾蛋白DNA序列，然后將其包裝到目標載體中。該植物的目標蛋白是從芽孢桿菌NBL420中分離的纖維素酶(Genbank Accession#AY039744)。從芽孢桿菌NBL420中分離出DNA模板，PCR擴增該蛋白的對應基因。將模板DNA、兩種與擴增模板DNA 3`端互補的引物、Taq DNA聚合酶、反應緩沖液(500mM KCl，100mM Tris-ClpH 9.0，0.1％Triton X-100)和MgCl2，在250L的薄壁PCR管中混合，進行PCR反應。一旦混合，每個反應管置于熱循環中，該熱循環設定為35個循環，包括三個步驟，94℃、30秒，60℃、60秒，72℃、120秒。擴增后，生成的PCR產物在1％瓊脂糖凝膠上與分子量標準(Iivitrogen，Carlsbad，CA)在1X TAE(或TBE)緩沖液中電泳，溴化乙啶(0.5g/mL)印跡。應該小心操作以確保得到大約3200個核苷的合適大小的條帶。然后用解剖刀從凝膠中切出該條帶，用市售凝膠純化試劑盒(Qiagen)純化(從凝膠物質中分離)。一旦片段從凝膠中純化出來，用限制性消化或測序進行分析(參考Ausbel等；CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley，New York(1998))。基因擴增后，插入內含肽序列片段修飾基因。本例中，使用來自Pyrrococcus spp的Psp pol內含肽突變體(GenBank Accession #PSU00707)。該突變體已在文獻中描述，包含一個酪氨酸534殘基變為蛋氨酸的突變(參見Xu，M，Perler，F，(1996)The mechanism of protein splicing and its modulation bymutation，The EMBO Journal 155146-5153)。該內含肽在體外由于pH變化而裂解。然后用PCR擴增內含肽編碼序列，模板為PyrrococcusspP的染色體組DNA。使用標準方法和下列引物進行PCR擴增(例如，30個循環，包括94℃、30秒，60℃、60秒，72℃、120秒)。5′-A TT A TGTGCA T AGAGGAA TCCAAAG-3′[SEQ ID NO5]5′-AGCA TTTTACCGGAAGAA TGGGTTC-3′[SEQ ID NO6]擴增一旦完成，將PCR產物轉移到1％瓊脂糖凝膠上，在1XTAE或TBE緩沖液中電泳。生成條帶按上述對天然纖維素酶編碼序列的方法進行純化和分析。這時的這兩個PCR產物片段顯示在附圖1中，一個編碼纖維素酶蛋白，另一個編碼內含肽多肽序列，將兩者連接。其中，內含肽插入到了天然蛋白的框架內，于是天然蛋白的絲氨酸殘基在內含肽和該天然蛋白的C-外顯肽之間的連接點處成為末端C-外顯肽氨基酸。生產內含肽修飾蛋白片段時首先用PCR擴增纖維素酶基因的C-外顯肽序列。擴增C-外顯肽序列所用的引物是交叉引物，即它不僅針對C-外顯肽，也針對內含肽的與C-外顯肽序列毗鄰的包含組氨酸和天冬氨酸密碼子的末端5′-TTTGGATTCCTCTATGCACATAATTCCGGAAACGGCGGTGTCTCCTCG-3′[SEQ ID NO7]5′-GTGTCTGCTCCGTTTACCGCTTTTTTTAATTGGAACGAATTTTGTGA-3′[SEQ ID NO8]生成序列的長度為604個核苷。然后用正義引物和反義引物擴增內含肽，所述正義引物含有包含末端色氨酸密碼子的內含肽末端和纖維素酶基因的N-外顯肽末端，反義引物含有內含肽和C-外顯肽的特定核酸。本例PCR反應中，應用下列引物以得到一1661核苷長的序列5′-CAGAATGGGGAACGAGCGATGCTAGCATTTTACCGGAAGATGGGTTC-3′[SEQ ID NO9]5′-GAGGTAGACACCGCCGTTTCCGGAATTATGTGCATAGAGGATCCAAAG-3′[SEQ ID NO10]然后使用PCR擴增N-外顯肽，一個引物包含正義N-外顯肽鏈的特定核酸，另一個引物包含N-外顯肽鏈和鄰近內含肽序列的特定核酸。纖維素酶的N-外顯肽部分得到擴增，使用下列引物，生成一1541核苷長的序列5′-GCATTCAGACCTCCCATTTCATACGAAAAGAGGAAATAGATAATTTTC-3′[SEQ ID NO11]5′-AACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTAGCATCGCTCGCTCGTTCCCATTCTGTG-3′[SEQ ID NO12]一旦這三個反應完成，清洗每個PCR片段以去除殘留引物，然后，通過另外兩個PCR反應將C-外顯肽、內含肽和N-外顯肽PCR產物片斷連接在一起。在兩個單一反應中分別擴增內含肽或一個纖維素酶外顯肽區域，即C-外顯肽或N-外顯肽，將生成的兩個PCR片產物段等摩爾混合，如上所述進行PCR反應。該反應不需要多余的外加引物，產生第一內含肽-外顯肽融合體。清洗該反應混合物，將等摩爾經清洗的融合產物與另一個的外顯肽部分混合，不添加額外的引物，再次PCR。在最后兩個PCR反應中，不需要外源引物，在內含肽-外顯肽連接處發生退火。經Taq聚合酶，退火區延伸并產生最終融合產物。通過該反應得到一種內含肽被插入到所需的準確位置的內含肽修飾蛋白的編碼序列。再次清洗終反應產品，進行最后一次PCR擴增，所用引物序列特異于纖維素酶外顯肽末端，且具特異末端方便于連接到克隆載體。該反應一結束，將PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳，純化3806個核苷長的合適條帶，然后根據上述方法分析。得到的內含肽修飾蛋白編碼序列(核苷酸片段)包含核糖體連接位點、起始于N-外顯肽的起始密碼子、帶有以合適方向插入到閱讀框內的內含肽的內含肽修飾纖維素酶的完整序列和位于C-外顯肽末端的終止密碼子。使用文獻[Ausbel等，Current Protocols in Molecular Biology(1998)]和[Parsons TJ，Sinkar，VP，Stettler，RF，Nester，EW，Gordon，MP，″Transformation ofPoplar by Agrobacterium tumefaciens，″Biotechnolog 4533-536，1986]中描述的方法，將該內含肽修飾纖維素酶編碼序列克隆到pTiBo542中，在TDNA中替換tms和tmr基因，此時表達盒中包括“MAC”啟動子、甘露堿合成酶終止子和卡那霉素抗性標記。通過本領域公知的合適方法(如電穿孔或CaCl2方法)，將該載體轉化到根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)A281中。各種轉化方法在上述文獻[Ausbel等，1998]中也有描述。
