用于持家基因mRNA檢測的核酸擴增用引物和使用該引物的檢查方法

專利名稱：用于持家基因mRNA檢測的核酸擴增用引物和使用該引物的檢查方法
技術領域：
本發明涉及到用于持家基因(housekeeping gene)檢測的核酸擴增用引物。
背景技術：
隨著近年來基因工程和分子生物學等領域的進步，可以在DNA或RNA水平對傳染病和基因疾病等進行診斷了。特別是通過聚合酶鏈式反應法(PCR法、Science，2301350-1354，1985)和NASBA法(Nucleic Acid Sequence Based Amplification法、Nature，350，91-92，1991、日本專利第2648802號公報和日本專利第2650159號公報記載)等核酸擴增方法，以往比較困難的生物檢體中極微量核酸量的檢測也可以進行了，基因解析迅速變成了容易的事情。
例如在癌癥領域，向淋巴節的癌轉移診斷就具有極其重要的意義。作為向淋巴節的癌轉移診斷的一個手法，有檢測作為癌標志的例如細胞角蛋白(CK)那樣的蛋白質方法。由于近年來基因解析技術的發展，通過檢測與癌標志蛋白質有關的mRNA的表達，已經可以有效地進行癌診斷了(北海道醫學雑志、p.135-141，Vol.66(2)，1991)。通過RT-PCR可以通過切除的組織進行CK的mRNA表達的檢測，漏掉癌轉移(診斷)的問題已經可以避免到一定程度。在腫瘤或癌的診斷領域中，這樣的核酸擴增方法已經實用化了(臨床檢查法提要、第31版、金原出版株式會社、1998年9月20日發行)。
作為上述以外的DNA擴增方法，報道了LAMP法(專利文獻1)。LAMP法是通過利用含有當進行鏈置換反應時在擴增產物末端形成發卡構造的引物的多個引物進行的基因擴增方法。首先，在初期反應，通過2種內引物(FIP，RIP)以及2種外引物(F3引物、R3引物)和鏈置換型DNA聚合酶由模板DNA合成兩端具有一條鏈環部分的啞鈴狀的結構。該結構成為擴增循環的起點結構，由該結構的3’末端側以自身作為模板進行DNA的延伸合成反應。擴增產物由許多重復結構構成，重復結構単位由夾在引物之間構成被擴增區域的雙鏈核酸的堿基序列成反向的同一鏈內的互補區構成。LAMP法的特征是不需要通過熱變性將模板DNA的雙鏈變為一條鏈的操作，擴增反應都是在等溫下連續進行的(非專利文獻1和2)。模板是RNA時，通過在模板為DNA的反應液組成中再添加逆轉錄酶，同樣可以合成起點結構，進行擴增(RT-LAMP法)。通過LAMP法在30分鐘左右時間就可檢測到充分的擴增產物。因此，由于核酸檢測需要的時間被縮短，可以運用于以例如迅速確定治療方針為目的的向淋巴節的癌轉移的診斷。另外由于可以迅速得到結果，也有望可運用于術中診斷。
在對mRNA進行定量時，作為樣品中的內部對照，即可以使用認為雖然組織不同但表達量沒有差異的持家基因的mRNA。存在著通過使用該持家基因的mRNA作為內部對照，即使不考慮靶基因mRNA的提取效率或cDNA的合成效率也可以檢測相對的靶基因mRNA的優點。
作為持家基因例子，如作為細胞骨架構成成分的β-肌動蛋白的基因和作為糖酵解主要酶的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(以下稱為「GAPDH」)基因。
關于作為內部對照目的使用的持家基因，期望開發出更有效的核酸擴增用引物。
(關于β-肌動蛋白基因)肌動蛋白是大量出現在所有真核細胞的蛋白質。該蛋白質在高等生物細胞中提供包括有絲分裂中的作用、運動性以及結構完全性在內的很多結構和調節的功能。在脊椎動物中已鑒定有6個肌動蛋白的同工型，其中4個為肌肉型(骨骼肌、心肌、大動脈型平滑肌和胃型平滑肌的肌動蛋白)和2個非肌肉型(細胞質的β-肌動蛋白和γ-肌動蛋白)。肌肉肌動蛋白存在組織特異性，參與肌肉的收縮。與之相反，細胞質肌動蛋白基本上出現在所有細胞中，與許多細胞功能有關。細胞內存在的肌動蛋白盡管存在多樣性，但氨基酸序列在肌動蛋白的類型和真核生物的種間高度保守。
人的細胞質β-肌動蛋白基因的序列已經確定，并已與其它種類的β-肌動蛋白基因進行了比較(Nakajima-Iijima，et.al.PNAS 82，p.6133-6137(1985)、歐洲專利申請第0174608號、Ponte et.al.1984.Nucleic Acids Res.12，p.1687-1696(1984))。用于擴增人β-肌動蛋白基因整體的引物來自Clontech Laboratories(Clontech Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)的以MAPPING Amplimershito β-肌動蛋白用的商品名在市場銷售。而關于與人β-肌動蛋白的核苷酸序列進行種特異性雜交的寡核苷酸，有報道將這些寡核苷酸作為核酸擴增反應中的內部對照，以及用作決定核酸擴增反應中使用的樣品的完全性的手段(特開平7-99981)。
(關于GAPDH基因)人甘油醛-3-磷酸是生物體內糖酵解、戊糖磷酸循環等糖代謝以及脂質合成中的重要中間體之一，廣泛分布于人體內。另外為了由該物質合成脂質，需要人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，所以該酶也廣泛分布于人體內。
關于作為內部對照目的使用的β-肌動蛋白和GAPDH，期望開發更有效的核酸擴增用引物。
(專利文獻1)國際公開第WO 00/28082號公報(非專利文獻1)Bioventure、2001年、Vol.1，No.1，p.109-115(非專利文獻2)BIO INDUSTRY、2001年、Vol.18，No.2，p.15-29發明的內容本發明的目的在于提供用于持家基因mRNA檢測的核酸擴增用引物，具體來說是提供用于擴增β-肌動蛋白基因或GAPDH基因的mRNA的新的引物。
(用于解決課題的手段)本發明人等為了解決上述課題進行了深入地研究，結果可以構建持家基因用核酸擴增用引物。
即本發明包括以下內容1.一種用于通過LAMP法對與持家基因和/或持家基因相關的mRNA進行檢測的核酸擴增用引物。
2.上述1所述的核酸擴增用引物，其中持家基因是β-肌動蛋白基因或GAPDH基因。
3.含有選自以下組的序列構成的寡核苷酸的用于β-肌動蛋白檢測的核酸擴增用引物；1)由序列1所示堿基序列的第240～380位、或第401～1060位的區域和/或其互補鏈的區域選擇的，至少含有5個以上的序列1或其互補鏈的連續堿基的寡核苷酸。
2)由序列2或4～34中任一個所示堿基序列構成的寡核苷酸。
3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈。
4)在嚴格條件下可與上述1)～3)中任一個所述的寡核苷酸雜交的寡核苷酸。
5)含有在上述1)～4)所述寡核苷酸中1個至數個堿基被變異(置換、缺失、插入或付加)的堿基序列在內的具有引物功能的寡核苷酸。
4.由從序列10和14～17、29～50的序列表示的堿基序列中選擇的任一個寡核苷酸構成的用于β-肌動蛋白檢測的核酸擴增用引物。
5.含有由以下組中選擇的序列構成的寡核苷酸的用于GAPDH檢測的核酸擴增用引物；1)含有由序列51所示堿基序列的第110～450位的區域和/或其互補鏈區域選擇的序列51或其互補鏈的至少5個以上連續堿基的寡核苷酸。
2)由序列52～79任一個所示堿基序列構成的寡核苷酸。
3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈。
4)在嚴格條件下可與上述1)～3)中任一個所述寡核苷酸雜交的寡核苷酸。
5)含有在上述1)～4)所述寡核苷酸中1個至數個堿基被變異(置換、缺失、插入或付加)的堿基序列的具有引物功能的寡核苷酸。
6.由從序列58和62～64、73～96的序列表示的堿基序列中選擇的任一個寡核苷酸構成的用于GAPDH檢測的核酸擴增用引物。
7.上述3～6項任一項所述的核酸擴增用引物，其中核酸擴增手段是LAMP法。
8.一種用于β-肌動蛋白檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有由以下各組選擇的序列構成的寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇2種。
1)含有從序列1所示堿基序列的第240～1060位的區域和/或其互補鏈選擇的序列1或其互補鏈的至少5個以上連續堿基的寡核苷酸。
2)由序列2～34所示堿基序列構成的寡核苷酸。
3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈。
4)在嚴格條件下可與上述1)～3)中任一個所述寡核苷酸雜交的寡核苷酸。
5)包含在上述1)～4)所述寡核苷酸中1個至數個堿基被變異(置換、缺失、插入或付加)的堿基序列的具有引物功能的寡核苷酸。
9.一種用于β-肌動蛋白檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有上述8所述寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇4種。
10.上述8或9所述的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組中含有的引物中至少2種識別序列1所示堿基序列和/或其互補鏈的各2處的基因區域。
11.上述9或10所述的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組中含有的引物識別序列1所示堿基序列和/或其互補鏈中的至少6個基因區域。
12.由序列10和14～17、29～32、35～42和43～50所示的堿基序列的寡核苷酸構成的用于β-肌動蛋白檢測的核酸擴增用引物，該引物是從(a)FIP序列35～42、(b)RIP序列43～50、(c)F3序列10和14～17、和(d)R3序列29～32各個分類中各選擇1個引物組合后的引物組。
13.在上述12所述的引物組中，作為引物還含有序列33和34所示堿基序列的寡核苷酸的引物組。
14.用于GAPDH檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有上述5所述寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇2種。
15.用于GAPDH檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有上述5所述寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇4種。
