專利名稱：可溶性sars病毒3cl蛋白酶的表達和純化的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子和細胞生物學研究領域，具體涉及在宿主細胞中可溶性SARS病毒3CL蛋白酶(SARS_3CLpro)的表達和純化。
背景技術：
自2002年底至2003年初，一種被稱為“非典型肺炎(severe acuterespiratory syndrome，SARS)”的病例在我國廣東省被首次發現，隨后在世界30多個國家和地區爆發，SARS在我國內地的北京、山西、內蒙等25個省市自治區“肆意橫行”，對我國人民群眾的生命財產構成嚴重威脅。SARS是一種傳染性強、生存力強、致死率高的新型病毒，截止到2003年5月19日，全球累計報告病例已達7864人，死亡病例643人。SARS已被世界公認為人類的共同敵人。SARS爆發后，引起了各國政府和研究機構的高度重視，世界衛生組織(WHO)已派遣技術人員前往疫區指導防治工作，各國科研人員緊密合作，共同尋找SARS的病原體和防治方法。經過多國科研人員的努力，終于發現SARS冠狀病毒(coronavirus)是SARS感染、病人發病和致死的元兇。SARS病毒的全基因組已分別被加拿大、美國和中國的科學家測定，這對于研究SARS病毒的致病機理以設計抗SARS藥物具有重要意義。
根據SARS冠狀病毒(SARS-CoV)的基因組分析發現，在其ORF編碼的復合蛋白中，除了RNA聚合酶外，還含有胰凝乳蛋白樣結構域蛋白酶(3GLpro)。通過對SARS-CoV 3CLpro蛋白酶的基因分析發現，SARS-CoV 3CLpro與引起普通感冒的人冠狀病毒HCoV 229E 3CLpro的同源性為40％，與引起豬的傳染性胃腸炎的豬冠狀病毒TGEV 3CLpro的同源性為44％，這表明它們具有很好的同源型。根據上述兩種蛋白同源模建的SARS-CoV 3CLpro結構顯示，整個分子由三個結構域構成。結構域I和結構域II是六段反平行的β-折疊，它們一起組成了胰凝乳蛋白酶和小核糖核酸病毒3CL蛋白酶的結構。底物結合位點位于這兩個結構域之間的縫隙中。一段長loop將結構域II和結構域III連接起來。結構域III是由五個螺旋一起形成的球狀體，它對蛋白酶的水解活性有重要意義。
SARS-CoV 3CLpro模型的底物結合位點與豬冠狀病毒(TGEV)和人冠狀病毒229E(HCoV229E)晶體結構的底物結合位點匹配得相當好。因此，可以推測，與TGEV結合的抑制劑在應當可以與HCoV229E、SARS-CoV等冠狀病毒以類似的方式結合。這一點已經通過切除實驗得到證實。序列為H2NVSVNSTLQ↓SGLRKMA-COOH的小肽可以有效地被SARS-CoV 3CLpro切斷，說明豬冠狀病毒組蛋白酶(TGEV Mpro)與SARS-CoV Mpro的作用方式是十分類似的。
SARS冠狀病毒(SARS-CoV)的3CLpro對病毒的復制起著重要的控制作用。它負責將從mRNA復制合成的原始的肽鏈在特定的位點切割成各種不同功能的蛋白。因此，如果可以有效抑制住該蛋白酶的活性，那么就可以控制住病毒在體內的傳播，從而發現治療SARS的有效藥物。
因此，在體外大量表達和純化可溶性SARS病毒3GLpro以建立抗SARS病毒藥物篩選分子模型將具有重要的現實意義。本發明者經過反復實驗并利用實驗過程中所積累的獨特相關技術經驗，在宿主細胞中成功表達和純化了可溶性SARS病毒3CLpro，從而完成了本發明。
本發明的一個目的是提供能夠在宿主細胞中表達可溶性SARS病毒3CLpro的表達質粒。
本發明的另一個目的是提供用該表達質粒轉化的宿主細胞。
本發明的再一個目的是提供可溶性SARS病毒3CL蛋白酶在宿主細胞中的表達方法。
本發明還有一個目的是提供SARS病毒3CL蛋白酶表達產物的純化方法。
發明內容
本發明的一個方面提供可在宿主細胞中表達可溶性SARS病毒3CL蛋白酶的表達質粒3CL-pQE30，保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，分類名稱為大腸桿菌M15/pQE30-SARS-3CL，保藏日2003年5月30日，保藏號CCTCCNo.203048。
