專(zhuān)利名稱(chēng)：番杏的Na的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域中的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及番杏的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鹽害是農(nóng)作物產(chǎn)量的嚴(yán)重限制因素。了解植物的抗鹽機(jī)理，克隆抗鹽基因并轉(zhuǎn)移到鹽敏感的農(nóng)作物中，培育抗鹽的轉(zhuǎn)基因作物新品種，對(duì)于有5億多畝鹽荒地的我國(guó)來(lái)說(shuō)，具有十分重要的意義。
植物為了抵御鹽脅迫，形成了一系列的適應(yīng)機(jī)制，主要是通過(guò)在細(xì)胞質(zhì)中積累小分子的無(wú)毒有機(jī)溶質(zhì)和離子在液泡內(nèi)區(qū)隔化來(lái)實(shí)現(xiàn)滲透平衡。高等植物細(xì)胞液泡占完全膨脹細(xì)胞總體積的95％，對(duì)于植物來(lái)說(shuō)Na+是細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的基本營(yíng)養(yǎng)成分，Na+的區(qū)隔化是它在鹽環(huán)境中生存的必要保障。Na+/H+逆向運(yùn)輸?shù)鞍?antiporter)是一種Na+的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體，在細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜上均有分布，液泡膜上的Na+/H+antiporter將細(xì)胞質(zhì)中的Na+逆著Na+濃度梯度運(yùn)送到液泡中區(qū)隔化集中，細(xì)胞質(zhì)膜上的Na+/H+antiporter將細(xì)胞質(zhì)中的Na+逆向運(yùn)送到胞外高Na+環(huán)境中，從而減少了鈉離子對(duì)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器的毒害，對(duì)于維持細(xì)胞的滲透平衡起重要作用。
植物中Na+/H+antiporter最早發(fā)現(xiàn)是在大麥質(zhì)膜上，此后在質(zhì)膜和液泡膜上均有研究報(bào)道，到目前已經(jīng)在大量的鹽生植物及非鹽生植物中發(fā)現(xiàn)Na+/H+antiporter活力。已經(jīng)從擬南芥(AtNHX1)、水稻(OsNHX1)、北濱藜(AgNHX1)、冰葉午時(shí)花(McNHX1)分離了Na+/H+antiporter基因，證明該基因的表達(dá)產(chǎn)物具有Na+/H+交換的功能。雖然這些基因絕大多數(shù)是從具有低逆向運(yùn)輸活力的甜土植物中分離的，但前人的研究表明鹽生植物普遍具有在液泡中高效區(qū)隔化Na+的機(jī)制。對(duì)鹽生植物Na+/H+antiporter基因只在北濱藜和堿蓬有過(guò)研究，而后者中的工作未見(jiàn)正式發(fā)表。
耐鹽性屬?gòu)?fù)雜性狀，大量的鹽脅迫反應(yīng)相關(guān)基因的存在也支持這個(gè)觀點(diǎn)。但單一基因一般不能顯著提高作物的耐鹽水平，需要多個(gè)耐鹽基因的協(xié)同作用植物才能具有高耐鹽性。然而轉(zhuǎn)AtNhx1基因的擬南芥植株在200mM NaCl中能正常生長(zhǎng)發(fā)育。將擬南芥的AtNhx1基因轉(zhuǎn)入番茄中，過(guò)量表達(dá)液泡Na+/H+antiporter的轉(zhuǎn)基因番茄在200mM NaCl脅迫下能夠正常生長(zhǎng)、開(kāi)花和結(jié)實(shí)。盡管葉片中Na+濃度高，但番茄果實(shí)中Na+濃度很低。說(shuō)明轉(zhuǎn)Na+/H+antiporter單基因能夠明顯提高植物耐鹽性，同時(shí)，具有器官表達(dá)的特異性，有力支持了Na+/H+antiporter在植物耐鹽性方面所具有的重要作用。
番杏是一年生的肉質(zhì)草本植物，有較強(qiáng)的耐鹽性，原產(chǎn)于澳大利亞、東南亞和智利等地，我國(guó)現(xiàn)亦有栽培，其嫩莖葉可作蔬菜食用。但對(duì)番杏的耐鹽機(jī)制尚未從分子水平加以研究。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供番杏Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的番杏Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)源于番杏(Tetragoniatetragonioides O.)，名稱(chēng)為T(mén)tNHX1，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2氨基酸殘基序列是由554個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
根據(jù)GenBank中Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白保守的氨基酸序列設(shè)計(jì)合成了2個(gè)簡(jiǎn)并性引物，P15′-ATTGG(T/A)GCAAT(A/C)TT(C/T)GCTGC-3′；P25’-TCTCAAT(A/g)TCCA(A/g)(T/g/A)gCATCC-3’，通過(guò)RT-PCR及RACE方法從鹽生植物番杏中克隆Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。
番杏Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因TtNHX1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由2199b個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第92位到第1756位堿基。