16.上述14或15所述核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組中含有的引物中至少有2種識別序列51所示堿基序列和/或其互補鏈的各2處的基因區域。
17.上述14～16中任一項所述的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組含有的引物識別序列51所示堿基序列和/或其互補鏈的至少6個基因區域。
18.由序列80～96所示堿基序列的寡核苷酸構成的用于GAPDH檢測的核酸擴增用引物，其特征是含有由(a)FIP序列80～87、(b)RIP序列88～96各個分類選擇的1個引物的組合的引物組。
19.在上述18所述的被選擇的各引物組合中作為引物還含有序列58或序列62～64所示堿基序列的寡核苷酸中的任一個和序列73～77所示堿基序列的寡核苷酸中的任一個的引物組。
20.在上述18或19所述的引物組中作為引物還含有序列78和79所示堿基序列的寡核苷酸的引物組。
21.上述8～20任一項所述核酸擴增用引物組，核酸擴增手段為IAMP法。
22.由以下1)～12)中所示任一個構成的β-肌動蛋白檢測用的核酸擴增用引物組；1)作為引物，含有序列35、43、14和29所示堿基序列的寡核苷酸的引物組。
2)作為引物，含有序列36、44、15和30所示堿基序列的寡核苷酸的引物組。
3)作為引物，含有序列37、45、10和31所示堿基序列的寡核苷酸的引物組。
4)作為引物，含有序列41、50、17和32所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
5)作為引物，含有序列38、45、10和31所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
6)作為引物，含有序列39、45、10和31所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
7)作為引物，含有序列40、45、16和31所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
8)作為引物，含有序列41、45、16和31所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
9)作為引物，含有序列37、46、16和31所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
10)作為引物，含有序列37、47、16和31所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
11)作為引物，含有序列37、48、16和31所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
12)作為引物，含有序列37、49、16和31所示堿基序列の寡核苷酸引物組、23.由以下1)～16)中所示的任一個構成的用于GAPDH檢測的核酸擴增用引物組；1)作為引物含有序列80、88、62和73所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
2)作為引物，含有序列81、89、63和75所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
3)作為引物，含有序列86、95、58和76所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
4)作為引物，含有序列87、96、64和77所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
5)作為引物，含有序列81、89、62和75所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
6)作為引物，含有序列82、89、62和75所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
7)作為引物，含有序列83、89、63和75所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
8)作為引物，含有序列83、89、62和75所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
9)作為引物，含有序列84、89、62和75所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
10)作為引物，含有序列85、89、62和75所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
12)作為引物，含有序列81、90、63和75所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
13)作為引物，含有序列81、91、63和75所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
14)作為引物，含有序列81、92、63和75所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
15)作為引物，含有序列81、93、63和75所示堿基序列的寡核苷酸引物組。
16)作為引物，含有序列81、94、63和75所示堿基序列の寡核苷酸引物組、
24.至少使用一個上述1～7中任一項所述的引物進行的核酸檢測方法、25.使用上述8～23中任一項所述的引物組進行的核酸檢測方法、26.上述24或25所述的核酸檢測方法中使用的試劑和/或試劑盒、27.利用上述24或25所述的核酸檢測方法的核酸檢測系統。
附圖的簡單說明

圖1是表示使用本發明β-肌動蛋白用引物時的靈敏度的圖(實驗例2)，圖2是表示在LS180細胞和Raji細胞培養液中使用本發明β-肌動蛋白用引物進行測定時的結果(實驗例3)圖。
圖3是表示使用本發明GAPDH用引物時的靈敏度的圖(實驗例5)、圖4是表示在LS180細胞和Raji細胞培養液中使用本發明GAPDH用引物進行測定時的結果(實驗例6)圖。
發明的
具體實施例方式
(引物的設計)本發明目的在于提供持家基因的核酸擴增法、更具體地說是提供可適用于β-肌動蛋白基因或GAPDH基因的mRNA的核酸擴增法的核酸擴增用引物。
在LAMP法中使用的引物的基本思路就象專利文獻1所述那樣。
具體來說，由要擴增的靶DNA的3’末端側開始依次規定稱為F3c、F2c、F1c的區域，由5’末端側開始依次規定稱為R3、R2、R1的區域，至少對于這6個區域，選擇實質上含有同一堿基序列、或實質上含有互補堿基序列的寡核苷酸鏈，至少設計4種引物。
所謂實質上同一堿基序列定義如下。即，以某一堿基序列為模板合成的互補鏈與目的堿基序列雜交，給出互補鏈合成的起點時，該序列相對于目的堿基序列實質上是同一序列。例如，所謂對于F2實質上同一的堿基序列，除了與F2完全同一的堿基序列外，還包括與F2雜交，具有作為給出可成為互補鏈合成起點的堿基序列的模板功能的堿基序列。
根據本發明，用于賦予構成寡核苷酸的堿基序列的特征中使用的同一、或互補的用語無論哪一個都不需要完全同一、或完全互補。即，所謂與某一序列同一也包括對可與某一序列雜交的堿基序列互補的序列。而，所謂互補的序列指的是在嚴格條件下可進行雜交，可提供成為互補鏈合成起點的3’末端的序列。
本發明的引物具有在以下所述的各種核酸合成反應中在所給予的環境下，一方面維持必要的特異性，一方面可與互補鏈進行堿基對結合的程度的鏈長。具體來說，做成5～200堿基、最好是10～50堿基對。由于催化依賴于序列的核酸合成反應的眾所周知的聚合酶識別的引物鏈長最低為5個堿基左右，進行雜交的部分的鏈長必需為5個堿基以上。此外，為了維持作為堿基序列的特異性，希望維持在10個堿基以上的長度。另一方面，由于過長堿基序列通過化學合成制備困難，所以舉出上述那樣的希望的范圍。
本發明中使用的所謂模板的用語指的是成為互補鏈合成的模板的一側的核酸。具有與模板互補的堿基序列的互補鏈具有作為可與模板雜交的鏈的意思，兩者的關系只不過始終是相對的關系。就是說，作為互補鏈合成的鏈可以起到再作為模板的功能。即，互補鏈可以變成模板。
在本發明中，由靶DNA堿基序列選擇的引物構成各個FIP(正向內引物，forward inner primer)、F3引物(正向外引物，forward outerprimer)、RIP(反向內引物，reverse inner primer)和R3引物(反向外引物，reverse outer primer)中的任一個。
FIP設計成在3’末端具有與靶DNA的F2c區域實質上互補的F2區域的堿基序列，在5’末端具有與靶DNA的F1c區域實質上相同的堿基序列。在這種情形下，在F2和F1c的序列間也可以含有不依賴于靶DNA的序列。不依賴于該靶DNA的序列的長度可容許為0～50堿基、優選是0～40堿基。
F3引物可以設計為具有與F3區域實質上相同的堿基序列，而F3區域實質上與靶DNA的F3c區域互補。
RIP可以設計為在3’末端具有與靶DNA的R2c區域實質上互補的R2區域的堿基序列，在5’末端具有與靶DNA的R1c區域實質上相同的堿基序列。RIP也與FIP同樣，在R2和R1c的序列間可以含有不依賴于靶DNA的序列。
R3引物可以設計為具有與R3區域實質上相同的堿基序列，而R3區域實質上與靶DNA的R3c區域互補。
另外在LAMP法中，通過并用至少1種以上的回環引物，可以縮短擴增時間(國際公開WO 02/24902號公報)。所謂回環引物指的是啞鈴構造的5’末端側的回環的單鏈部分，具體來說，例如在R1區域和R2區域間、或F1區域和F2區域間具有互補的序列的引物。通過使用回環引物，可以增加DNA合成的起點。該回環引物設計成在DNA合成過程中可與生成的FIP或RIP不雜交的回環區域進行雜交。
為了構建上述引物，選擇的基因區域要注意堿基組成、GC含量、二級結構、Tm值等，識別DNA區域的堿基序列長度可以選擇堿基數至少在5個堿基以上、最好是10～30個堿基、更理想的是17～25個堿基的堿基序列。Tm值一般可以通過Nearest Neighbor法求出。DNA區域可以選擇Tm值為55～65℃、最好是58～64℃、GC含量為40～70％、最好是50～65％的區域。
