專利名稱：一種重組嗜甲醇酵母的發酵方法
技術領域：
本發明涉及一種重組嗜甲醇酵母發酵的改進方法。
畢赤酵母(Pichia pastoris)表達體系是近十年來發展起來的真核表達體系。畢赤酵母的醇氧化酶(Alcohol Oxidase，AOX)基因的強啟動子特別適合于外源基因的表達調控。畢赤酵母培養基成分明確，不含熱源或毒素，作為誘導劑和碳源的甲醇價格低廉，適宜于高密度發酵大規模生產藥用蛋白。根據利用甲醇的能力，整合外源基因的方法，重組畢赤酵母可劃分為3種表型。對于含有完整AOX1和AOX2基因的Pichia pastoris菌株，在含有甲醇的培養基中生長速率與野生型類似，稱為甲醇利用正表型(Mut+)。當aox1被外源基因取代，則甲醇代謝需依賴AOX2，AOX2與AOX1有97％的同源性，但甲醇代謝速度慢，稱為甲醇利用慢表型(MutS)。當AOX基因全部缺失，不能利用甲醇，稱為甲醇負表型(Mut-)。后二者表達外源蛋白有時優于Mut+型，且消耗甲醇較少。三種表型菌株在AOX1啟動子調控下均可誘導異源蛋白的表達。
重組畢赤酵母的高菌體密度發酵過程一般為三個階段首先是分批發酵階段，菌體利用培養基中的甘油生長；其次為甘油完全消耗后進入補料發酵階段，流加甘油進一步提高菌體濃度；最后是外源基因誘導表達階段，流加甲醇誘導外源基因的表達。由于具有MutS表型的畢赤酵母在以甲醇為唯一碳源時生長緩慢，所以在表達階段常采用混合碳源流加的方式，即流加甲醇的同時流加易被其代謝的其它碳源，以使菌體維持一定的生長。甘油—甲醇是常用的混合碳源組合，其中甲醇既是誘導劑又是碳源，甘油作為主要碳源。由于甲醇傳感器的發明和應用，甲醇的流加可實現反饋控制，發酵液中的甲醇濃度可以穩定地控制在需要的水平；由于甘油對AOX1啟動子有嚴重的阻遏作用，甘油的代謝產物乙醇也會阻遏AOX1啟動子，所以在流加甘油—甲醇混合碳源時，必須嚴格控制甘油的流加，避免發酵液中出現殘余甘油；甘油的在線檢測尚未解決，也增加了控制甘油流加的難度。因此，這些不利因素影響了甘油—甲醇混合碳源流加的效果，也限制了MutS表型畢赤酵母的應用。鑒于上述原因，山梨醇作為一種非阻遏碳源被廣泛地用在誘導表達階段的混合碳源中代替甘油，例如文獻Biotechnol.Lett.1999，21669-672中，在誘導表達階段流加山梨醇—甲醇混合碳源，蛋白的比生產速率比流加甘油—甲醇混合碳源時的提高了33％，但由于山梨醇的細胞得率較甘油低，最終的蛋白產量差別不大。因此，開發更為有效的非阻遏碳源用于畢赤酵母發酵的誘導表達階段，對提高Pichiapastoris表達異源蛋白的能力是十分重要的。
根據上述構思，發明人提出如下技術方案本發明所說的重組嗜甲醇酵母的發酵方法，依次包括培養基發酵、補料發酵和外源基因誘導表達三階段，其特征在于，在所說的外源基因誘導表達階段中的碳源含有C2-C3的有機酸(如乳酸或乙酸)和甲醇，所說的碳源中有機酸流加速率可以根據發酵罐中的溶氧變化情況進行調節(見文獻Biotechnol.Lett.2003，25(2)173-177)。在所說的外源基因誘導表達階段中其它培養條件均為同技術領域中一般技術人員所熟知的現有技術，在此不再贅述。為更好控制外源基因誘導表達階段中的pH值，可采用C2-C3的有機酸鹽替代部分有機酸。
