殼聚糖酶生產(chǎn)菌及低聚殼聚糖的生產(chǎn)方法

專利名稱：殼聚糖酶生產(chǎn)菌及低聚殼聚糖的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及殼聚糖的降解方法，特別是能產(chǎn)生高活性殼聚糖酶的微生物以及利用該微生物和其產(chǎn)生的高活性殼聚糖酶對(duì)殼聚糖進(jìn)行降解，使之得到性能優(yōu)異的水溶性低聚殼聚糖的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
殼聚糖是由甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，它在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、特別是食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。但由于殼聚糖分子量大、水溶性差、不易被人體或動(dòng)物吸收，使其應(yīng)用受到限制。而殼聚糖經(jīng)降解后得到的低聚殼聚糖(又稱甲殼低聚糖、殼寡糖、氨基寡糖素等)，其聚合度(D.P.)一般為2-20。這種低聚合度的水溶性殼聚糖具有多種優(yōu)異的性能，除了作為人體的功能性食品和作為紡織、造紙等輕工業(yè)原料外，近年來發(fā)現(xiàn)其更具有促進(jìn)脾臟抗體生成、抑制腫瘤細(xì)胞生長的生理功能；可有效地降低肝臟和血清中的膽固醇以及降低血壓、血糖和血脂；增強(qiáng)免疫力和抗疾病的能力；強(qiáng)化肝臟功能，防止痛風(fēng)和胃潰瘍；促進(jìn)雙歧桿菌的增殖，抑制大腸桿菌及引起腸內(nèi)感染的一些其它細(xì)菌的生長；抑制成人病的發(fā)生等。
在農(nóng)業(yè)上，低聚合度的殼聚糖可作為性能良好的水果和食物保鮮劑，有專利文獻(xiàn)報(bào)道，將降解的殼聚糖加入適量的殺菌劑，能使荔枝、芒果、草莓、龍眼等難保鮮的水果在常溫下保鮮10-15天；將其單獨(dú)使用或與一些農(nóng)藥組合，可作為植物誘導(dǎo)抗病劑和植物生長調(diào)節(jié)劑。
在日用工業(yè)上，將低聚合度的殼聚糖與聚乙烯、聚丙烯等塑料混煉，可得到生物降解塑料，這種降解塑料強(qiáng)度和生物降解性能優(yōu)于摻入變性淀粉的降解塑料；低聚合度的殼聚糖還可以作為優(yōu)良的紡織助劑和造紙助留劑等。總之隨著科學(xué)的進(jìn)步，低聚殼聚糖將會(huì)得到越來越廣泛的應(yīng)用。
怎樣制備性能優(yōu)異的低聚殼聚糖，多年來一直是化學(xué)家和生物學(xué)家的研究熱點(diǎn)，通常的降解殼聚糖的方法有化學(xué)法、物理法和生物法。生物法又通常稱為酶法，它優(yōu)于化學(xué)法和物理法，其原因是酶法降解可特異性地、選擇性地切斷β-(1，4)-糖苷鍵，降解過程和降解產(chǎn)物的分子量易于控制，條件也比較溫和，因而可以方便地對(duì)降解過程進(jìn)行監(jiān)控，得到所需分子量分布范圍的低聚殼聚糖。降解過程不需要加入大量的試劑，對(duì)環(huán)境基本不會(huì)造成污染。目前已發(fā)現(xiàn)多種酶可降解殼聚糖，其中包括專一性酶如殼聚糖酶、非專一性酶如纖維素酶、脂肪酶和蛋白酶等。
公開文獻(xiàn)報(bào)道了一些殼聚糖酶的制備，主要是從一些微生物中經(jīng)過篩選，選擇那些能以殼聚糖為原料的，培養(yǎng)條件不復(fù)雜的，又可得到高活性殼聚糖酶的菌種，如《工業(yè)微生物》2002年第12期公開了經(jīng)過篩選出的假單孢菌作為產(chǎn)生殼聚糖酶的菌種，以及培養(yǎng)條件包括溫度、PH、時(shí)間、接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響，其酶活力一般可達(dá)0.4u/ml左右?！吨袊Ｑ笏幬铩?999年第2期以球孢白僵菌作為產(chǎn)生殼聚糖酶的菌種，其種子培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用蛋白胨、膠體殼聚糖、馬鈴薯、瓊脂等，復(fù)篩液體培養(yǎng)基采用硫酸鹽、膠體殼聚糖以及蛋白胨、酵母膏等。按此方法得到的殼聚糖酶活力為0.2u/ml。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明人多年來一直從事對(duì)殼聚糖酶的研究，1993年在《微生物學(xué)通報(bào)》上發(fā)表了對(duì)球孢白僵菌產(chǎn)生酶的文章，最早認(rèn)識(shí)到球孢白僵菌對(duì)殼聚糖的降解作用，但這種菌由于產(chǎn)生的殼聚糖酶活力較低，還不能應(yīng)用于酶解法制備低聚殼聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明人于是又重新尋找適合殼聚糖作為培養(yǎng)基誘導(dǎo)物的菌種，經(jīng)過多年的艱苦探索和試驗(yàn)，終于在自然界(我國沿海地區(qū)的海灘上)尋找到一些菌株，采集后進(jìn)行了初步試驗(yàn)，終于發(fā)現(xiàn)了一株能在以殼聚糖和甲殼素為唯一碳、氮源的培養(yǎng)基中生長，并分泌出幾丁質(zhì)酶(chitinase)和殼聚糖酶(chitosanase)的優(yōu)良菌株來。
