專利名稱：煙酸、氰基吡啶雙底物微生物羥基化偶聯生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種同時生產6-羥基煙酸和6-羥基-3-氰基吡啶的微生物轉化方法，具體涉及一種煙酸、氰基吡啶雙底物微生物羥基化偶聯生產工藝。
背景技術：
6-羥基煙酸和6-羥基-3-氰基吡啶是一類重要的合成醫藥、農藥、染料等化合物的中間體。如合成農藥吡蟲啉、啶蟲脒等，其關鍵中間體是6-氯-3-羥甲基吡啶或6-氯-3-氯甲基吡啶。煙酸和3-氰基吡啶可分別被微生物羥基化為6-羥基煙酸和6-羥基-3-氰基吡啶。以煙酸為原料通過微生物轉化方法羥基化得到6-羥基煙酸，再進一步酰氯化、還原，可達到6-氯-3-羥甲基吡啶；以3-氰基吡啶為原料，先用微生物羥基化為6-羥基-3-氰基吡啶，然后氯化，再還原水解可得到6-氯-3-氯甲基吡啶。
利用微生物羥基化煙酸已有瑞士公司申請歐洲專利(Lehky，P et al，Eur.Pat.Appl.No.0152948，1985；Kulla H and Lehky，P.，Eur.Pat.Appl.No.0152949，1985)，該專利采用Achromobacter xylosoxydans DSM2783菌株和Pseudomonasputida NCIB 10521菌株和8176菌株進行微生物轉化，其專利生產工藝分為兩步第一步是先培養一定生物量的具有高活性煙酸羥基化酶的菌體，第二步是利用菌體進行煙酸的羥基化反應。該專利強調這兩步過程不可能合并為一個過程。日本學者Nagasawa等人(Biosci.Biotech.Biochem.58(4)，665-668，1994)和Hurh等人(J Fermentation and bioengineering，77(4)，382-385，1994)也分別報道首先在一定培養基中培養熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens TN5)或沙雷鐵氏菌(Serratia marcescens IFO 12648)，培養過程中可加煙酸、6-羥基煙酸誘導羥基化酶的形成，然后通過離心獲得靜息菌體細胞，再使用靜息細胞在含有煙酸的緩沖溶液中進行羥基化反應。
利用微生物羥基化3-氰基吡啶為6-羥基-3-氰基吡啶已有日本和美國專利(Yasuda，M et al，US Pat.Appl.No.246570，1995；JP 4039562，1992；JP 4-0774 61，1992)。但已有專利是先培養具有轉化活力的微生物，然后分離、回收獲得靜息菌體細胞，再將獲得的菌體與3-氰基吡啶水溶液混合反應，使3-氰基吡啶被微生物羥基化為6-羥基-3-氰基吡啶。Yasuda et al(Biosci.Biotech.Biochem.，59(4)，572-575，1995)報道一種睪丸酮假單胞菌MCI-2848菌株(Comamonastestosterone MCI-2848)，可使3-氰基吡啶6位羥基化，其過程為向培養介質中加入煙酸誘導所培養的菌體具有較高的羥基化轉化活力，然后分離、回收獲得靜息菌體細胞，再利用獲得的靜息菌體細胞轉化3-氰基吡啶為6-羥基-3-氰基吡啶。
