專利名稱：鹽角草的Na的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域中的一種轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及鹽角草的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鹽害是農(nóng)作物產(chǎn)量的嚴(yán)重限制因素。了解植物的抗鹽機理，克隆抗鹽基因并轉(zhuǎn)移到鹽敏感的農(nóng)作物中，培育抗鹽的轉(zhuǎn)基因作物新品種，對于有5億多畝鹽荒地的中國來說，具有十分重要的意義。
植物為了抵御鹽脅迫，形成了一系列的適應(yīng)機制，主要是通過在細胞質(zhì)中積累小分子的無毒有機溶質(zhì)和離子，以及在液泡內(nèi)區(qū)隔化來實現(xiàn)滲透平衡。高等植物細胞液泡占完全膨脹細胞總體積的95％，對于植物來說Na+是細胞生長所需要的基本營養(yǎng)成分，Na+的區(qū)隔化是它在鹽環(huán)境中生存的必要保障。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白(antiporter)是一種Na+的逆向轉(zhuǎn)運體，在細胞質(zhì)膜和液泡膜上均有分布，液泡膜上的Na+/H+antiporter將細胞質(zhì)中的Na+逆著Na+濃度梯度運送到液泡中區(qū)隔化集中，細胞質(zhì)膜上的Na+/H+antiporter將細胞質(zhì)中的Na+逆向運送到胞外高Na+環(huán)境中，從而減少了鈉離子對細胞質(zhì)中細胞器的毒害，對維持細胞的滲透平衡起重要作用。
植物中Na+/H+antiporter最早發(fā)現(xiàn)是在大麥質(zhì)膜上，此后在質(zhì)膜和液泡膜上均有研究報道，到目前已經(jīng)在大量的鹽生植物及非鹽生植物中發(fā)現(xiàn)Na+/H+antiporter活力。已經(jīng)從擬南芥(AtNHX1)、水稻(OsNHX1)、北濱藜(AgNHX1)、冰葉午時花(McNHX1)分離了Na+/H+antiporter基因，證明該基因的表達產(chǎn)物具有Na+/H+交換的功能。雖然這些基因絕大多數(shù)是從具有低逆向運輸活力的甜土植物中分離的，但前人的研究表明鹽生植物普遍具有在液泡中高效區(qū)隔化Na+的機制。
耐鹽性屬于復(fù)雜性狀，大量的鹽脅迫反應(yīng)相關(guān)基因的存在也支持這個觀點。單一基因一般不能顯著提高作物的耐鹽水平，需要多個耐鹽基因的協(xié)同作用植物才具有高耐鹽性。然而轉(zhuǎn)AtNhx1基因的擬南芥植株在200mM NaCl中能正常生長發(fā)育。將擬南芥的AtNhx1基因轉(zhuǎn)入番茄中，過量表達液泡Na+/H+antiporter的轉(zhuǎn)基因番茄在200mM NaCl脅迫下能夠正常生長、開花和結(jié)實。盡管葉片中Na+濃度高，但番茄果實中Na+濃度很低。說明轉(zhuǎn)Na+/H+antiporter單基因能夠明顯提高植物耐鹽性，同時，具有器官表達的特異性，有力支持了Na+/H+antiporter在植物耐鹽性方面所具有的重要作用。
鹽角草是世界上最耐鹽的鹽生植物，同時是一種最有潛力發(fā)展為新型作物的鹽生植物，在我國有較廣泛的分布，可以在高于海水鹽度的條件下正常生長。植物體多汁和肉質(zhì)化，食之可發(fā)現(xiàn)具有很重的咸味，說明植物體蓄鹽量高。鹽角草這些超乎尋常的耐鹽特性表明在該植物中無疑存在極其高效的Na+逆向運輸和儲存機制。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白來源于鹽角草(Salicorniaeuropaea L.)，名稱為SeNHX1，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2氨基酸殘基序列是由560個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
根據(jù)GenBank中Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白保守的氨基酸序列設(shè)計合成了2個簡并性引物，P15′-ATTGG(T/A)GCAAT(A/C)TT(C/T)GCTGC-3′；P2 5′-(C/T)TCAT(A/G)AgACCAgCCCACCA-3′，通過RT-PCR及RACE方法從鹽生植物鹽角草中克隆Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因。
鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因SeNHX1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由2668bp個堿基組成，該基因的讀碼框為自5’端第492位到第2174位堿基。
利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達的載體，將本發(fā)明所提供的編碼鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白SeNHX1的基因?qū)胫参锛毎色@得對高鹽脅迫耐受力增強的轉(zhuǎn)基因細胞系及轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達載體中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導(dǎo)型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子，Ubiqutin啟動子，增強子既可以是轉(zhuǎn)錄增強子，也可以是翻譯增強子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素，卡那霉素等)。攜帶有本發(fā)明鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白SeNHX1基因的表達載體可以是Ti(Tu mor-induced-癌誘導(dǎo))質(zhì)粒、Ri(Root-induced-根誘導(dǎo))質(zhì)粒、植物病毒載體等，轉(zhuǎn)化可通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法等常規(guī)生物技術(shù)方法實現(xiàn)，被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻，小麥，玉米，大豆，棉花，蔬菜，樹木和草坪草等。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤果}植物品種，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。