經(jīng)對(duì)上述篩選出來的優(yōu)良菌株在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其誘導(dǎo)物為殼聚糖，發(fā)現(xiàn)其分泌出的殼聚糖酶具有較高的活性和十分穩(wěn)定的遺傳性，初步鑒定為芽孢桿菌。
本申請(qǐng)人目前已將該菌種送到中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期為2002年8月16日，保藏編號(hào)為0790，建議的分類命名為芽孢桿菌。
該芽孢桿菌的表面特征是芽孢囊膨大，芽孢橢圓形，芽孢一般次端生，革蘭氏陽性。在PDA培養(yǎng)基上生長，菌落的顏色由白色轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色。
本發(fā)明的殼聚糖酶生產(chǎn)菌的菌種培養(yǎng)以及低聚殼聚糖的生產(chǎn)方法如下先將上述提及的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏號(hào)為0790的殼聚糖酶產(chǎn)生菌擴(kuò)大培養(yǎng)，再用兩步法制備低聚殼聚糖第一步使用誘導(dǎo)產(chǎn)酶發(fā)酵，制備粗制液體型殼聚糖酶制劑；第二步使用第一步產(chǎn)生的粗制殼聚糖液體型酶制劑對(duì)殼聚糖溶液進(jìn)行降解，制備低聚殼聚糖。
上述所說殼聚糖酶產(chǎn)生菌的擴(kuò)大培養(yǎng)是將篩選的菌種在介質(zhì)中培養(yǎng)，培養(yǎng)的介質(zhì)可以是固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基。所述的固體培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，或者由豆餅粉、麩皮、殼聚糖和無機(jī)鹽組成的培養(yǎng)基，其中重量百分含量為豆餅粉1-5％，麩皮1-3％，玉米粉或薯類淀粉1-5％，鈣、鐵、銨鹽，其含量各占0.01-0.1％，磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀0.1-0.5％，其余為殼聚糖粉。
所述的液體培養(yǎng)基為CTNP培養(yǎng)基氯化鉀、氯化鈉、硫酸鎂各0.05-0.1％，磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀0.1-0.5％及適量的鈣、鐵、銨鹽，其含量各占0.01-0.1％，殼聚糖0.5-2.0％，其PH為6-8?；蚴怯?-2％蛋白胨、0.5-2％牛肉膏、0.5％-1鈉鹽配制的pH6-8的肉汁胨培養(yǎng)基。
在擴(kuò)大培養(yǎng)基培養(yǎng)的溫度為25-38℃，時(shí)間為1-3天。
從擴(kuò)大培養(yǎng)得到的菌種選少量留種保存于4℃的冰箱中，大部分可直接用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶制劑。工業(yè)化生產(chǎn)殼聚糖酶制劑的設(shè)備采用帶攪拌器和加熱器裝置的發(fā)酵罐，生產(chǎn)過程首先是配制誘導(dǎo)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，方法是在CTNP培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，再加入0.5-2％的其它氮源，如氯化銨、硫酸銨、尿素等，并加入促酶釋放因子(ZSY)0.01-0.1％，然后加入擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種，加入菌種的量按總殼聚糖總量的0.5-1％。調(diào)節(jié)PH為6-8，最佳為6.5-7.5，溫度保持20-40℃，發(fā)酵時(shí)間24-48小時(shí)，發(fā)酵過程定時(shí)對(duì)物料進(jìn)行分析，一般當(dāng)發(fā)酵液中出現(xiàn)芽孢時(shí)，發(fā)酵液中的殼聚糖酶活力達(dá)到高峰時(shí)即可結(jié)束發(fā)酵。離心除渣除菌后的發(fā)酵液即為粗制液體型殼聚糖酶制劑。
