專利名稱：一種在蛋白質芯片表面固定蛋白質的方法
技術領域：
本發明涉及一種在蛋白質芯片表面固定蛋白質的方法。
背景技術：
蛋白質是一種組成、結構復雜的有機大分子，幾乎能與所有固體表面發生相互作用并吸附在表面上。在蛋白質芯片表面上固定目標蛋白質分子已經廣泛用于蛋白質純化、固相免疫檢測和生物材料制備等生物醫學領域。
目前在蛋白質芯片表面上固定蛋白質的主要方法是通過物理吸附作用，也就是通過兩者之間的靜電、疏水和氫鍵等相互作用將蛋白質固定到固體表面上。如Jonsson，U.；lvarsson，B.；Lundstrom，I.；Berghem，L.J.Colloid.Interface Sci.1982，90，148.中所述，通過物理吸附在蛋白質芯片表面固定蛋白質，是使用了二氯二甲基硅烷改性硅表面。但是，使用物理吸附的方法，固定在蛋白質芯片表面上的蛋白質分子的生物活性通常都低于溶液狀態下的蛋白質活性，其主要原因是蛋白質分子在吸附到固體表面的同時，其空間構像也會隨之發生變化，而蛋白質分子的生物活性是依賴于其空間構像的穩定的。此外，通過這種方法固定的蛋白質很不穩定，一方面，在有流動液體的環境下，固定在蛋白質芯片表面上的蛋白質容易發生脫落；另一方面，由于競爭吸附，其它蛋白質也會替代原有固定在表面上的蛋白質，造成其流失。
另一種較為常用的在蛋白質芯片表面上固定蛋白質的方法是通過共價連接的方式。如Haodan Yuan，Wayne M.Mullett and Janusz Pawliszyn，Biological sample analysiswith immunoaffinity solid-phase microextraction，The Analyst，2001，126，1456-1461.中所述的通過共價方法在蛋白質芯片表面固定蛋白質，是使用氨丙基三乙氧基硅烷改性硅表面。此方法形成的共價鍵比物理吸附作用牢固，使得蛋白質相對比較穩定，可以部分解決物理吸附方法存在的蛋白質不穩定問題。但是，在蛋白質芯片表面上用于共價固定蛋白質的基團多為極性的基團，這會進一步增強蛋白質與蛋白質芯片表面間的靜電相互作用，從而使得蛋白質的空間構像發生更大的改變，引起生物活性的降低。
發明內容
本發明的目的在于克服已有固定蛋白質的方法使得蛋白質空間構像發生較大的改變、蛋白質生物活性低、固定的蛋白質不穩定的缺陷，從而提供一種所固定的蛋白質穩定、空間構像所受影響小、生物活性高的、在蛋白質芯片表面固定蛋白質的方法。
本發明的目的是通過如下的技術方案實現的本發明提供一種在蛋白質芯片表面固定蛋白質的方法，包括如下的步驟1)配制組分A和組分B的無水乙醇溶液，其中組分A的濃度為1毫摩爾～1摩爾，組分A和組分B的摩爾比為20～100∶1；所述組分A為能夠使蛋白質芯片表面呈疏水性的有機化合物；所述組分B為一端含有能夠與所需固定的蛋白質分子以共價連接的活性基團、一端含有極性基團的有機化合物；2)將蛋白質芯片的基片放置于步驟1)的溶液中浸泡30分鐘～5小時進行改性；用無水乙醇清洗固體基片3次；再使用常規方法活化組分B的極性基團；3)將所需固定的蛋白質溶液中加入0.05～1wt％非離子型表面活性劑；4)將步驟2)改性的蛋白質芯片的基片放入步驟3)的蛋白質溶液中浸泡30分鐘。
所述組分A為甲基三乙氧基硅烷、十一烷硫醇或甲基三甲氧基硅烷。
所述組分B為氨丙基三乙氧基硅烷、羧基十一烷硫醇或巰基三甲氧基硅烷。
所述蛋白質芯片的基片為玻璃、硅片、金屬或塑料。
所述蛋白質包括人免疫球蛋白G、人血清蛋白、單克隆抗體。
所述非離子型表面活性劑為Tween 20(吐溫)。
該方法的原理是通過兩種有機化合物——組分A和組分B同時使用，在蛋白質芯片表面固定蛋白質。其中，組分A用來封閉蛋白質芯片表面，使蛋白質芯片表面呈強疏水性、電中性，不與蛋白質分子形成氫鍵，如甲基三乙氧基硅烷、烷硫醇等；而組分B為一端含有能夠與所需固定的蛋白質分子以共價連接的活性基團、一端含有極性基團的有機化合物，如氨基三乙氧基硅烷、羧基烷硫醇等。
