專利名稱：重組人骨形成蛋白4和7在甲醇酵母中的高效表達的制作方法
技術領域：
本發明涉及應用甲醇酵母(Pichia pastoris)高效表達人骨形成蛋白技術，尤其涉及根據酵母偏愛密碼子對人骨形成蛋白成熟肽序列進行定點突變技術，屬于生物工程技術領域。
骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)是一類廣譜性的蛋白質生長調節因子，其全長cDNA約為1.2Kb。在哺乳動物(包括人類)中已發現的BMPs家族成員至少有16種，它們對骨質的生長、神經細胞的再生、創口愈合以及神經腫瘤的治療等均有明顯的促進作用。就骨質生長發育而言，BMP-2(也稱之為BMP-2A)、BMP-4(也稱之為BMP-2B)及BMP-7具有明顯的促使細胞組織分化形成骨組織的作用，而且這三種BMPs同時具有明顯的促進成體骨組織再生的作用。因此BMPs在骨科臨床及相關的臨床學科上有著極為廣泛的應用前景。然而BMPs在骨組織中的含量只有百萬分之一。提取的步驟煩瑣，存在重復性差、產量低、生產成本昂貴以及產品純度不高等缺點。因而不能滿足臨床科研和基礎研究的要求。
1988年至今，人BMP 1-13的cDNA序列均已得到克隆，這使得應用基因工程技術生產重組人BMPs成為可能(Proc.Natl.Acad.Sci.USA第87卷，第2220-2224頁，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA第87卷，第9843-9847頁，1990；J.Biol.Chem.第267卷，第25220-25227頁，1992；Mel.Reprod.Dev.第32卷，160-167頁，1992)。對人BMPs基因表達的研究，國外多用CHO、COS、HOS等真核細胞，其活生雖好，但生產成本高、產量低、無法達到大規模生產要求。利用人BMP-7和鼠BMP-2的啟動子探測骨相關物質的方法已申請專利(CN 1307643 A，WO 97/15305)，然而其獲得的只是小分子量有機化合物，而非重組BMPs。國內也有相關研究，構建了重組人BMP-2、-3部分或完整成熟肽cDNA片段的表達載體，利用大腸桿菌表達出了有誘導骨活性的人BMP-2、-3肽段(生物工程學報15卷3期，288-292，1999；CN1165189A；生物化學雜志10卷3期，318-324，1994)。大腸桿菌表達體系表達量雖高，但其背景雜蛋白多，純化麻煩，重要的是不能對真核生物蛋白質進行翻譯后的修飾和加工，最終影響產物的生物活性。
甲醇酵母表達體系是最近發展迅速的一種外源蛋白表達系統，與以往的基因表達體系相比，它具有無可匹敵的高表達特性(1)適合高密度發酵培養。生產成本低，便于工業化生產；(2)能高效嚴格地調控外源蛋白的表達，表達的蛋白可分泌至胞外，且自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，利于純化。
統計學分析110個酵母基因使用密碼子的情況表明61個密碼子中有25個為偏愛密碼子，對偏愛密碼子的使用程度和基因表達水平呈正比。如在酵母大量表達的基因中編碼精氨酸的6個密碼子中AGA的使用頻率為86.6％，幾乎不使用CGA和CGG這兩個密碼子。目前利用甲醇酵母表達外源蛋白不乏報道和專利，如表達人血管內皮細胞抑制素(CN 1305004A)，魚生長激素(CN 1207415A)及人白細胞介素11(CN 1288062A)等，但利用甲醇酵母高效表達人骨形成蛋白在國內外尚屬首例。由于人BMPs是一類磷酸化的二聚體糖蛋白多肽，其磷酸和多糖結構與其生理活性密切相關，因此本發明中可通過甲醇酵母表達體系對定點突變后的人骨形成蛋白成熟肽cDNA序列進行表達，并對表達蛋白進行結構上的加工修飾，使其生物活性增強。另外修飾后的人骨形成蛋白具較低的糖基化程度，對人體也無明顯的抗原性，適于臨床治療用途。
本發明的目的在于提供甲醇酵母基因工程菌株GS115。該工程菌能夠分別高效表達人BMP-4、BMP-7及BMP-4-BMP-7異型二聚體，為大規模生產高純度重組人BMP-4、BMP-7及BMP-4-BMP-7異型二聚體以用于骨科及相關臨床治療奠定基礎。