將此粗酶液與3％-6％殼聚糖溶液按一定比例(如1∶10V/V)混勻，在40℃-50℃，pH5-6條件下進(jìn)行殼聚糖的酶解反應(yīng)，由于底物殼聚糖的分子量不同，酶解反應(yīng)終止的時(shí)間不同，一般不超過4-12小時(shí)，殼聚糖即已全部轉(zhuǎn)化為水溶性低聚殼聚糖。利用不同的酶底比和酶解反應(yīng)時(shí)間，可獲得不同分子量分布范圍的低聚殼聚糖產(chǎn)物。
酶解反應(yīng)混合物進(jìn)行50-70℃的高溫滅酶活，經(jīng)超濾、納濾濃縮和純化，噴霧干燥得到低聚殼聚糖產(chǎn)品(殼寡糖，氨基寡糖素)，此產(chǎn)品可用作制藥、.農(nóng)藥、食品或輕工業(yè)原料等。
與目前所公開文獻(xiàn)的技術(shù)相比，本發(fā)明具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和進(jìn)步是1.本發(fā)明篩選的菌種為芽孢桿菌，其遺傳性十分穩(wěn)定；用PDA培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)5年，產(chǎn)酶能力不下降，在室溫15-40℃的條件下密封保存半年以上不失活，產(chǎn)酶能力也不下降。
2.用誘導(dǎo)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明的菌種，其產(chǎn)酶能力高，單位發(fā)酵液所含殼聚糖酶活力高，并能抑制雜菌的生長，殼聚糖消耗少，培養(yǎng)條件容易控制。
3.產(chǎn)酶發(fā)酵及酶解反應(yīng)的時(shí)間短，一般40-48小時(shí)即可完成發(fā)酵及酶解的全過程，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)很有利，表明可在短時(shí)間內(nèi)提高生產(chǎn)效率，節(jié)約生產(chǎn)成本。
4.酶解反應(yīng)條件溫和，易于控制反應(yīng)條件以獲得不同的分子量分布范圍的低聚殼聚糖產(chǎn)物。
5.產(chǎn)物好，用本發(fā)明菌種及方法獲得的低聚殼聚糖，制備2-10聚合度的產(chǎn)率可達(dá)90％以上，基本不產(chǎn)生單糖。
以下是
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一1、液體培養(yǎng)基擴(kuò)大菌種。將菌種從PDA斜面接入液體CTNP培養(yǎng)基中，氯化鉀、氯化鈉、硫酸鎂各0.05-0.1％，磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀0.1-0.5％及適量的鈣、鐵、銨鹽，其含量占0.01-0.1％，殼聚糖0.5-2.0％，其PH為6-8。或是由1-2％蛋白胨、0.5-2％牛肉膏、0.5％-1鈉鹽配制的pH6-8的肉汁胨培養(yǎng)基，在擴(kuò)大培養(yǎng)基培養(yǎng)的溫度為25-38℃，時(shí)間為1-3天。
2.產(chǎn)酶發(fā)酵生產(chǎn)。將上述的擴(kuò)大菌種培養(yǎng)液300ml加入600L發(fā)酵罐(罐內(nèi)有上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基400升和硫酸銨2公斤，促酶釋放因子(ZSY)0.01-0.1％)調(diào)節(jié)PH為6.0-7.8，溫度20-40℃，發(fā)酵時(shí)間為36小時(shí)，此時(shí)發(fā)酵液中殼聚糖酶活性達(dá)到高峰，終止發(fā)酵，然后離心除渣除菌即得粗制液體型殼聚糖酶制劑。
3.酶解產(chǎn)糖生產(chǎn)。在5000升反應(yīng)釜內(nèi)，將上述粗酶液與3-6％殼聚糖溶液按1∶10的體積比混勻，40-50℃，pH5-6條件下反應(yīng)9小時(shí)，升溫至60℃滅酶活，超濾濃縮10倍后噴霧干燥得到粗制低聚殼聚糖粉劑。
實(shí)施例二1、固體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種。配制由豆餅粉、麩皮、殼聚糖和無機(jī)鹽組成的培養(yǎng)基，其中重量百分含量為豆餅粉1-5％，麩皮1-3％，玉米粉或薯類淀粉1-5％，鈣、鐵、銨鹽，其含量占0.01-0.1％，磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀0.1-0.5％，促酶釋放因子(ZSY)0.01-0.1％，其余為殼聚糖粉。將菌種接入此培養(yǎng)基上，26-30℃培養(yǎng)3-5天，得到擴(kuò)大菌種。
2.產(chǎn)酶發(fā)酵生產(chǎn)。