番杏Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆，有利于在分子水平上進(jìn)一步研究逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特征。對(duì)鹽生植物與非鹽生植物、質(zhì)膜型與液泡型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行比較分析，可進(jìn)一步在細(xì)胞和分子水平上明確植物的抗鹽機(jī)制。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的編碼番杏Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TtNHX1的基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對(duì)高鹽脅迫耐受力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株，以培育出抗鹽的轉(zhuǎn)基因作物新品種，使其正常生長(zhǎng)在鹽漬土地上，對(duì)于擁有5億多畝鹽荒地的我國(guó)來(lái)說(shuō)，這種措施的經(jīng)濟(jì)效益是十分可觀的。而且未來(lái)農(nóng)業(yè)的發(fā)展面臨著人口增多，可耕地減少的挑戰(zhàn)，充分利用鹽堿地將發(fā)揮巨大作用。
番杏TtNHX1與AtNHX1、AgNHX1等液泡型逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有高度同源性，系統(tǒng)發(fā)育分析也表明TtNHX1與液泡型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源性高于質(zhì)膜型的。因此TtNHX1的功能可能是跨液泡膜運(yùn)輸Na+，將其在液泡中積累。哺乳動(dòng)物中氨氯吡嗪嘧結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)識(shí)別出來(lái)為163DVFFLFLLPPI173，氨氯吡嗪嘧抑制Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活力。番杏中這個(gè)區(qū)域的序列為85LFFIYLLPPI94，與AtNHX1，OsNHX1和NHX高度同源，因此對(duì)于番杏TtNHX1的研究還便于更好地比較鹽生植物與甜土植物逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的不同。
圖1為Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cDNA克隆圖2為Southern blot分析結(jié)果圖3為Northern blot分析結(jié)果圖4為番杏(TtNHX1)疏水性分析圖5為植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列圖6為Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析圖7為200mM NaCl誘導(dǎo)不同時(shí)間番杏中TtNHX1的表達(dá)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、番杏的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的克隆具體實(shí)驗(yàn)步驟如下(1)RNA和DNA的分離用Trizol試劑盒(GIBCO-BRL)從番杏(Tetragonia tetragonioides O.)幼苗(播種在蛭石中，生長(zhǎng)在溫室條件下)中提取RNA，隨后用無(wú)RNase的DNase(TaKara)除去RNA中殘留的DNA。
DNA提取采用CTAB方法。
(2)番杏Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cDNA片段的分離根據(jù)北濱藜、堿蓬、柑桔中Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白保守的氨基酸序列合成簡(jiǎn)并性引物，P15′-ATTGG(T/A)GCAAT(A/C)TT(C/T)GCTGC-3′；P25′-TCTCAAT(A/g)TCCA(A/g)(T/g/A)gCATCC-3′。
為了分離cDNA片段，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)合成第一鏈cDNA。RT-PCR反應(yīng)混合物為25μl，含有2μl cDNA模板，0.8mmol/L dNTPs，0.6μmol/L的每條引物，1×PCR緩沖液，1U Taq DNA polymerase(Promega)。PCR反應(yīng)程序95℃，4min；95℃30sec，50℃30sec，72℃1min，共36個(gè)循環(huán)；72℃10min。得到一個(gè)約500bp的cDNA片段(圖1(b))。將其與PGEM T-easy載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落，提質(zhì)粒，Not I酶切質(zhì)粒鑒定插有預(yù)期大小片段(500bp)的陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，獲得了535bp的cDNA片斷，用blast比對(duì)番杏cDNA片段，發(fā)現(xiàn)這個(gè)cDNA片段與已克隆的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因具有較高的同源性，說(shuō)明獲得的番杏cDNA片斷是Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的片段。
(3)番杏Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cDNA末端的分離根據(jù)已克隆的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cDNA片段的序列合成基因特異引物3-GSP15′-CATGGCATAACGTGACTGAGAGC-3′；3-GSP25′-TGAGAGCTCAAGAGTAACCACCAAG-3′；5-GSP15′-GGCATTGAAAAGCACCACTG-3′；5-GSP25′-CTACACCTTCCCCAAACACCAGACT-3′；5-GSP35′-ACTGTATAGCAAAGGTGTCTCGTCC-3′。
