專利名稱：羅氏沼蝦病毒復合反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應檢測的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于蝦類病害檢測技術領域，具體涉及一種羅氏沼蝦病毒復合反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應檢測的方法，適用于羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒病原的診斷。
背景技術：
羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)肌肉白濁病是90年代以來影響東南亞和加勒比國家羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要病害(Nash et al.，1987；Tung et al.，1999；Arcieret al.，1999)。該病害的感染對象是育苗場的幼苗，發(fā)病幼苗肌肉呈白濁現(xiàn)象。該病害導致蝦苗在短時間內(nèi)大量死亡，從農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局全國水產(chǎn)技術推廣總站編輯的《水產(chǎn)養(yǎng)殖動植物病情月報》知道，該病害目前已經(jīng)傳播到我過主要羅氏沼蝦養(yǎng)殖地區(qū)。從2001年采集的病蝦幼苗體內(nèi)分離到兩種病毒，一種是直徑為27nm的、具有諾達病毒特征的顆粒，與法國研究人員從來自安替列群島(Antillan)的患白體病的羅氏沼蝦中分離的諾達病毒非常相近(Bonami，2002)；一種是直徑為15nm左右的小病毒顆粒，基因組包含一段0.9kb大小的單鏈RNA，目前已經(jīng)獲得兩種病毒的部分基因組序列。發(fā)現(xiàn)來自不同地方的樣品中均存在大小兩種顆粒病毒同時感染的現(xiàn)象。這兩種病毒的主要靶組織均為肌肉組織和結締組織，在超薄切片中，大顆粒病毒呈分散排列而容易被觀察到；小病毒顆粒則形成晶格結構，病毒顆粒不容易被觀察到。在粗提的病毒懸液中，大顆粒病毒也是主要成分，而小病毒顆粒因占次要成分和直徑小而容易被忽略。關于檢測技術方面，法國研究人員報道了一種簡便、快速的免疫檢測方法(Romestand&Bonami，2003)。從目前的文獻和專利查詢結果知道，沒有關于羅氏沼蝦兩種病毒的復合反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應檢測的方法的報道和專利申請。
參考文獻(1)Arcier J.M.，Herman F.，Lightner D.V.，Redman R.M.，Mari J.&Bonami J.R.(1999).A viral disease associated with mortalities in hachery-rearedpost larvae of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii.Diseases of Aquatic Organisms，38，177-181.
(2)Bonami J.R.(2002)A new viral disease in the giant freshwater prawnMacrobrachiumrosenbergii.World Aquaculture 2002.Annual Meetings of theWorld Aquaculture Society and the China Society of Fisheries，April 23-27，2002.Beijing Convention Center，Beijing China.Abstract，p.79.
(3)錢冬 楊國梁 劉問等。羅氏沼蝦苗肌肉白濁病病原研究。水生生物學報，2002，26472-476(4)Romestand B.&Bonami J.R.(2002)A sandwich enzyme linked immunosorbentassay(S-ELISA)for detection of MrNV in the giant fresh water prawnMacrobrachium rosenbergii.Journal of Fish Diseases，(in press).
(5)Tung C.W.，Wang C.S.&Chen S.N.(1999)Histological and electronmicroscopic study on Macrobrachium muscle virus(MMV)infection in thegiant freshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii(de Man)，cultured inTaiwan.Journal of Fish Diseases，22，1-5.
參考資料(1)、(2)(3)和(5)主要側(cè)重于羅氏沼蝦肌肉白濁病的病原研究，在組織病理、病毒的超微結構和生化特征的水平上對病毒進行描述。資料(4)報道了一種羅氏沼蝦諾達病毒的免疫檢測方法，該方法操作簡單、快速，但靈敏度低，只能檢測一種病毒。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種羅氏沼蝦病毒復合反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應檢測的方法。根據(jù)羅氏沼蝦兩種病毒基因組cDNA序列，設計兩種病毒特異性寡核甘酸引物，用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應的方法，同時檢測羅氏沼蝦體內(nèi)兩種病毒的感染狀況.該方法快速，靈敏度高，適合于羅氏沼蝦肌肉白濁病病原的診斷以及親蝦、幼苗和成蝦的健康狀況監(jiān)測。
為了達到以上目的，本發(fā)明采取以下技術方案A、制備檢測試劑盒試劑盒含有所有檢測程序中的必要成分，包括總RNA提取試劑(4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉pH7.0，0.5％月桂基肌氨酸鈉鹽，0.1M巰基乙醇，0.2M醋酸鈉)、病毒特異引物(諾達病毒上下游引物ggtagttcccgaagcaaatgtag，cactcttaacccccactcctg；小病毒上下游引物atgcagccgggtggtaatg，tgtgcagctggtggataaagaata)、擴增系統(tǒng)成分[在50μl反應體系內(nèi)，加入4μl 10mM脫氧核糖核甘酸混合物，2.5μl 100mM DTT，1μl RNA酶抑制劑5U/μl，10μl 5x反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應緩沖液，2μl兩種病毒的上下游引物(10pmol/μl)，1μl酶混合物，1μl病蝦組織總RNA]。
B、建立DNA擴增的最佳條件(55℃ 30min，1個循環(huán)；94℃，30s，55℃ 30s，72℃ 1min30s，30個循環(huán)，72℃ 7min，1個循環(huán)。1.5％瓊脂糖電泳檢查擴增產(chǎn)物)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比有以下優(yōu)點可以同時檢測兩種病毒；靈敏度高，樣品處理程序簡單；檢測時間短；可以同時檢測多個樣品。
具體實施例方式
具體步驟如下(1)設計病毒特異引物，諾達病毒上下游引物ggtagttcccgaagcaaatgtag，cactcttaacccccactcctg；小病毒上下游引物atgcagccgggtggtaatg，tgtgcagctggtggataaagaata.