本發明的引物也根據上述原理選擇區域、進行設計。
在本發明中可選擇的β-肌動蛋白基因的區域包括在序列1所示堿基序列的第240～1060位和/或其互補鏈的區域、最好是第240～380位或第401～1060位、更理想的是第740～990位的區域和/或該互補鏈的區域。
本發明中β-肌動蛋白檢測用引物是1)序列1所示堿基序列的第240～1060位、最好是第240～380位或第401～1060位、更理想的是第740～990位的區域和/或該互補鏈的區域，堿基數至少在5個以上的寡核苷酸，2)由序列2～50所示堿基序列構成的寡核苷酸、3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈、4)在嚴格條件下可與上述1)～3)中任一個所述寡核苷酸雜交的寡核苷酸、或、5)含有上述1)～4)中所述寡核苷酸中1個至數個堿基被變異(置換、缺失、插入或付加)的堿基序列的寡核苷酸，可從中選擇、設計用作引物。
而本發明中可選擇的GAPDH基因的區域包括在序列51所示堿基序列的第110～450位的區域和/或該互補鏈的區域。
本發明中的GAPDH的引物是1)序列51所示堿基序列的第110～450位的區域和/或該互補鏈的區域，堿基數至少在5以上的寡核苷酸，2)由序列52～96所示堿基序列構成的寡核苷酸、3)上述1)或2)所述的寡核苷酸的互補鏈、4)在嚴格條件下可與上述1)～3)中任一個所述的寡核苷酸雜交的寡核苷酸、或、5)含有上述1)～4)中所述寡核苷酸中1個至數個堿基被變異(置換、缺失、插入或付加)的堿基序列的寡核苷酸，可從中選擇、設計用作引物。
寡核苷酸可以通過眾所周知的方法制造，例如可以通過化學合成制造。或者通過限制性內切酶等切天然核酸，可以使之變成或連接成上述那樣的堿基序列的構成。具體來說，可以通過寡核苷酸合成裝置(Applied Biosystems公司生產Expedite Model 8909 DNA合成儀)等進行合成。另外、變異(置換、缺失、插入或付加)1至數個堿基的寡核苷酸的合成法也可以使用眾所周知的制造方法。另外，可以單獨或適當組合使用部位特異的變異導入法、基因同源重組法、引物延伸法或PCR法，例如根據Molecular Cloning；A Laboratory Manual、2版、Sambrook等人編、Cold Spring Harbor Laboratory Prss，ColdSpring Harbor，New York，1989年；[Laboratory Manual基因工程]、村松正實編、丸善株式會社、1988年；[PCR Technology、DNA擴增的原理和應用]、Ehrlich，HE.編、Stockton Press、1989年等記載的方法，或改變的這些方法實施，例如可以利用Ulmer的技術(Science(1983)219666)。
嚴格雜交條件可以選擇一般都知道的條件。舉一個例子，在含有50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉、pH7.6、5×Denhardt溶液、10％葡聚糖硫酸酯、和20μg/ml的DNA的溶液中，于42℃下雜交過夜后，于室溫下在2×SSC的0.1％SDS中洗一次，然后在約65℃下用0.1×SSC的0.1％SDS洗二次的條件。
在本發明應當被擴增的核酸的模板由于是持家基因的mRNA，使用的引物需要設計成不擴增檢體中含有的基因組DNA。具體來說，希望本發明引物組中含有的至少一個引物是包含橫跨例如β-肌動蛋白或GAPDH的基因中多個外顯子區域的引物。可以通過想辦法將來自基因組DNA序列的擴增排除，有選擇地擴增來自β-肌動蛋白或GAPDH的mRNA的序列。
(引物組)使用本發明引物進行核酸擴增時，將至少2種引物組合作為引物組使用。在LAMP法中、將至少4種引物(FIP、F3引物、RIP、R3引物)組合后作為引物組使用。另外也可以組合1種以上回環引物作為引物組使用。
(RT-LAMP法)RT-LAMP法是以RNA為模板的LAMP法，LAMP法的基本思路就象專利文獻1所述那樣。在RT-LAMP法中，在一個溶液中一方面由模板RNA合成cDNA，一方面合成了LAMP法的起點結構。具體來說，以下的1)步驟后、通過反復進行2)～5)步驟、反復進行DNA延伸，進行靶DNA的擴增。
1)FIP結合模板RNA鏈，與模板RNA鏈互補的DNA鏈延伸。該反應使用逆轉錄酶、例如來自AMV的逆轉錄酶等。
2)F3引物將上述1)中合成的從FIP開始的DNA鏈從模板RNA剝下，與模板RNA鏈互補的DNA鏈延伸。以后DNA鏈的延伸由DNA聚合酶催化進行。
3)RIP與上述2)中剝下的DNA鏈結合后DNA鏈延伸。
4)R3引物將上述3)中延伸的由RIP開始的DNA鏈剝下，與來自FIP的DNA鏈互補的DNA鏈延伸，合成LAMP法的起點結構。
5)在上述4)中被剝下的DNA鏈兩端序列由于在同樣DNA鏈序列中含有互補的序列，各自進行雜交，兩端具有回環結構。
另外，存在著例如象BcaDNA聚合酶那樣具有逆轉錄酶活性和DNA聚合酶活性兩者活性的酶，使用這樣的酶時，上述反應可以通過一個酶實施。
(測定方法)在LAMP法中，由于合成的DNA鏈具有與自身序列互補的序列，所以其大部分可形成堿基對結合。利用該特征，可以進行擴增產物的檢測。在溴化乙錠、SYBER GREEN I、或Pico Green那樣的雙鏈嵌入劑(インタ一カ一レ一タ一)熒光色素的存在下，使用本發明引物實施核酸擴增，可以觀察到隨著產物増加，熒光強度増大的現象。對該現象進行監測，可同時追蹤在閉鏈系中DNA的擴增和熒光的增加(臨床檢查法提要、31版1318頁；特開2001-242169號公報參照。以下簡單稱為「實時(real time)法」。)。
(試劑、試劑盒等)使用本發明引物進行核酸檢測時需要的各種試劑類可以預先進行包裝，做成試劑盒。具體來說、可以將作為本發明的互補鏈合成引物，或作為置換用的引物所必需的各種寡核苷酸、具有逆轉錄活性的酶、成為互補鏈合成的底物的dNTP、進行鏈置換型的互補鏈合成的DNA聚合酶、賦予酶反應合適條件的緩沖液、以及根據需要用于反應生成物檢測所必需的試劑類做成試劑盒提供。
本發明涉及到核酸擴增用引物和引物組、以及使用這些引物的核酸檢測方法、核酸檢測方法中使用的檢測試劑、核酸檢測試劑盒和核酸檢測系統整體。
(實施例)以下、通過實施例對本發明進行具體說明，但本發明并不限定于這些實施例。
(實施例1)β-肌動蛋白基因區域的選擇由序列1記載的堿基序列，使用探針設計軟件研究適合LAMP法的β-肌動蛋白基因區域的位置。基因區域的選擇，F1c和R1c通過Tm值為58.5～63.5℃、F2和R2通過Tm值為61.5～62.5℃、F3和R3通過Tm值為58.5～62.5℃選擇基因區域，結果選擇了如下所示序列1記載的堿基序列上第240～1060位區域和其互補鏈的區域中含有的序列。
F1c位于序列1記載序列的互補鏈中的基因區域343-327 5′-tggccttgggttcagg-3′ (序列2)400-381 5′-cgtacatggctggggtgttg-3′ (序列3)822-803 5′-gatgccacaggactccatgc-3′ (序列4)838-817 5′-tgaaggtagtttcgtggatgcc-3′ (序列5)922-904 5′-cagggtacatggtggtgcc-3′(序列6)F2序列1記載的序列上的基因區域265-284 5′-accttctacaatgagctgcg-3′ (序列7)341-357 5′-ccaaccgcgagaagatg-3′ (序列8)748-766 5′-attggcaatgagcggttcc-3′(序列9)750-766 5′-tggcaatgagcggttcc-3′ (序列10)774-790 5′-tgaggcactcttccagc-3′ (序列11)782-799 5′-tcttccagccttccttcc-3′ (序列12)851-868 5′-agtgtgacgtggacatcc-3′ (序列13)
F3序列1記載的序列上的基因區域240-259 5′-cgacatggagaaaatctggc-3′ (序列14)274-290 5′-aatgagctgcgtgtggc-3′ (序列15)718-734 5′-tacgagctgcctgacgg-3′ (序列16)750-766 5′-tggcaatgagcggttcc-3′ (序列10)818-837 5′-gcatccacgaaactaccttc-3′ (序列17)R1c序列1記載的序列上的基因區域346-366 5′-cgcgagaagatgacccagatc-3′ (序列18)402-423 5′-tgctatccaggctgtgctatcc-3′ (序列19)848-868 5′-tgaagtgtgacgtggacatcc-3′ (序列20)857-876 5′-acgtggacatccgcaaagac-3′ (序列21)925-945 5′-attgccgacaggatgcagaag-3′ (序列22)R2處于序列1記載的序列的互補鏈中的基因區域414-396 5′-agcctggatagcaacgtac-3′(序列23)461-444 5′-tccatcacgatgccagtg-3′ (序列24)921-905 5′-agggtacatggtggtgc-3′ (序列25)925-909 5′-tgccagggtacatggtg-3′ (序列26)929-911 5′-gcaatgccagggtacatgg-3′(序列27)1011-994 5′-gtacttgcgctcaggagg-3′ (序列28)R3處于序列1記載的序列的互補鏈中的基因區域454-438 5′-cgatgccagtggtacgg-3′ (序列29)497-480 5′-tagatgggcacagtgtgg-3′ (序列30)947-930 5′-tccttctgcatcctgtcg-3′ (序列31)1059-1043 5′-ctggaaggtggacagcg-3′ (序列32)loop F處于序列1記載的序列的互補鏈中的基因區域816-801 5′-acaggactccatgccc-3′ (序列33)loop R序列1記載的序列上的基因區域878-895 5′-tgtacgccaacacagtgc-3′ (序列34)
(實施例2)β-肌動蛋白用引物的設計從選擇區域的序列得到適用于LAMP法的β-肌動蛋白用的如下核酸擴增用引物。
