專利名稱：甘蔗斑茅雜種的dna鑒定方法
技術領域：
本發明涉及一種植物雜交后代的鑒定方法，特別是甘蔗斑茅雜種的DNA鑒定方法。
背景技術：
近百年的甘蔗有性雜交育種實踐表明，甘蔗遺傳改良是發展蔗糖生產的最經濟有效的措施。甘蔗的“高貴化育種”曾經創造了一個多世紀甘蔗糖業輝煌，但是，由于親本材料少，“種”的血緣狹窄，導致在親本選配中出現近親雜交、而且距離野生種的代數越來越遠，導致育成品種生活力、適應性、抗逆性、宿根性普遍下降。斑茅[Erianthus arundinaceus(Retz.)Jeswiet]為甘蔗近緣屬植物，具有較強的抗病蟲性、抗旱性、抗寒性及耐瘠性，宿根性好，分蘗性強，極粗生，適應性廣。若通過甘蔗斑茅遠緣雜交，對斑茅的多種強抗逆性基因加以開發利用是甘蔗育種界長期致力解決的關鍵問題。在甘蔗遠緣雜交史中，曾有過近百例的甘蔗栽培種的種間甚至屬間雜交報道，但其中大部分雜種的真實性受到懷疑。主要原因是甘蔗栽培種是由種間雜交而來，本身含有近緣物種的血緣，即使自交也會分離出野生的形態性狀。雜交利用時雜種的真假鑒定顯得非常重要，因為利用屬間或種間雜種一定要充分了解雜種的真實性，才能提高育種利用的有效性。甘蔗種間、屬間雜種鑒定經歷了由生物學的形態鑒定到染色體鑒定、同功酶鑒定，使鑒定結果較為可靠，但由于甘蔗染色體數量多、傳遞行為復雜，同一材料計數差別達十多條，同功酶譜帶受材料、環境等影響大，因此鑒定結果也不能令人十分信服。
發明內容
本發明的目的是探索從DNA分子水平上獲得最直接的雜種證據，通過分子技術準確、直觀地查明染色體或片斷的來源。
本發明的甘蔗斑茅雜種的DNA鑒定方法，其特征如下
1、基因組DNA提取供鑒定的甘蔗斑茅雜種葉片經液氮研磨，依次加入CTAB提取緩沖液、聚乙烯基吡咯烷酮、月桂酰肌氨酸鈉、CTAB溶液；經水浴加溫，室溫冷卻，再用酚、氯仿抽提純化、異丙醇沉淀、然后TE溶解；2、試劑配制反應體系含1/10體積的10倍PCR反應緩沖液；dNTP各0.1～0.3mmol/L；Taq DNA聚合酶0.1～5國際單位；分離純化的DNA模板液0.1～5μl，；PCR引物1對，各0.1～2μmol/L；加無菌去離子水使總體積達到10～100μl；上述PCR引物在以下引物中選取ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGTITS2TCCTCCGCTTATTGATATGCITS3TTGGCCGCCGTCCCATCCTCITS4AGAAAAAGAAAAACAAAGGCITS5TTCAGGTTTTTGGAGAACGGITS6ACAAATTGGACTCTTGGAGCITS7GGAAGAAAGAAAACAAGGGTITS8GGGACGGMCMAAACAAAATTITS9ACCCTTGTTTTCTTTCTTCCITS10AATTTTGTTTGGGCCGTCCC3、擴增程序90-98℃預變性1-10min，90-98℃變性10-120s，45-65℃退火10-120s，65-80℃延伸10-120s，共20-40個循環，最后65-80℃保溫1-10min；4、電泳檢測擴增結束后，以GeneRuler100bp DNA Ladder Plus為marker，用含有EB的1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
本發明的甘蔗斑茅雜種的DNA鑒定方法，具有準確、直觀、便捷的特點，鑒定速度快，環境影響因素小，鑒定的準確率高，成功地解決了長期以來甘蔗斑茅雜種鑒定的困難，確保了被鑒定雜種的真實性，提高了育種利用的有效性。
附圖是甘蔗(拔地拉)、斑茅(崖城92-105)及其F1雜種(崖城96-66)，崖城96-66與甘蔗商業栽培種(CP84-1198)的回交后代(崖城01-1～崖城01-9)的雜種鑒定電泳檢測圖。
具體實施例為了充分公開本發明的甘蔗斑茅雜種的DNA鑒定方法，結合以下實施例加以說明。
本發明是通過以下方法實現的1、基因組DNA的提取(1)取稍嫩的葉片100mg，剪碎后放入2.0ml的Eppendorf管中，在液氮處理下，用潔凈的玻璃棒迅速研成粉末狀；(2)加入800ul 65℃預熱的CTAB提取緩沖液(200mM Tris-HCl，50mM EDTA，2.2M NaCl，2％CTAB，0.06％亞硫酸鈉，pH8.0)。顛倒離心管，使葉片粉末與提取緩沖液充分混均；(3)然后依次加入200ul 10％聚乙烯基吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)，200ul 5％月桂酰肌氨酸鈉(Sodium lauroyl sarcosine)，200ul 20％十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，200ul無水乙醇，充分混合均勻；(4)于65℃恒溫水浴箱中溫浴30min；(5)取出離心管自然冷卻至室溫后6000g離心3min；(6)吸取上層清夜，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醉(25∶24∶1)，顛倒混勻后，在室溫下8000g離心5min；(7)轉移上層清夜至另一個新的離心管中，加入等體積的冰預冷的異丙醇，輕輕混勻；(8)-20℃下放置20min，使DNA充分纏繞成團；(9)在室溫下4000g離心2min，盡棄上層液；(10)用70％的乙醇洗滌二次，在真空濃縮儀中將DNA沉淀抽干。
