專利名稱：植物乳桿菌st-iii菌株及其在調節血脂方面的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種乳桿菌屬的新菌株，及通過培養該菌株在調節血脂方面的應用。
因而本發明的目的是提供一種植物乳桿菌ST-III；本發明的另一目的是公開上述植物乳桿菌ST-III在調節血脂方面的應用。
本發明的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)ST-III制備過程如下將泡菜汁或苜蓿汁作為樣品冷藏，測定其PH值，并接種于MRS平板(Merck公司購得)且進行總菌落計數；然后采取上述樣品，根據上述測定結果用pH6.8的PBS緩沖溶液浸泡混勻并梯度稀釋；吸取合適的稀釋度(每毫升含有100個左右細菌)100微升涂布于LBS平板，進行培養；挑取典型菌落轉接到MRS平板進一步純化；挑取理想單菌落轉接于MRS液體進行增菌，獲得乳酸菌菌株并冷藏保存；將上述新鮮的乳酸菌菌株以體外模型初步篩選具有降膽固醇功能的益生菌(USMAN and A.HOSONO.Bile tolerance，taurocholate deconjugation，andbinding of cholesterol by lactobacillus gasseri strains.J.Dairy Sci.199982243-248.)，進行菌種鑒定，其中可獲得植物乳桿菌ST-III。
本發明的植物乳桿菌ST-III已于2002年12月6日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址中國北京市海淀區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所)保藏，并收到保藏登記號CGMCC No.0847。
該植物乳桿菌ST-III(CGMCC No.0847)的微生物學特性示于表1。
表1植物乳桿菌ST-III的微生物學特性
上述操作均在無菌條件下進行。
本發明的植物乳桿菌ST-III除具有一般乳桿菌的有益作用外，將該菌株應用于調節血脂方面，如開發功能性的乳制品，作為人類膳食補充劑，還起到輔助降低人們血清膽固醇濃度的功效。
通過借助以下實施例將更詳細說明本發明。以下實施例僅為說明性的，本發明并不受這些實施例限制。
本發明的植物乳桿菌ST-III已于2002年12月6日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，并收到保藏號CGMCCNO.0847。
實施例3LBS平板分離取泡菜汁和苜蓿汁，根據實施例2中所測定的結果，無菌條件下用PBS緩沖溶液(pH6.8)梯度稀釋，吸取合適的稀釋度溶液(每毫升含有100個左右細菌)100微升涂布于LBS平板，平板倒置放入厭氧培養箱，37℃厭氧培養36-72小時，觀察菌落生長情況，平板4℃保存。
實施例4菌株鏡檢無菌操作，接種環挑取實施例3所得典型菌落培養物，涂于載玻片，制片并革蘭氏染色，油鏡觀察菌體形態，挑取革蘭氏陽性細菌作為目的菌株。
實施例5菌株平板純化無菌條件下，接種環挑取實施例4所初步確定的目的菌落，在MRS平板上劃線分離，37℃倒置厭氧培養24-36小時，挑取單菌落進行鏡檢，直至確定所得的菌株已經純化。
實施例6菌株的增菌過程挑取實施例5所得的理想單菌落，轉接到1毫升MRS液體，37℃靜置培養24小時左右，再按1％(體積比)的接種量將培養液轉接到新的MRS液體，37℃靜置培養24小時，再在液體MRS中重復擴增2次，所得培養液4℃保存。
實施例7以體外模型初步篩選具有降膽固醇功能的益生菌15毫升無菌具塞離心管加入10毫升以無菌雞蛋黃液為膽固醇源的高膽固醇培養液MRSO-CHOL，按1％(體積比)的接種量接入實施例6獲得的新鮮的菌株，37℃培養24小時。培養液12,000×g離心10分鐘，按照鄰苯二甲醛測定膽固醇的方法測定上清夜中膽固醇的含量，以未接種的MRSO-CHOL作為對照，計算出各個實驗菌株對膽固醇的降低率(S.E.Glliland，C.R.Nelson，C.Maxwell.Applied and EnviromentalMicrobiology，1985，49377～381.)，從中選出具有較好的降低膽固醇功效的菌株，結果見表2。
