炭疽菌診斷基因芯片的制備及應用的制作方法

專利名稱：炭疽菌診斷基因芯片的制備及應用的制作方法
炭疽桿菌是人畜共患致病菌，可通過消化道、呼吸道及皮膚接觸感染入和動物，具有高度致病性，其芽孢能大量繁殖，易在空氣中傳播，并可存活十年以上，所以被認為是最有效的生物武器之一。它的存在對人類的健康和生命構成了極大的威脅，其檢測和防御一直倍受重視。炭疽檢測現在面臨兩個主要問題一、如何快速確定某人是接觸了炭疽芽胞還是其他無害細菌；二、如何快速診斷出有可能致命的吸入性炭疽感染以挽救病人的生命。
通常炭疽的檢測診斷都是基于形態學特征或表型特征，如革蘭氏陽性染色試驗、噬菌體試驗、串珠和青霉素抑制試驗、拉絲試驗(粘型菌落)、溶血試驗、芽孢形成試驗等，這些方法在一定程度上都存在著費時、操作繁瑣、靈敏度低等缺點。PCR等技術的出現為炭疽的快速、高效檢測提供了有力的工具，也越來越受注視。
炭疽與蘇云金、蠟樣桿菌、蕈狀桿菌等同屬蠟樣菌群，都是哺乳動物和昆蟲的病原體。它們之間具有很高的同源性，屬同一種屬。炭疽桿菌與蠟樣菌群的其他菌株的重要區別在于它有兩個毒性質粒即編碼炭疽熱毒素的pXO1(185kb)和編碼莢膜的pXO2(95kb)，缺失任何一個質粒其毒性都會下降。莢膜為D-谷氨酸聚合物，其合成酶由capA，capB，capC基因編碼；而毒素由三個因子組成pag基因編碼的保護性抗原，lef基因編碼的致命因子，cya基因編碼的水腫因子。這些基因都可被用做PCR法鑒定炭疽的標志物，檢測這些特異致病因子成為鑒定炭疽的主要手段。然而質粒非常不穩定，易缺失，現已發現自然界中存在缺失上述一種或兩種質粒的菌株；而且質粒可被導入其它菌株，在異源系統中也發現毒素基因(如aslef、cya等)的表達。因此，應用質粒鑒定炭疽的方法并不完全可靠。而染色體表達相對穩定，在炭疽的準確鑒定中起著重要的作用。染色體標志物rpoB基因、16sRNA、vrrA基因、Ba813及SG-850標志物等都可用于炭疽的鑒定。但常規PCR檢測一般是將擴增后的產物經瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，在紫外燈下通過觀察有無特異性的熒光條帶的出現判定陰陽結果，其結果的準確性、可靠性受主觀及客觀因素影響較大，同時溴化乙錠有強致癌毒性。而基因芯片技術的出現為基因檢測提供了一個更高通量、更安全、更有效的手段。
基因芯片是近年來發展成熟的一種高通量基因檢測技術(Hacia J.Naturegenetics(Supl)，1999，21(1)42-47)。他可用于基因表達分析、突變檢測、藥物篩選等，用途非常廣泛。基因條碼識別通用芯片屬于寡核苷酸芯片，是由F.Barany等(J.MOL.BIO.1999，292251-262)發明的，它最初用于進行高通量的單堿基點突變檢測，是通過結合PCR、連接酶檢測技術(LDR)以及基因編碼雜交技術而實現的，其中所采用的可尋址的基因條碼序列是隨機產生的人工設計探針，其序列獨一無二，因此由這些序列組成的芯片可作為通用芯片，用于任意基因的突變檢測，只需變換一下可尋址條碼序列后所連接的靶核酸的序列就可實現。我們在試驗中發現利用尋址編碼識別通用芯片不僅可進行突變檢測，而且還可實現多基因、多樣本分析。其檢測多樣品、多基因的原理如下(附圖1)設計合成待檢基因的特異擴增引物及報告探針(可按復合探針設計原則設計Wang SQ et al，Anal.BioChem.2002)，其中一條引物向5’端延伸一段尋址條碼序列，該序列與引物間有一間隔臂，可阻止PCR延伸，并且該序列與固定在通用芯片上的可尋址捕獲探針互補，通過PCR擴增使產物的末端連上一段可尋址的條碼序列，然后將所有PCR擴增產物混合，與報告探針一起加入到雜交體系，與通用芯片進行雜交，這樣這些PCR產物上連接的可尋址條碼序列與芯片上互補的尋址捕獲探針雜交，從而將擴增產物定向地錨定在芯片對應位置上，被錨定的PCR產物再與熒光或生物素等報告分子標記的特異報告探針雜交，通過信號掃描等分析即可檢測出每份樣品的結果。因為一條尋址條碼序列可對應一份樣本或一個基因，有多條尋址條碼序列就可對應多分樣本或多個基因，這樣通過一次雜交就能同時檢測出多份樣本或多個基因，從而實現多樣本、多基因檢測的目的。