以往生產工藝存在兩個主要缺點(1)是6-羥基煙酸和6-羥基-3-氰基吡啶的微生物轉化工藝都是分開獨立進行的；(2)是3-氰基吡啶羥化酶的產生需要使用大量的煙酸作為誘導物加入到微生物培養的介質中，在培養過程中誘導菌體產生較高的羥基化酶活性，然后收獲靜息菌體細胞，再將收獲的靜息菌體細胞加入到轉化液中，轉化3-氰基吡啶為6-羥基-3-氰基吡啶，由于菌體培養時使用的誘導劑濃度通常為1％煙酸，結果每轉化一定量的3-氰基吡啶幾乎需要消耗同樣量的煙酸，由于煙酸的市場價格高于氰基吡啶，因而從經濟角度講是無法應用于生產的。
發明內容
本發明的目的是提供一種可以滿足商業目的的方法，解決6-羥基煙酸和6-羥基-3-氰基吡啶的工業生產工藝課題。解決含3-氰基吡啶羥化酶菌體細胞培養過程中需要使用大量的煙酸作為誘導物的問題，將培養基中誘導物煙酸的使用作為6-羥基煙酸的生產過程，在誘導菌體產生3-氰基吡啶羥化酶活力的同時，將煙酸羥基化為6-羥基煙酸。本發明采用所分離保藏的可羥基化3-氰基吡啶的菌種，分析煙酸作為誘導物培養微生物時的代謝去向，發現在微生物培養過程中，誘導物煙酸并沒有被徹底降解，而只是被羥基化成6-羥基煙酸，進一步研究證明高濃度6-羥基煙酸在培養基中積累不影響微生物的生長，因而建立了將煙酸和3-氰基吡啶的微生物羥基化偶聯生產的工藝。
本發明的煙酸、氰基吡啶雙底物微生物羥基化偶聯生產工藝步驟如下將微生物菌種接種到含底物1(煙酸)的發酵培養液中，先進行微生物煙酸轉化發酵培養，在微生物發酵培養的同時使底物1(煙酸)轉化為6-羥基煙酸，發酵培養過程中要不斷添加被消耗的底物1(煙酸)到發酵培養液中；轉化發酵培養結束后，將培養液與菌體離心或過濾分離，去除菌體的煙酸轉化發酵培養液酸化靜置后，使結晶析出得產品1，6-羥基煙酸；從煙酸轉化發酵培養液中分離所得的菌體，可直接或經適當處理后，再加入到含底物2(3-氰基吡啶)轉化液中，進行氰基吡啶轉化反應，將3-氰基吡啶轉化為6-羥基3-氰基吡啶，轉化過程中要不斷添加被消耗的3-氰基吡啶；轉化結束后，將菌體去除，澄清的轉化液酸化靜置后，使結晶析出得產品2，6-羥基3-氰基吡啶。
上述微生物煙酸轉化發酵培養接種采用的可羥基化3-氰基吡啶的微生物菌種，可以是Achromobacter spp.，Acinetobacter spp.，Alcaligenes spp.，Comamonas spp.，Micrococcus spp.，Pseudomonas spp.，Serratia spp.等中的一種，也可以是任何其他可羥基化3-氰基吡啶的微生物。
上述用于微生物煙酸轉化發酵培養所用的含底物1(煙酸)的培養基，可以是任何一種適合于微生物生長的營養介質，但是其中要加入0.1％以上的煙酸。
上述微生物煙酸轉化發酵培養條件是，10-60℃，1-300rpm搖瓶震蕩通氣、或攪拌通氣、或管道通氣供氧，發酵培養1-96小時，但與眾不同的是需要在培養過程中不斷添加底物1(煙酸)到發酵培養液中，維持誘導物煙酸濃度在0.1％以上，接種之前需要進行滅菌處理。
上述微生物煙酸轉化發酵培養生產過程中，添加底物1(煙酸)到發酵培養液中時，可使用含0.5％以上煙酸的水溶液、或含0.5％以上煙酸的發酵培養基、或含0.5％以上煙酸的任何一種緩沖溶液，也可以直接使用煙酸固體。添加方式可通過管道流加、或滴加或直接間歇添加。