通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增(GIBCO-BRL)分離Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cDNA的3′末端和5′末端。用基因特異引物3-GSP1、3-GSP2和3′RACE，5-GSP1、5-GSP2、5-GSP3和5′RACE試劑盒分離cDNA3′末端和5′末端。用5′RACE和3′RACE方法克隆了cDNA5′末端序列(圖1(a))和3′末端序列(圖1(c))，測(cè)序結(jié)果顯示5′和3′端片段的長(zhǎng)度分別為628bp和1221bp，它們與中間535bp cDNA片段相應(yīng)末端分別有81bp和104bp的重疊區(qū)，將這3個(gè)片段拼接，得到一個(gè)全長(zhǎng)2199bp番杏Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的全長(zhǎng)cDNA(圖1(d))，為序列表中的序列1。
實(shí)施例2、番杏Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cDNA全序列分析按拼接的序列設(shè)計(jì)特異引物，用常規(guī)RT-PCR方法克隆番杏Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白全長(zhǎng)cDNA，對(duì)其測(cè)序驗(yàn)證拼接是準(zhǔn)確的。該cDNA包括1665bp的開(kāi)放讀碼框(Open ReadingFram，ORF)，91個(gè)堿基的5′非翻譯區(qū)(Non Translated Region，NTR)，412個(gè)堿基的3′非翻譯區(qū)和31個(gè)堿基的多聚腺苷酸尾。在5′非翻譯區(qū)+59位置有一個(gè)終止密碼子(TAG)，而且與編碼區(qū)的讀碼框相吻合，這說(shuō)明不存在其它更前的起始密碼子，表明這個(gè)cDNA是全長(zhǎng)的，將其命名為T(mén)tNHX1。此cDNA編碼一個(gè)554個(gè)氨基酸的多肽，見(jiàn)序列表中的序列2，推測(cè)分子量為61.2KD。
實(shí)施例3、Southern blot分別用Dra I，Xsp I，HaeIII酶切40μg番杏基因組DNA，這三種酶在克隆的535bpcDNA片段上沒(méi)有酶切位點(diǎn)。完全酶切的DNA經(jīng)1.2％的瓊脂糖電泳分離后，轉(zhuǎn)移到HybondN+尼龍膜上，按Random Primer DNA labeling Kit Ver.2(TaKaRa，Japan)的方法用[32P]dCTP標(biāo)記的725bp cDNA片段做探針進(jìn)行雜交分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上述3種酶切的DNA中Dra I，Xsp I有2個(gè)DNA片段雜交，如圖2所示，HaeIII有3個(gè)DNA片段雜交，表明番杏基因組有兩到三個(gè)拷貝的TtNHX1。圖2中的泳道1、2、3分別表示用Dra I，XspI，HaeIII酶切番杏基因組DNA的Southern blot雜交斑點(diǎn)。
實(shí)施例4、Northern blot按照常規(guī)方法進(jìn)行Northern blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示，表明TtNHX1的表達(dá)具有組織特異性，在番杏的根、莖和葉中均有表達(dá)，而花中沒(méi)有表達(dá)。經(jīng)NaCl誘導(dǎo)后根、莖和葉中的表達(dá)量增加，而花中仍沒(méi)有表達(dá)。圖3(a)為未經(jīng)誘導(dǎo)的番杏mRNA Northernblot雜交斑點(diǎn)，圖3(b)為經(jīng)NaCl誘導(dǎo)后的番杏mRNA Northern blot雜交斑點(diǎn)，泳道1、2、3、4分別表示根、莖、葉和花中提取的mRNA Northern blot雜交斑點(diǎn)。
實(shí)施例5、TtNHX1序列分析用常規(guī)方法進(jìn)行的疏水性分析表明TtNHX1具有12個(gè)跨膜區(qū)(如圖4所示)。TtNHX1的氨基酸序列與已克隆的其它Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有很高的同源性，TtNHX1的跨膜區(qū)與其它Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜區(qū)相似性較高。TtNHX1中85LFFIYLLPPI94是高度保守的，這是Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活力的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑氨氯吡嗪嘧的結(jié)合位點(diǎn)(如圖5所示)。圖5中加黑部分是一致性的氨基酸，框起來(lái)的是氨氯吡嗪嘧結(jié)合位點(diǎn)。AgNHX1，AtNHX1，CNHX1，OsNHX1和TaNHX1 GenBank登陸號(hào)分別為BAB11940，AAF21755，AAK27314，BBA83337，AAK76737。