本發明的目的是，聯合PCR技術和基因條碼識別通用芯片檢測炭疽桿菌，可同時鑒定炭疽桿菌的PXO1、PXO2兩個質粒及染色體標志物，并實現多份標本同時分析的目的，為快速確定某人是接觸了炭疽芽胞還是其他無害細菌以及指導臨床合理用藥提供快速高效的檢測手段。本發明的主要內容包括通用芯片的制備、針對炭疽兩個質粒及染色體的基因條碼引物以及報告探針的設計與合成、通用芯片檢測炭疽標志物的雜交條件的優化以及特異性/靈敏度的分析、通用芯片在檢測多份炭疽標本中的應用。
結合


本發明的具體實施過程附圖1 基因編碼識別通用芯片檢測多標本的示意圖附圖2 通用芯片的外觀示意圖及點陣布局附圖3 雜交時間對雜交信號的影響附圖4 雜交溫度對雜交信號的影響附圖5 通用芯片檢測炭疽的特異性分析(a)檢測染色體標志物(b)檢測PXO2標志物(c)檢測PXO1標志物附圖6 通用芯片在多份標本檢測中的應用實施例1.尋址條碼捕獲探針的設計與合成根據F.Barany等(J.MOL.BIO.1999，292251-262)介紹的尋址條碼探針設計原則，設計16條(探針數量可按需要增減)長24mer，Tm值相近(由OLIGO6.0軟件計算)，且相互之間無同源性的探針，其序列及對應的編號見表1。合成在391 DNA合成儀(Applied Biosystems)上完成，探針的3′端進行氨基修飾。利用以四縮乙二醇為基礎的氰乙基-N′，N′-二異丙基亞磷酰氨試劑在氨基試劑及寡核苷酸探針之間引入間隔臂。合成完畢后濃氨水55℃脫保護/切割15hr，經反相柱純化，紫外定量后真空濃縮至干，-20℃保存備用。
表1 尋址條碼捕獲探針的序列及編號編號序列(5’→3’) Tm(℃)bar1 GTCT TCTG GCAA TCGT CTCA CGTT-spacer-NH2 71.1bar2 GCAA TCTG ACCT TCGT CCAT CGTT-spacer-NH2 72.9bar3 ACCT TCTG AGGA TCGT TGTC CGTT-spacer-NH2 71.7bar4 AGGA TCTG GTCT TCGT CTTG CGTT-spacer-NH2 72.0bar5 TCTG TGTC TCGT GCAA CGTT CTCA-spacer-NH2 71.4bar6 TCGT TGTC CGTT GCAA CTGT CTCA-spacer-NH2 71.4bar7 CGTT TGTC CTGT GCAA TCTG CTCA-spacer-NH2 73.6bar8 CTGT TGTC TCTG GCAA TCGT CTCA-spacer-NH2 70.7bar9 CGTT GGTA CTCA TGTC CCAT CTGT-spacer-NH2 69.4bar10 CTCA GGTA CTTG CGTT TGTC CCAT-spacer-NH2 71.0bar11 CTGT GGTA CCAT TGTC CGTT GAGT-spacer-NH2 71.4bar12 CTTG CCAT CTCA GGTA TGTC GGTT-spacer-NH2 70.9bar13 TCTG CGAA TGTC CTGT ACCT TCGT-spacer-NH2 71.5bar14 TGTC CAGA AGTG CTTG CTGT TCGT-spacer-NH2 72.5bar15 TCGT AGTG CTTG ACCT TCTG CTGT-spacer-NH2 69.7bar16 CTTG GCAA AGTG CTGT TCGT ACTC-spacer-NH2 69.7bar17 TGTC TCTG AGTG CTTG CTCA ATCG-spacer-NH2 70.2bar18 CGTT TCTG ACCT CTTG CCAT ATCG-spacer-NH2 70.4bar19 TGTC CGTT ATCG CTCA TCTG TGTC-spacer-NH2 71.5bar20 CCAT TCTG GTCT CTTG CGTT ATCG-spacer-NH2 71.52.通用芯片的制備用厚約50微米的防水紙制成方形格柵，將其緊密貼于醛基化的玻片上，使玻片分割成10個互相分開的方形小區， 每個區的邊長為9毫米。然后將氨基修飾的捕獲探針以50μmol/L的濃度溶于3×SSC溶液中，用Pix sys 5500芯片制備儀(Catesian Technologies)點到醛基化玻片上的各個方形小區中，這樣就得到了包含10個完全一樣探針矩陣的芯片，探針矩陣的排列及芯片示意圖見附圖2，其中前三行的每一列分別對應檢測一份標本的三個基因，最后一行分別用于檢測三個基因的陽性對照及陰性對照，以監測實驗是否成功，芯片點制完畢后晾干，放載玻片盒上室溫放置備用。
