專利名稱：轉基因家蠶打靶載體的構建方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域轉基因載體的構建方法，特別是家蠶打靶載體的構建方法。
背景技術：
自1983年Smith等建立桿狀病毒表達系統以來，已有500多種外源基因在這一系統中得到了表達，這也使得用家蠶作為生物反應器生產藥用蛋白成為可能，前田進等(1985)利用這一系統成功地在家蠶中表達了人體干擾素。用家蠶作為生物反應器生產藥用蛋白，具有生產成本低，放大生產容易等優點。但由于重組病毒不能口服感染家蠶，并引起宿主死亡，使得每批生產時都要接種病毒，操作繁瑣，也引起每批蠶的表達水平難以控制；另外，從家蠶或其血淋巴中純化目的蛋白也較為困難。這些因素制約著家蠶生物反應器的商業化生產。
各種轉基因技術和手段的日漸成熟，使得轉基因動物相繼問世，也為轉基因家蠶的獲得提供了基礎。Yagaguchi等(1989)測定了家蠶絲素輕鏈基因序列(基因庫登錄號X17291)。家蠶絲腺在5齡期可合成大量絲蛋白，約0.5克，因此家蠶絲素蛋白啟動子是家蠶中最強的啟動子，若能使外源目的基因通過同源重組整合到家蠶基因組中，在絲素蛋白啟動子的控制下得到表達，則可用于藥用蛋白的大量生產；同時家蠶繁殖快，飼養容易，一旦獲得所需的轉基因家蠶，可迅速放大生產；蠶絲的成分簡單，分離目的蛋白容易，生產成本將會大大降低；家蠶的轉基因技術也可用于改良蠶絲性狀，使家蠶的育種邁上一個新的臺階。因此利用轉基因技術進行家蠶絲腺生物反應器的研究具有重要的理論價值和應用價值。
發明內容
本發明的目的是提供一種簡便、廉價的轉基因家蠶打靶載體的構建方法。
本發明的轉基因家蠶打靶載體的構建方法，包括以下步驟1)設計引物a)根據家蠶絲素輕鏈基因序列，設計0.5kb和5kb基因片段PCR擴增的專用引物 b)為便于連接和克隆，5kb基因片段PCR擴增兩段專用引物設計時分別引入XbaI和BamHI酶切位點；0.5kb基因片段專用引物設計時分別引入ApaI和XhoI酶切位點；2)絲素輕鏈基因0.5kb和5kb基因片段以Taq DNA聚合酶進行PCR擴增；3)0.5kb與pBlueselect質粒經Xho I和Apa I雙酶切后以T4 DNA連接酶連接成pBs-FS中間質粒；4)5kb與pBs-FS經BamHI和XbaI雙酶切后以T4 DNA連接酶連接成pBs-FS-FL中間質粒；5)帶有目的基因GFP的質粒pUCGFP構建；6)pBs-FS-FL與pUCGFP經PstI和BamI雙酶切后以T4 DNA連接酶連接構建成轉基因蠶絲腺生物反應器基因打靶載體pBs-FS-GFP-FL。
本發明中，限制性內切酶、T4 DNA連接酶和Taq DNA聚合酶購自上海博亞生物技術有限公司；PCR引物由上海博亞生物技術有限公司合成；PCR產物純化試劑盒、DNA回收純化試劑盒購自上海生工生物技術有限公司。
本發明的優奌在于方法簡便，成本低并具有較高的目的基因導入率。
圖1是轉基因家蠶打靶載體的構建流程圖。
具體實施例方式
具體實施方法按構建流程圖分步驟進一步敘述。
1、0.5kb和5kb絲素輕鏈基因片段PCR擴增引物設計根據Yagaguchi等測定的家蠶絲素輕鏈基因序列(基因庫登錄號X17291)，設計0.5kb和5kb基因片段PCR擴增的專用引物為 為便于連接和克隆，5kb基因片段PCR擴增兩段專用引物設計時分別引入XbaI和BamHI酶切位點；0.5kb基因片段專用引物設計時分別引入ApaI和XhoI酶切位點。
2、0.5kb和5kb絲素輕鏈基因片段PCR擴增5kb絲素輕鏈基因片段按下列條件分別進行PCR擴增10×PCR緩沖液 2.5μldNTP(2.5mmol/L) 1μl家蠶絲腺基因組模板(0.025μg/μl) 1μl引物-1(5μmol/L) 1μl引物-2(5μmol/L) 1μlTaq DNA聚合酶(5U/μl) 0.2μl無菌水18.3μl總體積25μl其中10×PCR緩沖液20mM MgSO4，100mM KCl，80mM(NH4)2SO4，100mMTris-Cl，pH9.0，0.5％NP-40，以上混合物以94℃預變性5分鐘，94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，35個循環，72℃再延伸10分鐘進行PCR擴增得到5kb絲素輕鏈基因片段。
