運動發酵單胞菌乙醇發酵基因的克隆及應用的制作方法

專利名稱：運動發酵單胞菌乙醇發酵基因的克隆及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及運動發酵單胞菌基因組文庫的構建、參與發酵的功能基因的克隆及相應基因在構建工程菌株方面的應用。本發明還涉及運動發酵單胞菌工程菌發酵生產乙醇的用途。
背景技術：
燃料乙醇是一類可補充或替代汽油的高效清潔環保燃料。但乙醇的生產成本較高，在價格上同汽油沒有競爭力。在發酵生產乙醇的工藝方面，必須解決的關鍵性問題就是提高糖轉化率，才能降低生產成本。
廣泛應用于乙醇發酵研究和應用的傳統酵母菌株主要為啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。若是以糖質或淀粉質原料生產酒精，這類酵母的酒精轉化率已接近最大理論值(92克乙醇/180克葡萄糖)，可進一步挖掘的生產潛力已十分有限。
而分離自乙醇飲料物的運動發酵單胞菌被認為是可以降低發酵生產成本、大規模生產燃料乙醇的最佳替代微生物。運動發酵單胞菌為革蘭氏陰性菌，自從1912年發現以來，其命名經過Termobacterium mobilis，Pseudomonas linderi，和Zymomonas mobilis的演變。Zymomonas mobilis是迄今為止所發現的唯一一株通過脫氧酮糖酸(Entner-Doudoroff，E-D)途徑利用葡萄糖、果糖和蔗糖發酵生產乙醇的厭氧細菌。與酵母菌比較，具有糖的利用率高、發酵周期短、耐高滲透壓，能在40％的葡萄糖(g/g)和13％乙醇(V/V)濃度下生長、在發酵中不需要控制氧氣的添加量；以及容易進行遺傳操作等優點。但野生型運動發酵單胞菌的生產乙醇的速度仍不夠快，乙醇的產量只有在發酵72小時后才能達到最高。
在E-D代謝途徑中，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化葡萄糖-6-磷酸生成6-磷酸葡萄糖內酯，同時，還原NAD生成NADH。催化活性很好的內酯酶迅速水解內酯，然后6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶將水解產物6-磷酸葡萄糖酸轉化為2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸。2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸是E-D途徑中獨特的中間產物。特異性醛縮酶再將這種化合物裂解為丙酮酸和甘油醛-3-磷酸，后來再經過一系列在糖酵解途徑中常見的反應轉化為第二個丙酮酸分子。接著丙酮酸通過一種不尋常的丙酮酸脫羧酶催化轉變成乙醛和二氧化碳，這種丙酮酸脫羧酶和酵母中丙酮酸脫羧酶不同之處在于它不需要硫胺素焦磷酸作為輔酶來維持其活力。最后兩種乙醇脫氫酶(乙醇脫氫酶I和乙醇脫氫酶II)將乙醛還原為乙醇，乙醇脫氫酶I同常見的乙醇脫氫酶一樣，是一個四聚體，金屬鋅位于其活動中心，而乙醇脫氫酶II的不同之處在于鐵位于其活性中心。如果乙醇濃度降低，乙醇脫氫酶I還原乙醛的Vmax值大約是氧化乙醇的2倍，而乙醇脫氫酶II氧化乙醇的速率要快一些；如果沒有乙醇存在，兩者催化還原乙醛的速率是一致的；如果乙醇濃度提高，則乙醇脫氫酶I受到強烈抑制，但是，此時乙醇生產仍然能持續進行，因為這種情形極大地提高了乙醇脫氫酶II還原乙醛的速率。因此在利用運動單胞菌進行發酵生產乙醇的過程中，運動發酵單胞菌的乙醇脫氫酶是將糖酵解途經中產生的丙酮酸高效轉化為乙醇的關鍵酶，而乙醇脫氫酶II對反應速度的增加起著重要作用。

發明內容
本發明的目的是從運動發酵單胞菌中克隆乙醇脫氫酶II的編碼基因，導入到野生型運動發酵單胞菌中，提高乙醇的產率。
本發明的技術方案是構建運動發酵單胞菌XW101的質粒基因文庫，然后以乙醇脫氫酶II基因的部分序列為探針，從XW101的基因文庫中篩選和克隆編碼乙醇脫氫酶II酶的基因，直接或經過改造后，連接到廣寄主范圍的穿梭質粒載體上，然后導入到野生型運動發酵單胞菌或大腸桿菌中。
本發明構建基因組文庫的方法是CTAB法(Wilson，K.Inf.M.et al 1987)，提取運動發酵單胞菌XW101的總DNA，限制性內切酶Sau3AI部分酶切總DNA，酶切的合適片段連接到載體pLA2917上，連接產物電擊轉化到宿主大腸桿菌JM109中，在含有抗生素的LB平板上篩選含有重組質粒的菌株。克隆發酵功能基因的方法是，在已構建好的基因組文庫中通過菌落原位雜交方法(DNA-DNA雜交)得到含有發酵基因重組質粒的菌落，將得到的重組質粒測序，分析出能翻譯有功能蛋白的框架，進而得到所需基因。得到的基因可以根據試驗目的與合適載體連接，用于構建工程菌株。所克隆的乙醇脫氫酶II的編碼基因大小為1.267Kb，序列如SEQ ID NO1所示。將所述乙醇脫氫酶II的編碼基因連接到質粒pLA2917后，得到重組質粒pLWP18(插入片段序列如SEQ ID NO2所示)，轉入到野生型菌株XW101后，可顯著提高乙醇的發酵速度及產率，使乙醇轉化效率提高8％。