本發明的另一個方面提供用質粒3CL-pQE30轉化的宿主細胞。所述宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。
本發明的再一個方面提供在宿主細胞中表達可溶性SARS病毒3CL蛋白酶的方法，包括以下步驟1)采用PCR技術從SARS病毒cDNA文庫中獲得SARS病毒3CL蛋白酶DNA片段(序列依據TRO2)；2)用pQE30載體構建SARS病毒3CL蛋白酶表達質粒3CL-pQE30；3)將3CL-pQE30質粒轉化于宿主細胞中，并在宿主細胞中表達。
本發明的還有一個方面提供可溶性SARS病毒3CL蛋白酶表達產物的純化方法，包括細胞裂解、裂解液透析、NTA-Ni柱層析和分子篩純化。
附圖的簡單說明
圖1所示為可溶性SARS病毒3CL蛋白酶表達質粒(3CL-pQE30)構建示意圖。
圖2所示為SARS病毒3CL蛋白酶PCR產物DNA瓊脂糖電泳分析圖譜。
圖3所示為克隆產物的酶切鑒定圖。
圖4所示為3CL-pQE30測序報告。
圖5所示為SARS病毒3CL蛋白酶純化產物聚丙烯酰胺電泳分析圖譜。圖中，M為標記物(Marker)；1-4，含咪唑的3CL蛋白酶粗提物；5-6為經分子篩純化后的3CL蛋白酶。
圖6所示為SARS病毒3CL蛋白酶純化產物液質聯用總離子流圖。
圖7所示為SARS病毒3CL蛋白酶分子量測定8所示為SARS病毒3CL蛋白酶純化產物多電荷離子圖。
具體實施例方式
試驗材料pQE30載體，大腸桿菌菌株M15由本室保存。各種限制性內切酶、T4DNA連接酶、高保真DNA聚合酶等工具酶購自TaKaRa公司。DNA標記物、蛋白質標記物購自Invitrogen公司。IPTG、氨芐西林和卡那霉素購自Sigma公司。膠回收試劑盒購自華舜公司。
實施例1 SARS病毒3CL蛋白酶表達質粒(3CL-pQE30)的構建利用PCR技術從SARS病毒cDNA文庫中獲得SARS病毒3CL蛋白酶DNA片段(基因序列依據多倫多2號(TRO2))，按圖1所示，構建表達可溶性的SARS病毒3CL蛋白酶的表達質粒(3CL-pQE30)。
1)設計引物，擴增3CL蛋白酶的序列引物序列FW5’TTAGGATCCACCATGAGTGGTTTTAGGAAA3’RV5’TAAAAGCTTTTGGAAGGTAACACCAGAGC3’PCR擴增反應(100μl)模板2μl；10×PyrobestTMbuffer10μl；dNTP(2.5mM)8μl；FW4μl；RV4μl；高保真DNA聚合酶(pyrobest DNA polymerase)1μl；水71μl。
反應條件95℃ 8分鐘；(95℃ 45秒；60℃ 45秒；72℃ 1分鐘)30循環；72℃ 10分鐘。
圖2所示為SARS病毒3CL蛋白酶PCR產物DNA瓊脂糖電泳分析圖譜。
2)將3CL的PCR產物克隆到pQE30載體上3CL的PCR產物和pQE30分別用BamHI和HindIII酶切(實驗方法參照《分子克隆實驗指南》，科學出版社，1999年第二版)；用試劑盒(華舜公司)回收酶切產物(回收3CL的PCR酶切產物近918bp；pQE30酶切產物近3.5kb)；用T4DNA連接酶連接；連接產物轉化入感受態細胞M15；挑選正確的克隆(酶切鑒定)。
酶切鑒定BamHI & HindIII酶切鑒定(實驗方法參照《分子克隆實驗指南》，科學出版社，1999年第二版)，切出918bp條帶的克隆是正確的(見圖3)。樣品進行測序。
DNA測序報告3CL-pQE30表達載體測序報告如圖4所示，3CL-pQE30DNA測序結果和3CL蛋白酶原DNA序列比較，完全一致。
實施例2 可溶性SARS病毒3CL蛋白酶的表達將3CL-pQE30質粒轉化于大腸桿菌M15中，IPTG(濃度0.8mM)誘導，氨芐西林和卡那霉素為雙抗生素，溫度30℃，表達時間10小時。在上述表達條件下，6升LB培養基經4℃、4000rpm離心30分鐘后，將得到的18克細菌沉淀物以每份3克分裝，-80℃保存。