使用改進的葉盤(leaf disk)法以使重組根瘤土壤桿菌轉化到目標Populas trichocarpa×美洲黑楊(deltoides)，H11植物種中。將該重組根瘤土壤桿菌在選擇性培養基中30℃下搖床培育，該培養基包括50％MG培養基(10g/L甘露醇，2.32g/L谷氨酸鈉鹽，0.5g/LKH2PO4，0.2g/L NaCI，0.2g/L MgSO4-7H2O，0.002g/L生物素，pH7.0)，50％ luria肉湯(20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物和10g/L NaCl)和合適的抗生素。為了進行轉化，用20％漂白劑、0.1％Tween 20和30mg/L的Benomyl系統殺真菌液(Chas.H.Lilly Co.，Portland，OR)將大約7mm長和2-3mm直徑的小綠色木材莖部分殺菌。蒸餾水沖洗后，將莖部分無菌轉移到根瘤土壤桿菌培養基中，細胞濃度為大約5×108細胞/Ml，培養16小時。植物莖暴露于重組根瘤土壤桿菌培養物后，將其轉移到在垂直位置補加了玉米素核糖甙和卡那霉素的固體Murashige-Skoog培養基中[參考文獻Murashige T，Skoog F，″A revisedmedium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures，″Physiol.Plant，15473-497，1962]。一旦根開始生長，芽就能發育。每2-3周，將再生植物轉移到新鮮培養皿中，在植物生長期間，保持正常光照周期并增加培養箱中的濕度。一旦根形成，將外植體轉移到沒有玉米素核糖甙但含有卡那霉素的固體培養基中，2-3周后，將植物轉移到裝有土壤的盒子中生長4-5天，然后再植到土壤中，在溫室或可控土塊中完成生長。用幾種方法監測初始植物以確保內含肽修飾纖維素酶DNA序列已經轉移到基因組中，并且表達蛋白具有活性。通過用內含肽修飾纖維素酶編碼序列作為探針，對轉基因植物分離的基因組DNA進行southern分析來進行基因監測，如上述文獻[Ausbel等，1998)]所描述。如上所述，用內含肽修飾纖維素酶編碼序列作為探針，以轉基因植物基因組DNA為模板進行PCR。溴化乙啶著色的膠中出現大小接近的條帶證明存在內含肽修飾纖維素酶編碼序列。也可以對植物基因組DNA進行直接測序。通過用內含肽修飾纖維素酶和天然纖維素酶的特異性抗體進行western分析來監測蛋白產物。另外纖維素酶活性檢測方法是本領域公知的，可以對非剪接內含肽修飾纖維素酶和剪接內含肽修飾纖維素酶活性進行定量分析。
實施例2轉基因花旗松的生產表達內含肽修飾的木質素過氧化物酶本實施例應用與實施例1相同的方法構建包含內含肽修飾木質素過氧化物酶編碼序列的構建體。主要的差異是使用的根瘤土壤桿菌質粒、經修飾的天然蛋白序列和選擇用來擴增新的內含肽修飾木質素過氧化物酶編碼序列的引物。
木質素過氧化物酶基因(Genbank Accession #M37701)以黃孢原毛平革菌(P.chrysosporium)基因組DNA作為模板，進行PCR擴增。如實施例1的描述進行PCR反應，所用引物為5′-TGGCCTTCAAGCAGCTCGTCGCAG-3′[SEQ ID NO13]5′-TTAAGCACCCGGCGGCGGGGGGCTG-3′[SEQ ID NO14]擴增后，生成的PCR產物如實施例1所述與分子量標準用瓊脂糖凝膠電泳分析，溴化乙啶染色后，得到大約1567個核苷大小的條帶，用解剖刀將其從凝膠中切下，用如上所述方法純化。片段從凝膠中純化后，用限制性消化或測序進行分析(參考Ausbel等，1998)。
基因擴增后，將內含肽序列插入到該基因序列而使其修飾。例如，使用與實施例1相同的內含肽，用與實施例1所述的相同方法擴增內含肽，通過如前所述方法進行內含肽擴增和凝膠電泳純化和分析。
將兩個PCR產物片段，一個編碼木質素過氧化物酶，另一個編碼內含肽多肽序列，相互連接。為確保正確的內含肽剪接，將該內含肽插入到木質素過氧化物酶的序列框內，緊鄰絲氨酸殘基，同時絲氨酸位于內含肽的組氨酸與天冬氨酸保守殘基(即末端536和537氨基酸位點)的羧基側。內含肽插入到天然蛋白中，使天然蛋白的絲氨酸殘基成為介于天然內含肽和該天然蛋白的C端外顯肽之間的連接點的屬于C端外顯肽的氨基酸。內含肽位于天然蛋白內，他的存在大幅度降低了內含肽修飾后蛋白的活性。在大多情況下，在該分子活性位點內或附近的任何絲氨酸殘基都能達到上述目的，然而作一些優化也是必需的。
使用實施例1相同的PCR，生產內含肽修飾蛋白序列，唯一不同是引物選擇。使用上述PCR反應產物清洗后的基因產物對木質素過氧化物酶的C-外顯肽部分進行擴增，得到一個長445個核苷的序列，引物如下5′-CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTCTCGCCCGCGACTCCCGCACCGCT-3′[SEQ ID NO15]5′-TAAGCACCCGGCGGCGGGGGGCTGGAAGAGGAATATGTCAGCTGGGGGC-3′[SEQ ID NO16]使用相同模板，對木質素過氧化物酶的N-外顯肽部分進行擴增，所用的PCR引物如下5′-ATGGCCTTCAAGCAGCTCGTCGCAGCGATTTCCCTCGCACTCTCGCTCAC-3′[SEQ ID NO17]5′-GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTGTGTGGTCGGTCTGGATGCGGATCT-3′[SEQ ID NO18]生成的序列長為1196個核苷。內含肽編碼序列置于木質素過氧化物酶基因內，如實施例1所述對其進行PCR擴增。在該反應中，使用Pyrrococcus spp基因組DNA為模板，引物如下5′-AGATCCGCATCCAGACCGACCACACAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3′[SEQ ID NO19]5′-GCGGTGCGGGAGTCGCGGGCGAGAATTATGTGCATAGAGGAATCCAAAG-3′[SEQ ID NO20]生成的序列長為1661個核苷。這些反應一旦結束，將反應產物按上述方法在瓊脂糖凝膠中電泳、純化和分析。如實施例1所述方法將外顯肽和內含肽部分連接。在本例中，將內含肽片段和等摩爾木質素過氧化物酶C-外顯肽部分混合。組合這些片段通過以所需的模板和引物進行pCR反應而得到。在與實施例1相同的條件進行PCR，一旦完成，PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠中電泳，條帶長大約2106個核苷，然后從凝膠中純化。用如實施例1所述的方法分析純化的條帶。少量純化反應產品在UV光譜儀上260和280nm波長處進行吸收定量測定。