本發明的優點在于克服了現有技術中使用甘油—甲醇混合碳源時甘油及其代謝產物乙醇等對AOX1啟動子的阻遏而導致重組基因表達量低、發酵過程中碳源流加控制困難等問題，使重組基因表達量得以很大程度的提高。
1mL甘油冷凍菌種保藏管融化后，取0.7mL種液接入裝有25mL BMGY培養基(1L含YNB 13.4g，甘油10mL，生物素0.4mg，1mol/L pH6.0磷酸緩沖溶液100mL，Yeast Extract 10g，Polypepton 20g)的250mL的搖瓶中，于250rpm，30℃搖床培養14h，得一級種子。250mL搖瓶中裝入25mL搖瓶發酵培養基(1L含甘油5g，(NH4)2SO42g，CaSO40.06g，K2SO41.2g，MgSO4·7H2O 1g，生物素0.2mg，1mol/L pH6.0磷酸緩沖溶液100mL)，接入5mL一級種子，于250rpm，30℃搖床培養12-14h至培養基中的甘油被消耗，同時加入3g/L甲醇及一定量碳源。所選用碳源為甘油，山梨醇，乳酸，乙酸銨，乙酸鈉，其中甘油和山梨醇為參照組。由于乙酸的加入會導致發酵液的pH有較大改變，所以使用乙酸銨和乙酸鈉。碳源的加入量與5g/L甘油碳原子摩爾數相等，每種碳源都有三個搖瓶平行試驗，于250rpm，30℃搖床培養8h。取樣測定菌體濃度(采用濁度法，發酵液經稀釋后于波長600nm測光密度OD600，1OD600相當于菌體干重0.36g/L)。發酵液6000rpm離心10min后采用ELISA方法測定發酵上清液中血管生長抑制素的濃度。結果見表1。
表1五種碳源對菌體生長及蛋白表達的影響碳源 甘油山梨醇乳酸乙酸銨乙酸鈉OD60019.517.1 13.716.9 16.5血管生長抑制素(mg/L) 0.432.65 0.611.65 1.59實施例2將如實施例1中所述的一級種子分別接于三個裝有50mL BMGY培養基的500mL搖瓶中，于250rpm，30℃搖床培養7-8h，得二級種子。將二級種子接種于5-L發酵罐中的BSM培養基(1L含85％磷酸26.7mL，CaSO40.93g，K2SO418.2g，MgSO4·7H2O 14.9g，KOH 4.13g，甘油40g，PTM1溶液4.35mL。1L PTM1含CuSO46.0g，KI 0.8g，MnSO43.0g，Na2MoO40.2g，H3BO30.2g，CoCl20.5g，ZnCl220.0g，FeSO4·7H2O 65.0g，生物素0.2g，硫酸5mL)中，接種后體積為2.5L(接種量7％)，溫度30℃，通氣量4mL/min下培養。通過自動流加5MKOH調節pH5.0，手動調節攪拌轉速維持溶氧不低于20％。甘油耗盡后，饑餓0.5h開始流加50％(w/w)甘油(每升含12mL PTM1溶液)，菌體密度達64g/L時停止流加甘油，饑餓0.5h后開始誘導重組蛋白表達，流加甲醇(每升加12mLPTM1溶液)，發酵罐中的甲醇濃度由甲醇檢測控制系統(見文獻無錫輕工大學學報，2003，22(1)12-15)維持在5g/L；同時流加28.7％(w/w)乙酸銨(每升加12mL PTM1溶液)，乙酸銨流加速率由48h的3mL/h逐漸提高到78.8h的7mL/h并至發酵結束，并用50％(v/v)乙酸維持pH5.0。采用乙酸銨—乙酸流加系統時，加入的乙酸銨的CH3COO-被菌體作為碳源而代謝，其消耗造成殘余在發酵液中的NH4+引起pH上升，從而加入乙酸維持pH恒定。乙酸不僅是pH調節劑，同時也是碳源。菌體濃度和蛋白表達量的測定同實施例1。經55h誘導(全部發酵時間為111.5h)，菌體濃度達到125g/L，血管生長抑制素的表達水平達到51.5mg/L，平均比生產速率0.01mg/gh。在蛋白誘導表達階段采用乙酸銨(乙酸)—甲醇混合碳源，在5-L發酵罐中發酵水平與采用山梨醇—甲醇混合碳源相當。