實施例3 表達產物的純化在4℃下，將3克細菌沉淀物懸浮于15mL裂解緩沖溶液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0，300mM NaCl，1mM PMSF)中，超聲波破碎(超聲強度200～300W；超聲環境冰水混合物；總超聲時間15分鐘，每超聲1.5分鐘間隙1分鐘)。經4℃、15,000rpm超速離心1小時后，棄去沉淀物。將得到的14mL上清液在4℃下透析(透析緩沖液PBS，10mM咪唑)過夜后，用NTA-Ni柱(Pharmacia公司產品)純化蛋白，其中洗滌緩沖液為，PBS+60mM咪唑；洗脫緩沖液為，PBS+500mM咪唑。將得到的10mL蛋白粗提物經蛋白純化系統FPLC(Pharmacia公司產品)分子篩進一步純化得到純SARS病毒3CL蛋白酶(如圖5所示)。
實施例4 SARS病毒3CL蛋白酶質譜檢測1)3CL蛋白酶的分子量測定質譜所測3CL蛋白酶的分子量35831D，按計算3CL-pQE30所表達出的蛋白質應是35833.153D，和質譜結果幾乎完全一致(如圖7所示)。
2)3CL蛋白酶序列MRGSHHHHHH GSTMSGFRKMAFPSGKVEGC MVQVTCGTTT LNGLWLDDTV YCPRHVICTA60EDMLNPNYEDLLIRKSNHSFLVQAGNVQLRVIGHSMQNCL LRLKVDTSNPKTPKYKFVRI 120QPGQTFSVLA CYNGSPSGVY QCAMRPNHTI KGSFLNGSCG SVGFNIDYDC VSFCYMHFME 180LPTGVHAGTD LEGKFYGPFVDRQTAQAAGTDTTITLNVLAWLYAAVINGDRWFLNRFTTT240LNDFNLVAMKYNYEPLTQDHVDILGPLSAQTGIAVLDMCAALKELLQNGMNGRTILGSTI 300LEDEFTPFDV VRQCSGVTFQKLN 323(注帶下劃線的為實驗中找到的肽段)3)3CL蛋白酶的酶解(膠內酶解)A.切下考馬斯蘭染色膠帶，置于離心管中，用30％ACN/100mM NH4HCO3脫色至膠帶呈無色透明狀。
B.棄去上清，加入100mM的NH4HCO3(pH8.3)，平衡5分鐘。
C.棄去上清，加入ACN脫水3分鐘。
D.棄去上清，冷凍干燥。
E.將干燥好的膠用50mM NH4HCO3浸潤，加入胰蛋白酶至酶物比為1∶30(W/W)；輕輕渦旋混合。
F.35℃保溫，反應過夜。
G.吸出上清，置于另一離心管中。
H.用60％ACN(0.1％TFA)提取肽段三次，提取液與前一次的上清合并置于離心管。
J.濃縮至15μl，進行LC-MS檢測。
4)3CL蛋白酶液質聯用(LC-MS)分析HPLC儀Agilent HP1100質譜儀LCQ Deca ion-trap質譜儀(Finnigan公司)液相柱C830×2.1mmID，Tum(AQUAPORE，RP-300)流動相AH2O(0.1％HCOOH)，BACN(0.1％HCOOH)
時間(分鐘) A B0 95％5％2 95％5％15 85％15％35 50％50％45 5％ 95％47 5％ 95％53 95％5％60 95％5％質譜電噴霧電離電壓(ESI voltage)5KV毛細管電壓(capillary voltage)3V毛細管溫度(capillary temperature)220℃鞘氣(sheat gas)流速40arb輔助氣(Aux gas)流速3arb覆蓋率150/323＝46.4％3CL蛋白酶經還原、修飾、酶解后液質聯用(LC-MS)分析結果見表1。
表1 3CL蛋白酶經酶解后所得肽段及相關信息
產業上利用的可能性利用本發明可在宿主細胞中獲得大量的可溶性SARS病毒3CL蛋白酶(如，在大腸桿菌中，每升LB培養基可生產15毫克3CL蛋白酶)，利用NTA-Ni柱層析和分子篩提純方法即可得到純化的蛋白。本發明具有操作簡單、蛋白純度高等特點。
利用本發明得到的SARS病毒3CL蛋白酶可用于1)抗SARS病毒藥物分子水平篩選模型利用本發明得到的SARS病毒3CLpro可建立抗SARS病毒藥物分子水平篩選模型，在分子水平上篩選出抗SARS病毒藥物。
2)結構生物學方面的研究