加入100ul TE緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)，充分溶解DNA沉淀，-20℃下貯存備用。
2、配制試劑 反應體系含1/10體積的10倍PCR反應緩沖液；dNTP各0.2mmol/L；Taq DNA聚合酶1.5國際單位；分離純化的DNA模板液1μl(50ng)；0.5ul引物I(5μmol/L)，0.5ul引物II(5μmol/L)；加無菌去離子水使總體積達到45μl。
上述引物I和引物II，在采用常規方法設計的具有適合本發明鑒定方法的PCR引物ITS1-ITS10中選取；以能夠清晰顯示甘蔗與斑茅雜種特異譜帶為主要指標，經選擇發現引物I為ITS7、引物II為ITS 8是最佳組合，具體如下ITS7GGAAGAAAGAAAACAAGGGTITS8GGGACGGMCMAAACAAAATT3、擴增程序95℃預變性5min，93℃變性50s，52℃退火20s，72℃延伸40s，共30個循環，最后72℃保溫5min。
4、電泳檢測擴增結束后，以GeneRuler100bp DNA Ladder Plus為marker，用含有EB的1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，VILBERLOURMAT公司凝膠成像系統照相并保存，觀察特異譜帶的差異。如附圖所示，熒光條帶即317bp的條帶所對應的樣品均為斑茅的真實后代。圖中，1為拔地拉；2為海南92-105；3為崖城96-66；4為CP84-1198；5～13依次為崖城96-66/CP84-1198組合的后代崖城01-1～崖城01-9；M為DNA分子量標記。測定結果表明除拔地拉、CP84-1198和崖城01-4無317bp的條帶，為非斑茅后代外，其余的樣品都是斑茅的真實后代。
權利要求
1.甘蔗斑茅雜種的DNA鑒定方法，其特征在于鑒定方法如下(1)基因組DNA提取供鑒定的甘蔗斑茅雜種葉片經液氮研磨，依次加入CTAB提取緩沖液、聚乙烯基吡咯烷酮、月桂酰肌氨酸鈉、CTAB溶液；經水浴加溫、室溫冷卻，再用酚、氯仿抽提純化、異丙醇沉淀、然后TE溶解；(2)試劑配制反應體系含1/10體積的10倍PCR反應緩沖液；dNTP各0.1～0.3mmol/L；Taq DNA聚合酶0.1～5國際單位；分離純化的DNA模板液0.1～5μl，；PCR引物1對，各0.1～2μmol/L；加無菌去離子水使總體積達到10～100μl；上述PCR引物在以下引物中選取ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGTITS2TCCTCCGCTTATTGATATGCITS3TTGGCCGCCGTCCCATCCTCITS4AGAAAAAGAAAAACAAAGGCITS5TTCAGGTTTTTGGAGAACGGITS6ACAAATTGGACTCTTGGAGCITS7GGAAGAAAGAAAACAAGGGTITS8GGGACGGMCMAAACAAAATTITS9ACCCTTGTTTTCTTTCTTCCITS10AATTTTGTTTGGGCCGTCCC(3)擴增程序90-98℃預變性1-10min，90-98℃變性10-120s，45-65℃退火10-120s，65-80℃延伸10-120s，共20-40個循環，最后65-80℃保溫1-10min；(4)電泳檢測擴增結束后，以GeneRuler100bp DNA Ladder Plus為marker，用含有EB的1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測；
2.根據權利要求1所述的甘蔗斑茅雜種的DNA鑒定方法，其特征在于所使用的PCR引物中，引物I為ITS7、引物II為ITS8，具體如下ITS7GGAAGAAAGAAAACAAGGGTITS8GGGACGGMCMAAACAAAATT
3.根據權利要求1或2所述的甘蔗斑茅雜種的DNA鑒定方法，其特征在于擴增程序為95℃預變性5min，93℃變性50s，52℃退火20s，72℃延伸40s，共30個循環，最后72℃保溫5min。
全文摘要
甘蔗斑茅雜種的DNA鑒定方法，包括甘蔗、斑茅基因組DNA提取、試劑配制、擴增和電泳檢測。該鑒定方法能從DNA分子水平上獲得最直接的雜種證據，具有準確、直觀、便捷的特點，鑒定速度快，環境影響因素小，鑒定的準確率高，成功地解決了長期以來甘蔗斑茅雜種鑒定的困難，確保了被鑒定雜種的真實性，提高了育種利用的有效性。
文檔編號C12Q1/68GK1566362SQ0313882
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月10日 優先權日2003年7月10日
發明者張木清, 陳如凱, 鄭雪芳, 鄧祖湖 申請人:福建農林大學