用于重組生產雪花蓮外源凝集素的大腸桿菌菌株及方法

專利名稱：用于重組生產雪花蓮外源凝集素的大腸桿菌菌株及方法
技術領域：
本發明涉及用于重組生產雪花蓮外源凝集素的大腸桿菌菌株及方法。更具體地說，本發明涉及轉化了表達質粒p22bMG3的大腸桿菌菌株以及利用該菌株重組生產雪花蓮外源凝集素(Snowdrop lectin，Galanthus nivalis agglutinin，GNA)的方法。
背景技術：
植物外源凝集素是植物的防御蛋白，對植物有很重要的生理作用，已成為生物科學和醫學研究中非常有價值的新工具，如分離和鑒定糖蛋白和糖脂，研究細胞和組織的組織化學新試劑，細胞分型，分離淋巴細胞和骨髓細胞，評估疾病患者的免疫狀態，染色體分析等。雪花蓮(Galanthus nivalis)外源凝集素(GNA)具有甘露糖特異結合活性。除了上述用途之外，對人類和動物的巨細胞病毒及逆轉錄病毒，具有強烈及選擇性的抑制作用，正成為艾滋病研究的一個重要工具。另外，GNA對刺吸式和某些咀嚼式害蟲、以及線蟲均有毒性，在害蟲和線蟲病防治方面具有廣闊的應用前景。
目前GNA的制備方法主要是從雪花蓮球莖中提取，因含量少、原料缺、分離方法繁瑣，導致天然GNA的成本高、價格昂貴，僅美國Sigma公司有商品GNA出售，常常出現缺貨。這嚴重制約了GNA的開發利用。
雪花蓮外源凝集素的基因已被克隆，其核苷酸序列及相應的氨基酸序列已被公開(參見van Damme，E.J.M.，Kaku，H.，Perini，F.，Goldstein，I.J.，Peeters，B.，Yagi，F.，Decock，B.and Peumans，W.1993.Biosynthesis，primary structure and molecular cloning ofsnowdrop(Galanthus nivalis L.)lectin.GenBank，1993，(Protein)，ACCESSION AAA33346.(Nucleotide)Locus GAAL2A accessionM55556.1)。然而，目前尚沒有快速，簡便，高效且經濟地重組生產GNA的方法。本發明為滿足現有技術中的這一需要提供了一種途徑。

發明內容
本發明的一個目的是提供可用于重組生產雪花蓮外源凝集素(GNA)的大腸桿菌菌株。
本發明的另一目的是提供重組生產雪花蓮外源凝集素(GNA)的方法。


圖1是pC1300UG質粒的結構示意圖。
圖2是重組質粒pMGT42的結構示意圖。
圖3是大腸桿菌表達載體pET22b(+)的結構示意圖。
圖4是重組表達質粒p22bMG3的結構示意圖。
圖5是重組GNA多肽的完整氨基酸序列(SEQ ID NO1)及相應的編碼核苷酸序列(SEQ ID NO2)。
具體實施例方式
本發明涉及轉化了p22bMG3或者其衍生物的多種大腸桿菌菌株或者其衍生菌株，它們可以用來生產雪花蓮外源凝集素。
在本發明的上下文中，重組質粒的“衍生物”是指在質粒中外源基因的位置之外可以存在一些不影響該外源基因表達的額外序列，或者可以在雪花蓮外源凝集素的編碼序列中存在一些不改變所編碼氨基酸的突變。普通技術人員知曉，不同的宿主生物存在比較偏愛的密碼子用法。優選地，GNA編碼基因針對待選用的宿主細胞而進行了密碼子優化，以適于在其中表達。在一個實施方案中，所述額外序列可以是其他外源基因。在另一個實施方案中，所述額外序列可以是有助于本發明雪花蓮外源凝集素純化的標記序列，例如六組氨酸標記序列。在又一個實施方中，所述額外序列還可以是插入其中的接頭序列，以便于例如其他基因的克隆。
在本發明的上下文中，大腸桿菌宿主菌株的“衍生菌株”是指在宿主菌株的培養過程中形成的菌株，包括例如由其單克隆形成的菌株，或者在長期的傳代培養過程中可能形成的因形態、外觀或某些物理化學性質發生了改變、但與親本菌株相比生產外源蛋白質例如雪花蓮外源凝集素的能力未受到削弱的菌株，包括例如缺失了某些內源性蛋白酶基因的突變菌株。
可用本發明中宿主菌株可以是本領域已知用于異源蛋白生產的任何大腸桿菌宿主菌株，包括市售的那些。
在一個實施方案中，所述大腸桿菌宿主菌株是BL21(美國Novagen公司產品)。在另一個實施方案中，所述大腸桿菌宿主菌株是BL21的衍生菌株BL21(DE3)或B834(DE3)(美國Novagen公司產品)等。