將上述的擴(kuò)大菌種50公斤加到事先放有產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(罐內(nèi)有上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基400升和氯化銨2公斤，促酶釋放因子(ZSY)0.01-0.1％，不含殼聚糖)的4噸的發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)PH在6.5-8.0，溫度25-35℃，發(fā)酵時(shí)間為36小時(shí)，當(dāng)分析產(chǎn)物中殼聚糖酶活性達(dá)到高峰時(shí)終止發(fā)酵，離心除渣除菌即得粗制液體型殼聚糖酶制劑。
3.酶解產(chǎn)糖生產(chǎn)。按實(shí)施例一的方法進(jìn)行。
實(shí)施例三1.液體培養(yǎng)基擴(kuò)大菌種。將菌種由PDA斜面接入事先放有實(shí)施例一肉汁胨培養(yǎng)液的200L的種罐中，28-38℃通氣培養(yǎng)24小時(shí)，得到液體擴(kuò)大菌種。
2.產(chǎn)酶發(fā)酵生產(chǎn)。將上述的擴(kuò)大菌種加到事先放有3噸產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(罐內(nèi)有上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基400升和尿素2公斤，促酶釋放因子(ZSY)0.01-0.1％，不含殼聚糖))的發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)PH為6.5-8.0，溫度為20-40℃，發(fā)酵時(shí)間36小時(shí)，離心除渣除菌得到粗制液體型殼聚糖酶制劑。
3.酶解產(chǎn)糖生產(chǎn)。按實(shí)施例一的方法進(jìn)行。
實(shí)施例四1.固體培養(yǎng)基擴(kuò)大菌種。將PDA培養(yǎng)基在500毫升的茄形瓶內(nèi)鋪成斜面，將菌種由試管PDA斜面接入茄形瓶PDA斜面，28℃-30℃培養(yǎng)3-5天，得到固體擴(kuò)大菌種。
2.產(chǎn)酶發(fā)酵生產(chǎn)。將上述的一個(gè)茄形瓶的擴(kuò)大菌種接入有400L誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的0.6噸發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)PH7-8，溫度為30-40℃，發(fā)酵36小時(shí)后終止發(fā)酵。離心除渣除菌，經(jīng)硫酸胺鹽析、透析除鹽后得到較為純化的液體型殼聚糖酶制劑。
3.酶解產(chǎn)糖生產(chǎn)。將上述酶液與6％純化殼聚糖溶液混勻，40-50℃，pH5-6條件下酶解4小時(shí)，調(diào)pH值至8.0終止反應(yīng)。離心除渣，超濾除蛋白質(zhì)及濃縮糖液，納濾除單糖及無機(jī)鹽后，噴霧干燥或真空冷凍干燥制備純凈的低聚殼聚糖固體制劑。
應(yīng)用實(shí)例1.將上述制得的低聚殼聚糖作為生防農(nóng)藥的主成分，可將防治能力提高20％以上。
2.將上述制得的低聚殼聚糖作為醫(yī)藥用品，做成口服液糖漿，具有效控制肝炎、糖尿病的病情。
3.將上述制得的低聚殼聚糖加入5％的2，4-D，做成5-10％溶液，將采摘后的荔枝鮮果浸泡其中10分鐘，晾干，自然放置，其保鮮期可延長7-10天。
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖酶生產(chǎn)菌，其特征在于它是芽孢桿菌，是將從自然界提取分離得到的菌株，用pDA或其它培養(yǎng)基培養(yǎng)，在4℃或常溫下保存，菌種的送保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏日為2002年8月16日，保藏號(hào)為0790。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖生產(chǎn)菌，其特點(diǎn)在于其菌種特征芽孢囊膨大，芽孢橢圓形，一般次端生，革蘭氏陽性，在PDA培養(yǎng)基上生長，菌落的顏色由白色轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色。