圖1為Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白cDNA克隆圖2為鹽角草(SeNHX1)疏水性分析圖3為植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白氨基酸序列的同源性比較圖4為鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析圖5為鹽角草基因組DNA的Southern雜交分析具體實施方式
實施例1、RNA和DNA的分離用Trizol試劑盒(GIBCO-BRL)從鹽角草(Salicornia europaea L.)幼苗中提取RNA，隨后用無Rnase的DNase(TaKara)除去RNA中殘留的DNA。
DNA提取采用CTAB方法。
實施列2、鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白cDNA片段的分離根據(jù)北濱藜、堿蓬、柑桔中Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白保守的氨基酸序列合成簡并性引物P15′-ATTGG(T/A)GCAAT(A/C)TT(C/T)GCTGC-3′；P2 5′-(C/T)TCAT(A/G)AgACCAgCCCACCA-3′。
為了分離cDNA片段，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)根據(jù)鹽角草的RNA合成第一鏈cDNA。用合成的第一鏈cDNA作為模板，進行RT-PCR。RT-PCR反應(yīng)混合物為25μl，含有2μl cDNA模板，0.8mmol/L dNTPs，每條引物0.6μmol/L，1×PCR緩沖液，1U Taq DNA polymerase(Promega)。PCR反應(yīng)程序95℃，4min；95℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 1min，共36個循環(huán)；72℃ 10min。得到一個700bp的cDNA片段如圖1中的(b)所示。將其與PGEM T-easy vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用藍白斑篩選，挑取白色單菌落，提質(zhì)粒，NotI酶切質(zhì)粒鑒定插有預(yù)期大小片段(700bp)的陽性克隆，進行測序。測序結(jié)果表明，獲得了725bp的cDNA片斷，用blast比對鹽角草cDNA片斷，發(fā)現(xiàn)這個cDNA片斷與已克隆的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因具有較高的同源性，說明獲得的鹽角草cDNA片斷是Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的片段。
實施例3、鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白cDNA末端的分離根據(jù)已克隆的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白cDNA片段的序列合成基因特異引物
3-GSP15′-CGGGAACTTCTGTTGCTGTGAG-3′；3-GSP25′-TTACTCATGGTTGGACGAGCAGC-3′；5-GSP15′-CGCATTGAAAAGCACCACCG-3′；5-GSP25′-GCACCACCGAAGTAGCATCATT-3′；5-GSP35′-CAACACCTTCACCATACACCAGACT-3′。
通過cDNA末端快速擴增(GIBCO-BRL)分離Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白cDNA的3′末端和5′末端。用基因特異引物3-GSP1，3-GSP2和GIBCO-BRL 3′RACE、5′RACE試劑盒分離cDNA3′末端、5′末端。用5′RACE和3′RACE方法克隆的cDNA 5′末端序列如圖1中的(a)所示，3′末端序列如圖1中的(c)所示，測序結(jié)果顯示5′和3′端片段的長度分別為1050bp和1124bp，它們與中間725bp cDNA片段相應(yīng)末端分別有103bp和128bp的重疊區(qū)，將這3個片段拼接，得到一個全長2668bp鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的全長cDNA，如圖1中的(d)所示，為序列表中的序列1。
實施例4、鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白cDNA全序列分析按拼接的序列設(shè)計特異引物，用RT-PCR方法克隆鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白全長cDNA，對其測序驗證拼接是準(zhǔn)確的。該cDNA包括1683bp的開放讀碼框(openreading fram，ORF)，491個堿基的5’非翻譯區(qū)(non translated region，NTR)，443個堿基的3’非翻譯區(qū)和51個堿基的多聚腺苷酸尾。在第2461和2497個堿基處發(fā)現(xiàn)一個PolyA加尾信號(AATAAA)。在5’非翻譯區(qū)+486位置有一個終止密碼子(TAA)，而且與編碼區(qū)的讀碼框相吻合，說明不存在其它更前的起始密碼子。起始密碼子和典型的polyA加尾信號表明這個eDNA是全長的，命名為SeNHX1。此cDNA編碼一個561個氨基酸的多肽，推測分子量為62.1KD。
實施例5、鹽角草基因組DNA的Southern blot分別用Dra I，XspI，HaeIII酶切40μg鹽角草基因組DNA，這3種酶在克隆的725bp cDNA片段上沒有酶切位點。完全酶切的DNA經(jīng)1.2％的瓊脂糖電泳分離后，轉(zhuǎn)移到Hybond N+尼龍膜上，按Random Primer DNA labeling Kit Ver.2(TaKaRa，Japan)的方法用[32P]dCTP標(biāo)記的725bp cDNA片段做探針進行雜交分析。結(jié)果如圖5所示，在上述3種酶切的DNA中均有1個DNA片段雜交，表明鹽角草基因組有一個拷貝的SeNHX1。
實施例6 SeNHX1序列分析疏水性分析表明SeNHX1具有12個跨膜區(qū)，如圖2所示。SeNHX1的氨基酸序列與已克隆的其它Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白具有很高的同源性，SeNHX1的跨膜區(qū)與其它Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的跨膜區(qū)相似性較高。SeNHX1中85LFFIYLLPPI94是高度保守的，這是Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白活力的競爭性抑制劑氨氯吡嗪嘧的結(jié)合位點，如圖3所示，圖中加黑部分是一致性的氨基酸，框起來的是氨氯吡嗪嘧結(jié)合位點。AgNHX1，AtNHX1，CNHX1，OsNHX1和TaNHX1 GenBank登陸號分別為BAB11940，AAF21755，AAK27314，BBA83337，AAK76737。
