專利名稱：一種昆蟲病毒繁殖中的收集方法
技術領域：
本發明涉及一種昆蟲病毒繁殖技術，更具體地說，本發明涉及一種昆蟲病毒繁殖中的高產及收集方法。
背景技術：
茶尺蠼、茶毛蟲、扁刺蛾等是茶樹的主要食葉性害蟲。為了降低茶葉中化學農藥的殘留量，應用昆蟲病毒殺蟲劑是茶樹害蟲的有效生物防治途徑。但昆蟲病毒只能在活體(細胞)中繁殖，不能像真菌、細菌那樣用培養基中進行發酵的方法來大量生產。迄今國內外進行昆蟲病毒生產的方法是，大量飼養幼蟲，到一定蟲齡，使幼蟲取食病毒感染體，病毒在幼蟲體內不斷繁殖，當體內充滿病毒時幼蟲死亡，在幼蟲開始死亡后逐日收集蟲尸和瀕死幼蟲(估計下一天會死亡的幼蟲)，收集完畢后再提取蟲尸中的病毒，制成生物病毒殺蟲劑。但在目前昆蟲病毒生產中存在著生產周期長，病毒產量低。如茶尺蠼，產量僅1～1.5億多角體(PIB)/頭，病毒收集工作費工又費時，操作十分煩瑣，如一般幼蟲飼毒7～8天后開始死亡，即每天要收集蟲尸與瀕死幼蟲，約需收集7～8天，這飼毒、繁毒、收集全過程需經15～16天才能結束，同時，收集蟲尸時少數蟲尸已解體，難于取出，也有的蟲尸在收集時破碎，病毒產量受損失，收集瀕死幼蟲也較難確認，因此，如何提高單蟲病毒產量及簡化昆蟲病毒繁殖中的收集方法是迫切需要解決的技術問題。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的不足之處，提供一套生產周期短，病毒產量高，并能一次性快速收集病毒的方法。
本發明目的通過下述技術方案予以實現。
一種昆蟲病毒繁殖中的收集方法，包括以下步驟(1)健康幼蟲的飼養以廣口透明瓶為容器，在20～30℃條件下添加飼料，飼養健康幼蟲8～10天，飼養密度由密逐步放稀至10頭幼蟲/100cm3；(2)適齡幼蟲的飼毒感染及病毒繁殖在20～30℃條件下，選用3齡中期健康幼蟲，始食含0.005億多角體(PIB)/毫升濃度病毒的飼料，飼毒3天后再改用無毒飼料，感染病蟲在體內逐步繁殖病毒；(3)蟲體病毒的收集3齡中期幼蟲飼毒7～8天后，即剛開始有蟲死亡時，一次性將所有活幼蟲及少量蟲尸收集到廣口容器中，按60～100頭蟲/100cm3密度在15℃恒溫條件下保存20～30天，幼蟲在此期間繼續繁毒并緩慢死亡；(4)病毒的提取與劑型配置上述蟲尸經浸泡、研碎、過濾、離心沉淀，顯微鏡測數，定量稀釋成病毒液后，再輔以填料、助劑等配置成病毒生物農藥。
所述幼蟲飼料為鮮食飼料，如新鮮茶樹葉或人工配合飼料；所述幼蟲飼毒，繁毒最佳溫度為24℃。
本發明所述方法的有益效果，一是顯著提高病毒繁殖的產量，本發明從蟲卵孵化開始，科學組配了3齡中期幼蟲，0.005億多角體/毫升飼毒濃度及24℃恒溫繁毒的工藝方案，既為病毒繁殖提供了最大的蟲體(即為病毒載體與營養源)，又提供了充足的繁毒時間，使感病幼蟲均在蛹期前夕充分繁毒后死亡，從而使單蟲產毒量由1～1.5億PIB提高到4～6億PIB左右；二是簡化了病毒收集的方法，提高了效率，新方法采用一次性收集所有感病活蟲及少量蟲尸，可在一天內完成，操作簡便、易行，大面積病毒繁殖周期由原來的15～16天縮短為7～8天，其用工、用電均減少50％左右，也可增加病毒繁殖的批次，同時新方法也不存在由于蟲尸體破裂而造成部分病毒損失，從而使每批次病毒產量提高10％以上。
具體實施例方式
下面結合3個實施例對本發明作進一步的描述。
實施例1 茶尺蠖病毒生產工藝(一)幼蟲的飼養1.將1對成蟲(雌、雄)放在玻璃罐頭瓶(玻璃容器)中飼養，產卵后取出成蟲。