通過另一些PCR反應得到內含肽修飾蛋白的DNA編碼序列。將剛構建的C端外顯肽與內含肽片斷融合體與等摩爾量的預純化N-外顯肽片段連接。PCR反應條件與前相同。PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠中電泳，條帶大約3302個核苷，然后根據實施例1的方法從凝膠中純化、分析。最終的內含肽修飾蛋白編碼序列在木質素過氧化物酶編碼序列內含有以合適方向插入到閱讀框內的完整內含肽序列。
將內含肽修飾木質素過氧化物酶編碼序列克隆到植物表達盒中。本例中使用具有卡那霉素抗性、缺乏octupine合成酶基因但包含octupine轉錄調控序列的pTiA6質粒。將內含肽修飾的木質素過氧化物酶的編碼下列連接到限制性PTiA6中，處于octupine轉錄調控序列(啟動子和3`聚腺苷酸位點)的調控下。用生成的連接載體轉化根瘤土壤桿菌(A.tumefaciens)K12X562，可以使用任何合適方法(例如電穿孔或CaCl2方法)。在Ausbel等的文章(1998)中描述了轉化方法。
利用重組根瘤土壤桿菌轉化花旗松及其結節部分或種子樣品。幼芽根據前述方法(Gupta PK，Durzan，DJ，″Shoot multiplication from maturetrees of Douglas-fir，and sugar pine，″Plant Cell Reports，9177.179，1985)在含有DCR基本培養基的培養皿中增殖和生長。重組根瘤土壤桿菌培養物根據實施例1方法培養生長。為了進行植物轉化，用20％漂白劑和0.1％ Tween 20對培養物中大約50mm長的再生幼芽、種子表面進行殺菌。殺菌后，用無菌的雙蒸去離子水在無菌條件下沖洗幼芽或種子。首先用無菌針扎傷表皮組織或用無菌刀切割表面以轉化種子或幼芽。將受傷的種子或幼芽浸泡在重組根瘤土壤桿菌培養物中，其中的細胞濃度大約為5×108細胞/mL。暴露于重組根瘤土壤桿菌培養物中大約12小時后，將種子或幼芽培養在DCR基本培養基(2.2％蔗糖，0.8％Bacto(Difco)瓊脂)中。培養條件包括25℃下16小時的光照期，然后在20℃的溫室或生長室中8小時的黑暗期。每2-3周將再生植物轉移到新鮮培養皿中；根一旦形成，就將外植體轉移到裝有土壤的盒子中，4-5天后再植入溫室或可控土塊的土壤中并完成整個生長。第一年在溫室中生長，溫度條件可控，不超過30℃。
用與實施例1相似的方法對上述植株進行監測，除了在western分析時使用特異性木質素過氧化物酶蛋白或內含肽修飾的木質素過氧化物酶蛋白。
生成的轉基因花旗松種無限地生長，且產生高效價內含肽修飾木質素過氧化物酶。因為用于修飾的內含肽相同，所以隨后木質素過氧化物酶以與實施例1相同的方法被激活。
實施例3發酵物質的制備加工方法使用植物表達內含肽修飾蛋白在實施例1中，轉基因白楊可作為底物通過發酵來生產乙醇。該加工方法中，轉基因樹以鏈鋸或斧頭等合適的工具收集。接著用機械制漿機將該樹制成漿，然后將該漿液倒入罐中。經任何必須的預處理后，提高罐內溫度或降低pH值到4來誘導內含肽剪接。依賴于使用的預處理方式，內含肽剪接也可以被預處理誘導，平行發生于加工操作中。一旦剪接后，天然酶活性開始消化漿液中的纖維素，增加單糖濃度。
剪接誘導后，將糖化容器的內容物以任意比例與天然白楊漿液或其他物質混合，以促進這些物質的纖維素降解。混合的比例依賴于轉基因白楊纖維素酶活性，即在植物中表達的具有功能的內含肽修飾蛋白的數量以及剪接效率、重組效率和混合的天然纖維素酶對物質的活性。每個參數都有廣泛選擇范圍的可能值，可以優化以促進更經濟地加工。
用0.22m或更小孔徑的過濾器過濾，或成批熱蒸餾，或通過熱交換器連續蒸餾經降解的纖維素中的無菌生成的葡萄糖。將無菌葡萄糖加入到發酵工藝中用作底物，用文獻中所描述的方法來生產乙醇。參見H.K.Sreenath和T.W.Jeffries，″Production of ethanol from Wood hydrolysateby yeasts，″Bioresource Technology，72(3)253-260，2000；Lisbeth Olsson和Barbel Hahn-Hagerdal，″Fermentation of lignocellulosic hydrolysates forethanol production，″Enzyme and Microbial Technology，18(5)312-331，1996；Kutluo O.Ulgen等，″Bioconversion of starch into ethanol by arecombinant Saccharomyces cerevisiae strain YPG-AB″，ProcessBiochemistry，37(10)1157-1168，2002；M.Mete Altintas等，″Improvementof ethanol production from starch by recombinant yeast throughmanipulation of environmental factors，″Enzyme and Microbial Technology，31(5)640-647，2002；Farooq Latif等，″Production of ethanol and xylitolfrom corn cobs by yeasts，″Bioresource Technology，77(1)57-63，2001。
發酵加工以分批、補料分批和連續方式進行。