為了分析不同Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白之間的遺傳關(guān)系，發(fā)明人進行了系統(tǒng)發(fā)育分析。從GenBank中查找一些有代表性的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列，分析SeNHX1與它們的關(guān)系。如圖4所示，SeNHX1與液泡型的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的親緣近，AgNHX1，cNHX1，AtNHX1，OsNHX1，TtNHX1，NHXI，和AtNHX1的功能是在液泡膜上將Na+區(qū)隔化到液泡中。SeNHX1與AgNHX1屬于同一簇，而SeNHX1和AgNHX1都是鹽生植物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白。SeNHX1與質(zhì)膜型的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白親緣關(guān)系較遠?？梢钥闯鯯eNHX1是液泡型的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白。上述逆向轉(zhuǎn)運蛋白氨基酸在GenBank登陸號為AgNHX1(BAB11940)，A.gmelini；OsNHX1(BBA83337)，O.sativa；TaNHX1(AAK76737)，T.aestivum；NHX1(NP-010744)，S.cerevisiae；Nhap(BM316951)，P.aeruginosa；SOS1(AF256224)，A.thaliana；NhaA(J03879)，E.coli；Sod2(CAA77796)，S.pombe；NHA1(NP-013239)，S.cerevisiae.
序列表<160>2<210>1<211>2668<212>DNA<213>鹽角草屬鹽角草(Salicornia europaea L.)<400>1atttttttct gtggcttata tttcttcttt ttccttttcg ttgatttatt agtattccct 60gaattttctg cttcccatcc tatcttcgtc tctcctctct ttcttctaga tatttccaat 120agcttctatt ttcgtccttg tttttatatc tttttacccc cccaccggaa atttcggtaa 180tttcctctgt ttttcttcgg gttcataacc cacctgaaaa atcaagaatt gggtgtcttt 240tgtttagacg caaaaggatt ttggttttgc tgattagttg ctttatgttc tgttttttgg 300agggaatttg gaggagctta gttgattgat tgtttgaaca atatacaatt tcacttggac 360ttgcaattga attggtaagg ttatgaattt ctgaaggtgt ttagaaagtt gattttggga 420agctacaaag aattccacat atcttgttgt gggtattatt ggatttgggt gtgcaaagaa 480atagataaac aatgttgtca caattgagct ctctatttta tagcaagatg gacatgctat 540ccacgtccga tcatgcttcc gtggtgtcga tgaatttgtt cgtagcactt ctatgtggct 600gcattgtaat tggtcatctt ctcgaggaga atcgttggat gaatgagtcc atcaccgctt 660tactaattgg tttgtgtact ggggttgtga ttctgctgat tagtggagga aaaagctcac 720atctactagt cttcagtgaa gatcttttct tcatatacct ccttccgcca attatattta 780atgcagggtt ccaggtaaaa aagaagcaat tcttccgcaa cttcattact attataatgt 840ttggagccat tggtacactg gtatcattct ccgtcatatc tctaggagca atgactattt 900ttaagaagat ggatattggt tctctggagt taggagacta tcttgcaatt ggtgcaatat 960tcgctgcaac cgattctgtt tgcacattgc aggtgcttaa tcaagatgag actcctcttc1020tgtacagtct ggtgtttggt gaaggtgttg ttaatgatgc tacttcggtg gtgcttttca1080atgcgattca gaacttcgac ctcacgaata ttgatcacag aattgctata cagttttctg1140gcaacttctt gtatttgttt ttcgcaagca ctatgcttgg agcgatgacc ggcttgctaa1200gtgcttatgt tatcaaaaag ctgtactttg gaaggcattc aactgatcgt gaggttgcct1260taatgatgct tatggcttat ctatcataca tgcttgctga actcttctat ttgagcggaa1320ttcttacagt attcttctgt gggattgtca tgtcgcatta tacatggcac aatgtgactg1380agagttcaag agtaaccacc aagcatgcat ttgcaacact gtcctttgtt gctgagattt1440tcctctttct atatgttggt atggatgcat tggacattga gaagtggaga tttgtgagtg1500atagtccggg aacttctgtt gctgtgagct ccatattgct tggtttactc atggttggac1560gagcagcttt tgttttccct ttatccttgt tgataaactt ttccaaaaaa tcgcatagtg1620agaagatcac cttcaatcag cagatagtta tatggtgggc tggtctcatg agaggtgctg1680tttccatggc acttgcttat aatcagttta cgaggtcagg gcacacgcag ctgaggggga1740atgcaatcat gatcacgagc actataacta ttgtcctttt tagtacgatg gtgtttgggt1800tgctgacaaa gccacttata ttatttttgt tgccacattc aaaacacttc aatagtgcca1860gcactgtatc agatttgggg agtccaaaat cattatcctt gcctctcctt gatggcggac1920
