Sars冠狀病毒的s蛋白的抗原表位、其抗體、編碼核酸以及含有它們的組合物的制作方法

專利名稱：Sars冠狀病毒的s蛋白的抗原表位、其抗體、編碼核酸以及含有它們的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的SARS冠狀病毒抗原表位、它的抗體及其抗原結(jié)合片斷、編碼它的核酸、含有它們的藥物組合物，診斷和治療SARS及相關(guān)疾病的方法。
背景技術(shù)：
SARS的病原學(xué)重癥急性呼吸綜合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)是一種急性呼吸道傳染病，主要通過(guò)近距離空氣飛沫和密切接觸傳播，起病急、傳染性強(qiáng)、流行面廣、病情嚴(yán)重，病死率高達(dá)15％。嚴(yán)重危害到人類的身心健康，并對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成了很大的損害。2003年全世界范圍爆發(fā)的SARS發(fā)病人數(shù)高達(dá)8000人左右。WHO于2003年4月16日正式宣布引起SARS的病原體為冠狀病毒屬中新出現(xiàn)的一種新的病毒，并命名為SARS冠狀病毒(SARS-coV)。
SARS冠狀病毒的簡(jiǎn)介1.SARS-coV概述SARS 冠狀病毒屬于巢狀病毒目(OrderNidovirales)，冠病毒科(FamilyCooronaviridae)，冠狀病毒屬(GenusCoronavirus)，SARS冠狀病毒種(SpeciesSARS Coronavirus)。根據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)分類，它屬于單鏈正義RNA病毒[(+)sense，ssRNA Virus]。
2.SARS-coV蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)是病毒的一類主要成份，蛋白質(zhì)的組成氨基酸及順序決定病毒株系的差異，抗原決定簇則決定其免疫特異性。病毒的蛋白質(zhì)根據(jù)是否存在于病毒顆粒中，分為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白指由病毒基因組編碼的，在病毒復(fù)制或基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中具有一定功能，但不構(gòu)成病毒顆粒結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。結(jié)構(gòu)蛋白系指構(gòu)成一個(gè)形態(tài)成熟的有感染性的病毒顆粒所必需的蛋白質(zhì)。包括殼體蛋白、包膜蛋白和毒粒酶等。SARS病毒包膜有主要三種糖蛋白，即S蛋白(spikeprotein)、M蛋白(Membrane protein)和E蛋白(Envelope protein)。
3.S蛋白(spike protein)S蛋白即病毒顆粒表面伸出包膜的棒-球形糖蛋白。它在與宿主細(xì)胞的表面受體結(jié)合并介導(dǎo)膜融合進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，也是冠狀病毒主要的抗原蛋白。S蛋白由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成?？拷麼端的部分形成一個(gè)球狀結(jié)構(gòu)域，靠近C端的部分形成一個(gè)穿膜的棒狀結(jié)構(gòu)。對(duì)已知的冠狀病毒的研究已經(jīng)證明S蛋白與冠狀病毒侵入細(xì)胞的過(guò)程密切相關(guān)。細(xì)胞中S蛋白前體合成后被切成兩個(gè)部分S1和S2。其中S1形成成熟蛋白的球狀部分，S2形成成熟蛋白的棒狀部分。S2包括一個(gè)N螺旋，一個(gè)M螺旋，一個(gè)C螺旋和一個(gè)穿膜部分。S1和S2之間通過(guò)分子間作用力相互結(jié)合。S2的穿膜部分把整個(gè)蛋白固定在病毒外殼膜上。冠狀病毒的S蛋白長(zhǎng)度為1255個(gè)氨基酸，是結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)編碼的最大的蛋白質(zhì)。穿膜區(qū)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在1197-1218位氨基酸處有一段穿膜序列，推測(cè)可能就是蛋白和病毒外殼膜結(jié)合的位置。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在約729-770，879-1016，1164-1185位氨基酸處分別可能為S2中的N/M/C螺旋。信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，N端1-13位氨基酸可能為信號(hào)肽序列。
對(duì)冠狀病毒科中的鼠肝炎病毒的侵染過(guò)程研究表明病毒要侵入宿主需要細(xì)胞表面受體的介導(dǎo)，參與受體識(shí)別的特定位點(diǎn)位于蛋白S1球狀部分的內(nèi)部。當(dāng)S1通過(guò)受體結(jié)合位點(diǎn)和宿主細(xì)胞膜受體結(jié)合后，導(dǎo)致S1和S2蛋白之間的分子間結(jié)合力減弱，S1和S2分離，從而暴露S2上的3個(gè)螺旋，穿過(guò)宿主細(xì)胞膜，使病毒外殼膜和宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合。S1和S2之間結(jié)合力的強(qiáng)弱是影響冠狀病毒侵染性強(qiáng)弱的重要因素之一。
過(guò)強(qiáng)自身免疫反應(yīng)是目前認(rèn)為最有可能解釋冠狀病毒引起急性肺損傷的機(jī)制。冠狀病毒所具有的結(jié)構(gòu)蛋白和5個(gè)全新的未知的蛋白進(jìn)入機(jī)體后不能為機(jī)體已有的抗體有效結(jié)合，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)異體蛋白持續(xù)存在，刺激機(jī)體發(fā)生過(guò)度的免疫反應(yīng)，釋出多種大量炎性因子，快速、大規(guī)模的破壞肺組織結(jié)構(gòu)，引起急性肺損傷，導(dǎo)致急性呼吸綜合癥。對(duì)病毒感染注射疫苗是最好的預(yù)防方法。SARS病人的治療方法目前正處于研究階段，如RNA干涉，反義核酸，抗病毒肽，治療性抗體，肽酶抑制劑等。
SARS-coV抗原表位的研究抗原表位(epitope)，又稱抗原決定簇(antigenic determinant)，是抗原性物質(zhì)表面誘導(dǎo)相應(yīng)抗體并與之結(jié)合的決定該抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)?？乖砦皇敲庖邞?yīng)答和免疫反應(yīng)特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)。可分為順序決定簇(連續(xù)決定簇)和構(gòu)象決定簇(不連續(xù)決定簇)。抗原表位是抗原中誘生特異性免疫應(yīng)答的最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，通常8-15個(gè)氨基酸大小。
迄今為止，尚未有關(guān)于SARS-coV抗原表位的報(bào)道，也沒(méi)有診斷或治療SARS的有效試劑或藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其含有選自下列組的序列(a) SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16或18所示的核苷酸序列；(b) 編碼SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15或17所示氨基酸序列的核苷酸序列；(c) 在中度嚴(yán)緊或高嚴(yán)緊條件下可與(a)或(b)的序列雜交的序列，并基本保持(a)或(b)序列的活性；(d) (a)或(b)的序列的變體序列，其中含有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失、添加、或替代，并基本保持(a)或(b)序列的活性；
(e) 與(a)或(b)的序列有至少約75％同一性的序列；(f) 與(a)或(b)的序列有至少約90％同一性的序列；(g) (a)或(b)的序列的簡(jiǎn)并變體；和(h) 以上序列的互補(bǔ)序列。
本發(fā)明還涉及一種分離的肽，其含有選自下列組的氨基酸序列(a) SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15或17所示氨基酸序列；(b) 本發(fā)明的多核苷酸編碼的序列；(c) 與本發(fā)明的多核苷酸編碼的氨基酸序列有至少約70％同一性的序列；(d) 與本發(fā)明的多核苷酸編碼的氨基酸序列有至少約90％同一性的序列；和(e) (a)序列的含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入、缺失、替代、添加并基本保持其活性的變體。