(2)組織總RNA提取稱取10-50mg的病蝦苗或成蝦組織，用1ml樣品處理液(4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉pH7.0，0.5％十二烷基肌氨酸鈉鹽，0.1M巰基乙醇，0.2M醋酸鈉)，研磨，3000g離心10min。取上清加入0.2ml的氯仿，混合30秒，12000g離心10分鐘，取水相0.6ml加入0.5ml的異戊醇混勻，放置10分鐘后，12000g離心10分鐘，75％乙醇洗2次，干燥后用焦碳酸二乙酯處理的雙蒸水溶解。
(3)反應體系在50μl反應體系內(nèi)，加入4μl 10mM dNTP，2.5μl 100mM DTT，1μlRNA酶抑制劑5U/μl，10μl 5x反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應buffer，2μl兩種病毒的上下游引物(10pmol/μl)，1μl酶混合物，底物為從組織提取的總RNA.
(4)擴增條件55℃ 30min，1個循環(huán)；94℃，30s，55℃ 30s，72℃ 1min30s，30個循環(huán)，72℃ 7min，1個循環(huán)。1.5％瓊脂糖電泳檢查為羅氏沼蝦諾達病毒反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應擴增序列和羅氏沼蝦15nm病毒反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應擴增序列。
序列表<110>中國科學院武漢病毒研究所<120>羅氏沼蝦病毒復合反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應檢測的方法<160>6<170>PatentIn 3.1<210>1<211>548<212>DNA<213>羅氏沼蝦肌肉濁病諾達病毒(Macrobrachium Rosenbergii Nodavirus)<400>1ggtagttccc gaagcaaatg taggtgtacc ttacagtttg gaagatgcgc gtaaagaact 60tgataaaccc acgcaagtca atgcggtaaa ccaaatttgg gaaacagtag acatggaagt120ccgccgctta attgaagcat ttgtgaagaa tgaaccgacc aataaatctg gtcgtataat180atcatctttt gcggactcaa gattcttgtt gaagttttcc acatatacgc ttgcctttcg240agatgaagta ttacatgctg aacataatca acattggttt tgtcctgggt tgacacctaa300tgaaatagca gataaagttt gcgactatgt tcgtggcgta gcaacacctg cagaaggtga360ttttagcaac tttgacggaa gggtatctgc ttggtgtcaa gagaacgtaa tgaatgctgt420ttatcataga tggtttaacc gtaagttctc taaggaattg cagaaataca catcaatgtt480ggttagttgc ccagctcgag ctaagcgttt tggtttccag tatgaaccag gagtgggggt540taagagtg 548<210>2<211>484<212>DNA<213>羅氏沼蝦肌肉濁病小病毒(Macrobrachium Rosenbergii Ex-small virus)<400>1tgacgttaaa tgcagccggg tggtaatgcg tattaatatt tcaacaacat gaataagcgc 60attaataata atcggagaac catgagatca cgtaggggac gtggtaggac aatgggatct120aatctcattc cttatgccaa ctcaccagtc cctataccat atacaccacc cgttacccca180gtcaccgtca ttggtaatcc tcggaaaact acttggattg acattgatct ttcaagtgaa240gagtccggga tttacacatt gacggttggg tcataccgta ataggatcac taaacttggt300ccatctaaac ctaactttat tattgagaag gtcgcagcat atgctgcacc aggagattat360aaggttgttc tcaatgactt taaaactggt atacaagtcg ttgatgaagg ctcttatgct420catagagccg cagcaggtat tctttatcca ccagctgcac aaatatttta cggtatttca480gcaa484<210>3<211>23<212>DNA<213>羅氏沼蝦肌肉濁病諾達病毒(Macrobrachium Rosenbergii Nodavirus)<400>1ggtagttccc gaagcaaatg tag23<210>4<211>21<212>DNA<213>羅氏沼蝦肌肉濁病諾達病毒(Macrobrachium Rosenbergii Nodavirus)<400>1cactcttaac ccccactcct g 21<210>5<211>19<212>DNA<213>羅氏沼蝦肌肉濁病小病毒(Macrobrachium Rosenbergii Ex-small virus)<400>1atgcagccgg gtggtaatg 19<210>6<211>24<212>DNA<213>羅氏沼蝦肌肉濁病小病毒(Macrobrachium Rosenbergii Ex-small virus)<400>1tgtgcagctg gtggataaag aata 2權利要求