本發明進行了如下實驗A運動發酵單胞菌XW101基因文庫的構建基因文庫(genomic libary)是指用分子克隆手段，將提取的某種生物核基因組或細胞器基因組DNA，隨機酶切或機械剪切為一定長度的片段，再與適當的載體DNA連接后轉移到受體細胞中而形成的各種片段的重組子克隆的總和。一個完整的基因文庫應囊括該生物基因組上的所有基因。基因文庫的構建，借助合適的探針，通過分子雜交等途徑即能篩選到目的基因。因此，基因文庫的建立，對研究基因的結構、功能以及基因表達調控機制等，都具有特別重要的意義。
本發明使用CTAB法提取運動發酵單胞菌XW101的總DNA，用Sau3AI限制性內切酶將總DNA部分酶切為范圍在15～23kb之間的片段后，連接到位于載體pLA2917上卡那霉素抗性基因中的BglII位點上，為確定染色體插入片段最適的連接條件，按載體和插入片段的不同比值(1∶1、1∶2和1∶3)設三個處理，同時設不加插入DNA的對照反應(表4-3)。將連接混合物在4攝氏度下過夜連接后，用電擊轉化到宿主大腸桿菌JM109中，在含有四環素抗生素的LB平板上篩選含有重組質粒或pLA2917的菌株。第一次經含有四環素抗性篩選的菌株再轉接到含有卡那霉素的LB平板上，觀察生長結果，只有那些不能在含有卡那霉素平板上生長的菌株中才含有插入運動發酵單胞菌XW101 DNA片段的重組質粒，計算重組質粒的個數，并得到基因文庫的容量為6.75×104。
建立了基因文庫，理論上基因文庫合格與否可采用Clarke建立的如下統計公式進行檢驗。
N=Ln(1-p)Ln(1-f)]]>P任何一段DNA序列在文庫中出現的概率f插入片段長度與全體基因組總長度的比值N重組總數]本試驗用于連接的插入片段平均長度15kb，運動發酵單胞菌為革蘭氏陰性菌，它的基因組大小約為1.56×106，如果以99％的概率篩選到任意基因，要求的重組子為4.67×102，達到基因文庫的要求。
B 乙醇脫氫酶II基因的克隆比較相關基因核苷酸序列，設計出乙醇脫氫酶II兩個基因的特異性引物，分別是Adh1(5’-TTA GAA ATC GGA GGC ATT GT-3’)和Adc2(5’-TCG GGT TGT TGC TTT AAACT-3’)，經PCR得到1.267Kb產物。純化這PCR產物，經沸水浴變性，用DIG-High-Primer標記，得到篩選陽性重組菌體所需的探針。將生長在培養基上的菌落轉到尼龍膜上，堿法裂解菌體，80℃烘烤固定DNA。用前述PCR產物探針進行菌落原位雜交。隨后洗脫雜交膜上非特異結合的探針，添加抗體溶液進行免疫學檢測。最后用X-光底片曝光顯示雜交結果。
雜交得到15個含目的基因的陽性重組菌，通過對重組質粒提取，經PCR和酶切鑒定分析，從中選取含插有目的基因的重組質粒pLWP18進行測序分析，得到插入基因的遺傳結構。
C 帶有目的基因的質粒的轉化及其對乙醇產率的影響的測定基因工程常用的質粒在運動發酵單胞菌中不能穩定存在，對Z.mobilis來說，最佳的可負載外源基因的質粒是其自身的原生質粒片段與一些廣寄主范圍的質粒片段融合后產生的質粒。本發明選取了廣寄主范圍的質粒pLA2917作載體，將帶有乙醇脫氫酶基因的陽性克隆質粒直接電轉入XW101，通過四環素抗性篩選得到陽性轉化子。
在實驗室中經同等條件批發酵比較，轉化子乙醇產率較未轉化菌體高8％，表明轉化子中重組質粒攜帶的乙醇脫氫酶基因有效表達，且基因的拷貝數直接影響到乙醇產率。
具體實施例方式實施例1運動發酵單胞菌XW101基因文庫的構建1、CTAB法提取細菌總DNA1)取單菌落接種于5ml相應的培養基中，在合適的溫度下培養。根據細菌的生長率不同培養時間可由幾小時到幾天不等。
2)取1.0ml菌液于1.5ml離心管中，13,000rpm離心2min，棄上清。
3)沉淀重懸于1.0ml 0.85％NaCl中。
4)室溫13,000rpm離心2min，棄上清。
5)沉淀重懸于550μl1×TE中。
6)加17μl溶菌酶(35mg/ml)，37℃溫育30min。
7)加3μl蛋白酶K(20mg/ml)，37℃溫育30min。
8)加30μl 10％SDS，37℃溫育30min。
9)加100μl 5M NaCl充分混勻。
10)加80μl CTAB/NaCl溶液，混勻，65℃水浴10min。
11)加等體積(0.7～0.8ml)氯仿/異戊醇(24∶1)，輕輕振蕩混勻。
12)室溫，13,000rpm離心10min。
13)將上清液轉移到一新1.5ml離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)輕輕振蕩混勻。
14)重復第12)步。
15)將上清液轉移到一新1.5ml離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)輕輕振蕩混勻。
16)重復第12)步。
17)將上清液轉移到一新1.5ml離心管中，加入0.6體積異丙醇，混勻后室溫靜置60min。
18)20℃13,000rpm離心20min。
19)棄上清，加500μl 70％乙醇，輕輕顛倒數次(洗鹽)。
20)4℃ 15,000rpm離心20min。
21)重復洗鹽兩次。
22)倒置離心管，干燥DNA沉淀10～15min。
DNA沉淀溶于100μl 1×TE緩沖液，-20℃保存備用。