3.炭疽檢測特異引物及探針的設計與合成以PXO1的pag基因、PXO2的cap基因以及染色體的rpoB基因為檢測對象，參照引物設計原則，設計PCR擴增檢測這些基因的上下游引物p1/p2，其序列見表2。報告探針F的設計可參照f復合探針設計的原則(Wang SQ et al，Anal.BioChem.2002)，引物與探針均用391A型DNA合成儀合成。
表2 炭疽檢測的特異引物及探針序列靶基因名稱 序列(5’→3’) 序列位置(nt)PXO1(pag)F-PAG CY3-ACA TGT ACA ATC GGA TAA GCT GCC ACA A-NH2926-899PAGp1 ACC AAT ATC AAA GAA CGA CGC 1086-1066PAGp2 ATC ACC AGA GGC AAG ACA CCC 876-896PXO2(cap)F-CAP CY3-ATC CAA GAG TAG CAA CCC TAA CAC CAT T-NH22548-2521CAPp1 GCT CCT GCT ACA AAT GCA TCT G2573-2552CAPp2 GCT GAT CTT GAC TCC TGT GGG TG 2452-2474染色體(rpoB)F-rpoB CY3-TCC AAA GCG CTA TGA TTT AGC AAA TGT-NH2 1871-1897rpoBp1 CCA CCA ACA GTA GAA AAT GCC 1821-1841rpoBp2 ATG TTT CAG CTA AAC GTT GG 1973-19544.尋址基因條碼引物的設計根據基因條碼識別芯片的檢測原理，所設計的報告探針應與連有條碼識別序列的擴增片段互補才能通過芯片掃描檢測出信號，因此將將與尋址捕獲探針互補的序列與分別連于CAPp2、PAGp2、rpoBp2的5’端，合成時在兩序列之間引入一個乙二醇作為間隔基團，以阻止PCR擴增，各引物序列及編號見表3。
表3 檢測炭疽三個基因的含有基因條碼序列的引物編號 序列(5’→3’)rpoBbar1R1 AACGTGAGACGATTGCCAGAAGAC-OCH2CH2O-ATGTTTCAGCTAAACGTTGGbar2R1 AACGAGTTACGAAGGTCAGATTGC-OCH2CH2O-ATGTTTCAGCTAAACGTTGGbar3R1 AACGGACAACGATCCTCAGAAGGT-OCH2CH2O-ATGTTTCAGCTAAACGTTGGbar4R1 AACGCAAGACGAAGACCAGATCCT-OCH2CH2O-ATGTTTCAGCTAAACGTTGGbar5R1 TGAGAACGTTGCACGAGACACAGA-OCH2CH2O-ATGTTTCAGCTAAACGTTGGbar16R1 GAGTACGAACAGCACTTTGCCAAG-OCH2CH2O-ATGTTTCAGCTAAACGTTGGbar19R1 GACACAGATGAGCGATAACGGACA-OCH2CH2O-ATGTTTCAGCTAAACGTTGGCAPbar6R1 TGAGAACGTTGCACGAGACACAGA-OCH2CH2O-GCTGATCTTGACTCC TGTGGGTGbar7R1 TGAGCAGATTGCACAGGACAAACG-OCH2CH2O-GCTGATCTTGACTCC TGTGGGTGbar8R1 TGAGACGATTGCCAGAGACAACAG-OCH2CH2O-GCTGATCTTGACTCC TGTGGGTGbar9R1 ACAGATGGGACATGAGTACCAACG-OCH2CH2O-GCTGATCTTGACTCC TGTGGGTGbar10R1 ATGGGACAAACGCAAGTACCTGAG-OCH2CH2O-GCTGATCTTGACTCC TGTGGGTGbar17R1 CGATTGAGCAAGCACTCAGAGACA-OCH2CH2O-GCTGATCTTGACTCC TGTGGGTGbar20R1 CGATAACGCAAGAGA CAGAATGG-OCH2CH2O-GCTGATCTTGACTCC TGTGGGTG