實施例4作為動物飼料應用的表達內含肽修飾蛋白的植物轉基因油菜籽用基本上與實施例1和2相同的方法構建，進行如下改進在構建CIVPS或內含肽修飾基因序列時，可以使用相同的內含肽編碼序列，但在本例中內含肽融合到Aspergillus ficuum表達的肌醇六磷酸酶中。在本實施例中，內含肽修飾蛋白的選擇依據是它是否能夠在該動物的胃酸水平下被誘導產生蛋白剪接。由于其在低PH值環境中具有高水平活性(van Ooijen等.(2000)，美國專利6,022,846)，所以選擇該肌醇六磷酸酶。在如上所述的相同條件下用下列引物擴增肌醇六磷酸酶C端外顯肽5′-CTTTGGATTCCTCTATGCACATAATTTCCTTCGACACCATCTCCAC CAGCA-3′[SEQ ID NO21]5′-CTAAGCAAAACACTCCGCCCAATCACCGCCAGATCTGGCAAAGCTCAACC-3′[SEQ ID NO22]生成的序列長為627個核苷。內含肽序列用下列引物擴增，反應條件如上5′-AGTGACCTACCTCATGGACATGTGCAGCATTTTACCGGAAGAATGGGTTC-3′[SEQ ID NO23]5′-GCTGGTGGAGATGGTGTCGAAGGAATTATGTGCATAGAGGAATCCAAAG-3′[SEQ ID NO24]最后，N-外顯肽用如下引物擴增，得到928個核苷的PCR片段5′-ATGGGTGTCTCTGCCGTTCTACTTCCTTTGTACCTCCTGTCCGGAGTATG-3′[SEQ ID NO25]
5′-GAACCCATTCTTCCGGTAAAATGCTGCACATGTCCATGAGGTAGGTCACT-3′[SEQ ID NO26]用PCR法及如實施例1和2所述的方法清洗、分析并連接生成的DNA片段。該步驟產生內含肽修飾肌醇六磷酸酶的編碼序列。然后將該連接的內含肽修飾肌醇六磷酸酶的編碼序列擴增、清洗、分析，方法如實施例1和2所述。與實施例2相同，將該內含肽修飾肌醇六磷酸酶的DNA編碼序列克隆到表達盒，然后轉化根瘤土壤桿菌。生成的重組根瘤土壤桿菌用于轉化油菜籽莖部分。轉化完全按照實施例1和2所述的方法進行，有下列改進用20％漂白劑溶液室溫下對5-6周的植物的油菜籽莖部分滅菌25分鐘。滅菌后，用無菌的雙蒸去離子水在無菌條件下沖洗莖部分。通過在加有1mg/L BAP的Murashige-Skoog培養基中培養以對該部分進行預處理，24小時后將莖部分與含有內含肽修飾肌醇六磷酸酶的新轉化的根瘤土壤桿菌一起培養48小時。緊接該培養步驟后，再生轉基因植物，用卡那霉素抗性標記進行選擇，后續步驟完全如實施例1和2所述。內含肽修飾肌醇六磷酸酶的插入也可用如實施例1和2所述的方法進行證實。
生成的轉基因油菜籽被培育在地方法律許可的區域。該油菜籽成熟后收割，作為動物飼料添加物。另外，油菜籽也可以生長在動物放牧區，因為內含肽剪接可在動物胃部中自發發生，而使肌醇六磷酸酶活性激活。
實施例5表達內含肽修飾纖維素酶的轉基因玉米的生產和其在乙醇生產中的用途本實施例顯示一種實施本發明的方法。在本實施例中，構建了轉基因玉米并將其用作生產乙醇的底物或其他發酵底物。在本實施例中，再次利用實施例1的內含肽修飾基因序列證明本發明效果。玉米易碎的胚源II型愈傷組織培養物的生長起始于溫室生長的A188(University of Minnesota，Crop Improvement Association)x B73(Iowa StateUniversity)的大約1.6-1.8mm長的未成熟胚。收割后，用50％漂白劑室溫下對片斷表面滅菌25分鐘，然后用無菌的雙蒸去離子水沖洗。將收集的片段開始進行無菌培養，培養條件為不超過10Em-2S-1的光照、24℃、改良的N6培養基(Chu，et al.，(1975)，″Establishment ofan EfficientMedium for Anther Culture of Rice through Comparative Experiments onNitrogen Sources，″Sci.Sin.，18659-668)中、pH 5.8、同時含2mg/L甘氨酸、2.9g/L L-脯氨酸、1mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、100mg/L酪蛋白水解產物、20g/L蔗糖，以2g/L Gelgro(ICN Biochemicals)凝固化。
大約培養2周后，根據合適的形態學評估培養物。這種仔細的肉眼觀察能發現性質良好的肉質胚。將能夠增殖的合適形態轉移到新鮮改良N6培養基中(如上所述)。每2-3周將具有合適形態的組織按常規方法進行次級培養，直到進行基因槍轟擊。該目標內含肽修飾基因序列和表達載體按實施例1方法構建，在本實施例中，優選的表達載體有以下改進用本領域公知的方法(例如，自合適模板PCR擴增潮霉素抗性標記物、以DNA核酸內切酶剪切載體、隨后純化和連接潮霉素抗性標記)將卡那霉素抗性標記取代為潮霉素抗性標記(Ausbel等，1998)。一旦構建后，載體以1∶1的摩爾比例沉淀在鎢(平均直徑1.2m，GTE Sylvania)或金顆粒中。如同該方法的其他步驟，沉淀參數可以作些微小優化，將1.25mg鎢顆粒與溶于含有1.1M CaCl2和8.7mM亞精胺，總體積為575L的溶液中的25g載體DNA混合以完成沉淀。將沉淀在0℃渦旋10分鐘。渦旋后，在500×g，離心混合物5分鐘。離心后，去除大約550L的上清液，剩余的25L沉淀物等分分配到1L微粒中(Biolistics，Inc，Ithaca，NY)，除了上述提及的不同以外，按照Klein等的描述(1987)進行轟擊。所有操作都是在無菌和冰上進行。
一旦生物微粒準備完畢，目標植物組織即準備進入轟擊步驟。每個愈傷組織塊重50mg(濕重)，將大量的愈傷組織塊在60×15mm無菌陪替式培養皿(petri dish)(Falcon 1007)的中央排列成X圖案。每次轟擊需要準備幾個培養皿，將這些培養皿順序放置，位于微注射儀器的終止平板下5cm。培養皿位于該裝置下方的中央，去蓋，用3×3mm網篩覆蓋在平板上，該網篩幫助限制位于培養皿中的被轟擊組織。根據制造商的描述用微注射儀器進行組織轟擊，商業上可用的微注射儀器可從Bio-Rad(Hercules，CA)得到。轟擊后，將愈傷組織轉移到新鮮的改良N6培養基中，按上述相同條件培養。