2、酶切DNA片斷與質粒pLA2917連接反應10×buffer 2μlpLA2917 100ng酶切DNA片斷 350ngT4連接酶(3U/μl) 2μl加水至20μl，4℃過夜連接。
3、電擊轉化感受態細胞的制備所有步驟均在冰浴條件下操作1)挑取LB固體培養基上的新鮮單菌落，接種于20ml LB液體培養基中，37℃220rpm振蕩培養2小時，菌液OD值達到0.5-0.6，冰上冷卻培養物至0℃。
2)將菌液轉入滅菌離心管，4℃ 4000g收集菌體，去上清，在吸水紙上倒置空干。
3)加入20ml的預冷10％甘油，置于冰上，不時輕輕顛倒離心管，將菌體泡溶。
4)4℃4000g收集菌體，去上清，在吸水紙上倒置空干。
5)加入10ml的預冷10％甘油，輕搖離心管，將菌體泡溶。
6)重復步驟(4)7)加入10ml的預冷10％甘油，輕搖離心管，將菌液泡溶。
8)重復步驟(4)9)加入200ul的預冷10％甘油，溶解菌體，分裝成40ul/1.5ml離心管。
連接產物轉化感受態細胞1)將電轉化儀(BIO-RAD Gene PulserII System)調到2.5kV，脈沖控制器調到400Ω。
2)將2ul連接產物(水溶)加入到盛有40ul新鮮制備的或融化的凍存的感受態細胞小管中，混勻。
3)將轉化混合物轉移到預冷的電轉化池中，吸干池的外表面，然后放入樣品槽中。
4)進行脈沖電轉化，然后取出電轉化池，馬上加入1ml LB培養液，于37℃中速振蕩培養60min。
5)取200ul涂布于含有四環素的LB平板上。
通過含有卡那霉素的LB平板篩選含有重組質粒的菌落。
實施例2 醇脫氫酶II基因的克隆1、PCR反應體系10×PCR buffer 2μl2.5mMdNTP2μl10×BSA 2μl50pM引物12μl50pM引物22μl模板DNA 5ng5U/μlTaq酶 0.25μl加無菌水至20μl2、PCR反應條件1、94℃預變性20s2、94℃ 0s54℃ 0s72℃ 40s(25個循環)3、72℃ 5min
3、DIG-DNA探針標記主要試劑1)滅菌dd-Water，15-25℃，用于稀釋DNA2)EDTA0.2MpH 8.0 15-25℃，用于終止反應模板DNA純度要求為用試劑盒純化(BioDev公司)DNA片段大小模板DNA為線性，大小應大于100bp，當DNA模板大于5Kb時，先用識別4bp的限制性內切酶硝化。
DNA量原則上可標記10ng-3μg的模板DNA，如果單一拷貝基因的檢測在復雜基因組進行至少300ng的DNA模板(探針濃度25ng/ml雜交溶液)需要標記。
步驟1)加1μg模板DNA(線性或超螺旋)、滅菌ddH2O終體積為16μl2)加熱沸水中變性DNA10min，迅速置于冰浴中冷卻。(注意要求完全變性)3)混合DIG引物，取4μl DIG引物加入到變性DNA中，混勻，并稍作離心。
4)37℃培養1小時(延長培養時間到20小時會增加標記產量)5)加入2μl 0.2M EDTA(pH8.0)或者加熱65℃，10min終止反應(注意得到DIG標記片段的長度200-1000bp或更長，取決于模板長度)4、菌落原位雜交硝酸纖維素膜上菌落的培養1)將硝酸纖維素膜鋪于含有選擇性抗生素的平板上；2)用無菌牙簽將菌落逐一對應地轉移至實驗板的濾膜上和含有抗生素的主平板上；3)在實驗板上和主平板上各劃一個含非重組質粒的克隆；4)倒置平板37℃培養16小時；5)在三個或更多不對稱的位置標記濾膜，在主板相近的位置也做同樣標記；6)用封口膜將主板封好，顛倒后置于4℃保存，直至得出雜交實驗的結果；菌落的裂解和DNA與濾膜的結合1)將濾紙切成大小和形狀適當的三張，使之適于三個玻璃托盤的底部，將三張濾紙分別浸泡在10％SDS、變性液、中和液三種液體中；2)傾去多余的液體，用一根玻璃棒滾壓濾紙，除去濾紙與托盤底部間的氣泡；3)用平頭鑷子揭下瓊脂板上的硝酸纖維素膜，菌落面向上置于SDS浸濕的濾紙上，3min；4)將膜轉到用變性液浸濕的第二張濾紙上，浸泡5min；5)將濾膜轉到在中和液中浸泡的第三張濾紙上，浸泡5min；6)在托盤中放置100ml 2×SSC，使濾膜浮在液體表面數分鐘。此后，在晃動容器的過程中讓濾膜沉入液面以下并留在液體中，5min；7)干燥濾膜將濾膜置于干的濾紙上，菌落面向上，于室溫至少30min；8)固定DNA用兩張濾紙上下包夾濾膜，在烤箱內80℃烤干1-2小時；雜交1)確定雜交溫度Tm＝49.82+0.41(G+C％)-600/1(1為堿基對中雜交的長度)；Topt＝Tm-20到25℃2)DIG Easy Hyb工作液的準備將64ml無菌ddH2O分兩次加入至DIG EasyHybGranules瓶中(第7號瓶)，37℃振蕩5min使之溶解；3)DIG EasyHyb(10ml/100cm2濾膜)適當的體積預熱至雜交溫度37-42℃；4)在適當的容器中輕輕搖動進行預雜交30min；5)沸水浴5min，使DIG標記探針變性，迅速置于0℃(注意不要用堿性溶液處理)6)將變性DIG標記探針與預熱處理的DIGEasy Hyb(3.5ml/100cm2膜)混勻(避免產生氣泡)7)傾去預雜交液加入探針/雜交混合液，輕輕搖動反應4hr。