本發明的另一目的在于提供了構建能高效表達重組人BMP-4和BMP-7及BMP-4-BMP-7異型二聚體的甲醇酵母基因工程菌株GS115的方法。
本發明通過以下技術方案加以實現分別以含人BMP-4和人BMP-7 cDNA序列的質粒pBluescript KS-BMP4和pBluescript KS-BMP7為模板，PCR擴增得到人BMP-4和人BMP-7成熟肽cDNA序列。分別克隆到甲醇酵母表達質粒pPIC9K中，得到pPIC9K-BMP4和pPIC9K-BMP7。堿性溶菌小量制備法提取質粒DNA，分別以pPIC9K-BMP4和pPIC9K-BMP7為模板，利用簡化的重疊PCR技術分別對人骨形成蛋白4和7成熟肽cDNA序列中精氨酸密碼子進行定點突變。其中人骨形成蛋白4和7的成熟肽cDNA序列長度分別為348bp和417bp。改造后的人BMP-4成熟肽cDNA序列特征為第22-24位、第49-51位由CGG突變為AGA。人BMP-7成熟肽cDNA序列第66-68位、第400-402位的CGG突變為AGA，第142-144位的CGA突變為AGA。改造后的基因產物作為模板克隆到甲醇酵母表達質粒pPIC9K中。堿性溶菌小量制備法提取質粒DNA，內切酶SacI酶切線性化重組甲醇酵母表達載體，并采用電轉化法轉化到甲醇酵母GS115中。MD平板初篩His4+轉化子，然后用不同濃度的G418篩選多拷貝轉化子。利用人BMP-4和人BMP-7成熟肽cDNA序列的上下游引物進行PCR反應復篩多拷貝轉化子，篩選能夠獲得正確擴增片段的真陽性轉化子，并在MM和MD平板上培養鑒定多拷貝轉化子的表型。挑取上述單菌落于BMGY和BMMY培養基中培養，22-30℃，250rpm搖床培養至OD600＝2-6，離心收集細胞，將細胞懸浮于BMMY培養液中，22-30℃振蕩培養，每24小時加入100％甲醇誘導重組蛋白表達，直至甲醇終濃度達到0.5-1.2％。離心收集上清液。表達產物經SDS-PAGE及Western blot測定重組蛋白表達量，并驗證目的蛋白。本發明提供甲醇酵母基因工程菌株GS115，利用簡化的重疊PCR技術分別對人骨形成蛋白4和7成熟肽cDNA序列中精氨酸密碼子進行定點突變及體外重組的方法，制備重組人BMP-4、BMP-7及BMP-4-BMP-7異型二聚體，用于骨科及相關臨床治療。
基于上述敘述，本發明的顯著優點是①首次構建了高效表達重組人BMP-4、BMP-7及BMP-4-BMP-7異型二聚體的甲醇酵母基因工程菌株。
②自我設計引物，利用簡化的重疊PCR技術對人BMP-4、BMP-7成熟肽cDNA序列進行了定點突變，將其中的哺乳動物細胞使用的精氨酸密碼子全部改變為酵母偏愛的精氨酸密碼子，使表達量提高了至少5倍，發酵液上清中重組蛋白含量可達到0.2mg/ml以上。
③構建的高效表達重組人骨形成蛋白的甲醇酵母基因工程菌株，可生產重組人骨形成蛋白用于臨床骨缺損、骨折愈合、骨不連等方面的治療。所表達的重組人BMP-4-BMP-7異型二聚體的生理效應可為同型二聚體的10-20倍，提高了促進骨質生長的作用。
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的說明。實施例僅是對本發明的進一步說明，而不是對發明的限制。
圖1是本發明的人BMP-4成熟肽序列及定點突變的位點示意圖。
圖2是本發明的人BMP-7成熟肽序列及定點突變的位點示意圖。
圖1中，人骨形成蛋白4的成熟肽序列長度為348bp，改造后的人BMP-4成熟肽序列特征為第22-24位、第49-51位由CGG突變為AGA。
圖2中，人骨形成蛋白7的成熟肽序列長度為417bp，改造后的人BMP-7成熟肽序列第66-68位、第400-402位的CGG突變為AGA，第142-144位的CGA突變為AGA。