上述微生物煙酸轉化發酵培養生產結束后，與以往不同的是，菌液分離后，發酵培養液不是排放丟棄，而是需要回收。回收得到的煙酸轉化發酵培養液，需要用鹽酸、或硫酸、或其他任意一種有機或無機酸調至pH1-5，低溫靜置使6-羥基煙酸結晶析出，回收晶體并用酸化水溶液(pH1-5)洗滌、干燥后為6-羥基煙酸成品，若產品不純，可通過中性水溶液或緩沖溶液重新溶解晶體，再酸化重結晶予以純化。
上述底物2(3-氰基吡啶)的轉化反應時，可直接使用的菌體是指將煙酸轉化發酵培養結束后經離心或過濾獲得的菌體沉淀。可使用經適當處理的菌體既可是指前述的菌體沉淀經30-90℃加熱處理一段時間后所獲得的死菌體；也可是指前述的菌體沉淀經任意一種已知的固定化方法(如凝膠包埋法和離子吸附法)處理所獲得的固定化菌體；也可是指前述的菌體沉淀，通過細胞自溶、或細胞破碎等方法使酶釋放到溶液中，通過離心或過濾等方法除去菌體細胞碎片后，所得的細胞酶提取液，或經硫酸銨鹽析法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法等純化后的羥基化酶制劑。
上述底物2(3-氰基吡啶)的轉化反應條件是，底物2(3-氰基吡啶)濃度＞0.1％(在任意一種pH6-8的溶液中)，溫度范圍在10-60℃，1-300rpm搖瓶震蕩通氣、或攪拌通氣、或管道通氣供氧，反應時間1-96小時。轉化過程中要流加或間歇添加含0.5％以上的3-氰基吡啶水溶液、或含0.5％以上的發酵培養液、或含0.5％以上的任何一種緩沖溶液，也可以直接添加3-氰基吡啶固體，以維持底物2(3-氰基吡啶)濃度在0.1％以上。轉化結束后，將轉化液與菌體通過離心或過濾分開。所獲轉化液用任意一種有機或無機酸調至pH1-6，低溫或室溫靜置使6-羥基3-氰基吡啶結晶析出，回收晶體并用酸化水洗滌、干燥后為成品，若產品不純，可通過中性水溶液或緩沖溶液重新溶解晶體，再酸化重結晶予以純化。
使用本發明的專利技術，可有效地解決含3-氰基吡啶羥化酶菌體細胞培養過程中需要使用大量的煙酸作為誘導物的問題，變煙酸誘導物的消耗為煙酸底物轉化生產6-羥基煙酸的過程，不但節約了誘導物的成本支出，還獲得了額外的轉化產物的生產效益。同時本專利為了進行煙酸的轉化生產，需要維持菌體煙酸轉化發酵培養基中的煙酸在一個恒定的較高濃度水平，結果使所獲得的靜息菌體細胞相對于以往的培養方法獲得的靜息菌體細胞，具有更高的3-氰基吡啶羥化酶活力，使6-羥基-3-氰基吡啶的轉化率提高了20％以上。
具體實施例方式
實施例1，將50ml含1％煙酸的LB培養基放入250ml三角瓶，121℃高壓蒸汽滅菌后，接入Pseudomonas sp.NJ，28℃，200rpm震蕩培養進行煙酸羥基化轉化反應，培養過程中每2h補充一次因轉化消耗了的煙酸，使之濃度恢復到1％，24h后停止誘導轉化發酵培養，5000rpm離心3分鐘，使菌體和發酵培養液分離。用1M硫酸將去除菌體的發酵培養液調至pH2.0，靜置過夜待晶體析出后，過濾收集晶體，洗滌、干燥后，得3.2克羥基煙酸。將菌體加入到50ml含1％3-氰基吡啶的20mM磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中，28℃，200rpm震蕩通氣進行3-氰基吡啶羥基化轉化反應，轉化過程中每2h補充一次因轉化消耗了的3-氰基吡啶，使之濃度恢復到1％，24h后停止轉化反應，5000rpm離心3分鐘去除菌體，上清液用1M硫酸調至pH3.0，靜置過夜待晶體析出后，過濾收集晶體，洗滌、干燥后，得1.4克6-羥基3-氰基吡啶。