膽固醇的降低率計算公式為D=C-AC×100%]]>其中A為各實驗菌株發酵上清液OD550nm[波長550nm(納米)處的吸收光度值]；C為空白對照的OD550nm；D為膽固醇降低率。
表2降膽固醇益生乳酸菌初步篩選結果膽固醇降低率 菌株數 比例 來源(％) (株)(％) 泡菜 腌制苜蓿40以上 6 9.09 4 230-40 9 13.64 5 220-30 13 19.70 2 820以下 38 57.28 12 16其中，ST-III具有最高的膽固醇降低率，達到47.68％，對應的膽固醇降低量為244.84微克/毫升。另外還有5株菌株的膽固醇降低率在40％以上。
實施例8ST-III菌種鑒定該ST-III的微生物學特性如上述表1示。
實施例9菌體懸浮液制備方法將本發明的植物乳桿菌ST-III(CGMCC No.0847)接入MRS液體，32℃靜置培養16小時，計數；根據計數結果用脫脂奶做適當的稀釋、懸浮得到如表3中所需的菌液濃度。ST-III死菌懸浮液制備方法懸浮108cfu/ml(每毫升中所含菌體個數)ST-III脫脂奶置于100℃水浴加熱15分鐘，冷卻，冰箱保存待用。
應用實施例降血清膽固醇功能性實驗(體內實驗，動物實驗)動物模型在益生乳酸菌降低血清膽固醇功能性實驗研究中得到越來越廣泛的應用(鄭建仙.功能性食品(第三卷).北京中國輕工業出版社，1999.9.408-412.)。高脂高膽固醇飼料誘發動物脂代謝紊亂，血脂水平發生變化血清膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平以及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量升高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量降低。降血清膽固醇功能性實驗通常做法是，飼喂高脂高膽固醇飼料的同時，飼喂實驗動物實驗樣品，通過測定動物血清脂類含量的變化來確定實驗樣品對動物血脂的影響效果。
本發明篩選得到的益生乳酸菌是植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)ST-III(CGMCC No.0847)，該菌株在體外實驗中具有較高的降低膽固醇濃度的能力。
本發明采用SD大鼠，在常規飼料中添加重量比為1％的膽固醇、5％的豬油和0.25％的豬膽鹽來誘發SD大鼠高膽固醇血癥。同時飼喂懸浮植物乳桿菌的脫脂牛奶，最后檢測SD大鼠血清膽固醇等血脂含量，來判斷該菌株是否具有降低血清膽固醇的功效。
1、實驗動物和動物房條件雄性SD大鼠(8周齡)，64個。常規飼料喂養3天，隨機分成8組，每組8個，分籠喂養。
動物房條件溫度22±2℃，濕度56±5％，1周換2-3次鋸末。控制12小時光照，12小時黑暗。
飼料常規飼料由中科院上海實驗動物中心提供；高膽固醇飼料常規飼料添加重量比為1.0％的膽固醇，5％的豬油以及0.25％豬膽酸鹽，委托中科院上海實驗動物中心加工；所有的飼料進動物房前輻射滅菌。
2、益生乳酸菌ST-III功能性動物實驗方法(1)實驗動物分組和飼喂安排64只SD大鼠隨機分成8組，飼喂不同的飼料和菌體懸浮液，具體的分組如表3所示。
