專利名稱：Sars冠狀病毒的假病毒及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及SARS冠狀病毒的假病毒及其制備方法，本發明還涉及SARS冠狀病毒的假病毒在進行SARS冠狀病毒中和抗體研究及藥物篩選研究方面的用途。
背景技術：
在開展疾病防治的研究工作中，如尋找病原體的受體、研究該病原體的致病機理，以及尋找抗體、研制疫苗和篩選對抗藥物時，往往需要利用該疾病的病原體進行研究。在傳染病的研究，尤其是烈性傳染病的研究中，直接研究病原體具有極大的危險性，不適于迅速開展大規模的藥物篩選和科學實驗。因此在傳染病的研究中，假病毒技術是一種非常有效的研究手段。已有不少成功制備假病毒的報道，如HIV、Marburg和Ebo1a病毒等。
SARS冠狀病毒是引起2003年在我國和世界范圍內爆發的“非典型肺炎”的病原體，目前對SARS病毒的研究主要依賴活病毒體外培養。已知“非典型肺炎”具有高度傳染性，且病死率較高，直接用SARS冠狀病毒開展研究具有相當大的危險性，且需要苛刻的實驗條件。因此研制SARS冠狀病毒的假病毒感染模型非常必要和急需。
發明內容
本發明的目的是建立安全、可靠、高效的體外研究SARS侵染宿主細胞的感染模型，即制備出SARS冠狀病毒的假病毒。
本發明提供的SARS冠狀病毒的假病毒是
SARS病毒的囊膜蛋白SPIKE參與到帶有報告基因的缺損型病毒基因組的包裝中而得到的SARS冠狀病毒假顆粒；所述報告基因可以是GFP，EGFP，YFP，RFP，BFP，AP，SEAP，Luc，LacZ等；所述缺損型病毒基因組或其一部分可以來源于VSV，HIV，SARS，Mulv，HTLV，SIV以及其它病毒；所述缺損型病毒基因組中所包含的一個或多個結構基因可以去除；所述缺損型病毒基因組中所包含的一個或多個結構基因可以受到調控而失活；所述SARS冠狀病毒假顆粒可以在帶有或不帶有報告基因序列的情況下包括一段或一段以上編碼生物活性物質的外源序列。
本發明提供的假病毒的囊膜表面帶有SARS病毒的囊膜蛋白，而囊膜內則是其它病毒的帶有報告基因的缺損型基因組和結構蛋白。用本發明制備的SARS假病毒顆粒感染SARS易感細胞，能在細胞內表達缺損型病毒基因組所攜帶的報告基因，檢測報告基因的表達量就可定量判斷假病毒的感染效率。
經實驗證明，SARS恢復期病人血清中存在SARS病毒的中和抗體能有效阻斷本發明所制備的SARS冠狀病毒的假病毒對靶細胞的感染，使GFP陽性細胞數明顯下降。由此證實本發明得到的SARS冠狀病毒的假病毒能夠作為行之有效的檢測手段，用于SARS中和抗體的研究。此外，利用本發明提供的SARS冠狀病毒的假病毒還可以檢測藥物對SARS感染的阻斷活性。
本發明提供的SARS冠狀病毒的假病毒制備方法是1.質粒一的制備將SARS囊膜蛋白SPIKE的基因插入真核細胞表達質粒中；2.質粒二的制備將某一病毒基因組中的囊膜蛋白基因去除或使其表達失活，并且使該病毒基因組帶有報告基因；3.將含有SARS囊膜蛋白的質粒一、含有攜帶報告基因的缺損型的其它病毒基因組的質粒二轉染到包裝細胞系中，30～60小時后收集細胞上清，然后從中提取并純化所得的SARS假病毒顆粒。
所述包裝細胞包括BHK21，293T，293，293GP，Cos，3T3，Hela等來源真核生物的傳代細胞系。
所述轉染的方法可以是磷酸鈣轉染法、脂質體轉染法、電轉染法等。
可將所述兩個質粒或其分解后的部分共轉染或將兩個質粒或其分解后的部分先后分步轉染。分步轉染可以先將含有缺損型病毒基因組的假病毒包裝擴增后再感染轉染有質粒一或其分解后部分的細胞。
所述純化方法是超速離心。