實施例11、人骨形成蛋白成熟肽cDNA序列的亞克隆根據已知的人BMP-4和人BMP-7的cDNA序列，設計并合成引物如下人BMP-4 cDNA序列5’端引物5’-AGCCCTAAGCATCACTCACAG-3’3’端引物5’-TCAGCGGCACCCACATC-3’人BMP-7 cDNA序列5’端引物5’-TCCACGGGGAGCAAACAG-3’3’端引物5’-CTAGTGGCAGCCACAGGC-3’分別以含人BMP-4和人BMP-7cDNA序列的質粒pBluescript KS BMP-4和pBluescript KS BMP-7為模板，PCR擴增得到348bp的人BMP-4的成熟肽cDNA序列和417bp的人BMP-7的成熟肽cDNA序列。PCR產物經DNA膠回收試劑盒(Promega產品)進行純化后分別與經SnaBI內切酶消化的酵母表達質粒pPIC9K連接，轉化到大腸桿菌Top10F’。酶切、PCR、測序分析篩選得到含正確的人BMP-4成熟肽cDNA序列的質粒pPIC9K-BMP4和含正確的人BMP-7成熟肽cDNA序列的質粒pPIC9K-BMP7。堿性溶菌小量制備法提取質粒DNA。
2、利用簡化的重疊PCR技術進行定點突變，構建含突變后人BMP成熟肽cDNA序列的甲醇酵母表達載體①.人BMP-4成熟肽cDNA序列的定點突變首先設計人BMP-4成熟肽cDNA序列5’端引物，其中載體引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)位于質粒pPIC9K BamH1位點的上游，載體引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)位于質粒pPIC9K EcoIRI位點的下游。其余為突變位點引物，每對突變引物有部分序列重疊。
引物序列和退火溫度以載體引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)和B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)擴增pPIC9K-BMP-4，PCR反應溫度條件95℃4min；94℃1min，53℃2min，72℃90sec(30個循環)；72℃10min。擴增產物經DNA膠回收試劑盒(Promega產品)進行純化。
第一步以上述PCR產物為模板，分別用三對引物進行PCR擴增反應引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)和突變位點1的反鏈引物(antisense mutagenicprimer)C(5’-GCTCTCTGTGAGTGATGC-3’)，引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)和突變位點1正鏈引物(sense mutagenic primer)D(5’-CACAGAGAGCAGGAAG-3’)，引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)與突變位點2正鏈引物F(5’-CAGACGCCACTCGT-3’)。得到三個PCR產物片斷，分別用符號AC(AC為引物A與引物C擴增的產物)、BD(BD為引物B與引物D擴增的產物)和BF(BF為引物B與引物F擴增的產物)表示，經DNA膠回收試劑盒(Promega產品)進行純化。
第二步重疊PCR反應先使產物片斷AC與BD退火，形成互補。反應溫度條件95℃4min；94℃1min，50℃2min，72℃90sec(5個循環)。然后加入引物A和突變位點2的反鏈引物E(5’-GGCGTCTGCAGTTCTTAT-3’)，使終濃度達到20pM，繼續進行PCR擴增。反應溫度條件94℃1min，52℃2min，72℃90sec(25個循環)；72℃10min。擴增產物AE(AE為引物A與引物E擴增的產物)經DNA膠回收試劑盒(Promega產品)進行純化。產物AE含兩個突變位點。