8)大量2×SSC/0.1％SDS洗膜，15-25℃，5min，不時搖一搖液體；重復一次；9)用大量預熱至65-68℃的0.5×SSC/0.1％SDS洗膜，5min，不時搖一搖液體；重復一次；免疫測定1)試劑盒工作液的制備終止液用順丁烯二酸緩沖液稀釋10×終止液(1∶10)抗體液使用前離心抗-DIG-AP，5min，10000rpm，從表面小心吸取所需的量，用終止液稀釋之，1∶10000(75mU/ml)。
2)雜交并嚴格洗膜后，用洗滌緩沖液漂洗膜1-5min；3)100ml終止液中反應30min；4)20ml抗體液培養30min；5)100ml洗滌緩沖液漂洗15min洗2次；6)20ml測定緩沖液中平衡2-5min；
7)將膜(DNA面作記號)置于雜交袋中，加入1mlCSPD ready-to-use(5號瓶)，15-25℃培養5min，8)擠出多余的溶液，封口；9)濕潤的膜培養10min 37℃，以增強化學發光反應。
10)X-ray感光15-25min 15-25℃。
實施例3帶有目的基因的質粒的轉化及其對乙醇產率的影響1、電轉方法同實施例1。
2、乙醇產率測定1)色譜條件色譜柱長2m，內徑4mm。
固定相GDX-102，60-80目溫度氣化室190度，檢測器190度，柱溫170度。
氣體流速載氣(N2)40ml/min。
2)進樣量5.0ul。
3)定性以乙醇標準出峰時間定性。乙醇標準應用液和樣品測定液各進樣5.0ul，分別測定保留時間，樣品與標準出峰時間對照而定性。
4)定量樣品測定液中乙醇含量測定取樣品測定液5.0ul進樣，測出乙醇峰高或峰面積，依據工作曲線或回歸方程計算測定液中乙醇含量(％)。
工作曲線制作取20±0.5度的乙醇標準應用液適量用20±0.5度純水稀釋成乙醇含量(V/V)分別為0.20％、0.40％、0.60％、0.80％、1.00％的標準系列濃度。分別取上述乙醇標準系列濃度5.0ul進樣，測得乙醇的峰高或峰面積。以乙醇的含量百分濃度為橫坐標、相應的峰高或峰面積為縱坐標，制作工作曲線，或用最小二乘法計算其回歸方程。
計算樣品中乙醇含量乙醇含量(C2H5OH，％，V/V)＝樣品測定液中乙醇含量×ff-稀釋倍數(1，50或100)。
5)乙醇實際產量與理論產量的百分數的計算

6)試驗數據(10ml培養基)1、2、3為含乙醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶重組質粒的XW101的三個重復，4、5、6為野生菌XW101的三個重復

SEQUENCE LISTING<110>中國農業科學院生物技術研究所<120>運動發酵單胞菌乙醇發酵基因的克隆及應用<130>03-02<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1152<212>DNA<213>運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)<400>11ATGGCTTCTT CAACTTTTTA TATTCCTTTC GTCAACGAAA TGGGCGAAGG TTCGCTTGAA61 AAAGCAATCA AGGATCTTAA CGGCAGCGGC TTTAAAAATG CGCTGATCGT TTCTGATGCT121 TTCATGAACA AATCCGGTGT TGTGAAGCAG GTTGCTGACC TGTTGAAAGC ACAGGGTATT181 AATTCTGCTG TTTATGATGG CGTTATGCCG AACCCGACTG TTACCGCAGT TCTGGAAGGC241 CTTAAGATCC TGAAGGATAA CAATTCAGAC TTCGTCATCT CCCTCGGTGG TGGTTCTCCC361 GAAGGTATCG ACAAATCTAA GAAACCTGCC CTGCCTTTGA TGTCAATCAA CACGACGGCT421 GGTACGGCTT CTGAAATGAC GCGTTTCTGC ATCATCACTG ATGAAGTCCG TCACGTTAAG481 ATGGCCATTG TTGACCGTCA CGTTACCCCG ATGGTTTCCG TCAACGATCC TCTGTTGATG541 GTTGGTATGC CAAAAGGCCT GACCGCCGCC ACCGGTATGG ATGCTCTGAC CCACGCATTT601 GAAGCTTATT CTTCAACGGC AGCTACTCCG ATCACCGATG CTTGCGCCTT GAAGGCTGCG661 TCCATGATCG CTAAGAATCT GAAGACCGCT TGCGACAACG GTAAGGATAT GCCAGCTCGT721 GAAGCTATGG CTTATGCCCA ATTCCTCGCT GGTATGGCCT TCAACAACGC TTCGCTTGGT781 TATGTCCATG CTATGGCTCA CCAGTTGGGC GGCTACTACA ACCTGCCGCA TGGTGTCTGC841 AACGCTGTTC TGCTTCCGCA TGTTCTGGCT TATAACGCCT CTGTCGTTGC TGGTCGTCTG901 AAAGACGTTG GTGTTGCTAT GGGTCTCGAT ATCGCCAATC TCGGTGATAA AGAAGGCGCA961 GAAGCCACCA TTCAGGCTGT TCGCGATCTG GCTGCTTCCA TTGGTATTCC AGCAAATCTG1021 ACCGAGCTGG GTGCTAAGAA AGAAGATGTG CCGCTTCTTG CTGACCACGC TCTGAAAGAT1081 GCTTGTGCTC TGACCAACCC GCGTCAGGGT GATCAGAAAG AAGTTGAAGA ACTCTTCCTG