本發明提供的一個制備SARS冠狀病毒的假病毒的實例是用磷酸鈣轉染法，將含有受調控的SARS病毒囊膜蛋白基因Spike序列的質粒一轉染到BHK21細胞系中；用磷酸鈣轉染法，將含有除去G蛋白的VSV病毒基因組序列并含有Egfp報告基因序列的質粒二和表達VSV其他結構基因的質粒共轉染BHK21細胞系，使其包裝為囊膜帶有G蛋白的假病毒并進行擴增培養；將擴增培養所得的病毒感染轉染有質粒一的BHK21細胞系；收獲囊膜蛋白為SPIKE的SARS假病毒顆粒。
在此實例中，SARS病毒的囊膜蛋白參與到帶有報告基因Egfp的缺損G蛋白基因的VSV病毒基因組的包裝中，制備出SARS冠狀病毒假顆粒。
本發明的優點是SARS病毒的假病毒不具有復制能力，也不會引起SARS導致的特異性的細胞病變，因此可以最大程度降低SARS病毒研究過程中的各種風險。由于假病毒的親噬性和感染過程與真病毒相同，因此可以模擬病毒感染的早期過程，而且假病毒內攜帶有報告基因，可以非常方便地快速地進行各種檢測和分析，因此假病毒不僅可以用來研究病毒與宿主細胞的關系，克隆細胞表面受體，更重要的是可以用于篩選抗病毒藥物、測定感染者體內的中和抗體的效價、尋找SARS病毒表面抗原上中和抗體結合的表位，評價疫苗免疫的效果，是研究烈性傳染病病毒安全有效的重要途徑。
假病毒感染模型的建立將為尋找SARS病毒的受體，研究該病毒的侵染機理，尋找抗病毒的藥物，研究抗病毒的中和抗體和疫苗提供了新的簡便的實驗方法。
利用這一模型研究SARS病毒侵染宿主細胞的全過程和阻斷這一過程的途徑，從而為大規模的體外藥物篩選提供簡便安全的方法。
具體實施例方式
實施例1 SARS病毒SPIKE蛋白基因的克隆和修飾1.SARS病毒樣本的總RNA的提取(1)用1ml trizol(GIBCO)抽提含有SARS病毒樣本；(2)加200μl氯仿，劇烈振蕩15秒；(3)室溫靜置3-5min，10000g 4℃離心15min；(4)吸出500μl水相，轉移到新管中；(5)加入500μl異丙醇，充分振蕩混勻；室溫靜置10min；(6)10000g 4℃離心10min，得到SARS病毒RNA沉淀。
2.SARS病毒SPIKE蛋白基因的克隆
(1)將SARS病毒RNA基因組反轉錄為DNA反轉錄引物SPIKE蛋白antisense primer反轉錄酶MMLV-RT(promega)(2)通過PCR方法擴增出SPIKE的DNA序列。
擴增引物Sense5′-cgggatccaacgaacatgtttattttcttattatttc-3′antisense5′-cggaattcgtttatgtgtaatgtaatttgacaccc-3′(3)將PCR產物連接到pcDNA 3.1+載體中連接方式BamHI，EcoRI雙切連接。
3.將SARS病毒SPIKE蛋白表達載體的構建(1)將SARS病毒S蛋白的胞外區(SARS S)對應氨基酸14-1195序列前連接VSV G蛋白的信號肽(G SP)后面連接VSV G蛋白的跨膜區和胞內區(G TMC)中間連接的酶切位點是XhoI-(G SP)-EcoRI-(SARS S)-XbaI-(G-TMC)-NheI(2)插入到載體的XhoI和XbaI位點間。
載體是pSK-Ter，即在pSK+的XbaI和SacI位點間插入了T7的Terminator序列。
實施例2 VSVΔG*-G病毒的制備1.VSV印第安那株來源于北京大學生命科學院2.構建VSVΔG*-G病毒相關載體(1)按PNAS(1995)V92 p4477-81的方法，去除VSV載體上的G蛋白，構建成帶有GFP作為報告基因的VSVΔG*載體；