第三步重疊PCR反應使第二步的產物AE與第一步的產物BD退火，形成互補。反應溫度條件95℃4min；94℃1min，50℃2min，72℃90sec(5個循環)。然后加入引物A和引物B，使終濃度達到20pM，繼續進行PCR擴增。反應溫度條件94℃1min，52℃2min，72℃90sec(25個循環)；72℃10min。擴增產物AB(AB為引物A與引物B擴增的產物)經DNA膠回收試劑盒(Promega產品)進行純化。終產物AB為含兩個突變位點的人BMP-4成熟肽cDNA序列。
②.人BMP-7成熟肽cDNA序列的定點突變本發明為提高人BMP-7在酵母中的表達量，在分子水平上對人BMP-7成熟肽cDNA序列進行改造，第66-68位、第400-402位的CGG突變為AGA，第142-144位的CGA突變為AGA。
首先設計引物，其中載體引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)位于質粒pPIC9K BamH1位點的上游，載體引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)位于質粒pPIC9K EcoIRI位點的下游。其余為突變位點引物。
引物序列及退火溫度以載體引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)和B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)擴增pPIC9K-BMP-7，反應溫度條件95℃4min；94℃1min，53℃2min，72℃90sec(30個循環)；72℃10min。擴增產物經DNA膠回收試劑盒(Promega產品)進行純化。
第一步以上述PCR產物為模板，分別用四對引物進行PCR擴增反應引物A(5’-ATAATTGCGACTGGTTCC-3’)和突變位點1的反鏈引物I(5’-TTGGCCATTCTCAGGG-3’)，引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)和突變位點1的正鏈引物J(5’-GCCCTGAGAATGGCC-3’)，引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’)與突變位點2正鏈引物L(5’-CTTCAGAGACCT GGGCT-3’)，引物B(5’-GGCATTCTGACATCCTCTT-3’’)與突變位點3正鏈引物N(5’-GGTGGTCAGAGCCTGTG-3’)。得到的四個PCR產物片斷，分別用符號AI(AI為引物A與引物I擴增的產物)、BJ(BJ為引物B與引物J擴增的產物)、BL(BL為引物B與引物L擴增的產物)和BN(BN為引物B與引物N擴增的產物)表示。經DNA膠回收試劑盒(Promega產品)進行純化。
第二步重疊PCR反應先使產物AI與BJ退火，形成互補。反應溫度條件95℃4min；94℃1min，50℃2min，72℃90sec(5個循環)。然后加入引物A和突變位點2的反鏈引物K(5’-AGCCCAGGTCTCTGAAG-3’)，使終濃度達到20pM，繼續進行PCR擴增。反應溫度條件94℃1min，52℃2min，72℃90sec(25個循環)；72℃10min。擴增產物AK(AK為引物A與引物K擴增的產物)經DNA膠回收試劑盒(Promega產品)進行純化。產物AK含兩個突變位點。
第三步重疊PCR反應使第二步的產物AK與第一步的產物BL退火，形成互補。反應溫度條件95℃4min；94℃1min，50℃2min，72℃90sec(5個循環)。然后加入引物A和突變位點3的反鏈引物M(5’-CAGGCTCTGACCACCAT-3’)，使終濃度達到20pM，繼續進行PCR擴增。反應溫度條件94℃1min，52℃2min，72℃90sec(25個循環)；72℃10min。擴增產物AM經DNA膠回收試劑盒(Promega產品)進行純化。產物AM(AM為引物A與引物M擴增的產物)含三個突變位點。