培養2天后，開始挑選轉化細胞以進行隨后的再生。將經過轟擊程序的愈傷組織平板在無菌的狀態下轉移到新鮮、無菌的改良N6培養基中，其中潮霉素B(Calbiochem)的終濃度為10mg/L。暴露2周后，將所有的愈傷組織從選擇平板無菌地轉移到新鮮、無菌的改良N6培養基中，其中潮霉素B的終濃度為50mg/L。進行該轉移從而使單一平板中只容納5個30mg的愈傷組織塊，因此平板數增加。在50mg/L潮霉素B的平板中培養3周后，將所有愈傷組織無菌轉移到新鮮、無菌的改良N6培養基中，其中潮霉素B的終濃度為60mg/L。培養2周后，觀察愈傷組織增殖塊。挑選增殖塊，并將其轉移到改良的Murashige-Skoog培養基中，該培養基中加有0.5mg/L維生素B1、HCl、0.75mg/L、2，4-D50g/L蔗糖、150mg/L天冬氨酸和2.0g/L Gelgro。
此時務必確保被選擇植物的成功轉化。使用實施例1和實施例2的方法證明內含肽修飾纖維素酶的存在。在本例中，用本領域公知的方法，內含肽修飾纖維素酶編碼序列和/或潮霉素抗性標記都可作為轉化有效性標記，如同Ausbel等的描述(1998)。在改良的Murashige-Skoog培養基中培養2周后，將平板暴露在明(14hrs)暗(10hrs)交替的周期中于24℃下培養。將形成的幼小植物無菌地轉移到裝有100mL改良的Murashige-Skoog培養基的1L廣口錐形瓶中，轉移生成的植物到蛭石(VERMICULITE)中，1-2周后植入土壤中，生長發育至成熟。成熟植物基本按照實施例1的方法分析以確保內含肽修飾蛋白序列穩定轉化，最好同時確保內含肽修飾纖維素酶成功表達。
生成的成熟植物可以通過標準技術異花授粉，該授粉可發生在兩個轉化植物之間或轉化植物與非轉化植物之間。檢測培育得到的后代是否含有內含肽修飾纖維素酶和潮霉素抗性標記。注意，此時在挑選中使用的潮霉素抗性標記對于構建的轉基因玉米的應用和用途不再是必需元件，只要含有內含肽修飾纖維素酶序列，保留的潮霉素抗性標記就不再是轉基因玉米的必需成分。可以從能育的轉基因植物中收集種子用于植物擴增，生成的轉基因植物可生長用于與實施例3相似的加工。利用表達多個內含肽修飾蛋白的轉基因玉米進行加工對于利用玉米植物的纖維素和淀粉部分，合并預處理、糖化、和發酵步驟和降低能源和原材料投入成本具有經濟利益。轉基因植物中含有內含肽修飾蛋白，這使有效使用該方法生產乙醇成為可能。
以上實施例并不對本專利范圍產生任何限制，其僅僅是用來幫助闡述本專利所公開發明的實施方式。本領域技術人員都知道可以進行其他改進，這些改進也包含在本發明的范圍內。
參考文獻Dale，Biotechnol.Prog.15775-776(1999).
Committee on Biobased Industrial Products，Biobased IndustrialProductsPriorities for Research and Commercialization，National AcademyPtess，Washington D C(1999).
Cameron，et al.，Biotechnol.Prog.14116.125(1998).
Park，et al.，Biotechnol.Prog.14699-704(1998).
Taylor，et al.，Biotechnol.Prog.16541.547(2000).
Poirier，Nature Biotechnology 17960-961(1999).
Lynd，Biotechnol.Prog.15777-793(1999).
Ingram，Biotechnol.Prog.15855-866(1999).
Aspergren，et al.，Molecular Breeding 191-99(1995).
Marsfield，et al.，Biotechnol.Prog.15804-816(1999).
Evans，et al.，Protein Science 72256-2264(1998).
Perler，et al.，Nucl.Acids Res.221125-1127(1994).
Xu，et al.，EMBO 155146-5153(1996).
Wood，et al.，Biotechnol.Prog.161055.1063(2000).
Clarke，P.N.A.S.(USA)9111084.11088(1994).
Derbyshire，et al.，P.N.A.S.(UBA)951356-1357(1998).
Perler，et al.，Nucleic Acids Res.221125-1127(1994).
Wallace，C.J.，Protein Sci.2697-705，(1993).
Xu，et al.，Cell 751371-1377(1993).
Pietrokovski，S.，Protein Sci.37352340-2350(1994).
Ausbel，et al.，″Current Protocols in Molecular Biology，″Wiley，NewYork(1998).
Draper，et al.，″Plant Genetic Ttansformation and Gene ExpressionA Laboratory Manual，″Blackwell Scientific Publications，Boston(1998).
Potrykus，et al.，″Gene Transfer to Plants，″Springer，New YorkGuilley，et al.，Cell，30763(1982).
Higgins，T.J.V.，Annu.Rev.Plant Physiol.35191(1984).
Coruzzi，et al.，EMEO J.31671(1984).
Tingey，et al.，EMBO J.63565(1987).
Ryan，et al.，Nuc.Acids Res.173584(1989).
Rocha-gosa，et al.，EMBO J.823(1989).
Wenzler，et al.，Plant Mol.BioI.1241(1989).
Bird et al.，Plant Mol.BioI.11651(1988).
Brederode，et al.，Nucl.Acids Res.82213(1980).
Smeekens，et al.，T.I.E.S.1573(1990).
van den Broeck et al.，Nature 313358(1985).
Schreier，et al.，EMBO J.425(1985).