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1801 GAGGGAGATG ACGAAGTCTG AATTGTTATC CTTCAGGATC TTAAGGCCTT CCAGAACTGC1861 GGTAACAGTC GGGTTCGGCA TAACGCCATC ATAAACAGCA GAATTAATAC CCTGTGCTTT1921 CAACAGGTCA GCAACCTGCT TCACAACACC GGATTTGTTC ATGAAAGCAT CAGAAACGAT1981 CAGCGCATTT TTAAAGCCGC TGCCGTTAAG ATCCTTGATT GCTTTTTCAA GCGAACCTTC2041 GCCCATTTCG TTGACGAAAG GAATATAAAA AGTTGAAGAA GCCATAGCTA TAACCTCACC2101 CTACATACTA GTTTAAAGCA ACAACCCGAA AACAACCATT TTCGAGAAAT CGCTTTCTAT2161 TGTTTTTGCG TTTTAATCCC GTTTTCGAGA CGTTTTCTCA AAGTTTTTCC TGAAAACGAG2221 TAAAATCACC AATTTTACGC ATTTTCAGCA ATCGGGCAGC GCAAAAGCAA TATGTCTATC2281 AGTTTTATCA GATCAAGGGG TTCGCTTTAT TCCAGCACAT TTATAGTCTG TNTTAACGAA2341 GCGACCTCTA TTTTCTGAAA GCCGAGATTT TTCTACTCGC GACAGCGGTG ATGAGCAAGG2401 CTGCTTGTTC TTTCTAAATA TGTATTTTTT ACATCAAGAC TTATGCAAAT TATGAAAAAG2461 TTGTCTTTTT ANTATGAAGT ATTGTTTAAT AATTGAGATG TGGTTACCGA TTTTGCCTTT2521 AAATTAAAAT AATAAATTTC AGGCGAAATA TTTTAAAATA AAACATTTAT GTTAAATTTT2581 AAGAAAGGAA ATTTTGAAGA ATCTGTTATT TTGTTCGTTT TTGAGGCTTT TTAGAGAAAG2641 ATAAGACTAA AAATAACATA GTTGTTAGGT ATTCATTCCA ATTTATTGTT CAAATATTAA2701 AAGCCAAATT GTAAATAGAA AACAAGAAAA TATCGTATAT GGCGAAATAT ACTGTATAAA2761 TTGCACAACA TTAAAATAAA GACATTTTCA GATATCCAAA TAGATTGTGA AAAAAGAAAT2821 AAAAGAATAA TTTGTAAGGA TGCAGGGGAA TAGTCAGGAA AAGAAGCTAT GGGGGTCGCG2881 GTAGCTTGAG GAGGAGGGGG GGGAGTGCTA CCGCCACCCG CTCTGCCGAA ATAGGGATAT2941 TCATCCATAA TAAAAATAGA AAAACCAGAC AATTATCGTT TCCATTTTTC ATCTAATCAA3001 TTGTCTCACA CGCTGCATCA AAAGCAGCTT GTTCTTTCTT CTGCTCAAAA TGGCAGATCA3061 GGCTTTCCTC AAAAAACGCA AAAAGACAAA AAAAATTGCA GCGGTAATGA AAAAATAAAA3121 GAAATTTTGA AAATTTTTGC CGCTTTTATG TGGAAGCGGA TATTTTATCT ATTTACAGTC3181 TCGACGAGAC AATCTTTGTT GTTGTTAAAG AAAAATCAGT AAGATGATGC TGTTTTGGAA3241 ACAATGATTC AACGGGGGGA TATATTTTTA TGAAGCGTTC CTTGCTATTT TTGCTAGCGA3301 CCAGTGCCAT CGCTTGGCAG GCACAAGCGA TACCAGCTGG AAATTCTGCA CCTCAACCTA3361 TGGCGATATC TGAAACGATT CCGGCTGCGG TTGATAAACC TTATAGCGGT CTCATTCGTC3421 TTAATGTCGA TGCCACAGAC