本發(fā)明還涉及表達(dá)載體，包含可操作地與表達(dá)控制序列連接的本發(fā)明的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及用根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，例如原核細(xì)胞(包括大腸桿菌細(xì)胞)和真核細(xì)胞(如酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。
本發(fā)明還涉及分離的抗體、或其抗原結(jié)合片斷，其特異地與本發(fā)明的肽結(jié)合。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的肽的衍生物、聚合物、串聯(lián)體或環(huán)化結(jié)構(gòu)，或包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的肽的融合蛋白。
本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的肽結(jié)合的核酸適配子，例如oligobody。
本發(fā)明還涉及檢測(cè)患者是否患有SARS的方法，包括步驟(a) 從患者得到生物學(xué)樣品；(b) 用可結(jié)合本發(fā)明的肽的結(jié)合劑接觸此生物學(xué)樣品；(c) 檢測(cè)樣品中與該結(jié)合劑結(jié)合的肽的量；和(d) 將此肽量與預(yù)先確定的截?cái)嘀颠M(jìn)行比較，由此確定患者是否患有SARS。
本發(fā)明還涉及一種診斷試劑盒，其含有(a) 本發(fā)明的多核苷酸；(b) 與本發(fā)明的多核苷酸在中等嚴(yán)緊或高嚴(yán)緊條件下雜交的多核苷酸；(c) 本發(fā)明的肽；(d) 本發(fā)明肽的衍生物、聚合物、串連體或環(huán)化結(jié)構(gòu)；(e) 本發(fā)明的融合蛋白；或(f) 與本發(fā)明的肽結(jié)合的結(jié)合劑。
本發(fā)明還涉及檢測(cè)患者是否患有SARS的方法，其特征在于使用了本發(fā)明診斷試劑盒。
本發(fā)明還涉及刺激和/或擴(kuò)增特異針對(duì)病毒蛋白的T細(xì)胞的方法，包括在足以允許T細(xì)胞得到刺激和/或擴(kuò)增的條件和時(shí)間下用至少一個(gè)選自下列的成分接觸T細(xì)胞(a) 本發(fā)明的多核苷酸；(b) 本發(fā)明的肽或融合蛋白；(c) 本發(fā)明的肽的衍生物、聚合物、串連體或環(huán)化結(jié)構(gòu)；(d) 表達(dá)本發(fā)明的肽的抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及分離的T細(xì)胞群，包含根據(jù)本發(fā)明的方法制備的T細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及組合物，包含選自可藥用載體和免疫刺激劑的第一成分，和選自如下的第二成分(a) 本發(fā)明的多核苷酸；(b) 本發(fā)明的肽；(c) 本發(fā)明的肽的衍生物、聚合物、串連體或環(huán)化結(jié)構(gòu)；(d) 本發(fā)明的抗體；(e) 本發(fā)明的融合蛋白；(f) 本發(fā)明的T細(xì)胞群；和(g) 表達(dá)本發(fā)明的肽的抗原呈遞細(xì)胞。
優(yōu)選地，所述組合物是噴鼻、噴口、滴眼及霧化吸入用藥的形式。
本發(fā)明還涉及刺激患者免疫應(yīng)答的方法，包括給患者施用本發(fā)明的組合物。
本發(fā)明還涉及為患者治療SARS冠狀病毒感染或SARS的方法，包括給患者施用治療有效量的本發(fā)明核酸的反義核酸、本發(fā)明的肽或其衍生物、聚合物、串聯(lián)體或環(huán)化結(jié)構(gòu)、本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片斷、本發(fā)明的核酸適配子、T細(xì)胞群或本發(fā)明的組合物。
本發(fā)明還涉及確定患者是否被SARS冠狀病毒感染或患有SARS的方法，包括步驟(a) 從患者得到生物學(xué)樣品；(b) 用本發(fā)明多核苷酸接觸此生物學(xué)樣品；(c) 檢測(cè)樣品中與該寡核苷酸雜交的多核苷酸的量；和(d) 將與該多核苷酸雜交的多核苷酸的量與預(yù)先確定的截?cái)嘀颠M(jìn)行比較，由此確定患者是否患有SARS。
本發(fā)明還涉及抑制患者體內(nèi)SARS冠狀病毒感染或SARS發(fā)展的方法，包括步驟(a) 將分離自患者的CD4+和/或CD8+T細(xì)胞與至少一種選自如下的成分一起孵育(i)本發(fā)明的多核苷酸；(ii)本發(fā)明的肽；和(iii)表達(dá)本發(fā)明的肽的抗原呈遞細(xì)胞，使得T細(xì)胞增殖；(b) 給患者施用有效量的此增殖的T細(xì)胞，由此抑制患者體內(nèi)SARS的發(fā)展。
本發(fā)明還涉及含有SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15和/或17所示氨基酸序列的SARS冠狀病毒S蛋白，或其含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入、缺失、替代、添加并基本保持其活性的變體。
本發(fā)明還涉及編碼上述蛋白的多核苷酸序列，或其含有一個(gè)或多個(gè)核苷酸插入、缺失、替代、添加并基本保持其活性的變體。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人利用Geysen HM等((1984)Proc Natl Acad SciU.S.A.813998)多中心同步多肽合成(Simultaneous multipin peptidesynthesis)技術(shù)按照SARS冠狀病毒的S蛋白的1255個(gè)氨基酸全序列由第n至第(n+9)號(hào)氨基酸順序合成1246個(gè)十肽片段，建立SARS冠狀病毒S蛋白的抗原肽庫(kù)。用免疫學(xué)方法測(cè)定各肽片的抗原反應(yīng)性，確定SARS冠狀病毒S蛋白連續(xù)性抗原表位的數(shù)目、氨基酸順序，及其在肽鏈中的定位及抗原強(qiáng)度。結(jié)果，得到9個(gè)陽(yáng)性肽表位。
由此，本發(fā)明提供了SARS冠狀病毒S蛋白的表位，即本發(fā)明的肽。還涉及編碼本發(fā)明肽的多核苷酸，抗體及其抗原結(jié)合片斷，免疫原性組合物，藥物組合物，診斷試劑盒，診斷和治療SARS的方法等。
多核苷酸“分離的”在此用于指多核苷酸基本上不帶有其它編碼序列，以及該DNA區(qū)段不含有大份額的無(wú)關(guān)編碼DNA，如染色體大片段或其它功能性基因或肽編碼區(qū)。當(dāng)然，這是指原始分離的DNA區(qū)段，并不排除之后人為在該區(qū)段中加入的基因或編碼區(qū)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，多核苷酸可以是單鏈的(編碼鏈或反義鏈)或雙鏈的，而且可以是DNA(基因組DNA、cDNA或合成的DNA)或RNA分子。
多核苷酸可以含有天然序列(即編碼本發(fā)明肽或其部分的內(nèi)源性序列)或可以含有該序列的變體、或生物學(xué)或抗原功能等同物。正如以下進(jìn)一步描述的，多核苷酸變體可以含有一或多個(gè)替代、添加、缺失和/或插入，優(yōu)選地，以致所編碼的肽的免疫原性相對(duì)于天然肽不減少。一般可以按本文所述方法評(píng)價(jià)對(duì)該編碼肽的免疫原性的影響。術(shù)語(yǔ)“變體”也包括異種來(lái)源的同源基因。
當(dāng)進(jìn)行多核苷酸或肽序列比較時(shí)，如果在按下述方法進(jìn)行最大匹配比對(duì)后，兩個(gè)序列中的核苷酸或氨基酸序列相同，則認(rèn)為這兩個(gè)序列是“同一的”。典型地，兩個(gè)序列之間的比較通過(guò)在比較窗中對(duì)序列進(jìn)行比較以鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性來(lái)進(jìn)行。本文所用“比較窗”是指具有至少約20個(gè)連續(xù)位置的區(qū)段，在該區(qū)段中可以在一個(gè)序列和具有相同數(shù)目連續(xù)位置的參考序列最佳比對(duì)后對(duì)這兩個(gè)序列進(jìn)行比較。
為了序列比較，可以采用Lasergene生物信息軟件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行序列的最佳比對(duì)。
或者，為了序列比較，可以利用以下方法進(jìn)行序列的最佳比對(duì)Smith和Waterman的局部同一性算法((1982)Add.APL.Math2482)；Needleman和Wunsch的同一性比對(duì)算法((1970)J.Mol.Biol.48443)；Pearson和Lipman的相似性搜索方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444)；這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行程序(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)；或目測(cè)。