FIP(連接區域F1c的堿基序列和F2的堿基序列的引物)AFA-1 (序列35)連接序列2和7的序列AFA-2 (序列36)連接序列3和8的序列AFA-4 (序列37)連接序列5和11的序列AFA-4a (序列38)連接序列5和12的序列AFA-4c (序列39)連接序列5和10的序列AFA-4d (序列40)連接序列4和9的序列AFA-4e (序列41)連接序列4和10的序列AFA-6 (序列42)連接序列6和13的序列RIP(連接區域R1c的堿基序列和R2的堿基序列的引物)ARA-1 (序列43)連接序列18和23的序列ARA-2 (序列44)連接序列19和24的序列ARA-4 (序列45)連接序列20和25的序列ARA-4a (序列46)連接序列20和27的序列ARA-4b (序列47)連接序列20和26的序列ARA-4d (序列48)連接序列21和27的序列ARA-4e (序列49)連接序列21和26的序列ARA-6 (序列50)連接序列22和28的序列F3引物(與F3區域的堿基序列同一的序列)AF3-1 (序列14)AF3-2 (序列15)AF3-4 (序列10)AF3-6 (序列17)AF3-9 (序列16)R3引物(與R3區域的堿基序列同一的序列)AR3-1 (序列29)
AR3-2 (序列30)AR3-4 (序列31)AR3-6 (序列32)回環引物(與loop F或loop R區域的堿基序列同一的序列)AD-LPF1 (序列33)AD-LPR1 (序列34)(實施例3)GAPDH基因區域的選擇由序列51記載堿基序列，利用探針設計軟件研究適合于LAMP法的GAPDH基因區域的位置。基因區域的選擇，F1c和R1C通過Tm值為58.5～63.5℃、F2和R2通過Tm值為61.5～62.5℃、F3和R3通過Tm值為58.5～62.5℃選擇基因區域，結果選擇了如下所示的序列51記載的堿基序列上第110～450位的區域含有的序列。
F1c位于序列51記載的序列的互補鏈中的基因區域213-192 5′-tccattgatgacaagcttcccg-3′(序列52)236-217 5′-tcctggaagatggtgatggg-3′ (序列53)246-228 5′-gggatctcgctcctggaag-3′ (序列54)284-265 5′-acgtactcagcgccagcatc-3′ (序列55)335-316 5′-aaatgagccccagccttctc-3′ (序列56)F2序列51記載的序列上的基因區域152-169 5′-ccacccatggcaaattcc-3′(序列57)163-180 5′-aaattccatggcaccgtc-3′(序列58)179-195 5′-tcaaggctgagaacggg-3′ (序列59)217-235 5′-cccatcaccatcttccagg-3′ (序列60)276-293 5′-tgagtacgtcgtggagtc-3′(序列61)F3序列51記載的序列上的基因區域103-120 5′-gaccccttcattgacctc-3′(序列62)
159-176 5′-tggcaaattccatggcac-3′ (序列63)163-180 5′-aaattccatggcaccgtc-3′ (序列58)227-244 5′-tcttccaggagcgagatc-3′ (序列64)R1c序列51記載的序列上的基因區域216-235 5′-tcccatcaccatcttccagg-3′ (序列65)248-268 5′-ccaaaatcaagtggggcgatg-3′ (序列66)254-271 5′-tcaagtggggcgatgctg-3′ (序列67)305-323 5′-tcaccaccatggagaaggc-3′(序列68)338-354 5′-aggggggagccaaaagg-3′ (序列69)R2處于序列51記載的序列的互補鏈上的基因區域295-279 5′-tggactccacgacgtac-3′ (序列70)305-289 5′-aagacgccagtggactc-3′ (序列71)310-294 5′-tggtgaagacgccagtg-3′ (序列72)324-308 5′-agccttctccatggtgg-3′ (序列73)327-311 5′-cccagccttctccatgg-3′ (序列74)365-346 5′-gagatgatgacccttttggc-3′ (序列75)399-383 5′-catgacgaacatggggg-3′ (序列76)R3處于序列51記載的序列的互補鏈上的基因區域324-308 5′-agccttctccatggtgg-3′ (序列73)365-346 5′-gagatgatgacccttttggc-3′ (序列75)399-383 5′-catgacgaacatggggg-3′ (序列76)445-426 5′-tgctgatgatcttgaggctg-3′ (序列77)loop F處于序列51記載的序列的互補鏈上的基因區域227-212 5′-atggtgatgggatttc-3′ (序列78)loop R序列51記載的序列上的基因領域275-293 5′-ctgagtacgtcgtggagtc-3′(序列79)(實施例4)GAPDH引物的設計從選擇的區域的序列得到適用于LAMP法的GAPDH用的以下核酸擴增用引物。
FIP(連接區域F1c的堿基序列和F2的堿基序列的引物)FA-2 (序列80)連接序列52和57的序列FA-3 (序列81)連接序列54和59的序列FA-3b (序列82)連接序列54和58的序列FA-3d (序列83)連接序列53和59的序列FA-3e (序列84)連接序列53和58的序列FA-3g (序列85)連接序列53和57的序列FA-5 (序列86)連接序列55和60的序列FA-7 (序列87)連接序列56和61的序列RIP(連接區域R1c的堿基序列和R2的堿基序列的引物)RA-2 (序列88)連接序列65和80的序列RA-3 (序列89)連接序列67和83的序列RA-3a (序列90)連接序列67和84的序列RA-3b (序列91)連接序列67和82的序列RA-3c (序列92)連接序列67和81的序列RA-3d (序列93)連接序列66和83的序列RA-3e (序列94)連接序列66和84的序列RA-5 (序列95)連接序列68和75的序列RA-7 (序列96)連接序列69和76的序列F3(與F3領域的堿基序列同一的序列)F3-3 (序列63)F3-4 (序列68)F3-6 (序列64)F3-8 (序列62)R3(與R3區域的堿基序列同一的序列)R3-2 (序列73)R3-3 (序列75)R3-5 (序列76)
R3-7 (序列77)回環引物(與loop F或loop R區域的堿基序列同一的序列)GC-LPF1(序列78)GC-LPR1(序列79)(實驗例1)對使用以表1各組合的實施例2記載的β-肌動蛋白用引物利用RT-LAMP法從開始反應后直至確認擴增為止所需要的時間進行研究。
1)人β-肌動蛋白的mRNA樣品作為人β-肌動蛋白的模板使用市售的人總RNA(來自Raji細胞、ABI公司生產)。
2)β-肌動蛋白用引物各引物使用(表1)的組合。
(表1)引物組和擴增確認時間

3)反應液組成dNTPs(GIBCO公司生產) 0.4mMMgSO42mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol) 5mM甜菜堿(betaine)(Sigma公司生產) 640mMThermopol buffer(New England BioLabs公司生產)AMV逆轉錄酶(Promega公司生產) 1.25UBst DNA聚合酶(New England BioLabs公司生產) 16U溴化乙錠(ethidium bromide) 0.125mg/ml各引物FIP 40pmol、RIP 40pmolF3引物 5pmol、 R3引物 5pmol4)RT-LAMP法向含有上述4種引物的反應液23μl中添加RNA樣品2μl(含有20ng的人總RNA)，于65℃加溫1小時。
5)擴增的確認擴增產物由于具有雙鏈結構，溴化乙錠嵌入后發熒光。該熒光強度的增加用ABI公司生產PRISM7700通過實時(real time)法進行測定。
6)結果表1給出了使用各引物組反應時直至確認β-肌動蛋白擴增為止的時間。該結果表明，確認擴增在各引物組中最大為45分，大多數情形是在30分以內。
(實驗例2)在實驗例1中研究的β-肌動蛋白用引物組中選擇確認在最短時間擴增的引物組，再使用組合有回環引物的引物組，研究利用RT-LAMP法測定時的靈敏度。
1)人β-肌動蛋白的mRNA樣品與實驗例1同樣進行。
2)引物組(表2)引物組

3)反應液組成向與實驗例1同樣的組成中再加入終濃度各為5pmol的F3回環引物和R3回環引物。
4)RT-LAMP法與實驗例1同樣進行。向含有上述6種引物的反應液23μl中添加RNA樣品2μl(含有20ng的人總RNA)，于65℃加溫1小時。
5)擴增的確認與實驗例1同樣進行。
6)結果圖1給出了研究結果。該結果表明，β-肌動蛋白基因的mRNA模板量越多，越可確認在短時間擴增。即使在模板量為0.02ng時30分以內也確認擴增，模板量為20ng時15分左右可確認擴增。
(實驗例3)研究在LS180細胞(大腸癌細胞株)和Raji細胞(Burkitt淋巴瘤細胞株)的培養細胞中進行β-肌動蛋白的擴增。
即、對于細胞角蛋白為陽性的LS180細胞溶液以及細胞角蛋白在用陰性的Raji細胞溶液稀釋情形的各濃度LS180細胞溶液樣品中進行β-肌動蛋白的擴增進行研究，研究在測定細胞角蛋白的腫瘤標志時作為數據修正對照能否使用β-肌動蛋白。
1)樣品制備LS180細胞和Raji細胞的總細胞數為8000的樣品。使總細胞數8000中的LS180細胞數為8000、800、80、8和0。
2)β-肌動蛋白用引物選擇與實驗例2同樣的引物。
3)反應液組成使用與實驗例2同樣組成的反應液。
4)RT-LAMP法與實驗例2同樣進行。
5)核酸的檢測與實驗例2同樣向含有6種引物的反應液23μl中添加2μl細胞的懸浮液，于65℃加溫1小時。
6)結果結果如圖2所示。其結果即使當LS180細胞和Raji細胞的比率不同時，β-肌動蛋白在15分左右也可確認擴增。該結果表明，不管有無腫瘤標志，也可確認在人細胞中β-肌動蛋白進行了組成表達，β-肌動蛋白可以作為LAMP法中數據修正的對照使用。
(實驗例4)對以表3記載的各組合使用實施例4記載的GAPDH用引物，利用RT-LAMP法從反應開始后直至確認擴增為止需要的時間進行研究。
1)GAPDH的mRNA樣品作為GAPDH的模板使用市售的人總RNA(來自Raji細胞、ABI公司生產)。