PAGbar11R1 ACTCAACGGACAATGGTACCACAG-OCH2CH2O-ATCACCAGAGG AAGACACCCbar12R1 AACCGACATACCTGAGATGGCAAG-OCH2CH2O-ATCACCAGAGGCAAGACACCCbar13R1 ACGAAGGTACAGGACATTCGCAGA-OCH2CH2O-ATCACCAGAGGCAAGACACCCbar14R1 ACGAACAGCAAGCACTTCTGGACA-OCH2CH2O-ATCACCAGAGGCAAGACACCCbar15R1 ACAGCAGAAGGTCAAGCACTACGA-OCH2CH2O-ATCACCAGAGGCAAGACACCCbar18R1 CGATATGGCAAGAGGTCAGAAACG-OCH2CH2O-ATCACCAGAGGCAAGACACCC5.炭疽DNA的PCR擴增將炭疽桿菌懸液在沸水中煮20min，然后10000rpm離心15min，收集上清，取5μl加入如下反應體系中PCR Mix 20μl，上游引物0.5μM，下游尋址基因條碼引物1μM，TaqPolymerase(5u/μl)0.2μl。94℃ 5min；[94℃ 20Sec，55℃ 30Sec，72℃ 10Sec]40 cycles；72℃3min。每個PCR管做上與尋址條碼引物及對應標本相應的標志，以防弄混。同時設陽性對照及無模板陰性對照。擴增后將這些PCR產物等體積混勻，準備進行芯片雜交檢測。
6.炭疽檢測的陽性對照構建分別以PAGp1/PAGp2、CAPp1/CAPp2和rpoBp1/rpoBp2為引物，提取的炭疽DNA為模板，進行PCR擴增，將擴增產物用Wizard PCR Preps DNA Purification System純化后，連接到pGEM-T載體上，并轉化至JM-109菌株中，挑取克隆，進行PCR及測序鑒定。重組質粒采用Wizard PlusSV Minipreps DNA Purification System提取。紫外定量后，備用。
7.寡核苷酸通用芯片處理Oligochip先用0.2％SDS清洗2次，接著以水清洗2次，空氣涼干。用NaBH4溶液[100ml含20％乙醇的PBS溶液中加入1.3g NaBH4]作用10min，封閉玻片表面的醛基。0.2％SDS清洗1次，水清洗1次，晾干后用于雜交。
8.雜交及其雜交條件的優化將PCR混合物與雜交液按比例混勻后，取10μl加到芯片的各個方型小區上，并置于雜交盒中，在一定溫度下雜交一定時間，芯片雜交完成后用洗液A(1×SSC，0.2％SDS)；洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)各清洗2分鐘。然后用Axon4000掃描儀對其進行掃描，并記錄結果，根據信號強度對結果進行判定。
(1)雜交體系的組成5×SSC，0.2％SDS，10％甲酰氨，PCR混合物，0.02μM報告探針。
(2)雜交時間的確定將同一雜交體系分成多份，分別加在多張芯片上于45℃進行雜交，在雜交5，10，20，30，60及90分鐘分別取出一張芯片進行掃描，分析并比較結果顯示(附圖3)，隨雜交時間的增長，信號逐漸增強，到30分鐘后信號已基本飽和。
(3)雜交溫度的確定將同一雜交體系分成多份，分別加在多張芯片上，于37℃，42℃，45℃，50℃，55℃雜交30分鐘后，取出芯片進行掃描，分析并比較結果顯示(附圖4)，42℃-50℃雜交信號強度無明顯差異，37℃雜交則特異性較差，55℃雜交信號減弱。
9.通用芯片特異性分析將基因條碼引物用于擴增其對應的質粒，然后將這些PCR產物混合后進行雜交，但在雜交時只加入一種報告探針，其結果顯示(見附圖5)，當只加F-CAP報告探針時，只有bar6-10及bar17對應的點有信號，只加F-PAG時，只有bar11-15及bar18對應的點有信號，而當加F-rpoB報告探針時，bar1-5及bar16對應的點亮，說明探針之間互相不存在交叉雜交。