按同樣條件以引物-3和引物-4進行PCR擴增得到0.5kb絲素輕鏈基因片段。
基因片段以PCR產物純化試劑盒(上海生工)按操作說明書進行純化，用紫外分光光度計測定其OD260。
3、0.5kb與pBlueselect質粒經Xho I和Apa I雙酶切后連接成pBs-FS中間質粒1)PCR獲得的0.5kb片段以Xho I和Apa I雙酶切形成粘性末端，反應條件如下0.5kb PCR純化產物 10μlBuffer B+ 3μlApaI 2μlddWater 20μl總體積35μl37℃反應2小時；酚氯仿抽提回收后溶于20μl水中。
0.5kb產物(ApaI酶切產物) 20μlBuffer H 3μlXhoI 2μlddWater 10μl總體積35μl37℃反應2小時；80℃10分鐘滅活內切酶。
2)pBlueselect質粒經Xho I和Apa I雙酶切后形成粘性末端，反應條件如下PBlueselect(pBs) 5μlBuffer B+ 5μlApaI 2μlddWater 23μl總體積35μl37℃反應2小時；酚氯仿抽提回收后溶于20μl水中。
PBs(ApaI酶切產物) 20μlBuffer H 3μlXhoI 2μlDdWater 10μl總體積35μl37℃反應2小時；80℃10分鐘滅活內切酶。
3)0.5kb與pBlueselect質粒經T4 DNA連接酶連接成pBs-FS中間質粒，反應條件如下0.5kb DNA/ ApaI+XhoI 5μlpBs/ApaI+XhoI 2μlT4 DNA連接酶 1μlT4連接酶緩沖液1μlddWater 4μl16℃連接16小時以上，保存于-20℃備用。
4、5kb與pBs-FS經BamHI和XbaI雙酶切后連接成pBs-FS-FL中間質粒1)經PCR獲得的5kb片段以BamHI和XbaI雙酶切形成粘性末端，反應條件如下5kb PCR純化產物 10μlBuffer G 3μlBamHI 2μlddWater 20μl總體積35μl37℃反應2小時；酚氯仿抽提回收后溶于20μl水中。
5kb產物(BamHI酶切產物)20μlBuffer M 3μlXbaI 2μlddWater 10μl總體積35μl37℃反應2小時；80℃10分鐘滅活內切酶。
2)pBs-FS中間質粒經BamHI和XbaI雙酶切后形成粘性末端，反應條件如下pBs-FS中間質粒5μlBuffer G 5μlBamHI 2μlddWater 23μl總體積35μl37℃反應2小時；酚氯仿抽提回收后溶于20μl水中。
PBs-FS(BamHI酶切產物) 20μlBuffer M 3μlXbaI 2μlddWater 10μl總體積35μl37℃反應2小時；80℃ 10分鐘滅活內切酶。
3)5kb與PBs-FS質粒經T4 DNA連接酶連接成pBs-FS-FL中間質粒，反應條件如下5kb DNA/ BamHI+XbaI5μlpBs/ BamHI+XbaI2μlT4 DNA連接酶 1μlT4連接酶緩沖液 1μlddWater4μl16℃連接16小時以上，保存于-20℃備用。
5、帶有目的基因GFP(綠色熒光蛋白)的質粒pUCGFP構建1)將含有目的基因GFP的pGFP-1質粒經Sma I和Xba I雙酶切后1％瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收0.8kb GFP片段，反應條件如下PGFP-1質粒 20μlBuffer A 5μlSma I 2μlXba I 2μlddWater21μl總體積 50μl37℃反應2小時，1％瓊脂糖凝膠電泳后割下目的片段，以UNIQ-10柱式DNA回收純化試劑盒(上海生工)按操作說明書回收0.8kb GFP片段。