2)GAPDH用引物各引物使用(表3)的組合引物。
(表3)引物組和擴增確認時間

3)反應液組成使用與實驗例1同樣組成的反應液。
4)RT-LAMP法與實驗例1同樣進行。向含有上述4種引物的反應液23μl中添加RNA樣品2μl(含有20ng的人總RNA)、于65℃下加溫1小時。
5)擴增的確認與實驗例1同樣進行。
6)結果表3給出了使用各引物組反應時直至確認GAPDH擴增為止的時間。其結果表明，擴增在各引物組中最大為45分，大部分情形在30分以內。
(實驗例5)實驗例4中研究的GAPDH用引物組中，選擇在最短時間內確認擴增的引物組，再使用組合有回環引物的引物組，研究通過RT-LAMP法進行測定時的靈敏度。
1)人GAPDH的mRNA樣品作為GAPDH模板、使用市售人總RNA(來自Raji細胞、ABI公司生產)。
2)引物組(表4)引物組

3)反應液組成使用與實驗例2同樣組成的反應液。
4)RT-LAMP法與實驗例2同樣進行。
5)核酸的檢測與實驗例2同樣進行。
6)結果圖3給出了研究結果。該結果表明，GAPDH的mRNA模板量越多，確認越可在短時間擴增。而且即使模板量為0.02ng時也可確認在30分以內進行了擴增，模板量為20ng時可確認10分左右就擴增了。
(實驗例6)在LS180細胞(大腸癌細胞株)和Raji細胞(Burkitt淋巴瘤細胞株)的培養細胞中進行GAPDH擴增研究。
即，對于細胞角蛋白在用陽性的LS180細胞溶液以及細胞角蛋白用陰性的Raji細胞溶液稀釋的情形的各濃度LS180細胞溶液樣品中進行GAPDH擴增的研究，研究作為數據修正的對照在測定細胞角蛋白的腫瘤標志時能否使用GAPDH。
1)樣品制備LS180細胞和Raji細胞的總細胞數為8000的樣品。使總細胞數8000中的LS180細胞數為8000、800、80、8和0。
2)GAPDH用引物組選擇與實驗例5同樣的引物組。
3)反應液組成使用與實驗例2同樣組成的反應液。
4)RT-LAMP法與實驗例2同樣進行。向與實驗例5同樣的含有6種引物反應液23μl中添加細胞懸浮液2μl，于65℃加溫1小時。
5)核酸的檢測與實驗例2同樣進行。
6)結果圖4給出了實驗結果。該結果表明，即使LS180細胞和Raji細胞的比率不同時，也可確認GAPDH10分左右擴增。這表明，不管有無腫瘤標志，都可確認人細胞中GAPDH進行了組成表達，作為LAMP法中的數據修正對照可以使用GAPDH。
產業上利用的可能性就象以上說明的那樣，如果使用本發明的引物或引物組，實施LAMP法，最快時，15分以內就可確認β-肌動蛋白或GAPDH的擴增。
另外不管有無細胞角蛋白那樣的腫瘤標志，可知通過確認來自人細胞的β-肌動蛋白或GAPDH的存在，可以使用他們作為LAMP法中數據修正的對照。
所以，使用本發明的引物、或引物組，在用核酸擴增手段進行癌轉移診斷時，可以縮短診斷需要的時間，是具有可靠性的診斷。
序列表<110>希森美康株式會社<120>用于持家基因mRNA檢測的核酸擴增用引物和使用該引物的檢查方法<130>GP02-1019<150>JP P2002-043866<151>2002-02-20<150>JP P2002-043867<151>2002-02-20<160>96<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1128<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1atggatgatg atatcgccgc gctcgtcgtc gacaacggct ccggcatgtg caaggccggc 60ttcgcgggcg acgatgcccc ccgggccgtc ttcccctcca tcgtggggcg ccccaggcac120cagggcgtga tggtgggcat gggtcagaag gattcctatg tgggcgacga ggcccagagc180aagagaggca tcctcaccct gaagtacccc atcgagcacg gcatcgtcac caactgggac240gacatggaga aaatctggca ccacaccttc tacaatgagc tgcgtgtggc tcccgaggag300caccccgtgc tgctgaccga ggcccccctg aaccccaagg ccaaccgcga gaagatgacc360cagatcatgt ttgagacctt caacacccca gccatgtacg ttgctatcca ggctgtgcta420
tccctgtacg cctctggccg taccactggc atcgtgatgg actccggtga cggggtcacc 480cacactgtgc ccatctacga ggggtatgcc ctcccccatg ccatcctgcg tctggacctg 540gctggccggg acctgactga ctacctcatg aagatcctca ccgagcgcgg ctacagcttc 600accaccacgg ccgagcggga aatcgtgcgt gacattaagg agaagctgtg ctacgtcgcc 660ctggacttcg agcaagagat ggccacggct gcttccagct cctccctgga gaagagctac 720gagctgcctg acggccaggt catcaccatt ggcaatgagc ggttccgctg ccctgaggca 780ctcttccagc cttccttcct gggcatggag tcctgtggca tccacgaaac taccttcaac 840tccatcatga agtgtgacgt ggacatccgc aaagacctgt acgccaacac agtgctgtct 900ggcggcacca ccatgtaccc tggcattgcc gacaggatgc agaaggagat cactgccctg 960gcacccagca caatgaagat caagatcatt gctcctcctg agcgcaagta ctccgtgtgg1020atcggcggct ccatcctggc ctcgctgtcc accttccagc agatgtggat cagcaagcag1080gagtatgacg agtccggccc ctccatcgtc caccgcaaat gcttctag 1128<210>2<211>16<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>2tggccttggg ttcagg 16
<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>3cgtacatggc tggggtgttg 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>4gatgccacag gactccatgc 20<210>5<211>22<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>5tgaaggtagt ttcgtggatg cc 22
<210>6<211>19<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>6cagggtacat ggtggtgcc 19<210>7<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>7accttctaca atgagctgcg 20<210>8<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>8ccaaccgcga gaagatg 17<210>9
<211>19<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>9attggcaatg agcggttcc 19<210>10<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>10tggcaatgag cggttcc 17<210>11<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>11tgaggcactc ttccagc 17<210>12<211>18
<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>12tcttccagcc ttccttcc18<210>13<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>13agtgtgacgt ggacatcc18<210>14<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>14cgacatggag aaaatctggc 20<210>15<211>17<212>DNA
<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>15aatgagctgc gtgtggc 17<210>16<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>Designed DNA based on beta-acitn<400>16tacgagctgc ctgacgg 17<210>17<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>17gcatccacga aactaccttc 20<210>18<211>21<212>DNA<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>18cgcgagaaga tgacccagat c21<210>19<211>22<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>19tgctatccag gctgtgctat cc 22<210>20<211>21<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>20tgaagtgtga cgtggacatc c21<210>21<211>20<212>DNA<213>人工合成序列