ACGCAGCGCG GTATTGTTCG GGTAACGGAA ACGATTCCTG3481 TTCAGGCTGG TGCGCTGACT TTGCTCTATC CTGAATGGTT GCCGGGACAT CATAGTCCAT3541 CAGGTCCCAT CGAAAAATTG GCAGGTTTGA TTGTTACCGC CAATAATCAG GTTATTCCTT3601 GGCAACGCGA TTCTGTCGAT GTTTATGCCT TTCATCTTGA TATTCCGGCA GGCGTGACCG3661 AAATCACCGC CCAATATCAA TATCTCTCCC CGACTTCGGA GTCGCAGGGA AGAATCCAGT3721 CCACACCGGA AATGGTCAAT TTGCAGTGGA ATACGCTGGC TTTATATCCG GCCGGATATT3781 TTACCCGCCA AATCCAGATA CAGCCGACCG TTATTTATCC AACGGGTTGG AAATCGGCTT3841 CTGCCTTAGA AATTTCTGGT ATCACGCCTG ATGGACAGAC ACCCAATGTC GTCCAATATA3901 AAACTACCGA TTTTGATACG CTAATTGATT CGCCGGTAAT GGCGGGTCGT TATACGCGGA3961 CAGAAACGCT CGCCCCCGGG GTTCGTCTCA ATCTTATAGC AGACAAACCC GAAGATATGG
4021 TGATGACGGA CAAACAGCTT AACGCGCATC GCCAGCTCAT AACCCAAGCC GTAAAACTTT4081 ACGGCGCACA ACATTATAGC CATTATGATT TCTTGCTGGC TTTGTCCGAA AAGCTCGGTG4141 GTATTGGTTT AGAACATCAC CAATCTTCCG AAGATGGGGA AGGGGCTGAT TACTTCTCGA4201 AATGGGATAA ATCAGCCGTT GGTCGTGATC TCCTCGCCCA TGAATATAAC CATAGCTGGA4261 ATGGTAAATA TCGCCGCCCC GCTGATCTTT GGACACCGGA CTATAAAACG CCGATGCGGG4321 ATAGCCTCCT TTGGGTTTAT GAAGGTCAAA CCCAGTTTTG GGGTTATGTA TTGGCCGCGC4381 GTTCCGGTCT GTGGCAGCAA AAAGATGCCT TGGAAGCCTT GGCTTTGGTG GCCGCCACTT4441 ACGACAATCG GGCAGGCCGC CGTTGGCGTC CGGTGGAAGA TACCACTAAT GATCCGATTA4501 TTTCGCAACG CCGCCCCAAA GGCTGGCTAA GCTGGCAACG TTCCGAAGAT TACTACAGTG4561 AAGGTCAGTT GATCTGGCTT GATGTTGATA GCCTGCTCCG GCAACAAACT CATGGCAAAC4621 ATTCGCTTGA CGATTTTGCA AAAGCCTTTT TCGGAATGCG TGACCGTGAT TGGGGTGAGT4681 TAACCTATAA TTTTGACGAT GTCGTCAAAA CCTTAAATGA CATCATGCCT TATGACTGGG4741 CAGCCTTCTT TAACCAGCGT TTGAATCAGC GTTCGACCCA TGCGCCTTTG GACTGGATCA4801 GCCGTGGCGG TTACAAACTG GTTTACAGTG ATGAGCCAAC CGACTGGATC AAAGGTGTTG4861 AAGGCGCACG CCATATGGCC GAGTTGTCTT TCTCTTTGGG ATTATCGACT TCTGAAAAAG4921 GCAAAGTCTC TTCGGTGATG TGGGATAGCC CTGCCTTTAA CGCTGGATTG ACCGTAGGAA4981 GTGAATTGGT CGCGGTTGAT GGTCATGCCT TTAGCAATGA TCTGCTAAAA ACAGCGATCA5041 AAAATGCCAA GGCCAATAAA ACGCCGATCA AATTGCTCAT CAAGCAAGGC GATAATTATC5101 GGGATGTCGC GATTCCTTAT TATGACGGCT TCCGTTACCC GCGCCTTGAG AAAATCGATA5161 AAACCCATAG CTATCTCGAG GATTTACTCG CAGCCAAAAA CTAATTTTGA TCCATGATGA5221 AAAGCAGTCA GGTATAAAGC CGATTTCGGT GCTTGCCTGA CTGCTTTTTC AGTCTTATTA5281 AAAAAGAGTG CAGATTTCTT CTCCTCTCCG TCTGGAATTA GACAAATCAG CCCTGATGGC5341 AAACTGGCAA