本發明包含了表達質粒p22bMG3或者其衍生物的重組大腸桿菌菌株可以用于基因工程化生產雪花蓮外源凝集素。該生產方法包括如下步驟(1)在合適的營養培養基中在適于雪花蓮外源凝集素表達的條件下培養本發明的上述重組大腸桿菌菌株；(2)從所得細胞培養物中回收所表達的重組雪花蓮外源凝集素。
在本發明方法中，利用本領域已知方法，在適于生產重組雪花蓮外源凝集素的營養培養基中培養細胞。例如，可在實驗室或工業用發酵罐內，在合適的培養基中、允許表達和/或分離該多肽的條件下經搖瓶培養、小規模或大規模發酵(包括連續、分批、分批補料或固相發酵)培養該細胞。培養是利用本領域已知方法(參見如Bennett J.W.和LaSure L.編，More Gene Manipulations in Fungi，學術出版社，CA，1991)，在含碳、氮源和無機鹽的適宜營養培養基中進行的。適當的培養基可商購，或按照公開的組合物(如美國典型培養物保藏中心的目錄中)配制而成，包括本領域中眾所周知的那些，例如LB培養基，TB培養基，SOB培養基，NZCYM培養基，等等。
本發明的重組菌株可以在任何合適的溫度，例如18-37℃下培養，以表達雪花蓮外源凝集素。優選地，可以在常溫下，例如18-30℃，更優選地20-28℃，尤其是22-25℃溫度下進行培養和發酵。
在發酵過程中，可以向培養物中添加任何合適濃度的IPTG來進行誘導，例如IPTG終濃度為0.1-1.0mmol/L，優選地0.2-0.8mmol/L，更優選地0.2-0.5mmol/L。普通技術人員根據現有技術中的常規程序，即可很容易確定各種發酵工藝中的相應條件。
發酵時間依具體情況而定，可以是幾小時至數十小時。優選地2-10小時，更優選地5-8小時。
發酵后，以常規蛋白質分離和純化方法從培養物中回收所表達的蛋白質。已知的純化方法包括從培養基中過濾分離細胞、采用超聲波破碎法、凍融裂解法、溶菌酶法和高速珠磨法破碎重組大腸桿菌細胞、采用尿素或十二烷基肌氨酸鈉等溶解包涵體，以及層析方法(如離子交換層析，親和層析，疏水層析，層析聚焦，和大小排阻層析)，電泳方法(如制備性等電聚焦(IEF))，差異溶解性(如硫酸銨沉淀)，或者提取(參看，如《蛋白質純化》，J.-C.Janson和Lars Ryden編著，VCHPublishers，紐約，1989)。
下面參考實施例對本發明作進一步說明。
實施例1 重組表達質粒的創建參照“羅素蘭等，GNA成熟蛋白基因的亞克隆及其大腸桿菌表達載體的構建。生物技術，2002(6)1-2”描述的操作構建重組表達質粒。具體地說，包括以下流程(1)GNA基因的克隆以pC1300UG(附圖1，由復旦大學唐克軒教授贈送)為模板，用P4(5′GCCCATGGACAATATTTTGTACTCC 3′，SEQ ID NO3，下劃線為添加的NcoI限制性酶切位點)和P2(5′TGGTCGACTCATCCAGTAGCCCAACGATC 3′，SEQ ID NO4下劃線為添加的SalI限制性酶切位點)進行PCR擴增。PCR條件如下在PE公司2400型PCR儀上進行，循環程序為94℃，5min；94℃30s，60℃30s，72℃40s(30cycles )；72℃5min。電泳檢測顯示得到了一條330bp的DNA條帶。用Promega公司的DNA Clean-up試劑盒回收PCR產物，克隆在T-vector(Promega公司)上，轉化經CaCl2處理過的感受態大腸桿菌XL1菌株，并對涂布了IPTG(8mg/mL)和X-gal(20mg/mL)的LB瓊脂平板進行鋪板。37℃下培養過夜后，利用蘭白菌落挑選重組子。經堿法小量制備質粒DNA，進行測序。經核對序列，證實重組質粒中插入了MGNA基因，并且附加的酶切位點和終止密碼序列完全正確。將重組質粒命名為pMGT42。
(2)構建GNA重組表達質粒用NcoI/SalI雙酶切pMGT42，回收約300bp的插入片段，并插入到同樣經NcoI/SalI雙酶切的pET22b(+)(Novagen，附圖3)內，得到與pelB信號肽融合的GNA原核表達載體p22bMG3(附圖4)。通過酶切和測序證實了連接的正確性(附圖5)。