為了分析不同Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的遺傳關(guān)系，發(fā)明人進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，用DNAMAN對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析。從GenBank中查找一些有代表性的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列，分析TtNHX1與它們的關(guān)系。TtNHX1與液泡型的Na+/H-逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的親緣近，有AgNHX1，cNHX1，AtNHX1，OsNHX1，TaNHX1，和NHXI，AtNHX1的功能是在液泡膜上將Na+區(qū)隔化到液泡中。TtNHX1與AgNHX1屬于同一簇，而TtNHX1和AgNHX1都是鹽生植物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。TtNHX1與質(zhì)膜型的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖6)?？梢钥闯鯰tNHX1是液泡型的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。上述逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸在GenBank登陸號(hào)為AgNHX1(BAB11940)，A.gmelini；OsNHX1(BBA83337)，O.sativa；TaNHX1(AAK76737)，T.aestivum；NHX1(NP-010744)，S.cerevisiae；Nhap(BAA316951)，P.aeruginosa；SOS1(AF256224)，A.thaliana；NhaA(J03879)，E.coli；Sod2(CAA77796)，S.pombe；NHA1(NP-013239)，S.cerevisiae.
實(shí)施例6、TtNHX1的RT-PCR表達(dá)分析用常規(guī)的RT-PCR方法分析TtNHX1的表達(dá)。結(jié)果如圖7所示，TtNHX1在番杏對(duì)照植株中有表達(dá)，經(jīng)NaCl誘導(dǎo)后表達(dá)量增加，鹽處理后TtNHX1在番杏中的轉(zhuǎn)錄物迅速增加，1小時(shí)就可達(dá)到穩(wěn)定水平。說(shuō)明TtNHX1可能執(zhí)行將番杏細(xì)胞質(zhì)中的Na+離子運(yùn)輸?shù)揭号葜械墓δ堋?br>
序列表<160>2<210>1<211>2199<2 12>DNA<213>番杏屬番杏(Tetragonia tetragonioides O.)<400>1caaacataaa aaaatagtcg tatttcgggc acgctgtgga ttaagttatt tgcatatata 60gtggaagtac aaggagttca aaaacacaaa aatggcattt gatttgagct attttgtgag 120caacaagttg ggaatgctgg ccacttctga tcatgcttct gtggtatcta tgaatctgtt 180tgtggcgcta ctgtgtggtt gtatcgtgct cggtcacctt ctcgaggaga atcgttggat 240gaatgagtca attacggctc taattatagg tttgggcact ggagttgtga ttttgctgat 300tagcggcgga aagagttcgc atttgttggt cttcagtgaa gatcttttct tcata1tatct 360tcttccgccg attatattca atgctgggtt tcaggtgaag aagaagcaat ttttccgcaa 420cttcatcaca atcatactgt ttggagctgt gggtacattg atatcattta ccatcatatc 480cctaggtgct atggagttct ttaagaagtt ggacattggt tctctggatt taggcgacta 540ccttgcaatt ggtgcaatat tcgctgcaac cgattctgtt tgcacgttgc aggtgcttaa 600tcaggacgag acacctttgc tatacagtct ggtgtttggg gaaggtgtag ttaatgatgc 660aacatcagtg gtgcttttca atgccatcca gaactttgac ctcacacata ttgatcacag 720aattgcttta cagttcgctg gcaatttcct atatttattt ttcacaagca cgctgctagg 780agcaatgact ggattgctca gtgcgtacat tatcaaaaaa ttgtactttg gaaggcactc 840cactgaccgt gaagttgctc taatgatgct catggcgtat ctatcgtaca tgctcgctga 900actattctat ttgagtggaa ttctgacagt atttttctgt gggattgtaa tgtctcatta 960tacatggcat aacgtgactg agagctcaag agtaaccacc aagcatgctt tcgcaaccct 1020gtcttttgtt gccgagactt tcatctttct atatgtcggc atggatgcat tagacattga 1080gaagtggaga tttgtgagcg atagtcctgg aatatctgtt gctgtgagtt ccatattgct 1140gggtctgctc atgcttggac gagcagcttt tgtttctccc ttgtccttcc taatgaattt 1200cttcaagaaa tctcaagctg aaaaagtcag cttaaggcag caggtgataa tatggtgggc 1260gggtctcatg agaggtgctg tttcgatggc tcttgcttat aatcagttta cgaggtcagg 1320gcacactcaa ctaagaggga atgcaataat gattacgagc actatatctg ttgtccttgt 1380cagcacagtg gtatttggca tactgacaaa gcctcttata ttgttcttgc tgcctcaacc 1440aaaacacttc aatagtacca gcactgtgtc atcggaaaat ttggggagcc caaaatcatt 1500cactttgcca cttcttggta atcaccaaga ctctgaaacg gatatcggaa accatcaaga 1560cagcactgac aggggtcttg gccggcccag cagcctgcgc atgcttctaa atgcgccaag 1620ccacacagtt caccactact ggcgcaaatt cgataacgct tttatgcggc ctgtatttgg 1680tggacgaggt ttcgtacctt atgtcccagg ctcacctaca gaacagagca ccaacaattt 1740