AGTTTGAACC GGATAACGGC TGGTCATTGT GGTGCCGCGA TCAAGGCTAA5401 TGGCTATGGT TTAGGGGCTG AACGCGTTCG TCATTATCTG GCACAGGCCG GATGTCGCGA5461 TTTTTTGTTT CCAGTTGGGA TGAAGCTCGC TTACTCGATA GTTCGGAAAA GGATTTCTCC5521 CTTTCTGTTC TCCATGGCCT AAGGGAAGAT GACCTCGGCT ATGCTCTGAA TTCTTCGGTC5581 AAGCCGGTTT TATGTAGTCC AGCGATGATT GCCCGCTGGA AACTCACGCG CCGAACCGTC5641 CCTGCGATGT CATGGTCGAT ACTGGAATGA ATCGGCTGGG TCTTTCGATG GAAGAGCGGG5701 TTCAGGCCTG CTGGATGGTC TTTCTATCGA CAATATTTTG AGCCATCTGG CCTGTGCAGA5761 CGAGGCAGAT CACCCGCTTA ATCAAAAGCA GCTTGAACGC TTTCGGATTT TAGCCGCCAG5821 AAAACAGGCA AAACGCTATA GTTTGGCTAA TTCTGCCGGT ATTTTTCTCA GCAAAGACTA5881 TCATTTTGAT CTGGCGCGTC CGGGCTTGGC GCTTTACGGC GGCCTGCCTG TTCCGCAATC5941 CAAAGATATT CTGAAACCCG TCGTTGCTAT TGCCGCCCAA GCCATTCAGG TAAGAGAAGT6001 CAGCGCCGGT GAGGCGATTG GCTATGGTGC TTGTTTTGTC ACGCCCAAAA AAATGCGGGT6061 GGCTATTTTG CATGTCGGTT ATGCTGATGG GTATTGGCGG GCTTTCTTTG AAAAAGGCCA6121 TGCCCGAAAA GACGGCGTTA TCTGTCCTTT GGCCGGTCGG GTTTCTATGG ATATGATAAC6181 GGTTGCCTTG CCGGATGTAT TGACAGCTCA CGAAGGTGAC TGGTTCTCGG TTGATTTTGA
6241CTTGCCTTCC CTTCGCAACA GACCGGATTA TCCCAATATG AACTACTGAC GGGCTTGGGG6301CATCGTTACC AATCTGTCTG GCAGGCAATA TAAATGCCGC CATTATCTAA TAATGTAGAG6361AGAGGATCAG CATTGCTTTT CCCTATTCGG TGCTTGGCCG CCATTGGTCG TTTGTTTATT6421GCTTTTTTGG CTGGCATCGG TCGGATAGCC CGTTTCGGAA TGACGATTTT GTTGAGAGGC6481GCTTTACCGC CTTATTATCC CGGTCGTTTT TTCCACGAAT TTTTTGAAAT CGGCTGGAAT6541TCGCTTCCAG TTGTGGCCTT AACCGCTGTT TTTACCGGAT CAGCCTTGGC ACAACAGGTC6601TATGCTGCGG CCAGCCGTTT TTCAGCGCAA TCGACAGTTC CGGCGGCGGT TGTTATCGGT6661ATGGTTCGGG AATTAGGCCC TGTTTTGGTC GGATTGATGG TTGTCGGTCG AGTCACTTCT6721GCGATTGCCG CCGAATTGGG CGCTATGCGG GTGACCGAGC AAATTGATGC GATGGAAACG6781CTGCATACAG ATCCCTATCG CTATCTTTTG GCACCTCGCC TTTATGCGGC TACCCTCGCT6841TTGCCTTTCT TGGTGATGCT GGCCAATGTT ATCGGCATTT TCGGGGGCTA TCTTCTTTCA6901ATCAGCAAAT TGGGCTTTAA CCCTGAAAAT TATCTCAAGG TAACACGCGA ATTCCTAAAG6961GCCGAAGATG TCCATATGGC GCTGGTAAAA TCGGCAGTTT TCGGTTTTCT CGTTGCATTA7021TTGGGCTGTT ATAATGGCTT TTTTGCCACC GGCGGCGCGG CAGGTGTTGG ACGTTCAACA7081AAGCGGGCGG TGGTCAGCGC CTTTATCATG ATCCTGTTTT CAAATCTGAT GATTACCATG7141TTCTTTTTCG GATAAAGAGT CTTATGCCTC AGACACAGCC TCTCATCCGA ATTCGCGGGT7201TAAGAAAATC TTTTGGCGAT CACGCTGTTT TACAAGGCGT GGATATTGAT ATCGACAAAG7261GACAGTCGGT TGTCATTATC