表3實驗動物分組和飼喂計劃實驗分組a日常飼喂b灌胃3毫升/個/天1.空白對照 常規飼料+水 水2.高脂對照 高脂飼料+水 水3.高脂SKMc對照高脂飼料+水 SKM4.L.bulgaricusd對高脂飼料+水 懸浮2.5×108cfu/ml L.bulgaricus的SKM照5.L.acidophiluse對高脂飼料+水 懸浮2.5×108cfu/ml L.acidophilus的SKM照6.ST-III活菌高 高脂飼料+水 懸浮2.5×108cfu/ml活菌ST-III的SKM7.ST-III活菌低 高脂飼料+水 懸浮2.5×106cfu/ml活菌ST-III的SKM8.ST-III死菌 高脂飼料+水 懸浮2.5×108cfu/ml死菌ST-III的SKM注a每組8個SD大鼠b飼喂實驗共持續21天
cSKM——滅菌10％脫脂奶dL.bulgaricus——保加利亞乳桿菌eL.acidophilus——嗜酸乳桿菌(2)實驗動物的日常管理和飼喂SD大鼠按表3隨機分成1-8個組別，除空白對照組1飼喂常規飼料外，2-8組均飼喂高脂飼料。按照表3中方案，每日上午8點對SD大鼠灌胃3毫升/個/天，記錄每日飼料消耗量，實驗開始和結束稱量大鼠的體重。
(3)大鼠血清采集和血脂和血清總膽酸濃度的檢測21天飼喂實驗結束后，禁食12小時，乙醚深度麻醉，摘眼球取血，裝入無菌離心管，離心(3000×g，10分鐘)收集血清，送上海華山醫院檢驗中心測定血清中總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，和以及總膽酸(TBA)的含量。
(4)統計分析同組數據單因素方差分析。
不同組之間t檢驗，p＜0.05差異有統計學意義，p＜0.01和p＜0.001差異有高度的統計學意義。
3、結果分析(1)大鼠血清TC和TG濃度的測定結果21天飼喂實驗結束后，禁食12小時，收集大鼠血清，送上海華山醫院進行血清脂類分析，測定TC、TG、HDL-C、LDL-C和TBA含量。具體結果見表4和表5。
表4大鼠血清TC和TG含量測定實驗分組aTC(mmol/L) TG(mmol/L)1 1.4±0.29 0.68±0.202 2.64±0.36 0.99±0.103 2.56±0.23 0.97±0.194 2.36±0.29 0.90±0.325 2.27±0.21*0.98±0.226 2.01±0.30**0.80±0.257 2.26±0.23*0.93±0.358 2.39±0.24 0.86±0.08注a實驗分組見表3組4-8分別和組3進行t檢驗*p＜0.05差異有統計學意義，**p＜0.01差異有高度的統計學意義。
比較表4中的空白對照組1和高脂對照組2的TC和TG含量，可以看出，組2的TC和TG含量分別比組1的高88.57％和45.59％，差異有高度的統計學意義(p＜0.001)和有統計學意義(p＜0.05)。由此本實驗中，飼喂高脂飼料可以誘發大鼠高TC和TG水平，符合文獻的報道和實驗要求。
組3和組2相比，TC和TG含量分別下降了3.03％和2.02％，差異無統計學意義(p＞0.05)，本實驗證實SKM對TC含量沒有降低效果。和組3相比較，飼喂菌體的組4-8中，組6的TG含量最低，比組3下降了17.52％，但是差異無統計學意義(p＞0.05)，其它4組的TG含量和組3相比差異也沒有統計學意義(p＞0.05)。可能飼喂菌體對大鼠TG含量的降低沒有明顯的影響。
就TC而言，飼喂SKM懸浮L.bulgaricus的組4及ST-III死菌組8和飼喂SKM的高脂對照組3相比，分別下降了7.81％和6.64％，差異無統計學意義(p＞0.05)；而和組3相比，飼喂SKM懸浮L.acidophilus的組5和ST-III活菌低的組7的大鼠TC含量分別下降了11.33％和11.72％，差異有統計學意義(p＜0.05)，飼喂ST-III活菌高的組8大鼠TC含量下降了21.48％，差異有高度的統計學意義(p＜0.01)。組6比組7多降低了11.06％的TC含量。可見本發明的ST-III具有降低TC的功效。
(2)飼喂ST-III菌體對大鼠HDL-C和LDL-C的影響如表5是實驗大鼠HDL-C和LDL-C測定結果。