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Gly Thr Leu Val Ser Phe Ser Val Ile Ser Leu Gly Ala Met Thr125 130 135Ile Phe Lys Lys Met Asp Ile Gly Ser Leu Glu Leu Gly Asp Tyr140 145 150Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Val Cys Thr155 160 165Leu Gln Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ser Leu170 175 180Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val Val Leu185 190 195Phe Asn Ala Ile Gln Asn Phe Asp Leu Thr Asn Ile Asp His Arg200 205 210Ile Ala Ile Gln Phe Ser Gly Asn Phe Leu Tyr Leu Phe Phe Ala215 220 225Ser Thr Met Leu Gly Ala Met Thr Gly Leu Leu Ser Ala Tyr Val230 235 240Ile Lys Lys Leu Tyr Phe Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val245 250 255Ala Leu Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu260 265 270Leu Phe Tyr Leu Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile275 280 285Val Met Ser His Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg290 295 300Val Thr Thr Lvs His Ala Phe Ala Thr Leu Ser Phe Val Ala Glu305 310 315Ile Phe Leu Phe Leu Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu Asp Ile Glu320 325 330Lys Trp Arg Phe Val Ser Asp Ser Pro Gly Thr Ser Val Ala Val335 340 345Ser Ser Ile Leu Leu Gly Leu Leu Met Val Gly Arg Ala Ala Phe350 355 360Val Phe Pro Leu Ser Leu Leu Ile Asn Phe Ser Lys Lys Ser His365 370 375Ser Glu Lys Ile Thr Phe Asn Gln Gln Ile Val Ile Trp Trp Ala
380 385 390Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala Leu Ala Tyr Asn Gln395 400 405Phe Thr Arg Ser Gly His Thr Gln Leu Arg Gly Asn Ala Ile Met410 415 420Ile Thr Ser Thr Ile Thr Ile Val Leu Phe Ser Thr Met Val Phe425 430 435Gly Leu Leu Thr Lys Pro Leu Ile Leu Phe Leu Leu Pro His Ser440 445 450Lys His Phe Asn Ser Ala Ser Thr Val Ser Asp Leu Gly Ser Pro455 460 465Lys Ser Leu Ser Leu Pro Leu Leu Asp Gly Gly Gln Asp Ser Glu470 475 480Ala Asp Met Asp Asn Gln Asp Glu Ala Val Asn Asn Arg Tyr Glu485 490 495Gly Thr His Asn Arg Thr Ile Ala Arg Pro Gly Ser Leu Arg Met500 505 510Leu Leu Asn Ala Pro Thr His Thr Val His Tyr Tyr Trp Arg Lys515 520 525Phe Asp Asp Ser Phe Met Arg Pro Val Phe Gly Gly Arg Gly Phe530 535 540Val Pro Tyr Val Pro Gly Ser Pro Ile Glu Gln Asn Thr Asp Asn545 550 555Leu Leu Asp Arg Thr560
權(quán)利要求
1.鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白SeNHX1，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
3.鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因SeNHX1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述鹽角草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框為自5’端第492位到第2174位堿基的DNA序列。
6.含有權(quán)利要求4所述基因的表達載體。
7.含有權(quán)利要求4所述基因的細胞系。
8.權(quán)利要求4所述基因在培育抗鹽植物品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鹽角草Na
文檔編號C12N15/63GK1524876SQ0313064
公開日2004年9月1日 申請日期2003年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月27日
發(fā)明者李銀心, 呂慧穎, 陳華 申請人:中國科學(xué)院植物研究所