Tague，et al.，Plant Phys.86506(1988).
Yon Heijne，G.，J.Mol.BioI.189239(1986).
Sijmons，et al.，Bio/Technol.8217(1990).
Gordon-Kamm，et al.，The Plant Cell 2603(1990).
Shimamoto，et al.，Nature 338274(1989).
Horsch，et al.，Science 21229(1985).
Ziegler，et al.，Molecular Breeding 637.46(2000).
Dai，et al.，(a)，Molecular Ereeding 6277-285(2000).
Dai，et al.，(h)，Molecular Breeding 943-54(2000).
Montvalvo.Rodriguez，et al.，Biotech.and Bioeng.2151-159(2000).
U.S.Patent No.6,022,846.
Chu，et al.，Sci.Sin.18659.668(1975).
Klein，et al.，Nature 32770-73(1987).
至此，已經對本發明進行了完整的說明，顯然，本領域技術人員在不偏離本發明的精神和范圍的情況下可以對本發明作一些改變和改進。
權利要求
1.一種重組的植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其包含能編碼至少一種含有靶蛋白或蛋白片斷的修飾蛋白的表達構建體，其中的靶蛋白或蛋白片斷融合到可控插入蛋白序列(CIVPS)或內含肽序列或其片段中間，或融合到上述序列或其片斷的氨基末端或羧基末端。
2.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的表達構建體包括可操縱性相互連接的編碼靶蛋白的第一核酸片段、編碼CIVPS或內含肽序列的第二核酸片段、和任選的選擇性標記或報告基因和/或啟動子。
3.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述修飾蛋白被組成型表達。
4.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中包含至少一種被誘導型表達的修飾蛋白，和其中任選的引發修飾蛋白剪接的刺激物。
5.如權利要求4所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的刺激物包括pH、滲透壓、溫度、肥料、殺蟲劑、化合物、光照和/或聲音方面的變化。
6.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中至少有一種修飾蛋白在植物生命周期的預定點；在至少一個特定組織或其部分；和/或在至少一個特定亞細胞器中表達，和/或表達并分泌到細胞外。
7.如權利要求6所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的植物的至少一種特定組織包括種子、根、果實、莖、塊莖和/或葉；和特定亞細胞器包括細胞溶質、線粒體、質體、內質網、包含體、空泡和/或核。
8.如權利要求2所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的至少一種選擇性標記能賦予其對一些化合物的抗性，所述化合物包括溴草腈、2，2-二氯丙酸、G418、甘磷酸、合氯氟、潮霉素、咪唑啉、卡那霉素、氨甲蝶呤、新霉素、膦絲菌素、稀禾定、2，2-二氯丙酸、甘磷酸、潮霉素、thichothrcne、磺酰脲、s-三嗪和/或三唑嘧啶；和/或其中包括位于至少一種CIVPS或者內含肽修飾蛋白多核苷酸之前的啟動子。
9.如權利要求8所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的重組植物對正常毒性水平的至少一種化合物具有耐受性或抗性。
10.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中它們是能繁殖的，并含有至少一個可遺傳的編碼修飾蛋白的多核苷酸序列。
11.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中它們是不能繁殖的。
12.同系繁殖的權利要求1所述的基因重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔。
13.雜交繁殖的權利要求1所述的基因重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔。
14.如權利要求4所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的剪接蛋白改變了至少一種預定的植物成分的含量或活性。
15.如權利要求17所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的含量減少的植物成分包括葡萄糖、果糖、甘油、甘氨酸三甲內鹽、蔗糖、乳糖、麥芽糖、半乳糖、氨基酸、脂、維生素和/或淀粉。
16.如權利要求17所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的活性下降的植物成分包括纖維素、半纖維素、木質素、淀粉、膠質和/或脂。
17.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的CIVPS或者內含肽與靶蛋白序列或其片段形成至少一個剪接連接。
18.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的剪接連接的羧基端氨基酸殘基包括帶有羥基或巰基側鏈的氨基酸殘基。
19.如權利要求17所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的位于CIVPS或內含肽序列或其片段的下游的剪接連接，在靶蛋白或其片段氨基端含有不帶羥基或巰基側鏈的氨基酸殘基。
20.如權利要求17所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的位于CIVPS或內含肽序列及其片段的上游的剪接連接，在CIVPS或內含肽序列或其片段的羧基端含有帶有羥基或巰基側鏈的氨基酸殘基。
21.如權利要求17所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的位于CIVPS或內含肽序列或其片段的上游的剪接連接，含有半胱氨酸。
22.如權利要求17所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的位于CIVPS或內含肽序列或其片段的下游的剪接連接，在CIVPS或內含肽序列或其片段的羧基端含有His-Asn，以及在靶蛋白連接區的氨基端含有帶有羥基或巰基側鏈的氨基酸殘基。
23.如權利要求17所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的位于CIVPS或內含肽序列或其片段的下游的剪接連接，于CIVPS或內含肽序列或其片段的羧基端含有Asp，以及在靶蛋白或其片段的連接區的氨基端含有帶有羥基或巰基側鏈的氨基酸殘基。
24.如權利要求23所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的位于羧基端的Asp被一種無羧基或氨基側鏈的氨基酸取代。
25.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的CIVPS或者內含肽序列或其片段含有CIVPS或者內含肽。
26.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的CIVPS或者內含肽序列或其片段含有外部可控的酵母屬(Saccharomyces)CIVPS或者內含肽序列。