3.一種使用權(quán)利要求1所述殼聚糖酶生產(chǎn)菌制備低聚殼聚糖的方法，其特征在于先將中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏號(hào)為0790的殼聚糖酶產(chǎn)生菌擴(kuò)大培養(yǎng)，再用兩步法制備低聚殼聚糖第一步使用誘導(dǎo)產(chǎn)酶發(fā)酵，制備粗制液體型殼聚糖酶制劑；第二步使用第一步產(chǎn)生的粗制殼聚糖液體型酶制劑對(duì)殼聚糖溶液進(jìn)行降解，制備低聚殼聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殼聚糖酶生產(chǎn)菌制備低聚殼聚糖的方法，其特征在于殼聚糖酶生產(chǎn)菌的擴(kuò)大菌種方法是將采集得到的菌種加入到固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中，在溫度為25-38℃，時(shí)間為1-3天得到擴(kuò)大菌種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3和4所述的殼聚糖酶生產(chǎn)菌制備低聚殼聚糖的方法，其特征在于殼聚糖酶生產(chǎn)菌的擴(kuò)大菌種方法采用的固體培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，或者由豆餅粉、麩皮、殼聚糖和無機(jī)鹽組成的培養(yǎng)基，其中重量百分含量為豆餅粉1-5％，麩皮1-3％，玉米粉或薯類淀粉1-5％，鈣、鐵、銨鹽，其含量各占0.01-0.1％，磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀0.1-0.5％，其余為殼聚糖粉；采用的液體培養(yǎng)基為CTNP培養(yǎng)基氯化鉀、氯化鈉、硫酸鎂各0.05-0.1％，磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀0.1-0.5％及適量的鈣、鐵、銨鹽，其含量各占0.01-0.1％，殼聚糖0.5-2.0％，其pH為6-8，或是由1-2％蛋白胨、0.5-2％牛肉膏、0.5％-1鈉鹽配制的pH6-8的肉汁胨培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殼聚糖酶生產(chǎn)菌制備低聚殼聚糖的方法，其特征在于使用誘導(dǎo)產(chǎn)酶發(fā)酵，制備粗制液體型殼聚糖酶制劑的過程是將擴(kuò)大培養(yǎng)得到的菌種放到事先加有誘導(dǎo)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在PH6-8，溫度20-40℃的條件下發(fā)酵24-48小時(shí)，得到的發(fā)酵液經(jīng)離心除渣除菌后得到粗制液體型殼聚糖酶制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求3和6所述的殼聚糖酶生產(chǎn)菌制備低聚殼聚糖的方法，其特征在于誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基包括CTNP培養(yǎng)基并添加0.5-2％的氯化銨、硫酸銨、尿素和其它氮源物質(zhì)以及0.01-0.1％的促酶釋放因子(ZSY)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殼聚糖酶生產(chǎn)菌制備低聚殼聚糖的方法，其特征在于用粗制殼聚糖液體型酶制劑對(duì)殼聚糖溶液進(jìn)行降解，制備低聚殼聚糖的過程是按粗酶液與3％-6％殼聚糖溶液的體積比1∶10，混勻，在40℃-50℃，pH5-6條件下進(jìn)行殼聚糖的酶解反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用微生物培養(yǎng)得到殼聚糖酶和生產(chǎn)低聚殼聚糖(或稱氨基寡糖素、殼寡聚糖)的方法，所述的微生物是從海灘上獲得的芽孢桿菌，獲得菌種后誘導(dǎo)產(chǎn)酶發(fā)酵的方法是加入適量殼聚糖和氮源、無機(jī)營養(yǎng)鹽的溶液中，在常溫下培養(yǎng)30－40小時(shí)即可得到具有高活性的殼聚糖酶制劑，酶解產(chǎn)糖的方法是將酶液與殼聚糖溶液按一定比例混勻，在十分溫和的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，短時(shí)間內(nèi)(4－12小時(shí))即可將殼聚糖轉(zhuǎn)化為低聚殼聚糖，濃縮或干燥得到產(chǎn)品。該方法的菌種遺傳性穩(wěn)定，產(chǎn)酶率高，發(fā)酵及酶解條件常規(guī)化、速度快，產(chǎn)品質(zhì)量好。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1492039SQ03128199
公開日2004年4月28日 申請(qǐng)日期2003年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月21日
發(fā)明者杜聲亮, 王士奎, 王世全, 章玉萍, 陳書勤 申請(qǐng)人:北海國發(fā)海洋生物產(chǎn)業(yè)股份有限公司