2 轉化大腸桿菌宿主菌株將上述構建的GNA原核表達載體p22bMG3導入宿主菌株E.coli菌株BL21(Novagen公司)中，獲得了重組大腸桿菌菌株E22bMG3。該菌株已于2003年6月5日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(中國北京市海淀區中關村北一條13號，100080)，保藏號為CGMCC0935。
3 重組GNA的發酵生產和純化方法(1)挑取E22bMG3單菌落接種在5mL(含Amp 100mg/L)的LB培養基中，于37℃過夜培養。
(2)取過夜培養物1mL接種到500mL LB培養基中培養2-3h，至OD600約0.3～0.6時，加入250μL 1mol/L IPTG貯液。于22℃繼續培養5h以誘導GNA的表達。
(3)經3000rpm離心收獲菌體沉淀，用超聲破碎法破碎細胞，并將細胞裂解物于8000rpm速度離心。所得上清即為可溶性蛋白樣品，沉淀為不溶性蛋白聚集體(包涵體)。
(4)用去污劑0.2％SKL((十二烷基肌氨酸鈉水溶液))室溫溶解包涵體20min。
(5)用透析液Buf A(含50mmol/L Tris-HCl(pH7.9)，0.5mmol/LEDTA，50mmol/L NaCl)室溫透析6-8h，去除SKL，使變性的重組GNA蛋白重折疊。用Buf A+50％甘油室溫再透析6h，濃縮重組GNA溶液至10倍。經SDS-PAGE及UVI凝膠分析系統測知純度達98％以上。
(6)將E22bMG3的可溶性蛋白樣品和重折疊GNA蛋白經甘露糖瓊脂糖柱(美國SIGMA Co.產品)層析。先用6倍體積NaCl/Pi(1.5mmol/L KH2PO4，8mmol/L Na2HPO4，2.7mmol/L KCl，137mmol/L NaCl，pH7.4)洗柱去除未結合蛋白，再用20mmol 1，3-二氨基丙烷洗脫獲得GNA蛋白。由此得到高純度的活性GNA。冷凍干燥得純品GNA。其產率約為15mg重組GNA。
4 重組GNA的活性測試(1)用SDS-PAGE和Western Blot分析證明所獲得的重組蛋白確為GNA。重組GNA用SDS-PAGE電泳分析，分離膠為15-20％的聚丙烯酰胺凝膠、5％積層膠，結果得到一條約12.5KD大小的條帶，與天然GNA(SIGMA Co.)一樣。用兔抗天然GNA的抗血清為一抗，偶聯辣根過氧化物酶的羊抗兔IgG(Bio-Rad)為二抗進行Western Blot分析。結果表明重組GNA可與天然GNA的抗體特異結合，并顯示雜交信號。
(2)重組GNA的凝血活性測定按照毛雪等(毛雪，高麗峰，李彩霞，李潤植。植物凝集素對蚜蟲的抗生效應。山西農業大學學報1999，19(2)；122-124，144。)的方法測定不同濃度梯度重組GNA與天然GNA對2％兔血紅細胞懸浮液的凝集活性。結果表明0.1-0.2mg/L重組蛋白即有凝血活性，與天然GNA的0.2mg/L凝集最低濃度一致。說明重組GNA與天然GNA具有相同的凝血活性。
(3)重組GNA抗蟲活性測定 按李彩霞等[李彩霞，高麗峰，李潤植，全純人工營養液飼養蚜蟲研究，山西農業大學學報，1997，17(3)217～221]方法人工飼養棉蚜(Aphis gossypii Glover)和蘿卜蚜(Rhopalosiphum pseudobrassicae Davis)，將不同濃度梯度重組GNA與天然GNA加入蚜蟲人工食料中，觀測對蚜蟲的抗生效應。結果顯示，0.1g/L重組GNA即對棉蚜和蘿卜蚜具有毒性，與天然GNA無顯著差異。用不同濃度梯度重組GNA直接噴殺飼養在盆栽小白菜[B.campestvis ssp.chinensis(L.)Makino]上的蚜蟲，和接種蚜蟲在事先噴布重組GNA的葉片上的方法測試抗蟲活性。結果表明濃度在0.2-0.5g/L范圍內對蚜蟲有明顯的毒性，毒性強度隨濃度的升高而增強。
因此可得出，本發明所得重組GNA與天然GNA完全一樣，且具有天然GNA的所有生物活性。
上述實施例只是為了闡明、而不是限制本發明。相關領域的技術人員清楚地知道，可對本文所述的內容作其它適當的修飾和變化，并可在本發明或其任何實施方案的范圍內進行這種修飾和變化。這樣的修飾和變化都落入本發明的保護范圍。