10.芯片檢測靈敏度分析將含炭疽CAP、PAG及rpoB基因的質粒10倍系列稀釋，制成濃度為106-102拷貝/ul的系列模板，然后用基因條碼引物分別擴增同一已知濃度的對應質粒，再將PCR產物混合后雜交，對雜交結果分析顯示，芯片上每個點的檢測限都能達到104拷貝。
11.基因條碼識別通用芯片分析多份標本將提取的5份細菌DNA分別用基因條碼引物進行PCR擴增，各取2uLPCR產物混合，加入0.02μM的三種報告探針，5×SSC，0.2％SDS，10％甲酰氨，使終體積為50μL，取出10μL加在通用芯片的一個小區上，放入雜交盒，置于45℃雜交30分鐘后取出，甩去表面的雜交液，用Axon4000掃描儀掃描，其掃描結果見附圖5，圖中，bar1，bar6，bar11分別對應第一份細菌rpoB、CAP及PAG基因，從圖看出，bar1，bar6亮，而bar11沒有信號，說明該細菌不含PXO1質粒，而bar3，bar8，bar13對應的第三份細菌，三個點都亮，說明該細菌三個基因都有，以此類推，第二份細菌、第五份細菌PXO1質粒缺失，第四份細菌則包含完整的基因信息。
總之，利用本發明進行炭疽檢測，不但可同時分析多份標本，還可同時分析炭疽的多個特異標志，確定細菌有無毒性，，可做為生物戰劑檢測、臨床診斷、環境監測、衛生檢疫等的分析工具，指導是否該采取措施盡快避免更大的危害。
權利要求
1.一種利用PCR技術結合基因芯片檢測炭疽桿菌的方法及其在炭疽檢測中的應用。其特征在于，針對炭疽PXO1、PXO2及染色體上的基因，設計合成特異擴增引物及報告探針，其中每組中各有一條引物向5’端延伸一段尋址條碼序列，該序列與引物間有一間隔臂，可阻止PCR延伸，并且該序列與固定在通用芯片上的可尋址捕獲探針互補，通過PCR擴增使產物的末端連上一段可尋址的條碼序列，然后將所有PCR擴增產物混合，與報告探針一起加入到雜交體系，與通用芯片進行雜交，這樣這些PCR產物上連接的可尋址條碼序列與芯片上互補的識別捕獲探針雜交，從而將擴增產物定向地錨定在芯片對應位置上，被錨定的PCR產物再與熒光等報告分子標記的特異報告探針雜交，通過信號掃描等分析即可檢測出每份樣品的結果。
2.權利要求1中PXO1上的基因可以包括pag、lef、cya等任何一個特異基因或片段，PXO2上的基因可以包括capA、capB、capC等任何一個特異基因或片段，染色體上的基因包括rpoB、Ba813、16sRNA等任何一個特異基因或片段。
3.根據權利要求1和2，一次雜交可以同時檢測炭疽的三個標志物PXO1、PXO2及染色體DNA。
4.權利要求1中的靶特異報告探針，按照復合探針設計原則設計，長15-80mer，位于擴增片段內，5，末端標記熒光素或生物素等報告分子，且與連有可尋址條碼序列的引物所延伸的鏈互補。
5.權利要求1中的芯片可被分隔成多個雜交孔，最佳為2-12個，每個雜交孔點制有相同的捕獲探針陣列。
6.根據權利要求1，一條尋址條碼序列可對應一份樣本的一個基因，有多條尋址條碼序列就可對應多份樣本的多個基因，這樣通過一次雜交就能同時檢測出多份樣本中炭疽標志物PXO1、PXO2及染色體等基因的表達情況。
7.根據權利要求5和6，每張芯片的每個雜交孔可以同時檢測多份標本，最佳為2-96份。
全文摘要
本發明涉及一種生物工程類檢測產品及其用途，具體地說是聯合PCR技術和基因芯片技術檢測炭疽桿菌。本發明可同時檢測炭疽的PXO1、PXO2質粒及染色體等多個標志物，并能同時分析多份標本，具有特異性好、靈敏度高的特點，可作為戰時或平時生物戰劑檢測、臨床診斷、環境監測、衛生檢疫等的檢測工具。
文檔編號C12Q1/04GK1537953SQ0312188
公開日2004年10月20日 申請日期2003年4月17日 優先權日2003年4月17日
發明者王升啟, 陳蘇紅, 張敏麗 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射醫學研究所, 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射醫