適合于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法的一個(gè)優(yōu)選例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它們分別描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.253389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410。采用例如本文所述參數(shù)，BLAST和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的多核苷酸和肽的序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過(guò)國(guó)立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。
因此，本發(fā)明包括與本文所公開(kāi)序列基本同一的多核苷酸和肽序列，例如當(dāng)采用本文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析，描述如下)時(shí)，與本發(fā)明多核苷酸或肽序列相比含有至少50％序列同一性、優(yōu)選至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、讀框的定位等，可以對(duì)這些值進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整以確定兩個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)同一性。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明指向在中等嚴(yán)緊條件下與本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互補(bǔ)序列能夠雜交的多核苷酸。在分子生物學(xué)領(lǐng)域中雜交技術(shù)是熟知的。
“雜交”包括任何能使核酸的一條鏈通過(guò)堿基配對(duì)與一條互補(bǔ)核酸鏈結(jié)合的程序。因此，嚴(yán)格地說(shuō)，該術(shù)語(yǔ)是指靶序列的互補(bǔ)序列與測(cè)試序列結(jié)合的能力，反之亦然。
典型地，“雜交條件”根據(jù)測(cè)量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來(lái)分類。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典型地發(fā)生在約Tm-5℃(低于探針Tm 5℃)；“高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5-10℃；“中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20℃；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20-25℃。作為替代，或者進(jìn)一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗滌為依據(jù)。例如，6×SSC＝極低嚴(yán)緊性；3×SSC＝低至中等嚴(yán)緊性；1×SSC＝中等嚴(yán)緊性；0.5×SSC＝高等嚴(yán)緊性。從功能上說(shuō)，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)格同一或近嚴(yán)格同一的核酸序列；而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80％或更多序列同一性的核酸序列。
對(duì)于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對(duì)嚴(yán)緊的條件來(lái)形成雜交體，例如，選擇相對(duì)低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊性在內(nèi)的雜交條件。
為便于說(shuō)明，用于檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊條件包括用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液預(yù)洗；在50-65℃下在5×SSC中雜交過(guò)夜；隨后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗滌兩次20分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)格性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的高度嚴(yán)格雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65℃或65-70℃。
探針和引物在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，本文提供的多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列可以有利地用作核酸雜交的探針或引物。同樣地，預(yù)期含有如下序列區(qū)域的核酸區(qū)段將是尤其有用的，該序列區(qū)域是與本文所公開(kāi)的30個(gè)核苷酸長(zhǎng)的連續(xù)序列具有相同序列或與之互補(bǔ)的至少約15個(gè)核苷酸長(zhǎng)的連續(xù)序列。這些核苷酸探針與目的序列特異雜交的能力使它們能夠用于檢測(cè)給定樣品中是否存在互補(bǔ)序列。然而，還可以預(yù)想其它用途，例如將該序列信息用于制備突變種引物、或在其它遺傳結(jié)構(gòu)的構(gòu)建中使用的引物。
多核苷酸在宿主細(xì)胞中的表達(dá)在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，可以將編碼本發(fā)明肽、或其融合蛋白或其功能性等同物的多核苷酸序列或其片段用于重組DNA分子中，以指導(dǎo)肽在適合宿主細(xì)胞中的表達(dá)。由于遺傳密碼固有的簡(jiǎn)并性，可以制備編碼基本上相同或功能上等同的氨基酸序列的其它DNA序列，并且可以采用這些序列克隆和表達(dá)指定的肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，在某些情況下制備具有非天然密碼子的肽編碼核苷酸序列可能是有利的。例如，可以選擇特定原核或真核宿主偏倚的密碼子，以增加蛋白質(zhì)表達(dá)速率，或制備具有期望性質(zhì)，如比天然序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本具有更長(zhǎng)半壽期的重組RNA轉(zhuǎn)錄本。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可以將天然、修飾的、或重組的核酸序列與異源序列連接在一起以編碼融合蛋白。例如，為了在肽文庫(kù)中篩選肽活性的抑制劑，編碼能夠被商業(yè)可獲得抗體識(shí)別的嵌合蛋白質(zhì)可能是有用的。還可以對(duì)融合蛋白質(zhì)進(jìn)行改造使其在該肽編碼序列和異源蛋白質(zhì)序列之間含有切割位點(diǎn)，以便使該肽可以通過(guò)切割和純化與該異源部分分離開(kāi)。
為了表達(dá)期望的肽，可以將編碼該肽或其功能性等同物的核苷酸序列插入適合的表達(dá)載體中，即該載體含有該插入編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯所必要的元件?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)熟知的方法構(gòu)建含有編碼目的肽的序列和適合的轉(zhuǎn)錄及翻譯控制元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)、和體內(nèi)遺傳重組。這些技術(shù)描述于Sambrook，J.等(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.；和Ausubel，F(xiàn).M.等(1989)當(dāng)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，紐約，N.Y.。
多種表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)可以用于包含和表達(dá)多核苷酸序列。這些包括但不限于重組噬菌體、質(zhì)粒、或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌等微生物；酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)或細(xì)菌表達(dá)載體(例如Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。