第四步重疊PCR反應使第三步的產物AM與第一步的產物BN退火，形成互補。反應溫度條件95℃4min；94℃1min，50℃2min，72℃90sec(5個循環)。然后加入引物A和引物B，使終濃度達到20pM，繼續進行PCR擴增。反應溫度條件94℃1min，52℃2min，72℃90sec(25個循環)；72℃10min。擴增產物AB經DNA膠回收試劑盒(Promega產品)進行純化。終產物AB為含三個突變位點的人BMP-7成熟肽序列。
3、突變后的人BMPs成熟肽序列克隆到甲醇酵母表達載體中以EcoRI和BamHI過夜消化上述1和2中獲得的已突變過的成熟肽cDNA片段以及質粒pPIC9K，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小無誤，將片段純化回收，將線性質粒和已突變的成熟肽cDNA片段進行連接反應，形成帶有突變位點的重組甲醇酵母表達載體，轉化到大腸桿菌Top10F’，酶切、PCR、測序分析確定得到的重組表達載體中的人BMP-4成熟肽cDNA片段和人BMP-7成熟肽cDNA片段均含有特定的突變位點。堿性溶菌小量制備法提取質粒DNA。
4、構建及篩選重組人BMP甲醇酵母菌株SacI酶消化處理上述的重組甲醇酵母表達載體使其線性化，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測小部分消化片段，檢驗是否消化完全。用25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶異戊醇抽提消化產物并用乙醇沉淀消化的DNA，將DNA溶解于TE中，-20℃保存備轉化用。電轉化法轉化甲醇酵母菌株GS115(His4-)，MD平板初篩His4+轉化子，再從中篩選多拷貝整合轉化子105個His+細胞涂布于G418濃度分別為0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，3.0和4.0mg/ml的YPD平板。在3.0mg/mlG418的平板上篩選到4個克隆，4.0mg/mlG418的平板上篩選到3個克隆。挑取4.0mg/mlG418耐受菌，純化后用15％甘油冷凍保存。應用PCR方法簡單直接的篩選甲醇酵母克隆，先取10μl酵母液于1.5ml離心管，加5μl的5U/μl溶菌酶，35℃孵育10min，-80℃冰凍樣品10min，建立50μl的PCR體系，以模板即上述酵母液5μ1，10×buffer 5μl；25mM Mg2+，5μl；25mMdNTP，1μl；Taq DNA聚合酶2.5U；5’AOX1引物和3’AOX1引物(10mM)，各1μl；加水至50μl。1％瓊脂糖凝膠電泳分析證明轉化子基因組中整合有重組甲醇酵母表達質粒中的目的基因片段。將等量多拷貝轉化子分別接種于MM和MD平板上，篩選表型是Mut+的轉化子。
5、搖瓶中甲醇誘導重組甲醇酵母菌株挑取G418濃度為4.0mg/mlYDP板上的單克隆，接種于內含10mlBMGY培養液的50ml離心管中，28-30℃，250rpm搖床培養至OD600＝2-6(大約16小時)，4℃1500g離心9min，去上清，加入10mlBMMY培養液重懸后繼續培養8小時，4℃1500g離心9min，去上清，再加入10mlBMMY培養液重懸后繼續培養，每24小時加入100％甲醇誘導重組蛋白表達，直至甲醇終濃度達到0.5％。分別在誘導后0小時、24小時、48小時、72小時、96小時、120小時和144小時取1ml表達上清液，分析其表達水平，確定最佳收獲時間為96小時。取少量上清用15％SDS-PAGE電泳分析，同時用鼠抗人BMP-4抗體、鼠抗人BMP-7抗體以及羊抗鼠IgG-AP對上清液進行Western雜交。結果表明上清中表達蛋白為人BMP-4和人BMP-7。篩選所得的含突變基因的重組酵母菌株，其表達重組人BMP-4和人BMP-7比未突變基因的菌株分別提高了7倍和10倍，上清液中重組蛋白含量達到0.2mg/ml以上。
權利要求
1.一種高效表達重組人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株，其特征在于在甲醇酵母Pichia pastoris的基因組DNA中整合了人骨形成蛋白成熟肽序列，并能在胞外高效表達重組人骨形成蛋白。