27.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的CIVPS或者內含肽序列或其片段含有外部可控的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CIVPS或者內含肽序列。
28.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的CIVPS或內含肽序列或其片段插入到靶蛋白或其片段的Ser、Thr或Cys前，并與該氨基酸緊鄰。
29.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的CIVPS或內含肽序列或其片段的氨基或羧基端含有Ser、Thr或Cys。
30.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的蛋白通過微生物表達。
31.如權利要求30所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中的微生物選自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)或島生商陸(Phytolacca insularis)。
32.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中表達的蛋白包括修飾的蘇云金芽孢桿菌內毒素。
33.如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中的所述蛋白通過病毒表達。
34.如權利要求33所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，其中所述的病毒選自馬鈴薯病毒Y(potato virus Y)、雙生病毒(geminivirus)、不孕病毒2b(aspermy virus 2b)、黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus)。
35.制備如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔的方法，該方法包括，提供一種表達構建體，所述構建體編碼至少一種含有靶蛋白或蛋白片段的修飾蛋白，該靶蛋白融合到CIVPS或內含肽序列或其片段中間或末端，或者氨基末端或者羧基末端；用該表達構建體轉化植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔；從編碼至少一種修飾蛋白的轉化植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔中再生一種基因重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔。
36.如權利要求35所述的方法，其中所述的轉化是穩定轉化。
37.如權利要求35所述的方法，其中所述的再生通過至少下列之一完成培育重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔；將重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔后代或后裔與非遺傳重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔雜交；或將兩種遺傳重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔回交。
38.如權利要求35所述的方法，其中所述的表達構建體至少含有啟動子、選擇性標記、抗性標記、遺傳標記、聚腺苷酸序列、抑制子、增強子、定位序列或信號序列中的一個。
39.如權利要求35所述的方法，其中所述的植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔用表達構建體通過下列方法轉化病毒轉化、DNA包裹微粒轟擊、脂質體基因轉化、細菌基因轉移、電穿孔、或基因化學轉化或其組合。
40.如權利要求35所述的方法，其中所述的植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔通過細菌，如根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)，轉化。
41.如權利要求35所述的方法，其中所述的植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔在磷酸鈣和/或聚乙二醇的協助下通過基因化學轉化法轉化。
42.如權利要求35所述的方法，其中所述的被轉化植物、或植物部分，胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔通過選擇標記或抗性標記中至少一種來進行篩選。
43.如權利要求35所述的方法，其中所述的被轉化植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔借助于至少一種編碼CIVPS或內含肽修飾蛋白的核酸的表達來進行篩選。
44.如權利要求35所述的方法，其中所述的遺傳重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔由一個轉化的胚組織；植物原生質體；未成熟胚的衍化細胞；或轉化種子再生。
45.從表達蛋白或蛋白片段的重組轉化植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔中生產修飾蛋白或蛋白片段的方法，所述方法包括實施權利要求35所述的方法；和從轉化植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔中收集修飾蛋白或蛋白片段。
46.如權利要求45所述的方法，還包括純化修飾蛋白的步驟。
47.如權利要求45所述的方法，其中所述的修飾蛋白或蛋白片段是CIVPS或內含肽修飾蛋白或蛋白片段。
48.生產含有靶蛋白或蛋白片段的修飾蛋白的方法，其中的靶蛋白或蛋白片斷融合到CIVPS或內含肽序列或其片段的中間或末端，或者氨基末端或者羧基末端，所述方法包括獲得編碼靶蛋白的表達構建體，該靶蛋白在框架內，或氨基或羧基端，有融合的CIVPS或內含肽序列或其片段；用表達構建體轉化宿主植物細胞；和在適合修飾蛋白表達的條件下培養轉化的植物宿主細胞。
49.如權利要求48所述的方法，其中在所述表達構建體中，至少一個編碼CIVPS或內含肽序列或其片段第一核苷酸融合到至少一個的編碼靶蛋白或其片段的第二核苷酸序列的5｀端。
50.如權利要求48所述的方法、其中在所述表達構建體中至少一個編碼CIVPS或內含肽序列或其片段第一核苷酸片斷融合到至少一個的編碼靶蛋白或其片段的第二核苷酸序列的3｀端。
51.如權利要求48所述的方法，其中所述的CIVPS或內含肽序列或其片段包括酵母菌蛋白及其片段。
52.如權利要求48所述的方法，其中所述的CIVPS或內含肽序列或其片段能以順式或反式影響剪切、裂解、連接、剪切-連接、裂解-連接和/或環化。
53.如權利要求48所述的方法，其中所述的蛋白剪接通過下列至少一種方式誘導改變光、溫度、或pH值，添加/去除有利/抑制剪接或裂解的化學劑，氨基酸去磷酸化或去糖基化，或接觸/去除激活/阻斷剪接/裂解過程的肽或模擬肽。
54.如權利要求53所述的方法，其中所述的蛋白剪接通過在體內或體外接觸/去除能激活/阻斷蛋白剪接/裂解過程的肽或模擬肽來誘導。
55.如權利要求48所述的方法，其中所述的CIVPS或內含肽或其片段的氨基或羧基端包含Ser、Thr或Cys。
56.如權利要求48所述的方法，其中所述的CIVPS或內含肽或其片段的羧基端在靶蛋白的Ser、Thr或Cys前含有Asp。
57.如權利要求48所述的方法，其中所述的表達構建體還含有至少一個的啟動子、選擇性標記、抗性標記、可遺傳標記、聚腺苷酸序列、抑制子、增強子、定位序列、或信號序列，還任選地包括用表達構建體轉化植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔，轉化方式包括病毒轉化、DNA包裹微粒轟擊、脂質體基因轉化、細菌基因轉移、電穿孔和/或基因化學轉化。