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140 145 150Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Val Cys Thr155 160 165Leu Gln Val Leu Ash Gln Asp Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ser Leu170 175 180Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val Val Leu185 190 195Phe Asn Ala Ile Gln Asn Phe Asp Leu Thr His Ile Asp His Arg200 205 210Ile Ala Leu Gln Phe Ala Gly Asn Phe Leu Tyr Leu Phe Phe Thr215 220 225Ser Thr Leu Leu Gly Ala Met Thr Gly Leu Leu Ser Ala Tyr Ile230 235 240Ile Lys Lys Leu Tyr Phe Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val245 250 255Ala Leu Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu260 265 270Leu Phe Tyr Leu Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile275 280 285Val Met Ser His Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg290 295 300Val Thr Thr Lys His Ala Phe Ala Thr Leu Ser Phe Val Ala Glu305 310 315Thr Phe Ile Phe Leu Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu Asp Ile Glu320 325 330Lys Trp Arg Phe Val Ser Asp Ser Pro Gly Ile Ser Val Ala Val335 340 345Ser Ser Ile Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Gly Arg Ala Ala Phe350 355 360Val Ser Pro Leu Ser Phe Leu Met Asn Phe Phe Lys Lys Ser Gln365 370375Ala Glu Lys Val Ser Leu Arg Gln Gln Val Ile Ile Trp Trp Ala
380 385 390Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala Leu Ala Tyr Asn Gln395 400 405Phe Thr Arg Ser Gly His Thr Gln Leu Arg Gly Asn Ala Ile Met410 415420Ile Thr Ser Thr Ile Ser Val Val Leu Val Ser Thr Val Val Phe425 430435Gly Ile Leu Thr Lys Pro Leu Ile Leu Phe Leu Leu Pro Gln Pro440 445450Lys His Phe Asn Ser Thr Ser Thr Val Ser Ser Glu Asn Leu Gly455 460465Ser Pro Lys Ser Phe Thr Leu Pro Leu Leu Gly Asn His Gln Asp470 475480Ser Glu Thr Asp Ile Gly Asn His Gln Asp Ser Thr Asp Arg Gly485 490495Leu Gly Arg Pro Ser Ser Leu Arg Met Leu Leu Asn Ala Pro Ser500 505510His Thr Val His His Tyr Trp Arg Lys Phe Asp Asn Ala Phe Met515 520525Arg Pro Val Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Tyr Val Pro Gly530 535540Ser Pro Thr Glu Gln Ser Thr Asn Asn Leu Thr Glu Arg Thr545 550 55權(quán)利要求
1.番杏Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TtNHX1，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的番杏Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
3.番杏Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因TtNHX1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述番杏Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第92位到第1756位堿基的DNA序列。
6.含有權(quán)利要求4所述基因的表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求4所述基因的細(xì)胞系。
8.權(quán)利要求4所述基因在培育抗鹽植物品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種番杏Na
文檔編號(hào)C12N15/29GK1535982SQ0310943
公開(kāi)日2004年10月13日 申請(qǐng)日期2003年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月9日
發(fā)明者李銀心, 呂慧穎 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所