(2)將VSV上的L，N，P，M，G五個蛋白分別克隆到“pBluescriptSKII+”(Clonetech)載體上。分別將這五個載體稱作pSKL，pSKN，pSKP，pSKM，pSKG。
3.VSVΔG*-G病毒的制備(1)用VTF7-3轉染BHK21細胞VTF7-3來源于PNAS(1986)，v83，p8122-8126；(2)磷酸鈣法將如下六個質粒共轉染事先經VTF7-3感染的BHK21細胞pSKL，pSKN，pSKP，pSKM，pSKG，pVΔG GFP培養體系為10CMDish中加DMEM+10％FCS 10ml；(3)48小時收集上清，12000轉10分鐘離心去除細胞碎片。
4.VSVΔG*-G病毒的擴增(1)用pSKG轉染BHK21細胞；(2)用3(3)中得到的上清感染事先轉染了pSKG的BHK21細胞培養體系為10CMDish中加DMEM+10％FCS10ml；(3)24小時后收集上清。
實施例3SARS假病毒VSVΔG*-S的制備1SARS假病毒的制備(1)用pSKG轉染BHK21細胞；(2)用4(3)中得到的病毒上清感染事先轉染了pSKG的BHK21細胞；培養體系為10CMDish中加DMEM+10％FCS10ml。
(3)18-40小時后收集上清。
實施例4 SARS假病毒的鑒定取150微升含有SARS假病毒VSVΔG*-S的上清液感染已知的SARS易感細胞VeroE6和非易感細胞Hep2。
(1)培養體系為10CMDish中加DMEM+10％FCS10ml，12-14小時后計算靶細胞GFP陽性細胞數，取VSVΔG*-G病毒為陽性對照；取無囊膜蛋白的VSVΔG*病毒作為對照。
(2)結果見下表SARS假病毒產毒實驗結果
結果從上表中可看出，本發明提供的帶有SARS囊膜蛋白的假病毒能夠有效感染SARS病毒易感細胞系VeroE6，但未感染對SARS病毒不敏感的Hep2細胞系。這說明SARS冠狀病毒的假病毒與真病毒有著相同的感染模式，利用SARS冠狀病毒的假病毒研究SARS真病毒對宿主細胞的侵染是可行的和有效的。
實施例5利用SARS冠狀病毒的假病毒檢測SARS中和抗體的活性。
一、實驗方法1、將SARS恢復期病人的血清以1∶20稀釋。
2、將SARS冠狀病毒的假病毒的濃度配制為每微升10IU(IU為感染單位，即病毒感染產生的GFP陽性細胞數)。
3、將20微升假病毒和1∶20稀釋后的血清100微升在37℃孵育30分鐘后，加入24孔板中的VeroE6細胞培養體系中，細胞匯合度為20％，培養體系500微升DMEM+10％FCS。
4、14小時后計算GFP陽性細胞數量。
二、實驗結果SARS恢復期病人血清中存在SARS病毒的中和抗體能有效阻斷本發明所制備的SARS冠狀病毒的假病毒對靶細胞的感染，使GFP陽性細胞數明顯下降。實驗數據見下表SARS冠狀病毒的假病毒對靶細胞的感染率
三、結論本發明得到的SARS冠狀病毒的假病毒能夠作為行之有效的檢測手段，用于SARS中和抗體的研究。
實施例6利用假病毒檢測藥物對SARS感染的阻斷活性一、實驗方法1、將大腸桿菌表達的多肽藥物樣品按比例稀釋。
序列如下ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGK2、將SARS冠狀病毒的假病毒的濃度配制為每微升10IU(感染單位)。
3、將20微升假病毒和1∶20稀釋后的血清100微升在37℃孵育30分鐘后，加入24孔板中的VeroE6細胞培養體系中，細胞匯合度為20％，培養體系500微升DMEM+10％FCS。
4、添加系列濃度的多肽樣品檢測其阻斷假病毒感染的能力。
5、14小時后計算GFP陽性細胞數量。