2.上述卵孵化為幼蟲時，加入飼料(茶葉或人工飼料)飼養，飼料食完前應添加飼料。隨著幼蟲不斷長大，1個瓶內的幼蟲分為3瓶或多瓶，最后使每瓶的蟲數為50頭左右。用人工飼料飼養的應多分幾瓶，每瓶10~15頭。
(二)病毒繁殖(增殖)3.上述幼蟲在24℃下飼養7～8天時，加入有毒葉片(葉片在0.005億多角體/ml的病毒液中浸濕后取出晾干)飼毒，3天后再用無毒葉片飼養；用人工飼料飼養的則用喉頭噴霧器和上述病毒液將瓶內飼料表面噴濕潤即成。
4.上述幼蟲從取食有毒葉片(飼毒日期)起飼養7～8天后，幼蟲開始死亡，此時將活幼蟲抓在罐頭瓶中(每瓶300～500頭)，放在15℃的恒溫中保存25天(此期間活幼蟲均緩慢死亡)后即可提取病毒，或轉放到冰箱4℃中保存。
(三)病毒提取與劑型配制5.上述蟲尸加少量水浸泡數天。
6.浸泡過的蟲尸用組織搗碎機搗碎。
7.搗碎液加適量水后用雙層紗布或銅60目紗過濾，棄去殘渣、取濾液。
8.濾液經300～500轉/分離心沉淀，棄去沉淀，取溶液(病毒液)。
9.病毒液經3000～4000轉/分離心沉淀，棄去上清液，取沉淀(病毒多角體)。
10.上述沉淀加水攪勻后再經3000～4000轉/分離心沉淀一次，棄去上清液，取沉淀(病毒多角體)。
11.上述沉淀加少量蒸餾水攪勻洗出，即獲得純病毒多角體原液。
12.病毒原液用顯微鏡血球計數法測出多角體含量，再加定量水稀釋成一定濃度的病毒液。
13.將填料高嶺土、助劑乳化劑等與病毒液按一定比例混勻后，即獲得茶尺蠖病毒制劑生物農藥。
實施例2茶毛蟲病毒生產工藝(一)幼蟲的飼養1.將1對成蟲(雌、雄)放在玻璃罐頭瓶(玻璃容器)中飼養，產卵后取出成蟲。、2.上述卵孵化為幼蟲時，加入飼料(茶葉或人工飼料)飼養，飼料食完前應添加飼料。隨著幼蟲不斷長大，1個瓶內的幼蟲分為3瓶或多瓶，最后使每瓶的蟲數為50頭左右。用人工飼料飼養的應多分幾瓶，每瓶10～15頭。
(二)病毒繁殖(增殖)3.上述幼蟲在24℃下飼養25天時，加入有毒葉片(葉片在0.005億多角體/ml的病毒液中浸濕后取出晾干)飼毒，3天后再用無毒葉片飼養，用人工飼料飼養的則用喉頭噴霧器和上述病毒液將瓶內飼料表面噴濕潤即成。
4.上述幼蟲從取食有毒葉片(飼毒日期)起飼養10天后，幼蟲開始死亡，此時將活幼蟲抓在罐頭瓶中(每瓶300～500頭)，放在25℃的恒溫中保存25天，此期間活幼蟲均緩慢死亡后即可提取病毒，或轉放到冰箱4℃中保存。
(三)病毒提取與劑型配制5.上述蟲尸加少量水浸泡數天。
6.浸泡過的蟲尸用組織搗碎機搗碎。
7.搗碎液加適量水后用雙層紗布或60目銅紗過濾，棄去殘渣、取濾液。
8.濾液經300～500轉/分離心沉淀，棄去沉淀，取溶液(病毒液)。
9.病毒液經3000～4000轉/分離心沉淀，棄去上清液，取沉淀(病毒多角體)。
10.上述沉淀加水攪勻后再經3000～4000轉/分離心沉淀一次，棄去上清液，取沉淀(病毒多角體)。
11.上述沉淀加少量蒸餾水攪勻洗出，即獲得純病毒多角體原液。
12.病毒原液用顯微鏡血球計數法測出多角體含量，再加定量水稀釋成一定濃度的病毒液。
13.將填料高嶺土、助劑乳化劑等與病毒液按一定比例混勻后，即獲得茶毛蟲病毒制劑生物農藥。
實施例3 扁刺蛾病毒生產工藝(一)幼蟲的飼養1.將1對成蟲(雌、雄)放在玻璃罐頭瓶(玻璃容器)中飼養，產卵后取出成蟲。