<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>21acgtggacat ccgcaaagac 20<210>22<211>21<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>22attgccgaca ggatgcagaa g21<210>23<211>19<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>23agcctggata gcaacgtac 19<210>24<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>24tccatcacga tgccagtg18<210>25<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>25agggtacatg gtggtgc 17<210>26<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>Designed DNA based on beta-acitn<400>26tgccagggta catggtg 17<210>27<211>19<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA
<400>27gcaatgccag ggtacatgg 19<210>28<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>28gtacttgcgc tcaggagg18<210>29<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>29cgatgccagt ggtacgg 17<210>30<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA
<400>30tagatgggca cagtgtgg18<210>31<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>31tccttctgca tcctgtcg18<210>32<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>32ctggaaggtg gacagcg 17<210>33<211>16<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>33
acaggactcc atgccc 16<210>34<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>34tgtacgccaa cacagtgc18<210>35<211>36<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>35tggccttggg ttcaggacct tctacaatga gctgcg36<210>36<211>37<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>36cgtacatggc tggggtgttg ccaaccgcga gaagatg 37
<210>37<211>39<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>37tgaaggtagt ttcgtggatg cctgaggcac tcttccagc 39<210>38<211>40<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>38tgaaggtagt ttcgtggatg cctcttccag ccttccttcc40<210>39<211>39<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>39tgaaggtagt ttcgtggatg cctggcaatg agcggttcc 39
<210>40<211>37<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>40gatgccacag gactccatgc tggcaatgag cggttcc 37<210>41<211>39<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>41gatgccacag gactccatgc attggcaatg agcggttcc 39<210>42<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>42gatgccacag gactccatgc agtgtgacgt ggacatcc 38
<210>43<211>40<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>43cgcgagaaga tgacccagat cagcctggat agcaacgtac40<210>44<211>40<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>44tgctatccag gctgtgctat cctccatcac gatgccagtg40<210>45<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>45tgaagtgtga cgtggacatc cagggtacat ggtggtgc 38<210>46
<211>40<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>46tgaagtgtga cgtggacatc cgcaatgcca gggtacatgg40<210>47<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>47tgaagtgtga cgtggacatc ctgccagggt acatggtg 38<210>48<211>39<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>48acgtggacat ccgcaaagac gcaatgccag ggtacatgg 39<210>49<211>37
<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>49acgtggacat ccgcaaagac tgccagggta catggtg 37<210>50<211>39<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于β肌動蛋白設計的DNA<400>50attgccgaca ggatgcagaa ggtacttgcg ctcaggagg 39<210>51<211>1008<212>DNA<213>人<400>51atggggaagg tgaaggtcgg agtcaacgga tttggtcgta ttgggcgcct ggtcaccagg 60gctgctttta actctggtaa agtggatatt gttgccatca atgacccctt cattgacctc120aactacatgg tttacatgtt ccaatatgat tccacccatg gcaaattcca tggcaccgtc180aaggctgaga acgggaagct tgtcatcaat ggaaatccca tcaccatctt ccaggagcga240gatccctcca aaatcaagtg gggcgatgct ggcgctgagt acgtcgtgga gtccactggc300
gtcttcacca ccatggagaa ggctggggct catttgcagg ggggagccaa aagggtcatc 360atctctgccc cctctgctga tgcccccatg ttcgtcatgg gtgtgaacca tgagaagtat 420gacaacagcc tcaagatcat cagcaatgcc tcctgcacca ccaactgctt agcacccctg 480gccaaggtca tccatgacaa ctttggtatc gtggaaggac tcatgaccac agtccatgcc 540atcactgcca cccagaagac tgtggatggc ccctccggga aactgtggcg tgatggccgc 600ggggctctcc agaacatcat ccctgcctct actggcgctg ccaaggctgt gggcaaggtc 660atccctgagc tgaacgggaa gctcactggc atggccttcc gtgtccccac tgccaacgtg 720tcagtggtgg acctgacctg ccgtctagaa aaacctgcca aatatgatga catcaagaag 780gtggtgaagc aggcgtcgga gggccccctc aagggcatcc tgggctacac tgagcaccag 840gtggtctcct ctgacttcaa cagcgacacc cactcctcca cctttgacgc tggggctggc 900attgccctca acgaccactt tgtcaagctc atttcctggt atgacaacga atttggctac 960agcaacaggg tggtggacct catggcccac atggcctcca aggagtaa 1008<210>52<211>22<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>52tccattgatg acaagcttcc cg 22