二、實驗結果該多肽的濃度為30nM時，對假病毒阻斷率為50％。
三、結論受試多肽藥物可以有效地阻斷SARS冠狀病毒的假病毒感染靶細胞，由此證實本發明所得到的SARS冠狀病毒的假病毒能夠作為行之有效的檢測手段，用于SARS阻斷藥物的研究。
最后所應說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。
權利要求
1.SARS冠狀病毒的假病毒，其特征是，將SARS病毒的囊膜蛋白SPIKE參與到帶有報告基因的缺損型病毒基因組的包裝中而得到的SARS冠狀病毒假顆粒；所述報告基因是GFP，EGFP，YFP，RFP，BFP，AP，SEAP，Luc，LacZ等；所述缺損型病毒基因組或其一部分來源于VSV，HIV，SARS，Mulv，HTLV，SIV以及其它病毒。
2.權利要求1所述的SARS冠狀病毒的假病毒，其特征是，所述缺損型病毒基因組中所包含的一個或多個結構基因可以去除。
3.權利要求1所述的SARS冠狀病毒的假病毒，其特征是，所述缺損型病毒基因組中所包含的一個或多個結構基因可以受到調控而失活。
4.權利要求1、2或3所述的SARS冠狀病毒的假病毒，其特征是，可以在帶有或不帶有報告基因序列的情況下包括一段或一段以上編碼生物活性物質的外源序列。
5.權利要求4所述的SARS冠狀病毒的假病毒，其特征是，所述缺損型病毒基因組是除去G蛋白的VSV病毒基因組。
6.權利要求4所述的SARS冠狀病毒的假病毒，其特征是，所述報告基因是含有Egfp的報告基因。
7.權利要求1-6任一所述的SARS冠狀病毒的假病毒的制備方法，其特征是，1)質粒一的制備將SARS囊膜蛋白SPIKE的基因插入真核細胞表達質粒中；2)質粒二的制備將某一病毒基因組中的囊膜蛋白基因去除或使其表達失活，并且使該病毒基因組帶有報告基因；3)將含有SARS囊膜蛋白的質粒一、含有攜帶報告基因的缺損型的其它病毒基因組的質粒二轉染到包裝細胞系中，30～60小時后收集細胞上清，然后從中提取并純化所得的SARS假病毒顆粒；所述包裝細胞是來源于真核生物的傳代細胞系，包括BHK21，293T，293，293GP，Cos，3T3，Hela。
8.權利要求7所述的SARS冠狀病毒的假病毒的制備方法，其特征是，所述轉染的方法是磷酸鈣轉染法、脂質體轉染法、電轉染法。
9.權利要求7所述的SARS冠狀病毒的假病毒的制備方法，其特征是，所述包裝細胞是BHK21細胞系。
10.權利要求1所述的SARS冠狀病毒的假病毒作為檢測手段進行SARS冠狀病毒中和抗體研究的用途。
11.權利要求1所述的SARS冠狀病毒的假病毒作為檢測手段進行SARS冠狀病毒藥物篩選研究的用途。
全文摘要
本發明涉及SARS冠狀病毒的假病毒及其制備方法和用假病毒進行SARS冠狀病毒中和抗體及藥物篩選研究方面的用途。所述假病毒是將SARS病毒的囊膜蛋白SPIKE參與到帶有報告基因的缺損型病毒基因組的包裝中而得到的。所述假病毒的制備方法是將含有SARS囊膜蛋白的質粒一、含有攜帶報告基因的缺損型的其它病毒基因組的質粒二轉染到包裝細胞系中，30～60小時后收集細胞上清，然后從中提取并純化所得的SARS假病毒顆粒。假病毒感染模型的建立為尋找SARS病毒的受體，研究該病毒的侵染機理，尋找抗病毒的藥物，研究抗病毒的中和抗體和疫苗效果評價提供了新的簡便的實驗方法。
文檔編號C12N15/63GK1552851SQ03138168
公開日2004年12月8日 申請日期2003年6月6日 優先權日2003年6月6日
發明者鄧宏魁, 丁明孝, 聶玉春, 史萱鈴, 王葳, 凌晨, 王在, 于翔, 任立晨 申請人:北京大學