表5大鼠HDL-c和LDL-c含量的測定實驗分組aHDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L)AIb11.02±0.21 0.32±0.14 0.3220.75±0.10 1.54±0.29 2.0530.79±0.10 1.51±0.22 1.9340.90±0.12 1.15±0.32*1.30**51.05±0.25*1.04±0.16***1.06***60.91±0.07*0.94±0.24**1.03***70.94±0.12*1.13±0.22**1.21**81.09±0.20**1.10±0.28**1.07***注組4-8分別和組3進行t檢驗*p＜0.05差異有統計學意義，**p＜0.01，***p＜0.001差異有高度的統計學意義a實驗分組見表3；bAI-動脈粥樣硬化危險因子，AI＝LDL-C/HDL-C從表5中可以看出，高脂對照組2的HDL-C含量比空白對照組1的下降26.47％，差異有統計學意義(p＜0.05)，LDL-C含量上升了381.25％，差異有高度的統計學意義(p＜0.001)，動脈粥樣硬化因子AI上升了540.62％，差異有高度的統計學意義(p＜0.001)。可以看出，高脂飼料誘發了大鼠的脂蛋白代謝紊亂，HDL-c含量下降和LDL-c含量升高，而且AI危險因子值升高非常明顯。
組3飼喂SKM的大鼠血清HDL-C和LDL-C含量分別比高脂對照組2升高5.33％和降低了1.95％，差異無統計學意義(p＞0.05)，AI因子差別也無統計學意義。說明SKM對脂蛋白代謝沒有調節作用。
組4大鼠血清HDL-C含量和LDL-C含量分別比高脂SKM對照組3升高13.92％和降低23.84％，但是差異無統計學意義(p＞0.05)。說明L.bulgaricus對大鼠的脂蛋白代謝沒有影響。
組5大鼠血清HDL-c含量比組3高32.91％，差異有統計學意義(p＜0.05)，LDL-C含量比組2低31.12％，差異有高度的統計學意義(p＜0.01)；并且AI因子降低了45.08％(p＜0.001)，差異也有高度的統計學意義。說明L.acidophilus具有升高大鼠HDL-C和降低LDL-C含量的功效。
飼喂SKM懸浮的108cfu/ml濃度ST-III活菌高組6的大鼠血清HDL-C含量比組3升高了15.19％，差異有統計學意義(p＜0.05)，LDL-C含量分別降低了37.75％，差異有高度的統計學意義(p＜0.01)；同時AI因子下降了46.63％，差異也有高度的統計學意義(p＜0.001)。
飼喂SKM懸浮的106cfu/ml濃度ST-III活菌低組7的大鼠血清HDL-C含量比組3升高了18.98％，差異有統計學意義(p＜0.05)，LDL-C含量降低了37.75％，差異有高度的統計學意義(p＜0.01)；同時AI因子下降了46.63％，差異有高度的統計學意義(p＜0.001)。
飼喂SKM懸浮的108cfu/ml濃度ST-III死菌組8的大鼠血清HDL-C含量比組3升高了37.98％，差異有高度的統計學意義(p＜0.01)，LDL-C含量下降了27.15％，差異有高度的統計學意義(p＜0.01)；同時AI因子下降了44.56％，差異有高度的統計學意義(p＜0.001)。
組6，組7和組8的實驗結果說明，ST-III活菌和死菌對大鼠血清脂蛋白代謝具有調節作用，可以升高HDL-C含量，降低LDL-C含量。比較發現，菌體量升高，效果明顯。
權利要求
1.一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)ST-III CGMCC NO.0847。
2.權利要求1所述的植物乳桿菌在調節血脂方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ST－IIICGMCC NO.0847，及其在調節血脂方面的應用。
文檔編號A23C9/12GK1467290SQ0311637
公開日2004年1月14日 申請日期2003年4月11日 優先權日2003年4月11日
發明者蔣能群, 孫立國, 郭本恒 申請人:上海光明乳業股份有限公司