存在于表達(dá)載體中的“控制元件”或“調(diào)節(jié)序列”是指該載體的那些非翻譯區(qū)域-增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、5’和3’非翻譯區(qū)-它們與宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)相互作用以實(shí)施轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些元件可以在其強(qiáng)度和特異性方面變化。依賴于所用的載體系統(tǒng)和宿主，可以采用任何數(shù)量的適合轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。例如，當(dāng)克隆在細(xì)菌系統(tǒng)中時(shí)，可以采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene，La Jolla，Calif.)或PSPORT1質(zhì)粒(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)的雜合lacZ啟動(dòng)子等。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中，一般優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物基因或來(lái)自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子。如果需要制備含有多拷貝的肽編碼序列的細(xì)胞系時(shí)，有利的是采用具有適合選擇標(biāo)志的基于SV40或EBV的載體。
可以在適合于表達(dá)和從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收該蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)目的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。根據(jù)該序列和/或所用的載體，重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以是分泌的或包含在細(xì)胞內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，可以對(duì)含有本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行設(shè)計(jì)以含有指導(dǎo)該編碼肽分泌通過(guò)原核或真核細(xì)胞膜的信號(hào)序列?？梢圆捎闷渌闹亟M結(jié)構(gòu)，將編碼目的肽的序列與編碼利于可溶性蛋白質(zhì)純化的肽域的核苷酸序列連接在一起。這些利于純化的域包括，但不限于，允許在固定化金屬上進(jìn)行純化的金屬螯合肽如組氨酸-色氨酸組件、允許在固定化免疫球蛋白上純化的A蛋白域、和用于FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)(Immunex Corp.，Seattle，Wash.)的域。
生物學(xué)功能等同物可以對(duì)本發(fā)明多核苷酸和肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾和改變，但仍獲得編碼具有期望特性的肽的功能性分子。正如以上提及的，常常期望在特定多核苷酸序列中引入一或多個(gè)突變。在某些情況下，該所獲編碼肽序列因該突變而發(fā)生改變，或在其它情況下，該肽的序列并不因該編碼多核苷酸中的一或多個(gè)突變而發(fā)生變化。
例如，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中某些氨基酸可以替代其它氨基酸，而不顯著喪失與其它結(jié)構(gòu)(如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上的結(jié)合位點(diǎn))的相互結(jié)合能力。由于一個(gè)蛋白質(zhì)的相互作用能力和性質(zhì)決定了該蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能活性，所以可以在蛋白質(zhì)序列中進(jìn)行某些氨基酸序列替代，當(dāng)然也可以對(duì)其根本的DNA編碼序列進(jìn)行替代，從而獲得具有相似形式的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明人考慮到，在本公開(kāi)的組合物的肽序列中或編碼所述肽的相應(yīng)DNA序列中可以進(jìn)行多種變化，而不引起它們的生物學(xué)用途和活性的明顯喪失。
一般基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等，來(lái)進(jìn)行氨基酸替代?？紤]到各種前述特性的替代實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
體內(nèi)多核苷酸遞送技術(shù)在其它實(shí)施方案中，含有本發(fā)明一或多個(gè)多核苷酸的遺傳結(jié)構(gòu)被引入體內(nèi)細(xì)胞中。這可以通過(guò)采用多種熟知方法中的任一種來(lái)實(shí)現(xiàn)，為了舉例說(shuō)明的目的以下列出了其中的幾種。
遞送載體包括腺病毒表達(dá)載體、腺伴隨病毒表達(dá)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體、非病毒載體等。
肽本發(fā)明在其它方面提供肽組合物。一般地，本發(fā)明的肽是來(lái)源于哺乳動(dòng)物物種的分離肽(或其表位、變體、或活性片段)。優(yōu)選地，該肽由本文所公開(kāi)的多核苷酸或在中等嚴(yán)緊條件下與本文所公開(kāi)的多核苷酸序列雜交的序列編碼?；蛘撸梢詫⒃撾亩x為含有本文所公開(kāi)氨基酸序列中的連續(xù)氨基酸序列的肽、或含有本文所公開(kāi)的完整氨基酸序列的肽。
本文中，肽的活性片段包括通過(guò)常規(guī)技術(shù)例如誘變、或通過(guò)添加、缺失或替代而被修飾的肽的全部或部分，但活性片段仍表現(xiàn)出與本文所述肽具有基本上相同的結(jié)構(gòu)功能、抗原性等。
屬于本發(fā)明的肽變體包括那些表現(xiàn)出與本文所公開(kāi)肽有至少約70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、或更高同一性的肽。
優(yōu)選地，變體含有保守替代?！氨Ｊ靥娲笔侵敢粋€(gè)氨基酸替代具有相似性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸，以致肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將預(yù)期該肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)基本上不發(fā)生改變。一般可以基于殘基的極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性和/或雙親性質(zhì)的相似性，進(jìn)行氨基酸替代。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；帶有非荷電極性頭部基團(tuán)、具有相似親水值的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
肽的制備可以采用多種熟知技術(shù)中的任意一種。采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種表達(dá)載體中的任何載體，可以容易地從上述DNA序列制備這些序列編碼的重組肽。表達(dá)可以在任何一種用含有編碼重組肽的DNA分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的適合宿主細(xì)胞中得到實(shí)現(xiàn)。適合的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母、高等真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。優(yōu)選地，所用宿主細(xì)胞是大腸桿菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系例如COS或CHO。首先可以采用可商業(yè)購(gòu)買(mǎi)獲得的濾器，濃縮來(lái)自將重組蛋白或肽分泌至培養(yǎng)基中的適合宿主/載體系統(tǒng)的上清液。濃縮后，可以將該濃縮物施加到適合的純化基質(zhì)例如親和基質(zhì)或離子交換樹(shù)脂上。最后，可以采用一或多個(gè)反相HPLC步驟進(jìn)一步純化重組肽。
還可以通過(guò)合成手段，采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)，制備具有少于約100個(gè)氨基酸、一般少于約50個(gè)氨基酸的肽部分和其它變體。例如，可以采用任何一種商業(yè)可獲得的固相技術(shù)，例如Merrifield固相合成法，通過(guò)將氨基酸順序地添加到生長(zhǎng)的氨基酸鏈上，合成這些肽。見(jiàn)Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2146，1963。用于自動(dòng)合成肽的儀器可從供應(yīng)商例如Perkin Elmer/Applied BioSystemsDivision(Foster City，CA)處購(gòu)買(mǎi)獲得，并可以按廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