2.根據權利要求1所述的基因工程甲醇酵母菌株，其特征在于表達的人骨形成蛋可以是人骨形成蛋白4、人骨形成蛋白7及人骨形成蛋白4和7異型二聚體。
3.根據權利要求1所述的基因工程甲醇酵母菌株，其特征在于甲醇酵母菌株為GS115/pPIC9K-BMP4，GS115/pPIC9K-BMP7和GS115/pPIC9K-BMP4-BMP7。
4.一種高效表達人骨形成蛋白基因工程甲醇酵母菌株的構建方法，其特征在于構建方法包括以下步驟(1)將已克隆到質粒pBluescript KS中的人骨形成蛋白基因亞克隆到表達載體中；(2)利用簡化的重疊PCR方法對表達載體中的人骨形成蛋白成熟肽序列進行定點突變，以酵母偏愛的精氨酸密碼子取代原來的精氨酸密碼子，構建重組人骨形成蛋白表達載體；(3)重組人骨形成蛋白甲醇酵母菌株的構建和篩選；(4)重組人骨形成蛋白甲醇酵母菌株的培養及蛋白的誘導表達、產物驗證。
5.根據權利要求4所述的高效表達人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株的構建方法，其特征在于其中所說的酵母表達載體為甲醇酵母的分泌型表達載體pPIC9K。
6.根據權利要求4所述的高效表達人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株的構建方法，其特征在于所述的經精氨酸密碼子進行定點突變后，人骨形成蛋白4和7的突變株成熟肽序列長度分別為348bp和417bp。
7.根據權利要求6所述的高效表達人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株的構建方法，其特征在于所述突變株重組序列特征為人骨形成蛋白4成熟肽序列第22-24位、第49-51位由CGG突變為AGA，人骨形成蛋白7成熟肽序列第66-68位、第400-402位的CGG突變為AGA，第142-144位的CGA突變為AGA。
8.根據權利要求4所述的一種高效表達人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株的構建方法，其特征在于所說的重組人骨形成蛋白甲醇酵母菌株的構建及篩選包括以下步驟(1)重組酵母表達載體用內切酶SacI進行酶切線生化；(2)重組酵母表達載體電轉化法轉化到甲醇酵母中；(3)MD平板初篩轉化子，并用G418篩選多拷貝轉化子；(4)PCR方法復篩多拷貝轉化子；(5)MM和MD平板上鑒定多拷貝轉化子的表型。
9.根據權利要求4所述的一種高效表達人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株的構建方法，其特征在于其中所說的重組人骨形成蛋白甲醇酵母菌株為構瓶過夜培養，至OD600＝2-6，離心收集菌種，每天加入甲醇誘導蛋白，直至甲醇終濃度達到0.5％。表達產物經SDS-PAGE及Western blot測定蛋白表達量，并驗證目的蛋白。
全文摘要
本發明涉及應用甲醇酵母高效表達人骨形成蛋白技術，尤其涉及根據酵母偏愛密碼子對人骨形成蛋白成熟肽序列進行定點突變技術。其特征是用含人BMP4和7cDNA序列的質粒pBluescript KS－BMP4和pBluescript KS－BMP7為模板，PCR擴增得到人BMP4和7成熟肽cDNA序列。利用簡化的重疊PCR技術分別對人BMP4和7成熟肽cDNA序列中精氨酸密碼子進行定點突變。突變后的序列作為模板克隆到甲醇酵母表達質粒pPIC9K中并轉化到甲醇酵母GS115內。通過篩選并獲得陽性克隆。構建好的工程菌在BMGY和BMMY培養基中培養，經甲醇誘導后，高效表達重組人骨形成蛋白。本發明方法可高效表達分泌型重組人BMPs。通過定點突變，表達量提高了至少5倍，達到0.2mg/ml以上。重組人BMPs可用于骨科及相關臨床治療。
文檔編號C12N15/81GK1513979SQ0313658
公開日2004年7月21日 申請日期2003年5月20日 優先權日2003年5月20日
發明者張彥定, 陳一平, 黃義德 申請人:福建師范大學