2)PUC19質粒經Sma I和Xba I雙酶切后形成粘性末端，反應條件如下PUC19質粒 5μlBuffer A 2μlSma I 1μlXba I 1μlddWater11μl37℃反應2小時，80℃水浴10分鐘滅活內切酶。
3)PGFP-1雙酶切回收片段與PUC19雙切酶產物經T4 DNA連接酶連接成pUCGFP質粒，反應條件如下PGFP-1雙酶切回收片段3μlPUC19雙切酶產物 1μlT4 DNA連接酶1μlT4連接酶緩沖液 1μlddWater 4μl16℃連接16小時以上，保存于-20℃備用6、pBs-FS-FL與pUCGFP經PstI和BamI雙酶切后連接構建成轉基因蠶絲腺生物反應器基因打靶載體pBs-FS-GFP-FL1)pUCGFP質粒經PstI和BamI雙酶切后1％瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收0.8kb GFP片段，反應條件如下pUCGFP質粒 20μlBuffer K5μlPst I 2μlBamH I 2μlDdWater 21μl總體積 50μl37℃反應2小時，1％瓊脂糖凝膠電泳后割下目的片段，以UNIQ-10柱式DNA回收純化試劑盒(上海生工)按操作說明書回收0.8kb GFP片段。
2)pBs-FS-FL經PstI和BamI雙酶切后形成粘性末端，反應條件如下pBs-FS-FL質粒 10μlBuffer K5μlPst I 2μlBamH I 2μlddWater 21μl37℃反應2小時，80℃水浴10分鐘滅活內切酶。
3)pBs-FS-FL中間質粒PstI和BamI雙酶切后與上述0.8kb GFP片段以T4 DNA連接酶連接構建成轉基因蠶絲腺生物反應器基因打靶載體pBs-FS-GFP-FL。反應條件如下pBs-FS-FL雙酶切產物 3μlPUCGFP雙酶切回收產物3μlT4 DNA連接酶2μlT4連接酶緩沖液 2μlddWater 5μl16℃連接16小時以上，保存于-20℃備用
權利要求
1.轉基因家蠶打靶載體的構建方法，包括以下步驟1)設計引物a)根據家蠶絲素輕鏈基因序列，設計0.5kb和5kb基因片段PCR擴增的專用引物 b)5kb基因片段PCR擴增兩段專用引物設計時分別引入XbaI和BamHI酶切位點，0.5kb基因片段專用引物設計時分別引入ApaI和XhoI酶切位點；2)絲素輕鏈基因0.5kb和5kb基因片段以Taq DNA聚合酶進行PCR擴增；3)0.5kb與pBlueselect質粒經Xho I和Apa I雙酶切后以T4 DNA連接酶連接成pBs-FS中間質粒；4)5kb與pBs-FS經BamHI和XbaI雙酶切后以T4 DNA連接酶連接成pBs-FS-FL中間質粒；5)帶有目的基因GFP的質粒pUCGFP構建；6)pBs-FS-FL與pUCGFP經PstI和BamI雙酶切后以T4 DNA連接酶連接構建成轉基因蠶絲腺生物反應器基因打靶載體pBs-FS-GFP-FL。
全文摘要
本發明公開了轉基因家蠶打靶載體的構建方法，該方法的步驟包括根據家蠶絲素輕鏈基因序列，設計0.5kb和5kb基因片段PCR擴增的專用引物；將絲素輕鏈基因0.5kb和5kb基因片段以Taq DNA聚合酶進行PCR擴增；然后將0.5kb與pBlueselect質粒經Xho I和Apa I雙酶切后以T4DNA連接酶連接成pBs－FS中間質粒；5kb與pBs－FS經BamHI和XbaI雙酶切后以T4 DNA連接酶連接成pBs－FS－FL中間質粒；構建帶有目的基因GFP的質粒pUCGFP；再將pBs－FS－FL與pUCGFP經PstI和BamI雙酶切后以T4 DNA連接酶連接構建成轉基因蠶絲腺生物反應器基因打靶載體pBs－FS－GFP－FL。本發明方法簡便、廉價并具有較高的目的基因導入率。
文檔編號C12N15/12GK1460719SQ0312928
公開日2003年12月10日 申請日期2003年6月10日 優先權日2003年6月10日
發明者繆云根 申請人:浙江大學