結(jié)合劑表位的確定不僅可以了解有關(guān)免疫反應(yīng)的眾多信息，為進(jìn)一步人工控制免疫反應(yīng)奠定基礎(chǔ)，而且對(duì)藥物合成、疫苗設(shè)計(jì)等也具有指導(dǎo)意義。
表位抗體的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，最大的優(yōu)勢(shì)是可選擇最佳和最具免疫保護(hù)潛力的表位以誘生特異性免疫應(yīng)答，盡量減少無(wú)關(guān)、干擾和抑制序列可能產(chǎn)生的負(fù)作用，具有巨大的應(yīng)用潛能。而且由于它本身就是抗原決定族，免疫原性強(qiáng)，因此制備出的抗體特異性強(qiáng)，效價(jià)高，且易于制備?？贵w可制備成外用的多價(jià)抗體消毒劑，應(yīng)用于常規(guī)外用消毒劑如一些理化消毒劑不能應(yīng)用的人體皮膚、粘膜以及食品等的消毒或病毒預(yù)防。特異的表位抗體還可開(kāi)發(fā)成診斷和檢測(cè)試劑盒，應(yīng)用于病毒的檢測(cè)及病人的血清學(xué)診斷。
因此，本發(fā)明還提供特異地與本發(fā)明肽結(jié)合的藥劑，例如抗體和其抗原結(jié)合片段。在本文中，如果抗體或其抗原結(jié)合片段與本發(fā)明肽的反應(yīng)(在例如ELISA中)處于可檢測(cè)到的水平，而在相似條件下與無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)的反應(yīng)不能被檢測(cè)到時(shí)，則被認(rèn)為與本發(fā)明肽“特異結(jié)合”。本文所用“結(jié)合”是指兩個(gè)獨(dú)立分子之間的非共價(jià)聯(lián)接以致形成復(fù)合物。結(jié)合能力可以通過(guò)例如測(cè)定形成該復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。結(jié)合常數(shù)是當(dāng)用各成分的濃度乘積除該復(fù)合物的濃度時(shí)獲得的值。一般地，在本發(fā)明的上下文中，當(dāng)形成復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)大于約103L/mol時(shí)，兩個(gè)化合物被認(rèn)為是“相結(jié)合的”。該結(jié)合常數(shù)可以采用本領(lǐng)域熟知的方法測(cè)定。
對(duì)本發(fā)明的肽可通過(guò)融合蛋白和肽及其衍生物自身或其聚合物、串連體或環(huán)化結(jié)構(gòu)等方式，進(jìn)行動(dòng)物免疫制備抗體。抗體的制備方式可參見(jiàn)巴德年主編，當(dāng)代免疫學(xué)技術(shù)與應(yīng)用，北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998)。制備的抗肽抗體用于病毒的外用消毒和預(yù)防，如滴眼液、噴鼻劑、食品的洗消液等，以及檢測(cè)和診斷試劑盒。
對(duì)目的抗原肽具有特異性的單克隆抗體可以采用例如Kohler和Milstein的技術(shù)(Eur.J.Immunol.6511-519，1976)，及其改良方法來(lái)制備。
在某些實(shí)施方案中，可能優(yōu)選采用抗體的抗原結(jié)合片段。這些片段包括Fab片段，它們可以采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。簡(jiǎn)而言之，可以通過(guò)在A蛋白珠柱上通過(guò)親和層析從抗血清中純化免疫球蛋白(Harlow和Lane，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，然后通過(guò)木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生Fab和Fc片段。該Fab和Fc片段可以在A蛋白珠柱上通過(guò)親和層析分離。
可以將本發(fā)明的抗表位抗體單獨(dú)作為被動(dòng)免疫劑用于預(yù)防活治療SARS-coV的感染，或與一或多種治療劑偶聯(lián)在一起。在此方面適合的治療劑包括放射性核素、分化誘導(dǎo)劑、藥物、毒素和它們的衍生物。
治療劑可以與適合的單克隆抗體直接或間接地(如通過(guò)接頭基團(tuán))偶聯(lián)(例如共價(jià)鍵合)?；蛘撸赡芷谕麑⒅委焺┖涂贵w通過(guò)接頭基團(tuán)偶聯(lián)。接頭基團(tuán)能夠作為間隔起作用使抗體和藥劑分隔開(kāi)，以便避免對(duì)結(jié)合性能的干擾。接頭基團(tuán)還可以用于增強(qiáng)藥劑或抗體上取代基的化學(xué)反應(yīng)性，由此增加偶聯(lián)效率。
可以采用多種途徑施用這些抗體和免疫偶聯(lián)物。典型地，可以靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、或皮下給藥，或經(jīng)噴霧、點(diǎn)滴用于眼、鼻及口腔，或霧化吸入呼吸道及肺中。很明顯，該抗體/免疫偶聯(lián)物的精確劑量將隨所用的抗體、抗原密度、和抗體的清除率而改變。
本發(fā)明的抗體還包括單鏈抗體、雙價(jià)或多價(jià)抗體等。
T細(xì)胞免疫治療組合物可以還，或者作為替代方案可以，含有本發(fā)明肽特異性T細(xì)胞。這些細(xì)胞一般可以在體外或離體采用標(biāo)準(zhǔn)程序制備。
可以用本發(fā)明肽、編碼本發(fā)明肽的多核苷酸和/或表達(dá)該肽的抗原呈遞細(xì)胞(APC)刺激T細(xì)胞。該刺激在足以允許產(chǎn)生該肽特異性T細(xì)胞的條件和時(shí)間下進(jìn)行。
對(duì)于治療目的，可以在體外或體內(nèi)擴(kuò)增響應(yīng)本發(fā)明肽、多核苷酸或APC而增殖的CD4+或CD8+T細(xì)胞的數(shù)量?？梢杂卸喾N途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)這些T細(xì)胞的體外增殖。例如，可以在添加了或未添加T細(xì)胞生長(zhǎng)因子(例如白介素2)和/或合成本發(fā)明肽的刺激細(xì)胞的情況下，將這些T細(xì)胞重新暴露于本發(fā)明肽或相應(yīng)于該肽免疫原性部分的短肽下?；蛘撸梢酝ㄟ^(guò)克隆擴(kuò)增在存在本發(fā)明肽時(shí)增殖的一或多種T細(xì)胞的數(shù)量。克隆細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域所熟知的，包括有限稀釋。
藥物組合物在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本文所公開(kāi)的一或多種多核苷酸、肽、T細(xì)胞和/或抗體組合物在可藥用溶液中的制劑，用于單獨(dú)或聯(lián)合一或多種其它形式的治療方法施用給細(xì)胞或動(dòng)物。
而且，應(yīng)當(dāng)理解，如果希望的話，表達(dá)本文所公開(kāi)肽的核酸區(qū)段、RNA、DNA或PNA組合物可以聯(lián)合其它藥劑例如其它蛋白質(zhì)或肽或各種具有藥物活性的藥劑一起施用。實(shí)際上，對(duì)于也可以包括在內(nèi)的其它成分確實(shí)沒(méi)有限制，只要這些額外藥劑在與靶細(xì)胞或宿主組織接觸時(shí)不引起顯著的不良反應(yīng)即可。
可藥用賦形劑和載體溶液的配制是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。同樣，對(duì)于在各種治療方案中使用本文所述具體組合物的適合給藥和治療方案(包括例如口服、非腸道途徑、呼吸道途徑、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、口內(nèi)、皮下和肌內(nèi)給藥和藥物配制)的研制也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
短語(yǔ)“可藥用”是指當(dāng)給人施用時(shí)不產(chǎn)生過(guò)敏或類似不當(dāng)反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。含有作為活性成分的蛋白質(zhì)的水性組合物的制備是本領(lǐng)域熟知的。典型地，將這些組合物制成可注射的液體溶液或懸浮液；還可以制成適于在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式。還可以使該制劑乳化。