A.培養SARS病毒3CL蛋白酶晶體，通過X-射線晶體衍射技術解析SARS病毒3CL蛋白酶晶體結構；B.開展NMR研究，以探求SARS病毒3CL蛋白酶溶液狀態下的三維結構。
3)與人體重要蛋白相互作用研究利用本發明得到的SARS病毒3CL蛋白酶以及生物物理技術可開展與人體重要蛋白(如免疫系統)相互作用研究，以探索SARS病毒感染人體正常細胞的途徑，為抗SARS藥物設計提供依據。
4)SARS診斷抗體研究利用本發明得到的SARS病毒3CL蛋白酶與其他生物工程技術相結合，可開展SARS診斷抗體研究。
序列表CTCGAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCACCATGAGTGGTTTTAGGAAAATGGCATTCCCGTCAGGCAAAGTTGAAGGGTGCATGGTACAAGTAACCTGTGGAACTACAACTCTTAATGGATTGTGGTTGGATGACACAGTATACTGTCCAAGACATGTCATTTGCACAGCAGAAGACATGCTTAATCCTAACTATGAAGATCTGCTCATTCGCAAATCCAACCATAGCTTTCTTGTTCAGGCTGGCAATGTTCAACTTCGTGTTATTGGCCATTCTATGCAAAATTGTCTGCTTAGGCTTAAAGTTGATACTTCTAACCCTAAGACACCCAAGTATAAATTTGTCCGTATCCAACCTGGTCAAACATTTTCAGTTCTAGCATGCTACAATGGTTCACCATCTGGTGTTTATCAGTGTGCCATGAGACCTAATCATACCATTAAAGGTTCTTTCCTTAATGGATCATGTGGTAGTGTTGGTTTTAACATTGATTATGATTGCGTGTCTTTCTGCTATATGCATCATATGGAGCTTCCAACAGGAGTACACGCTGGTACTGACTTAGAAGGTAAATTCTATGGTCCATTTGTTGACAGACAAACTGCACAGGCTGCAGGTACAGACACAACCATAACATTAAATGTTTTGGCATGGCTGTATGCTGCTGTTATCAATGGTGATAGGTGGTTTCTTAATAGATTCACCACTACTTTGAATGACTTTAACCTTGTGGCAATGAAGTACAACTATGAACCTTTGACACAAGATCATGTTGACATATTGGGACCTCTTTCTGCTCAAACAGGAATTGCCGTCTTAGATATGTGTGCTGCTTTGAAAGAGCTGCTGCAGAATGGTATGAATGGTCGTACTATCCTTGGTAGCACTATTTTAGAAGATGAGTTTACACCATTTGATGTTGTTAGACAATGCTCTGGTGTTACCTTCCAAAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCTAGCTTGGCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAAC TTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAC
權利要求
1.可在宿主細胞中表達可溶性SARS病毒3CL蛋白酶的表達質粒，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日2003年5月30日，保藏號CCTCCNo.M203048。