實施例3菌體生長階段的發酵過程如實施例2中所述，進入誘導表達階段后，流加甲醇(每升加12mL PTM1溶液)，發酵罐中的甲醇濃度由甲醇檢測控制系統維持在5g/L；同時流加51％(w/w)乳酸(每升含12mL PTM1溶液)，乳酸流加速率由49.1h的5.7g/h逐漸提高到102.6h的21.8g/h并至發酵結束，用14％(v/v)氨水調節pH5.0。經64.5h誘導(全發酵時間為113h)，菌體濃度達到87g/L，血管生長抑制素的表達水平達到191mg/L，平均比生產速率達到0.04mg/g·h。誘導階段采用不同碳源和甲醇混合碳源發酵生產血管生長抑制素的結果見表2，采用乳酸—甲醇混合碳源時重組蛋白表達水平較采用甘油—甲醇混合碳源和山梨醇—甲醇混合碳源有較大提高。
表2誘導表達階段流加混合碳源發酵結果表達時間 血管生長抑制素 菌體濃度 碳源*用量/甲醇用量 平均比生產速率混合碳源(h)(mg/L)(g/L) (w/w) (mg/g·h)甘油—甲醇 102108 1651.50.02山梨醇—甲醇 65 54.6 1051 0.01乙酸銨—甲醇 55 51.5 1254 0.01乳酸—甲醇 64.5 191 87 1.80.04*所指碳源為混合碳源中甲醇以外的碳源。
根據本發明公開的技術方案和實施例，有關的工程技術人員可以方便地將本發明所述的重組畢赤酵母發酵過程控制方法用于其它重組畢赤酵母特別是具有MutS表型的重組畢赤酵母表達生產其它外源蛋白的發酵過程中。
權利要求
1.一種重組嗜甲醇酵母的發酵方法，依次包括在基礎培養基中的分批發酵、流加甘油的補料發酵和外源基因誘導表達三階段，其特征在于，在所說的外源基因誘導表達階段中的碳源含有C2-C3的有機酸和甲醇。
2.如權利要求1所述的發酵方法，其特征在于，其中所說的有機酸為乳酸。
3.如權利要求1所述的發酵方法，其特征在于，在所說的外源基因誘導表達階段中的碳源還含有C2-C3的有機酸鹽。
4.如權利要求3所述的發酵方法，其特征在于，其中所說的有機酸鹽為C2-C3的有機酸銨鹽。
5.如權利要求4所述的發酵方法，其特征在于，其中所說的有機酸為乳酸，所說的有機酸鹽為乳酸銨。
全文摘要
本發明涉及一種重組嗜甲醇酵母(特別是巴斯德畢赤酵母)發酵的改進方法，即在重組嗜甲醇酵母發酵生產外源基因產物的誘導表達階段流加短碳鏈有機酸—甲醇混合碳源以促進菌體的生長和誘導外源基因的表達，克服了使用甘油—甲醇混合碳源時甘油及其代謝產物乙醇等對AOX1啟動子的阻遏而導致重組基因表達量低、發酵過程中碳源流加控制困難等問題。采用短碳鏈有機酸替代甘油后，重組基因表達量得以很大程度的提高。
文檔編號C12N1/16GK1446906SQ0311603
公開日2003年10月8日 申請日期2003年3月27日 優先權日2003年3月27日
發明者葉勤, 謝靜莉 申請人:華東理工大學