免疫原性組合物在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，提供免疫原性組合物或疫苗。該免疫原性組合物一般含有一或多種藥物組合物(例如上面討論的那些藥物組合物)和免疫刺激劑。免疫刺激劑可以是增強(qiáng)或加強(qiáng)針對(duì)外源性抗原的(抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)的)免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。免疫刺激劑的例子包括佐劑、生物可降解微球體(例如polylactic galactide)和脂質(zhì)體(所述化合物被摻入其中；見(jiàn)例如Fullerton，美國(guó)專利4,235,877)。疫苗的制備一般描述于例如M.F.Powell和M.J.Newman編，“疫苗的設(shè)計(jì)(亞單位和佐劑方法)”(Vaccine Design(the subunitand adjuvant approach))，Plenum Press(NY，1995)。屬于本發(fā)明范圍的藥物組合物和免疫原性組合物，或疫苗，還可以含有其它化合物，這些化合物可以具有或沒(méi)有生物學(xué)活性。
基于抗原表位合成的短肽疫苗在人體應(yīng)用中非常安全，如HIV的短肽疫苗在美國(guó)已應(yīng)用于臨床，盡管其療效不是很理想，但在人群中應(yīng)用是安全可行的。短肽疫苗的最大缺點(diǎn)之一是免疫原性較完整蛋白質(zhì)差。為了增強(qiáng)短肽的免疫原性，可將短肽制備成多聚體，如流感病毒血凝素C-端的23氨基酸制備成四聚體，可明顯加強(qiáng)免疫原性，使機(jī)體產(chǎn)生高效抗體。短肽疫苗以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)受到越來(lái)越多的學(xué)者的重視，在微生物學(xué)，腫瘤學(xué)、自身免疫性疾病等各個(gè)領(lǐng)域都有研究。將多個(gè)SARS冠狀病毒的抗原表位串聯(lián)在一起，制備多價(jià)肽疫苗，可用于預(yù)防SARS病毒的感染。
另外，示例性免疫原性組合物可以含有編碼一或多種上述肽的DNA，以便原位產(chǎn)生該肽。正如以上所指出的，該DNA可以存在于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種遞送系統(tǒng)的任一種中，包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)。許多基因遞送技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，例如描述于Rolland，Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems15143-198，1998，和其引用文獻(xiàn)中的那些技術(shù)。明顯地，免疫原性組合物可以含有多核苷酸和肽兩類成分。這些免疫原性組合物可以提供增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
盡管在本發(fā)明的免疫原性組合物中可采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何適合載體，但載體的類型將隨給藥方式的改變而改變?？梢詫?duì)本發(fā)明的組合物進(jìn)行配制成用于任何適當(dāng)?shù)慕o藥方式，包括例如局部、口服、鼻腔、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)給藥。對(duì)于非胃腸道給藥，例如皮下注射，該載體優(yōu)選含有水、鹽水、乙醇、脂肪、蠟或緩沖液。對(duì)于口服用藥，可以采用以上任何種載體或固體載體，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、和碳酸鎂。還可采用生物可降解微球體作為載體用于本發(fā)明的藥物組合物。
在本發(fā)明免疫原性組合物中可以采用多種免疫刺激劑中之任何種。例如，可以將佐劑包括在內(nèi)。大多數(shù)佐劑含有設(shè)計(jì)用以防止抗原快速代謝的物質(zhì)，例如氫氧化鋁或礦物油，和免疫應(yīng)答的刺激劑，例如脂質(zhì)A、百日咳博德特氏菌(Bortadella pertussis)或結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)來(lái)源的蛋白質(zhì)?？蓮纳虡I(yè)途徑獲得適合的佐劑，例如弗氏不完全佐劑和完全佐劑；Merck佐劑65(Merckand Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadalphia，PA)；鋁鹽例如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁；鈣、鐵或鋅的鹽類；酰化酪氨酸的不溶性懸浮物；?；?；陽(yáng)離子或陰離子衍生多糖；聚磷腈；生物可降解微球體；單磷酰脂A(monophosphoryllipid A)和quil A。細(xì)胞因子，例如GM-CSF或白介素-2、-7或-12，也可以用作佐劑。
本文提供的所有免疫原性組合物均可以采用將抗原、免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑和適合的載體或賦形劑組合在一起的熟知方法制備。本文所述組合物可以作為持續(xù)釋放制劑(即，施用后實(shí)現(xiàn)化合物的緩慢釋放的膠囊、海綿或凝膠(例如由多糖組成的)等制劑)的部分施用。這些制劑一般可以采用熟知技術(shù)(見(jiàn)例如Coombes等，疫苗(Vaccine)141429-1438，1996)制備，并通過(guò)例如口服、直腸或皮下植入，或通過(guò)在期望靶位置植入進(jìn)行施用。
SARS的檢測(cè)和診斷一般地，可以基于從患者獲得生物樣品(例如血液、血清、痰、唾液、尿、糞和/或活檢組織)中一或多種本發(fā)明肽、抗本發(fā)明肽的抗體和/或編碼這些肽的多核苷酸的存在，檢測(cè)該患者是否患有SARS。換言之，可以采用這些肽、抗體和/或編碼這些肽的多核苷酸作為標(biāo)志，指示是否存在SARS或相關(guān)疾病。本文提供的結(jié)合劑可以檢測(cè)生物樣品中與該藥劑結(jié)合的抗原的水平。多核苷酸引物和探針可以用于檢測(cè)編碼本發(fā)明肽的mRNA的水平，該水平也指示了SARS的存在與否。
SARS治療在本發(fā)明的其它方面，可以將本文所述組合物用于免疫治療SARS。在這些方法中，典型地給患者施用組合物。本文所用“患者”是指任何恒溫動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人類?；颊呖梢曰加谢蚩梢晕椿加蠸ARS。因此，以上藥物組合物和免疫原性組合物可以用于預(yù)防SARS的發(fā)生或治療SARS患者。施用可以通過(guò)任何適合的方法進(jìn)行，包括通過(guò)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、滴眼、噴鼻、吸入、肛門(mén)、陰道、局部和口服途徑進(jìn)行的施用。
新藥開(kāi)發(fā)在篩選得到抗原表位的基礎(chǔ)上，還可進(jìn)行特異性抗病毒藥物包括核酸藥物等生物工程藥物的開(kāi)發(fā)。如應(yīng)用SELEX技術(shù)或靶標(biāo)切換技術(shù)篩選得到與表位肽特異結(jié)合的核酸適配子，Oligbody等，作為核酸藥物預(yù)防或治療SARS。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步舉例描述，這些實(shí)施例是非限制性的。
實(shí)施例實(shí)施例1 多中心多肽合成1.制作工作計(jì)劃利用多中心多肽合成技術(shù)中Gnet軟件，將全部SARS冠狀病毒S蛋白的氨基酸序列[2]輸入計(jì)算機(jī)，在PepMaker的執(zhí)行程序下得到全部1246個(gè)十肽的合成計(jì)劃。
2.多肽合成在PinAID的協(xié)助下，完成加樣過(guò)程，反應(yīng)時(shí)間2h。
操作步驟1)按照工作計(jì)劃，在正確的位置固載Macrocrowns(負(fù)載量為1.5μmol/Macrocrowns)。
2)以20％哌啶的DMF溶液在室溫下脫Fmoc保護(hù)基20min。
3)以干燥DMF洗滌所有Pin 2min。
4)以新鮮的甲醇洗滌3次，每次2min。
5)空氣干燥30min。
6)按工作計(jì)劃稱取氨基酸，縮合劑及添加劑；按工作計(jì)劃溶解氨基酸，縮合劑及添加劑(DIC和HOBt)，并配好氨基酸活化酯溶液。
7)啟動(dòng)PinAID，并確認(rèn)線路暢通。按顯示正確位置加入深孔的Beckman反應(yīng)容器中，最后檢查所有的反應(yīng)孔中全部加入活化的氨基酸。反應(yīng)體積為300μl。
8)將Pin放入反應(yīng)容器中，室溫反應(yīng)2h(室溫一般指25℃)。
9)將Pin從反應(yīng)容器中去除，用甲醇洗滌5min，甩去甲醇，晾干2min，再在干燥的DMF中洗5min。
10)觀察是否有顯示藍(lán)色的Pin。如有，則按照6～10步將此Pin重新縮合，直至藍(lán)色消失。
11)如沒(méi)有藍(lán)色顯示的Pin，則重復(fù)2～10步，一直到全部氨基酸縮合完畢。
3.合成肽側(cè)鏈脫保護(hù)及將合成肽Pin上切除如果序列中含有甲硫氨酸和半胱氨酸時(shí)，是則用下述混合試劑三氟乙酸(TFA)∶乙二硫醇(EDT)∶苯甲醚∶苯甲硫醚∶水＝33∶1∶2∶2∶2(體積比)否則，則可用下述混合試劑三氟乙酸∶乙二硫醇∶苯甲醚＝38∶1∶1(體積比)上述試劑均新鮮配制。