58.如權利要求57所述的方法，其中所述的用于轉化表達構建體的細菌是根瘤土壤桿菌細菌。
59.如權利要求57所述的方法，其中所述的用于轉化表達構建體的化合物是磷酸鈣或聚乙二醇，被轉化植物細胞、植物部分、或植物通過選擇標記或抗性標記表達來篩選。
60.如權利要求48所述的方法，其中所述的轉化植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔通過修飾蛋白基因序列的表達來篩選；和遺傳重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔由轉化的胚組織再生。
61.如權利要求48所述的方法，其中所述轉化植物由未成熟胚的細胞再生。
62.如權利要求48所述的方法，其中所述的轉化植物由轉化的種子再生。
63.一種生產表達修飾蛋白的種子的方法，該方法包括獲得如權利要求1所述的遺傳重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔；培養或培育遺傳重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔；和獲得由此產生的表達修飾蛋白的植物種子。
64.使用表達修飾蛋白的植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔來生產一種物質中的方法，該方法包括收集如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔；機械加工所述植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔；以大于或等于零的重組非重組比例將機械加工的植物、或植物部分，胚，組織，細胞，亞細胞片段，種子，幼苗，原生質體，后代或后裔與非基因重組植物組合；和在能有效獲得該物質的條件下化學加工上述植物或特定植物部分。
65.如權利要求64所述的方法，其中所述的植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔的機械加工方法包括至少一次的擠出、碾磨、切碎、覆蓋、碎裂、切塊、壓縮、爆散和/或撕破。
66.如權利要求64所述的方法，其中所述的組合物的化學加工方法包括用至少一種以下方法預處理蒸，稀酸或濃酸處理，氨水爆炸，滅菌，水浸泡，溶劑混合，pH、溫度和/或滲透壓改變，暴露于光照，無機和/或酶催化，糖化，脫色，摩擦，發酵，蒸餾，層析，吸收或添加化合物。
67.如權利要求66所述的方法，其中所述的預處理包括蒸該組合物使其滅菌。
68.如權利要求66所述的方法，其中所述的化學加工方法包括下述之一用硫酸、鹽酸、磷酸或羧酸中的至少一種預處理；在大于或等于20℃的溫度中浸泡；和/或將組合物與水、有機或無機溶劑混合。
69.如權利要求67所述的方法，其中應用外來刺激物來誘導修飾蛋白或蛋白片段的剪接。
70.如權利要求69的所述方法，其中所述的外界刺激物包括pH、滲透壓或溫度改變，暴露于聲音、光照中或添加化合物。
71.如權利要求69所述的方法，其中所述的剪接蛋白或蛋白片段相對于修飾的蛋白或蛋白其片段其活性改變。
72.如權利要求71所述的方法，其中所述的剪接蛋白或蛋白片段具有分解代謝或合成代謝活性。
73.如權利要求72所述的方法，其中所述的剪接蛋白或蛋白片段能降解淀粉、糊精、膠質、脂、甲殼素、木質素、纖維素、或半纖維素，或修飾木質素或具有糖化活性。
74.如權利要求72所述的方法，其能生產葡萄糖、果糖、木糖、酚、甘油、甘露糖、乳酸、乙酸、乙烯、丙烯、甲苯、苯乙烷、苯乙烯、二甲苯、乙二醇、丁二烯、甲醛、異丙醇、丙酮、丁二醇、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙二醇、維生素、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、苯或生物高聚體中的至少一種。
75.如權利要求67所述的方法，其中所述的預處理、糖化和發酵是在一個步驟中進行的。
76.如權利要求67所述的方法、其中所述的糖化和發酵是在一個步驟中完成的。
77.如權利要求67所述的方法，其中所述的發酵是用原核或真核微生物進行的。
78.如權利要求74所述的方法，其中所述的微生物產生乳酸、乙酸、乙烯、丙烯、甲苯、苯乙烷、苯乙烯、二甲苯、乙二醇、丁二烯、甲醛、異丙醇、丙酮、丁二醇、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙二醇、維生素、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、苯或生物高聚體中的至少一種。
79.動物飼料，其含有營養需求量的如權利要求1所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔。
80.如權利要求79所述的飼料，其中所述的重組植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔經消化后，修飾蛋白或蛋白片段經動物的體內刺激誘導剪接。
81.如權利要求79所述的飼料，其中所述的體內刺激物包括動物的唾液、膽汁、糜蛋白酶、胰島素、重碳酸鹽、鹽酸、胃部pH和溫度的至少一種。
82.如權利要求79所述的飼料，其中所述的剪接蛋白包括肌醇六磷酸酶、內纖維素酶、外纖維素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、膠質酶、脂酶或生長激素中的至少一種。
83.含有如權利要求79所述的飼料的免疫反應提高組合物，其中的剪接蛋白或蛋白片段至少含有一種重組免疫原。
84.如權利要求83所述的組合物，其中所述的重組免疫原包括病毒或細菌免疫原。
85.如權利要求83所述的組合物，其中所述的組合物是口服型配方。
86.如權利要求83所述的組合物，其中所述的組合物是跨粘膜吸收型配方。
87.如權利要求83所述組合物，其中所述的組合物是胃腸道吸收型配方。
88.如權利要求83所述的組合物，其中所述的剪接蛋白或蛋白片段是原核蛋白或蛋白片段。
89.如權利要求83所述的組合物，其中所述的剪接蛋白或蛋白片段是真核蛋白或蛋白片段。
90.生產動物飼料的方法，該方法包括實施如權利要求35所述的方法；和在能有效獲得動物可消化飼料的條件下，加工遺傳修飾的植物、或植物部分、胚、組織、細胞、亞細胞片段、種子、幼苗、原生質體、后代或后裔。
91.提高動物生長的方法，該方法包括讓動物進食如權利要求79所述的飼料。
92.提高動物免疫反應的方法，該方法包括向需要提高免疫力的動物給予免疫有效量的如權利要求83所述的組合物。
93.生產靶蛋白或蛋白片段的方法，該方法包括產生第一修飾蛋白或蛋白片段、其中根據如權利要求45所述的方法將CIVPS或內含肽序列及其片段的氨基端融合到靶蛋白或蛋白片段的羧基端；產生包含CIVPS或內含肽序列片段的第二修飾蛋白；和在有利于第二修飾蛋白反式裂解CIVPS或內含肽序列及其片段的條件下將第一和第二修飾蛋白接觸。
94.生產靶蛋白的方法，該方法包括產生第一修飾蛋白及其片段，其中根據如權利要求45所述的方法將CIVPS或內含肽序列及其片段的羧基端融合到靶蛋白及其片段的氨基端；產生包含CIVPS或內含肽序列片段的第二修飾蛋白；和在有利于從第一修飾蛋白及其片段反式裂解的CIVPS或內含肽序列及其片段的條件下，將第一和第二修飾蛋白接觸。
95.如權利要求92所述的方法，其中所述的剪接由至少一種的下列條件誘導光照、溫度或pH值變化，添加/去除有利/抑制剪接或裂解的化學劑，氨基酸去磷酸化或去糖基化，或接觸/去除能激活/阻斷蛋白剪接/裂解過程的肽或模擬肽。
全文摘要
本發明涉及表達CIVPS或內含肽修飾蛋白的轉基因植物、以它們為成分的組合物、用轉基因植物造出的具各種用途的產品、構建含有表達CIVPS或內含肽修飾基因的轉基因植物的方法、在植物表達CIVPS或內含肽修飾蛋白的方法以及使用轉基因植物的方法。
文檔編號C12N15/82GK1633501SQ03804121
公開日2005年6月29日 申請日期2003年1月7日 優先權日2002年1月8日
發明者邁克爾·R·拉布爾 申請人:邁克爾·R·拉爾布