GGCCAGTCCG CGCGGCAAAT CGGTTTGCTG AAACCATATT7321AGGCCTGATC GAAGCCGATG CCGGTTCTAT CGAAATAGAG GGGCAGGATA TTGAAACCAT7381GTCCCAAAGC CAATTGGCTT CTATTCGCGA TCATATCGGG ATGCTGTTCC AAGGCGGGGC7441GTTATTCGAT TCCTTGCCAG TTTGGCGCAA TATTACCTTT GCCATTACCC AAGGTCATTT7501ACGCGATACC GCCAAAATGC AAAAATTGGC GAGCGAATAT CTCGCACGGG TCGGATTGGA7561TGACAGGATT CTCAATCTTC GTTCTGGGGA ATTATCAGGA GGGATGCAAA AACGCGTAGC7621GATTGCGCGG GCGATTGCGG CTAAACCCGA AATCCTGTTG TTTGATGAAC CGACCGCAGG7681CCTCGACCCC ATTCGCTCTG ATGTCATTGA CGACTTAACG CTTAGCCTCG TGCGCGATAA7741TGGTATGACC GCAATTACCA TTACCCATGA CATGGCTTCG GTTTGCAAAA TTGCGGATAA7801GATCGCCTTC CTGCATGAAG GCCGTATTAT CTGGACAGGG AATACTCAAG ACCTTCGGAC7861AACCGACAAT CCCTATGTTC GGCAATTTTT TGATCGCAAA GCCGAAGGCC CCTTCATTGA7921AAACAGCCTA CTGACTGTTT GTATAACCAG TAACGATCTA AACGCTAGAA TTAATGAATG7981AAAAAAGAGG CTATAAACAT AATCTATAGC CTCTAATTTT ATTAAAAAAT TTAAGGCATC8041TTTATGCCGA CATGCGTTAT AAAATCATTC CATAAATTTT CGGCAGCCTC TTGTGAAGTT8101AATGGTTTAT TACTTAAAGA TCCTCCCCCT CTTAAAAGGA ACTGATTGTA TCATCTGAGG8161ATACTTGAAA CCACCCATTC ATTGAACCTT CTGGAGCATG TTCTGTAAAA GAAAATTGAA8221TATCTCCAAA AGAGGTAGAG TTTTTAGCGG ATCGGACGGT AATATAGGCA GTTTTATTCG8281CCATTTTTTT GTTTACGAGA GTGCATCCAA AAGATAATGA ATCAATTTCA TCAAAAGCCC8341ATGTAATCAT CTATTGAATT GATTCTGTTA TTGATCTTTA AAAAATTCTT TAATGGCATT8401GAAAGATTGT MTTTTGAATT CTGTBTTGTC AATTTGATCA AAATCTTTYT GAATTTGATA
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權利要求
1.編碼乙醇脫氫酶II的DNA序列，如SEQ ID NO1所示。
2.一種重組質粒，含有SEQ ID NO2所示的DNA序列。
3.權利要求1所述的DNA序列的制備方法，包括構建運動發酵單胞菌基因組文庫、克隆參與發酵的功能基因。
4.權利要求3所述的制備方法，所述構建基因組文庫的方法是CTAB法，即提取運動發酵單胞菌XW101的總DNA，用限制性內切酶Sau3AI部分酶切總DNA，將酶切的合適片段連接到載體pLA2917上，連接產物電擊轉化到宿主大腸桿菌JM109中，在含有抗生素的LB平板上篩選含有重組質粒的菌株。
5.權利要求3所述的制備方法，所述克隆發酵功能基因的方法是，在已構建好的基因組文庫中通過菌落原位雜交方法得到含有發酵基因重組質粒的菌落，將得到的重組質粒測序，分析出能翻譯有功能蛋白的框架，進而得到所需基因。
6.權利要求1所述的DNA用于制備運動發酵單胞菌工程菌的用途。
7.一種運動發酵單胞菌工程菌，包含有權利要求1所述的DNA。
8.權利要求7所述的運動發酵單胞菌工程菌生產乙醇的用途。
9.一種生產乙醇的方法，其特征是用權利要求7所述的運動發酵單胞菌工程菌發酵。
全文摘要
本發明構建了運動發酵單胞菌XW101的質粒基因文庫，然后以乙醇脫氫酶II基因的部分序列為探針，從上述基因文庫中篩選和克隆編碼乙醇脫氫酶II酶的基因，連接到廣寄主范圍的穿梭質粒載體上，然后導入到野生型運動發酵單胞菌或大腸桿菌中。所克隆的乙醇脫氫酶II的編碼基因序列如SEQ ID NO1所示。將所述乙醇脫氫酶II的編碼基因導入到野生型運動發酵單胞菌后，可顯著提高乙醇的發酵速度及產率。
文檔編號C12N15/09GK1600862SQ0315751
公開日2005年3月30日 申請日期2003年9月23日 優先權日2003年9月23日
發明者徐玉泉, 武志強, 張維, 于曉瑾, 李紅權, 林敏 申請人:中國農業科學院生物技術研究所