操作步驟1)10ml離心管貼好標(biāo)簽，并標(biāo)明每一個(gè)合成肽的位置。
2)將Pin從反應(yīng)板上取下放入10ml正確位置的離心管中。
3)在每一個(gè)管中加入1.5ml上面的反應(yīng)混合試劑，并檢查是否將Pin浸沒(méi)。
4)室溫反應(yīng)2.5h。
5)移走Pin，最好將其放回到原來(lái)對(duì)應(yīng)的位置上，以便當(dāng)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有從Pin上切下肽時(shí)檢查原因。
6)用溫和的氮?dú)鈱⑷芤簼饪s至原體積的10％。
4.提取合成肽并進(jìn)行鑒定試劑A乙醚(干燥)∶石油醚(AR，40～60℃)＝1∶2(體積比)試劑B在乙醚∶石油醚溶劑中按0.1％的比例加入巰基乙醇試劑C0.1％TFA水溶液∶乙氰＝60∶40按下列步驟提取合成肽
1)以每分鐘2000～6000轉(zhuǎn)的速度離心6min。
2)檢查是否有沉淀生成。如有，則仔細(xì)傾倒出上清液；如沒(méi)有則用氮?dú)庑⌒拇蹈伞?br> 3)用試劑A(4ml)再萃取一次，重復(fù)1～3步。
4)仔細(xì)檢查所有的離心管中是否都有合成肽，并且在空氣中晾干。
5)每個(gè)干燥的合成肽中加入3ml試劑C，然后用液氮冷凍，再經(jīng)冷凍干燥，最后得粗品肽。
粗品肽用質(zhì)譜檢測(cè)其分子量，以保證合成肽序列的正確性。
實(shí)施例2 不同肽的包被濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響將合成SARS冠狀病毒S蛋白十肽(0.5mg/ml)以1∶100，1∶10稀釋，每孔加100μl，4℃過(guò)夜。甩干后，以PBS-Tween 20洗滌液洗滌3min×3次，再加入以PBS稀釋的病人混合血清，每孔100μl，37℃孵溫60min。以PBS-Tween 20洗滌后，加入1∶1000羊抗人HRP酶標(biāo)二抗，37℃孵溫1h。用洗滌液洗滌3min×4次。加入底物溶液，避光室溫反應(yīng)10min，立即以2mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)。以微量多道滴定掃描儀測(cè)定492nm消光值。實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性對(duì)照即通過(guò)篩選得到的1號(hào)陽(yáng)性肽，此后每次篩選都以它作為陽(yáng)性對(duì)照)，及陰性對(duì)照(492nm消光值低于0.25的肽)，無(wú)抗原陰性對(duì)照以肽包被稀釋液代替，余同樣品處理。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肽的稀釋倍數(shù)越高，所測(cè)消光值越低。在肽以1∶10稀釋時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照的消光值為0.857，而陰性對(duì)照的消光值為0.248，及無(wú)抗原陰性對(duì)照的消光值為0.025。
實(shí)施例3 病人混合血清的稀釋度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響合成SARS冠狀病毒S蛋白十肽(0.5mg/ml)以1∶10稀釋，而后加入以PBS稀釋1∶10，1∶100，1∶1000的病人混合血清，每孔100μl，37℃孵溫60min。以PBS-Tween 20洗滌后，加入1∶1000羊抗人HRP酶標(biāo)二抗，37℃孵溫1h。用洗滌液洗滌3min×4次。加入底物溶液，避光室溫反應(yīng)10min，立即以2mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)。以微量多道滴定掃描儀測(cè)定492nm消光值。實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照，無(wú)抗原陰性對(duì)照以肽包被稀釋液代替。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用3種稀釋度抗體對(duì)消光值有明顯差別。痊愈病人混合血清以1∶100稀釋時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照的消光值為0.770，而陰性對(duì)照的消光值為0.254，無(wú)抗原陰性對(duì)照的消光值為0.034。
實(shí)施例4 抗原表位的識(shí)別應(yīng)用固相ELISA方法篩選SARS冠狀病毒S蛋白的抗原表位。以0.05mol·L-1碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋肽濃度至50μg/ml，每孔加100μl，4℃過(guò)夜。甩干后，以PBS-Tween 20洗滌液洗滌3min×3次，加入以PBS稀釋的病人混合血清(1∶100)，每孔100μl，37℃孵溫60min。PBS-Tween20洗滌后，加入1∶1000以PBS稀釋的羊抗人HRP酶標(biāo)二抗，37℃孵溫1h，用洗滌液洗滌3min×4次，加入底物OPD溶液，避光室溫反應(yīng)10min，立即以2mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，以微量多道滴定掃描儀測(cè)定492nm消光值。
陽(yáng)性肽的消光值結(jié)果如下1號(hào)肽 0.770 0.803 0.857 0.697 0.609 0.5962號(hào)肽 0.439 0.424 0.486 0.555 0.377 0.3933號(hào)肽 0.487 0.488 0.530 0.598 0.505 0.4604號(hào)肽 0.414 0.419 0.464 0.443 0.414 0.5455號(hào)肽 0.444 0.455 0.459 0.490 0.496 0.3876號(hào)肽 0.411 0.378 0.452 0.458 0.588 0.5727號(hào)肽 0.443 0.477 0.687 0.6398號(hào)肽 0.347 0.325 0.353 0.375 0.506 0.5119號(hào)肽 0.600 0.677 0.506 0.511
陰性對(duì)照的消光值為0.242無(wú)抗原陰性對(duì)照的消光值為0.024陽(yáng)性肽的氨基酸和核酸序列如下1號(hào)肽PSGFNTLKPI (SEQ ID NO1)CCT TCT GGT TTT AAC ACT TTG AAA CCT ATT (SEQ ID NO2)2號(hào)肽IDATSTGNYN SEQ ID NO3)ATT GAT GCT ACT TCA ACT GGT AAT TAT AAT (SEQ ID NO4)3號(hào)肽TSTGNYNYKY (SEQ ID NO5)ACT TCA ACT GGT AAT TAT AAT TAT AAA TAT (SEQ ID NO6)4號(hào)肽KDGFLYVYKG (SEQ ID NO7)AAA GAT GGG TTT CTC TAT GTT TAT AAG GGC (SEQ ID NO8)5號(hào)肽LYVYKGYQPI (SEQ ID NO9)CTC TAT GTT TAT AAG GGC TAT CAA CCT ATA (SEQ ID NO10)6號(hào)肽KYDENGTITD (SEQ ID NO11)AAG TAT GAT GAA AAT GGT ACA ATC ACA GAT(SEQ ID NO12)7號(hào)肽YDENGTITDA (SEQ ID NO13)TAT GAT GAA AAT GGT ACA ATC ACA GAT GCT(SEQ ID NO14)8號(hào)肽SVITPGTNAS (SEQ ID NO15)AGT GTA ATT ACA CCT GGA ACA AAT GCT TCA(SEQ ID NO16)9號(hào)肽TTFDDVQAPN (SEQ ID NO17)
ACC ACT TTT GAT GAT GTT CAA GCT CCT AAT (SEQ ID NO18)
序列表<110>軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所<120>SARS冠狀病毒的S蛋白的抗原表位、其抗體、編碼核酸以及含有它們組合物<130>not specified<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>11<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>1Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile1 5 10<210>2<211>30<212>DNA
<213>SARS冠狀病毒<400>2ccttctggtt ttaacacttt gaaacctatt30<210>3<211>10<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>3Lle Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn1 5 10<210>4<211>30<212>DNA<213>SARS冠狀病毒<400>4attgatgcta cttcaactgg taattataat30<210>5