實施例2、將50ml含1.0％煙酸的牛肉膏蛋白胨培養基放入250ml三角瓶，121℃高壓蒸汽滅菌后，接入沙雷鐵氏菌(Serratia sp.NJ)，28℃，200rpm震蕩培養進行煙酸羥基化轉化反應，培養過程中每3h補充一次因轉化消耗了的煙酸，使之濃度恢復到1.0％，32h后停止誘導轉化發酵培養，離心使菌體和發酵培養液分離。用1M鹽酸將去除菌體的發酵培養液調至pH2.0，靜置使晶體析出后，過濾收集晶體，洗滌、干燥后，得2.2克羥基煙酸。將菌體加入到50ml含1％3-氰基吡啶的20mM硼酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中，28℃，200rpm震蕩通氣進行3-氰基吡啶羥基化轉化反應，轉化過程中每4h補充一次因轉化消耗了的3-氰基吡啶，使之濃度恢復到1％，24h后停止轉化反應，離心去除菌體，上清液用1M鹽酸調至pH3.0，靜置晶體析出后，過濾收集晶體，洗滌、干燥，得0.8克6-羥基3-氰基吡啶。
權利要求
1.一種煙酸、氰基吡啶雙底物微生物羥基化偶聯生產工藝，步驟如下將微生物菌種接種到含底物1煙酸的發酵培養液中，先進行微生物煙酸轉化發酵培養，在微生物發酵培養的同時使底物1煙酸轉化為6-羥基煙酸，發酵培養過程中要不斷添加被消耗的底物1煙酸到發酵培養液中；轉化發酵培養結束后，將培養液與菌體離心或過濾分離，去除菌體的煙酸轉化發酵培養液酸化靜置后，使結晶析出得產品1，6-羥基煙酸；從煙酸轉化發酵培養液中分離所得的菌體，直接或經適當處理后，再加入到含底物2，3-氰基吡啶轉化液中，進行氰基吡啶轉化反應，將3-氰基吡啶轉化為6-羥基3-氰基吡啶，轉化過程中要不斷添加被消耗的3-氰基吡啶；轉化結束后，將菌體去除，澄清的轉化液酸化靜置后，使結晶析出得產品2，6-羥基3-氰基吡啶。
2.按照權利要求1所述的煙酸、氰基吡啶雙底物微生物羥基化偶聯生產工藝，其特征在于所述微生物煙酸轉化發酵培養接種采用的可羥基化3-氰基吡啶的微生物菌種，是Achromobacter spp.，Acinetobacter spp.，Alcaligenes spp.，Comamonas spp.，Micrococcus spp.，Pseudomonas spp.，Serratia spp.中的一種。
3.按照權利要求1所述的煙酸、氰基吡啶雙底物微生物羥基化偶聯生產工藝，其特征在于微生物煙酸轉化發酵培養所用的含底物1煙酸的培養基，可以是任何一種適合于微生物生長的營養介質，但是其中要加入0.1％以上的煙酸。
4.按照權利要求1或2或3所述的煙酸、氰基吡啶雙底物微生物羥基化偶聯生產工藝，其特征在于微生物煙酸轉化發酵培養條件是，10-60℃，1-300rpm搖瓶震蕩通氣、或攪拌通氣、或管道通氣供氧，發酵培養1-96小時，但與眾不同的是需要在培養過程中不斷添加底物1煙酸到發酵培養液中，維持誘導物煙酸濃度在0.1％以上。