本發明提供的在蛋白質芯片表面固定蛋白質的方法與已有技術相比，其優點在于1、一方面，該方法使用組分B的活性基團，在蛋白質分子和固體表面間形成共價鍵，固定的蛋白質比較穩定；2、同時，由于蛋白質分子與固體表面之間形成的共價鍵數量越少，就越有利于蛋白質分子保持其空間構像，所以通過控制組分A和組分B的量，使得在一個蛋白質分子覆蓋的面積上，僅以一個共價鍵連接，就足以使其固定在蛋白質芯片表面上，并能夠有效降低蛋白質芯片表面與蛋白質分子間的相互作用，減少蛋白質芯片表面對蛋白質分子的空間構像的影響；3、可以選擇與蛋白質分子的分子量和體積差距大的表面改性的有機分子，這樣用于共價固定蛋白質的有機分子僅需稀疏地散布于蛋白質芯片表面上，就足以形成飽和蛋白質分子膜層，能夠有效降低蛋白質芯片表面與蛋白質分子間的相互作用，減少蛋白質芯片表面對蛋白質分子的空間構像的影響；4、通過加入少量的非離子型表面活性劑，能夠有效抑制蛋白質分子在蛋白質芯片表面上的物理吸附，保持蛋白質分子的空間構像；5、通過調控兩種有機分子的比例，可以定量地控制蛋白質在蛋白質芯片表面上的固定量6、通過這種方法固定的蛋白質的生物活性比通過物理吸附或單純組分B固定的蛋白質生物活性提高1倍以上。
具體實施例方式
實施例1配制甲基三乙氧基硅烷和氨丙基三乙氧基硅烷(二者的摩爾比為20∶1)的混合乙醇溶液，甲基三乙氧基硅烷的濃度為1毫摩爾；將以硅片為基片的蛋白質芯片放置于上述溶液中浸泡5小時進行改性；用無水乙醇清洗固體基片3次；再使用戊二醛活化氨丙基三乙氧基硅烷上的氨基；配制1mg/ml人免疫球蛋白G PBS(磷酸緩沖液)溶液，其中含有0.05wt％Tween 20；
將改性的蛋白質芯片放入此人免疫球蛋白G溶液中浸泡30分鐘。
實施例2配制十一烷硫醇和羧基十一烷硫醇(二者的摩爾比為100∶1)的混合乙醇溶液，十一烷硫醇的濃度為1摩爾；將以金為基片的蛋白質芯片放置于上述溶液中浸泡30分鐘進行改性；用無水乙醇清洗固體基片3次；再使用乙基碳二亞胺(EDC)活化羧基十一烷硫醇的羧基；配制1mg/ml人血清蛋白PBS溶液，其中含有1wt％Tween 20；將改性的蛋白質芯片放入此人血清蛋白溶液中浸泡30分鐘。
實施例3配制甲基三甲氧基硅烷和巰基三甲氧基硅烷(二者的摩爾比為80∶1)的混合乙醇溶液，甲基三甲氧基硅烷的濃度為0.5毫摩爾；將以塑料為基片的蛋白質芯片放置于上述溶液中浸泡2小時進行改性；用無水乙醇清洗固體基片3次；再使用GMBS(N-succinimidyl 4-maleimidobutyrate)活化巰基三甲氧基硅烷的巰基；配制1mg/ml單克隆抗體PBS溶液，其中含有0.5wt％Tween 20；將改性的蛋白質芯片放入此人單克隆抗體溶液中浸泡30分鐘。
權利要求
1.一種在蛋白質芯片表面固定蛋白質的方法，包括如下的步驟1)配制組分A和組分B的無水乙醇溶液，其中組分A的濃度為1毫摩爾～1摩爾，組分A和組分B的摩爾比為20～100∶1；所述組分A為能夠使蛋白質芯片表面呈疏水性的有機化合物；所述組分B為一端含有能夠與所需固定的蛋白質分子以共價連接的活性基團、一端含有極性基團的有機化合物；2)將蛋白質芯片的基片放置于步驟1)的溶液中浸泡30分鐘～5小時進行改性；用無水乙醇清洗固體基片3次；再使用常規方法活化組分B的極性基團；3)將所需固定的蛋白質溶液中加入0.05～1wt％非離子型表面活性劑；4)將步驟2)改性的蛋白質芯片的基片放入步驟3)的蛋白質溶液中浸泡30分鐘。
2.如權利要求1所述的在蛋白質芯片表面固定蛋白質的方法，其特征在于所述組分A為甲基三乙氧基硅烷、十一烷硫醇或甲基三甲氧基硅烷。
3.如權利要求1所述的在蛋白質芯片表面固定蛋白質的方法，其特征在于所述組分組分B為氨丙基三乙氧基硅烷、羧基十一烷硫醇或巰基三甲氧基硅烷。
4.如權利要求1所述的在蛋白質芯片表面固定蛋白質的方法，其特征在于所述蛋白質芯片的基片為玻璃、硅片、金屬或塑料。
5.如權利要求1所述的在蛋白質芯片表面固定蛋白質的方法，其特征在于所述蛋白質包括人免疫球蛋白G、人血清蛋白、單克隆抗體。
6.如權利要求1所述的在蛋白質芯片表面固定蛋白質的方法，其特征在于所述非離子型表面活性劑為Tween 20。
全文摘要
本發明涉及一種在蛋白質芯片表面固定蛋白質的方法。該方法使用組分A和組分B的無水乙醇溶液浸泡蛋白質芯片，所述組分A為能夠使蛋白質芯片表面呈疏水性的有機化合物；所述組分B為一端含有能夠與所需固定的蛋白質分子以共價連接的活性基團、一端含有極性基團的有機化合物；然后使用常規方法活化組分B的極性基團；最后將此蛋白質芯片放入所需固定的蛋白質溶液中浸泡。該方法固定的蛋白質比較穩定；而且能夠有效降低蛋白質芯片表面與蛋白質分子間的相互作用，減少蛋白質芯片表面對蛋白質分子的空間構像的影響；通過這種方法固定的蛋白質的生物活性比通過物理吸附或單純組分B固定的蛋白質生物活性提高1倍以上。
文檔編號C12Q1/68GK1598587SQ03157199
公開日2005年3月23日 申請日期2003年9月18日 優先權日2003年9月18日
發明者王戰會, 靳剛 申請人:中國科學院力學研究所