2.上述卵孵化為幼蟲時，加入飼料(茶葉或人工飼料)飼養，飼料食完前應添加飼料。隨著幼蟲不斷長大，1個瓶內的幼蟲分為3瓶或多瓶，最后使每瓶的蟲數為50頭左右。用人工飼料飼養的應多分幾瓶，每瓶10～15頭。
(二)病毒繁殖(增殖)3.上述幼蟲在24℃下飼養15天時，加入有毒葉片(葉片在0.005億多角體/ml的病毒液中浸濕后取出晾干)飼毒，3天后再用無毒葉片飼養，用人工飼料飼養的則用喉頭噴霧器和上述病毒液將瓶內飼料表面噴濕潤即成。
4.上述幼蟲從取食有毒葉片(飼毒日期)起飼養7～8天后，幼蟲開始死亡，此時將活幼蟲抓在罐頭瓶中(每瓶300～500頭)，放在15℃的恒溫中保存25天，此期間活幼蟲均緩慢死亡后即可提取病毒，或轉放到冰箱4℃中保存。
(三)病毒提取與劑型配制5.上述蟲尸加少量水浸泡數天。
6.浸泡過的蟲尸用組織搗碎機搗碎。
7.搗碎液加適量水后用雙層紗布或60目銅紗過濾，棄去殘渣、取濾液。
8.濾液經300～500轉/分離心沉淀，棄去沉淀，取溶液(病毒液)。
9.病毒液經3000～4000轉/分離心沉淀，棄去上清液，取沉淀(病毒多角體)。
10.上述沉淀加水攪勻后再經3000～4000轉/分離心沉淀一次，棄去上清液，取沉淀(病毒多角體)。
11.上述沉淀加少量蒸餾水攪勻洗出，即獲得純病毒多角體原液。
12.病毒原液用顯微鏡血球計數法測出多角體含量，再加定量水稀釋成一定濃度的病毒液。
13.將填料高嶺土、助劑乳化劑等與病毒液按一定比例混勻后，即獲得扁刺蛾病毒制劑生物農藥。
權利要求
1.一種昆蟲病毒繁殖中的收集方法，其特征是包括以下步驟(1)健康幼蟲的飼養以廣口透明瓶為容器，在20～30℃條件下添加飼料，飼養健康幼蟲8～10天，飼養密度由密逐步放稀至10頭幼蟲/100cm3；(2)適齡幼蟲的飼毒感染及病毒繁殖在20～30℃條件下，選用3齡中期健康幼蟲，始食含0.005億多角體/毫升濃度病毒的飼料，飼毒3天后再改用無毒飼料，感染病蟲在體內逐步繁殖病毒；(3)蟲體病毒的收集3齡中期幼蟲飼毒7～8天后，即剛開始有蟲死亡時，一次性將所有活幼蟲及少量蟲尸收集到廣口容器中，按60～100頭蟲/100cm3密度在15℃恒溫條件下保存20～30天，幼蟲在此期間繼續繁毒并緩慢死亡；(4)病毒的提取與劑型配置上述蟲尸經浸泡、研碎、過濾、離心沉淀，顯微鏡測數，定量稀釋成病毒液后，再輔以填料、助劑等配置成病毒生物農藥。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述幼蟲飼料為鮮食飼料或人工配合飼料。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述幼蟲飼毒，繁毒最佳溫度為24℃。
全文摘要
本發明公開了一種昆蟲病毒繁殖中的收集方法，旨在提高昆蟲病毒的產量并簡化病毒繁殖中的收集方法，它以3齡中期的幼蟲為適宜蟲齡，0.005億多角體/毫升濃度飼養3天，在24℃環境下試驗7～8天后即可一次性將活幼蟲收集，在15℃恒溫條件下保存20～30天后，提取病毒并加工成昆蟲病毒殺蟲劑，該法單蟲產量由1～1.5億PIB提高到4～6億PIB，并大大簡化了病毒收集的工序，用工、用電均接省50％左右，并使每批次病毒產量提高10％以上。
文檔編號C12N7/01GK1584021SQ0315044
公開日2005年2月23日 申請日期2003年8月20日 優先權日2003年8月20日
發明者殷坤山, 肖強, 唐美君, 郭華偉 申請人:中國農業科學院茶葉研究所