<210>53<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>53tcctggaaga tggtgatggg 20<210>54<211>19<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>54gggatctcgc tcctggaag 19<210>55<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>55acgtactcag cgccagcatc 20
<210>56<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>56aaatgagccc cagccttctc 20<210>57<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>57ccacccatgg caaattcc18<210>58<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>58aaattccatg gcaccgtc18<210>59
<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>59tcaaggctga gaacggg 17<210>60<211>19<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>60cccatcacca tcttccagg 19<210>61<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>61tgagtacgtc gtggagtc18<210>62<211>18
<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>62gaccccttca ttgacctc18<210>63<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>63tggcaaattc catggcac18<210>64<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>64tcttccagga gcgagatc18<210>65<211>20<212>DNA
<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>65tcccatcacc atcttccagg 20<210>66<211>21<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>66ccaaaatcaa gtggggcgat g21<210>67<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>67tcaagtgggg cgatgctg18<210>68<211>19<212>DNA<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>68tcaccaccat ggagaaggc 19<210>69<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>69aggggggagc caaaagg 17<210>70<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>70tggactccac gacgtac 17<210>71<211>17<212>DNA<213>人工合成序列
<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>71aagacgccag tggactc 17<210>72<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>72tggtgaagac gccagtg 17<210>73<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>73agccttctcc atggtgg 17<210>74<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>74cccagccttc tccatgg 17<210>75<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>75gagatgatga cccttttggc 20<210>76<211>17<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>76catgacgaac atggggg 17<210>77<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA
<400>77tgctgatgat cttgaggctg 20<210>78<211>16<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>78atggtgatgg gatttc 16<210>79<211>19<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>79ctgagtacgt cgtggagtc 19<210>80<211>40<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA
<400>80tccattgatg acaagcttcc cgccacccat ggcaaattcc40<210>81<211>36<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>81gggatctcgc tcctggaagt caaggctgag aacggg36<210>82<211>37<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>82gggatctcgc tcctggaaga aattccatgg caccgtc 37<210>83<211>37<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>83
tcctggaaga tggtgatggg tcaaggctga gaacggg 37<210>84<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>84tcctggaaga tggtgatggg aaattccatg gcaccgtc 38<210>85<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>85tcctggaaga tggtgatggg ccacccatgg caaattcc 38<210>86<211>39<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>86acgtactcag cgccagcatc cccatcacca tcttccagg 39
<210>87<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>87aaatgagccc cagccttctc tgagtacgtc gtggagtc 38<210>88<211>37<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>Desigend DNA based on GAPDH<400>88tcccatcacc atcttccagg tggactccac gacgtac 37<210>89<211>35<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>89tcaagtgggg cgatgctgag ccttctccat ggtgg 35
<210>90<211>35<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>90tcaagtgggg cgatgctgcc cagccttctc catgg 35<210>91<211>35<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>91tcaagtgggg cgatgctgtg gtgaagacgc cagtg 35<210>92<211>35<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>92tcaagtgggg cgatgctgaa gacgccagtg gactc 35
<210>93<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>93ccaaaatcaa gtggggcgat gagccttctc catggtgg 38<210>94<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>94ccaaaatcaa gtggggcgat gcccagcctt ctccatgg 38<210>95<211>39<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>95tcaccaccat ggagaaggcg agatgatgac ccttttggc 39<210>96
<211>34<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于GAPDH設計的DNA<400>96aggggggagc caaaaggcat gacgaacatg gggg 3權利要求
1.一種用于通過LAMP法對與持家基因和/或持家基因相關的mRNA進行檢測的核酸擴增用引物。
2.根據權利要求1所述的核酸擴增用引物，其中持家基因是β-肌動蛋白基因或GAPDH基因。