序列表<110> 海南大學<120> 用于重組生產雪花蓮外源凝集素的大腸桿菌菌株及方法<130><160> 4<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 333<212> DNA<213> 人工序列<400> 1gcccatggac aatattttgt actccggtga gactctctct acaggggaat ttctcaacta 60cggaagtttc gtttttatca tgcaagagga ctgcaatctg gtcttgtacg acgtggacaa120gccaatctgg gcaacaaaca caggtggtct ctcccgtagc tgcttcctca gcatgcagac180tgatgggaac ctcgtggtgt acaacccatc gaacaaaccg atttgggcaa gcaacactgg240aggccaaaat gggaattacg tgtgcatcct acagaaggat aggaatgttg tgatctacgg300aactgatcgt tgggctactg gatgagtcga cca 333<210> 2<211> 105<212> PRT<213> 人工序列<400> 2Asp Asn Ile Leu Tyr Ser Gly Glu Thr Leu Ser Thr Gly Glu Phe Leu1 5 10 15Asn Tyr Gly Ser Phe Val Phe Ile Met Gln Glu Asp Cys Asn Leu Val20 25 30Leu Tyr Asp Val Asp Lys Pro Ile Trp Ala Thr Asn Thr Gly Gly Leu35 40 45Ser Arg Ser Cys Phe Leu Ser Met Gln Thr Asp Gly Asn Leu Val Val50 55 60Tyr Asn Pro Ser Asn Lys Pro Ile Trp Ala Ser Asn Thr Gly Gly Gln65 70 75 80Asn Gly Asn Tyr Val Cys Ile Leu Gln Lys Asp Arg Asn Val Val Ile85 90 95Tyr Gly Thr Asp Arg Trp Ala Thr Gly100 105<210> 3<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<400> 3gcccatggac aatattttgt actcc 25<210> 4<211> 29<212> DNA<213> 人工序列<400> 4tggtcgactc atccagtagc ccaacgatc 29
權利要求
1.轉化了表達質粒p22bMG3或者其衍生物的大腸桿菌菌株。
2.根據權利要求1的大腸桿菌菌株，它是大腸桿菌菌株BL21或者其衍生菌株。
3.根據權利要求1的大腸桿菌菌株，它的保藏號為CGMCC No0935。
4.一種重組生產雪花蓮外源凝集素的方法，包括在適于表達雪花蓮外源凝集素的條件下在合適的培養基中培養權利要求1的大腸桿菌菌株，以及從培養物中回收表達的雪花蓮外源凝集素。
5.根據權利要求4的方法，其中所述大腸桿菌菌株是BL21或者其衍生菌株。
6.根據權利要求5的方法，其中所述大腸桿菌菌株是保藏號為CGMCC No0935的大腸桿菌菌株。
7.根據權利要求4的方法，其中向培養物中加入終濃度為0.1～1.0mmol/L IPTG以誘導雪花蓮外源凝集素的表達。
8.根據權利要求7的方法，其中向培養物中加入終濃度為02-0.5mmol/L IPTG以誘導雪花蓮外源凝集素的表達。
9.根據權利要求4的方法，其中所述大腸桿菌菌株在18～30℃的溫度下培養5～8小時以誘導雪花蓮外源凝集素的表達。
10.根據權利要求9的方法，其中所述大腸桿菌菌株在20～28℃的溫度下培養以誘導雪花蓮外源凝集素的表達。
全文摘要
本發明涉及轉化了表達質粒p22bMG3或者其衍生物的大腸桿菌菌株以及利用所述菌株重組生產雪花蓮外源凝集素(GNA)蛋白的方法。
文檔編號C12N15/70GK1483816SQ0315430
公開日2004年3月24日 申請日期2003年8月14日 優先權日2003年8月14日
發明者羅素蘭 申請人:海南大學