2.如權利要求1所述的表達質粒，含有如下序列CTCGAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCACCATGAGTGGTTTTAGGAAAATGGCATTCCCGTCAGGCAAAGTTGAAGGGTGCATGGTACAAGTAACCTGTGGAACTACAACTCTTAATGGATTGTGGTTGGATGACACAGTATACTGTCCAAGACATGTCATTTGCACAGCAGAAGACATGCTTAATCCTAACTATGAAGATCTGCTCATTCGCAAATCCAACCATAGCTTTCTTGTTCAGGCTGGCAATGTTCAACTTCGTGTTATTGGCCATTCTATGCAAAATTGTCTGCTTAGGCTTAAAGTTGATACTTCTAACCCTAAGACACCCAAGTATAAATTTGTCCGTATCCAACCTGGTCAAACATTTTCAGTTCTAGCATGCTACAATGGTTCACCATCTGGTGTTTATCAGTGTGCCATGAGACCTAATCATACCATTAAAGGTTCTTTCCTTAATGGATCATGTGGTAGTGTTGGTTTTAACATTGATTATGATTGCGTGTCTTTCTGCTATATGCATCATATGGAGCTTCCAACAGGAGTACACGCTGGTACTGACTTAGAAGGTAAATTCTATGGTCCATTTGTTGACAGACAAACTGCACAGGCTGCAGGTACAGACACAACCATAACATTAAATGTTTTGGCATGGCTGTATGCTGCTGTTATCAATGGTGATAGGTGGTTTCTTAATAGATTCACCACTACTTTGAATGACTTTAACCTTGTGGCAATGAAGTACAACTATGAACCTTTGACACAAGATCATGTTGACATATTGGGACCTCTTTCTGCTCAAACAGGAATTGCCGTCTTAGATATGTGTGCTGCTTTGAAAGAGCTGCTGCAGAATGGTATGAATGGTCGTACTATCCTTGGTAGCACTATTTTAGAAGATGAGTTTACACCATTTGATGTTGTTAGACAATGCTCTGGTGTTACCTTCCAAAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCTAGCTTGGCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATC TTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAC
3.一種用權利要求1所述表達質粒3CL-pQE30轉化的宿主細胞。
4.如權利要求3所述的宿主細胞，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。
5.如權利要求4所述的宿主細胞，所述宿主細胞為大腸桿菌。
6.在宿主細胞中表達可溶性SARS病毒3CL蛋白酶的方法，包括以下步驟1)用PCR技術從SARS病毒cDNA文庫中獲得SARS病毒3CL蛋白酶DNA片段；2)用pQE30載體構建SARS病毒3CL蛋白酶表達質粒pQE30-3CL；3)將pQE30-3CL質粒轉化于宿主細胞中，并在宿主細胞中表達。
7.可溶性SARS病毒3CL蛋白酶表達產物的純化方法，包括將細胞裂解液透析、NTA-Ni柱層析和分子篩純化。
全文摘要
本發明提供可在宿主細胞中表達可溶性SARS病毒3CL蛋白酶的表達質粒3CL－pQE30，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日2003年5月30日，保藏號CCTCCNo.M203048。還提供在宿主細胞中表達可溶性SARS病毒3CL蛋白酶的方法，包括采用PCR技術從SARS病毒cDNA文庫中獲得SARS病毒3CL蛋白酶DNA片段(TRO2)；用pQE30載體構建SARS病毒3CL蛋白酶表達質粒pQE30－3CL；和將pQE30－3CL質粒轉化于宿主細胞中，并在宿主細胞中表達。可溶性SARS病毒3CL蛋白酶表達產物的純化方法，包括將細胞裂解液透析、NTA－Ni柱層析和分子篩純化。本發明的方法操作簡單、得到的蛋白純度高。
文檔編號C12N9/50GK1468961SQ0312914
公開日2004年1月21日 申請日期2003年6月5日 優先權日2003年6月5日
發明者沈旭, 蔣華良, 汪垣, 陳靜, 沈建華, 葉飛, 羅小民, 陳凱先, 莊賢韓, 沈 旭 申請人:中國科學院上海藥物研究所, 中國科學院上海生命科學研究院, 上海先導藥業有限公司