3.用于β-肌動蛋白檢測的核酸擴增用引物，含有由以下組中選出的序列構成的寡核苷酸1)由序列1所示堿基序列的第240～380位、或第401～1060位的區域和/或其互補鏈的區域選擇的含有序列1或其互補鏈的至少5個以上連續堿基的寡核苷酸；2)由序列2或4～34中任一個所示堿基序列構成的寡核苷酸；3)上述1)或2)記載的寡核苷酸的互補鏈；4)在嚴格條件下可與上述1)～3)中任一個記載的寡核苷酸雜交的寡核苷酸；5)含有前記1)～4)所述寡核苷酸中1個至數個堿基被置換、缺失、插入或付加變異的堿基序列的具有引物功能的寡核苷酸。
4.用于β-肌動蛋白檢測的核酸擴增用引物，是由選自序列10和序列14～17、29～50表示的堿基序列中的任一種寡核苷酸構成的。
5.用于GAPDH檢測的核酸擴增用引物，含有由以下組中選出的序列構成的寡核苷酸1)含有由序列51所示堿基序列的第110～450位的區域和/或其互補鏈區域選擇的序列51或其互補鏈的至少5個以上連續堿基的寡核苷酸；2)由序列52～79任一個所示堿基序列構成的寡核苷酸；3)上述1)或2)所述寡核苷酸的互補鏈；4)在嚴格條件下可與上述1)～3)中任一個所述寡核苷酸雜交的寡核苷酸；5)含有上述1)～4)所述寡核苷酸中1個至數個堿基被置換、缺失、插入或付加變異的堿基序列的具有引物功能的寡核苷酸。
6.用于GAPDH檢測的核酸擴增用引物，是由從序列58和序列62～64、73～96表示的堿基序列中任一個中選出的寡核苷酸構成的。
7.根據權利要求3～6項任一項所述核酸擴增用引物，其中核酸擴增手段是LAMP法。
8.一種用于β-肌動蛋白檢測的核酸擴增用引物組，其特征是由含有從以下組中選出的序列構成的寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇2種1)含有從序列1所示堿基序列的第240～1060位的區域和/或其互補鏈中選出的序列1或其互補鏈的至少5個以上連續堿基的寡核苷酸；2)由序列2～34所示堿基序列構成的寡核苷酸；3)上述1)或2)所述寡核苷酸的互補鏈；4)在嚴格條件下可與上述1)～3)中任一個所述寡核苷酸雜交的寡核苷酸；5)含有上述1)～4)所述寡核苷酸中1個至數個堿基被置換、缺失、插入或付加變異的堿基序列的具有引物功能的寡核苷酸。
9.一種用于β-肌動蛋白檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從含有權利要求8所述寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇4種。
10.根據權利要求8或9所述的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組所含有的引物中至少2種識別序列1所示堿基序列和/或其互補鏈的各2處基因區域。
11.根據權利要求9或10所述的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組中所含有的引物識別序列1所示堿基序列和/或其互補鏈中的至少6處基因區域。
12.引物組，是在由序列10和序列14～17、29～32、35～42和43～50所示堿基序列的寡核苷酸構成的用于β-肌動蛋白檢測的核酸擴增用引物中，從(a)FIP序列35～42、(b)RIP序列43～50、(c)F3序列10和14～17、和(d)R3序列29～32各個分類中選擇1個引物組合后而成的。
13.引物組，在權利要求12記載的的引物組中，作為引物還含有序列33和34所示堿基序列的寡核苷酸。
14.用于GAPDH檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從包含權利要求5所述寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇2種。
15.用于GAPDH檢測的核酸擴增用引物組，其特征是從包含權利要求5所述寡核苷酸的核酸擴增用引物中至少選擇4種。
16.權利要求14或15記載的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組中含有的引物中至少有2種識別序列51所示堿基序列和/或其互補鏈的各2處的基因區域。
17.權利要求14～16中任一項記載的核酸擴增用引物組，其特征是上述引物組所含有的引物識別序列51所示堿基序列和/或其互補鏈的至少6處基因區域。
18.引物組，是由序列80～96所示堿基序列的寡核苷酸構成的用于GAPDH檢測的核酸擴增用引物，其特征是含有由(a)FIP序列80～87、(b)RIP序列88～96各個分類選擇的1個引物的組合區域的。
19.引物組，在權利要求18所述的被選擇的各引物組合中，作為引物還含有序列58或序列62～64所示堿基序列的寡核苷酸中的任一個和序列73～77所示堿基序列的寡核苷酸中的任一個的。
20.引物組，在權利要求18或19所述的引物組中，作為引物還含有序列78和79所示堿基序列的寡核苷酸。
21.權利要求8～20任一項所述的核酸擴增用引物組，核酸擴增手段為LAMP法。
22.用于β-肌動蛋白檢測的核酸擴增用引物組，由以下1)～12)所示任一個構成1)作為引物含有序列35、43、14和29所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；2)作為引物含有序列36、44、15和30所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；3)作為引物含有序列37、45、10和31所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；4)作為引物含有序列41、50、17和32所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；5)作為引物含有序列38、45、10和31所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；6)作為引物含有序列39、45、10和31所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；7)作為引物含有序列40、45、16和31所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；8)作為引物含有序列41、45、16和31所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；9)作為引物含有序列37、46、16和31所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；10)作為引物含有序列37、47、16和31所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；11)作為引物含有序列37、48、16和31所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；12)作為引物含有序列37、49、16和31所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；
23.用于GAPDH檢測的核酸擴增用引物組，由以下所示1)～16)中任一個構成1)作為引物含有序列80、88、62和73所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；2)作為引物含有序列81、89、63和75所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；3)作為引物含有序列86、95、58和76所示堿基序列的寡核苷酸 的引物組；4)作為引物含有序列87、96、64和77所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；5)作為引物含有序列81、89、62和75所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；6)作為引物含有序列82、89、62和75所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；7)作為引物含有序列83、89、63和75所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；8)作為引物含有序列83、89、62和75所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；9)作為引物含有序列84、89、62和75所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；10)作為引物含有序列85、89、62和75所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；12)作為引物含有序列81、90、63和75所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；13)作為引物含有序列81、91、63和75所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；14)作為引物含有序列81、92、63和75所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；15)作為引物含有序列81、93、63和75所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；16)作為引物含有序列81、94、63和75所示堿基序列的寡核苷酸的引物組；
24.核酸檢測方法，至少使用一個權利要求1～7中任一項記載的引物進行。
25.核酸檢測方法，至少使用一個權利要求8～23中任一項記載的引物組進行。
26.權利要求24或25所述核酸檢測方法中使用的試劑和/或試劑盒。
27.使用權利要求24或25所述核酸檢測方法的核酸檢測系統。
全文摘要
本發明的目的在于提供用于持家基因mRNA檢測的核酸擴增用引物，具體來說，是提供用于確認β－肌動蛋白或GAPDH擴增的新的引物。具體來說、對于β－肌動蛋白選擇含有序列2或4～49中任一個所示堿基序列的寡核苷酸、對于GAPDH選擇含有序列52～96任一個所示堿基序列的寡核苷酸的引物，組合后使用。
文檔編號C12Q1/68GK1633500SQ03804069
公開日2005年6月29日 申請日期2003年2月13日 優先權日2002年2月20日
發明者多田幸代 申請人:希森美康株式會社