5.按照權利要求4所述的煙酸、氰基吡啶雙底物微生物羥基化偶聯生產工藝，其特征在于所述添加底物1煙酸到發酵培養液中時，使用含0.5％以上煙酸的水溶液、或含0.5％以上煙酸的發酵培養基、或含0.5％以上煙酸的任何一種緩沖溶液，也可以直接使用煙酸固體；添加方式可通過管道流加、或滴加或直接間歇添加。
6.按照權利要求1所述的煙酸、氰基吡啶雙底物微生物羥基化偶聯生產工藝，其特征在于菌液分離后，回收得到煙酸轉化發酵培養液，其方法是用鹽酸、或硫酸、或其他任意一種有機或無機酸調至pH1-5，低溫靜置使6-羥基煙酸結晶析出，回收晶體并用酸化水溶液pH1-5洗滌、干燥后為6-羥基煙酸成品；或通過中性水溶液或緩沖溶液重新溶解晶體，再酸化重結晶予以純化。
7.按照權利要求1所述的煙酸、氰基吡啶雙底物微生物羥基化偶聯生產工藝，其特征在于底物2，3-氰基吡啶的轉化反應，直接使用的菌體是指將煙酸轉化發酵培養結束后經離心或過濾獲得的菌體沉淀；使用經適當處理的菌體是指所述的菌體沉淀經30-90℃加熱處理一段時間后所獲得的死菌體；或是指前述的菌體沉淀經任意一種已知的固定化方法處理所獲得的固定化菌體；也可是指前述的菌體沉淀，通過細胞自溶、或細胞破碎等方法使酶釋放到溶液中，通過離心或過濾等方法除去菌體細胞碎片后，所得的細胞酶提取液，或經硫酸銨鹽析法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法等純化后的羥基化酶制劑。
8.按照權利要求5或6或7所述的煙酸、氰基吡啶雙底物微生物羥基化偶聯生產工藝，其特征在于所述底物2，3-氰基吡啶的轉化反應條件是，底物2，3-氰基吡啶濃度＞0.1％，pH6-8，溫度范圍在10-60℃，1-300rpm搖瓶震蕩通氣、或攪拌通氣、或管道通氣供氧，反應時間1-96小時，轉化過程中要流加或間歇添加含0.5％以上的3-氰基吡啶水溶液、或含0.5％以上的3-氰基吡啶發酵培養液、或含0.5％以上3-氰基吡啶的任何一種緩沖溶液，也可以直接添加3-氰基吡啶固體，以維持底物2，3-氰基吡啶濃度在0.1％以上；轉化結束后，將轉化液與菌體通過離心或過濾分開；所獲轉化液用任意一種有機或無機酸調至pH1-6，低溫或室溫靜置使6-羥基3-氰基吡啶結晶析出，回收晶體并用酸化水洗滌、干燥后為成品，或通過中性水溶液或緩沖溶液重新溶解晶體，再酸化重結晶予以純化。
全文摘要
煙酸、氰基吡啶雙底物微生物羥基化偶聯生產工藝菌種接種到含底物1煙酸的發酵培養液中進行轉化發酵培養，同時使煙酸轉化為6－羥基煙酸，過程中不斷添加煙酸；培養結束后將培養液與菌體分離，去除菌體的培養液酸化靜置使結晶析出得產品1，6－羥基煙酸；分離所得的菌體再加入到含底物2，3－氰基吡啶轉化液中，將3－氰基吡啶轉化為6－羥基3－氰基吡啶，過程中不斷添加3－氰基吡啶；轉化結束后，將菌體去除，澄清的轉化液酸化靜置使結晶析出得產品6－羥基3－氰基吡啶。本發明可有效地解決含3－氰基吡啶羥化酶菌體細胞培養中使用大量的煙酸的問題，變煙酸消耗為煙酸底物轉化生產6－羥基煙酸，節約了成本還可獲得額外生產效益。
文檔編號C12P17/12GK1526823SQ0315827
公開日2004年9月8日 申請日期2003年9月22日 優先權日2003年9月22日
發明者袁生, 楊瑤, 徐尚成, 張湘寧, 王書生, 梁明祥, 秦友山, 袁 生 申請人:南京師范大學, 江蘇省農藥研究所有限公司