1.一種羅氏沼蝦病毒復合反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應檢測的方法，包括下列步驟(1)設計病毒特異引物，諾達病毒上下游引物ggtagttcccgaagcaaatgtag，cactcttaacccccactcctg；小病毒上下游引物atgcagccgggtggtaatg，tgtgcagctggtggataaagaata；(2)組織總RNA提取稱取10-50mg的病蝦苗或成蝦組織，用1ml樣品處理液，研磨，3000g離心10min，取上清加入0.2ml的氯仿，混合30秒，12000g離心10分鐘，取水相0.6ml加入0.5 ml的異戊醇混勻，放置10分鐘，12000g離心10分鐘，75％乙醇洗2次，干燥后用焦碳酸二乙酯處理的雙蒸水溶解；(3)反應體系在50μl反應體系內(nèi)，加入4μl 10mM dNTP，2.5μl 100mM DTT，1μlRNA酶抑制劑5U/μl，10μl 5x反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應buffer，2μl的上下游引物，1μl酶混合物，底物為從組織提取的總RNA；(4)擴增條件55℃ 30min，1個循環(huán)；94℃，30s，55℃ 30s，72℃ 1min30s，30個循環(huán)，72℃ 7min，1個循環(huán)，1.5％瓊脂糖電泳檢查擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物為羅氏沼蝦諾達病毒反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應擴增序列和羅氏沼蝦15nm病毒反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應擴增序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種羅氏沼蝦病毒復合反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應檢測的方法，其特征在于樣品處理液為4M異硫氰酸胍、25mM檸檬酸鈉pH7.0、0.5％十二烷基肌氨酸鈉鹽、0.1M巰基乙醇、0.2M醋酸鈉。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種羅氏沼蝦病毒復合反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應檢測的方法，其特征在于羅氏沼蝦諾達病毒反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應擴增序列是ggtagttccc gaagcaaatg taggtgtacc ttacagtttg gaagatgcgc gtaaagaact 60tgataaaccc acgcaagtca atgcggtaaa ccaaatttgg gaaacagtag acatggaagt 120ccgccgctta attgaagcat ttgtgaagaa tgaaccgacc aataaatctg gtcgtataat 180atcatctttt gcggactcaa gattcttgtt gaagttttcc acatatacgc ttgcctttcg 240agatgaagta ttacatgctg aacataatca acattggttt tgtcctgggt tgacacctaa 300tgaaatagca gataaagttt gcgactatgt tcgtggcgta gcaacacctg cagaaggtga 360ttttagcaac tttgacggaa gggtatctgc ttggtgtcaa gagaacgtaa tgaatgctgt 420ttatcataga tggtttaacc gtaagttctc taaggaattg cagaaataca catcaatgtt480ggttagttgc ccagctcgag ctaagcgttt tggtttccag tatgaaccag gagtgggggt540taagagtg 548
4.根據(jù)權利要求1所述的一種羅氏沼蝦病毒復合反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應檢測的方法，其特征在于羅氏沼蝦15nm病毒反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應擴增序列是tgacgttaaa tgcagccggg tggtaatgcg tattaatatt tcaacaacat gaataagcgc 60attaataata atcggagaac catgagatca cgtaggggac gtggtaggac aatgggatct 120aatctcattc cttatgccaa ctcaccagtc cctataccat atacaccacc cgttacccca 180gtcaccgtca ttggtaatcc tcggaaaact acttggattg acattgatct ttcaagtgaa 240gagtccggga tttacacatt gacggttggg tcataccgta ataggatcac taaacttggt 300ccatctaaac ctaactttat tattgagaag gtcgcagcat atgctgcacc aggagattat 360aaggttgttc tcaatgactt taaaactggt atacaagtcg ttgatgaagg ctcttatgct 420catagagccg cagcaggtat tctttatcca ccagctgcac aaatatttta cggtatttca 480gcaa 48全文摘要
本發(fā)明公開了一種羅氏沼蝦病毒復合反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應檢測的方法，其步驟是首先設計兩種病毒的特異引物；其次是組織RNA提??；第三是反應體系；第四是擴增體系。本發(fā)明靈敏度高，檢測時間短，可以同時檢測兩種病毒，適合于羅氏沼蝦肌肉白濁病的病原診斷及親蝦、幼苗和成蝦的健康監(jiān)測。
文檔編號C12Q1/68GK1451764SQ03119089
公開日2003年10月29日 申請日期2003年5月19日 優(yōu)先權日2003年5月19日
發(fā)明者石正麗 申請人:中國科學院武漢病毒研究所