<211>10<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>5Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr1 5 10<210>6<211>30<212>DNA<213>SARS冠狀病毒<400>6acttcaactg gtaattataa ttataaatat30<210>7<211>10<212>PRT<213>SARS冠狀病毒
<400>7Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly1 5 10<210>8<211>30<212>DNA<213>SARS冠狀病毒<400>8aaagatgggt ttctctatgt ttataagggc30<210>9<211>10<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>9Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile1 5 10<210>10
<211>30<212>DNA<213>SARS冠狀病毒<400>10ctctatgttt ataagggcta tcaacctata30<210>11<211>10<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>11Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp1 5 10<210>12<211>30<212>DNA<213>SARS冠狀病毒<400>12
aagtatgatg aaaatggtac aatcacagat30<210>13<211>10<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>13Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala1 5 10<210>14<211>30<212>DNA<213>SARS冠狀病毒<400>14tatgatgaaa atggtacaat cacagatgct30<210>15<211>10<212>PRT
<213>SARS冠狀病毒<400>15Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser1 5 10<210>16<211>30<212>DNA<213>SARS冠狀病毒<400>16agtgtaatta cacctggaac aaatgcttca30<210>17<211>10<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>17Thr Thr Phe Asp Asp Val G1n Ala Pro Asn1 5 10<210>18
<211>30<212>DNA<213>SARS冠狀病毒<400>18accacttttg atgatgttca agctcctaat30
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，其含有選自下列組的序列(a)SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16或18所示的核苷酸序列；(b)編碼SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15或17所示氨基酸序列的核苷酸序列；(c)在中度嚴(yán)緊或高嚴(yán)緊條件下可與(a)或(b)的序列雜交的序列，并基本保持(a)或(b)序列的活性；(d)(a)或(b)的序列的變體序列，其中含有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失、添加、或替代，并基本保持(a)或(b)序列的活性；(e)與(a)或(b)的序列有至少約75％同一性的序列；(f)與(a)或(b)的序列有至少約90％同一性的序列；(g)(a)或(b)的序列的簡(jiǎn)并變體；和(h)以上序列的互補(bǔ)序列。
2.一種分離的肽，其含有選自下列組的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15或17所示氨基酸序列；(b)權(quán)利要求1的多核苷酸編碼的序列；(c)與權(quán)利要求1的多核苷酸編碼的序列有至少約70％同一性的序列；(d)與權(quán)利要求1的多核苷酸編碼的序列有至少約90％同一性的序列；和(e)(a)序列的含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入、缺失、替代、添加并基本保持其活性的變體。
3.表達(dá)載體，包含可操作地與表達(dá)控制序列連接的權(quán)利要求1的多核苷酸。
4.用根據(jù)權(quán)利要求3的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，例如原核細(xì)胞(包括大腸桿菌細(xì)胞)和真核細(xì)胞(如酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。
5.分離的抗體、或其抗原結(jié)合片段，其特異地與權(quán)利要求2的肽結(jié)合。
6.權(quán)利要求2的肽的衍生物、聚合物、串聯(lián)體或環(huán)化結(jié)構(gòu)，或包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求2的肽的融合蛋白。
7.與權(quán)利要求2的肽結(jié)合的核酸適配子，例如oligobody。
8.一種診斷試劑盒，其含有(a)權(quán)利要求1的多核苷酸；(b)與權(quán)利要求1的多核苷酸在中等嚴(yán)緊或高嚴(yán)緊條件下雜交的多核苷酸；(c)權(quán)利要求2的肽；(d)權(quán)利要求6的衍生物、聚合物、串聯(lián)體、環(huán)化結(jié)構(gòu)或融合蛋白；或(e)與權(quán)利要求2的肽結(jié)合的結(jié)合劑。
9.檢測(cè)患者是否被SARS冠狀病毒感染或患有SARS的方法，其特征在于使用了權(quán)利要求8的診斷試劑盒。
10.刺激和/或擴(kuò)增特異針對(duì)病毒蛋白的T細(xì)胞的方法，包括在足以允許T細(xì)胞得到刺激和/或擴(kuò)增的條件和時(shí)間下用至少一個(gè)選自下列的成分接觸T細(xì)胞(a)權(quán)利要求1的多核苷酸；(b)權(quán)利要求2的肽；和(c)表達(dá)權(quán)利要求2的肽的抗原呈遞細(xì)胞。
11.分離的T細(xì)胞群，包含根據(jù)權(quán)利要求10的方法制備的T細(xì)胞。
12.疫苗組合物，包含選自可藥用載體和免疫刺激劑(例如佐劑)的第一成分，和選自如下的第二成分(a)權(quán)利要求1的多核苷酸；(b)權(quán)利要求2的肽；和(c)權(quán)利要求6的衍生物、聚合物、串聯(lián)體、環(huán)化結(jié)構(gòu)或融合蛋白；優(yōu)選地，所述組合物是噴鼻、噴口、滴眼及霧化吸入用藥的形式。
13.預(yù)防SARS冠狀病毒感染或SARS的方法，包括給患者施用免疫有效量的權(quán)利要求12的組合物。
14.治療SARS冠狀病毒感染或SARS的方法，包括給患者施用治療有效量的權(quán)利要求1的核酸的反義核酸、權(quán)利要求2的肽、權(quán)利要求6的衍生物、聚合物、串聯(lián)體或環(huán)化結(jié)構(gòu)、權(quán)利要求5的抗體或其抗原結(jié)合片斷、權(quán)利要求7的核酸適配子、權(quán)利要求11的T細(xì)胞群或權(quán)利要求12的組合物。
15.含有SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15和/或17所示氨基酸序列的SARS冠狀病毒S蛋白，或其含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入、缺失、替代、添加并基本保持其活性的變體。
16.編碼權(quán)利要求15的蛋白的多核苷酸序列，或其含有一個(gè)或多個(gè)核苷酸插入、缺失、替代、添加并基本保持其活性的變體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)用于治療和診斷SARS組合物和方法。說(shuō)明性組合物含有一種或多種SARS肽、編碼這些肽的多核苷酸、抗體、表達(dá)這些肽的抗原遞呈細(xì)胞，和對(duì)于表達(dá)這些肽的細(xì)胞特異的T細(xì)胞。這些公開(kāi)的組合物可以例如用于診斷、預(yù)防和/或治療疾病SARS。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1566342SQ0314303
公開(kāi)日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月16日
發(fā)明者李前, 劉剛, 孫曼霽, 付愛(ài)玲, 董朝輝 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所