膽固醇酶電極的制作方法

專利名稱：膽固醇酶電極的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于測定水性溶液中的膽固醇的新型酶電極。本發明也主要提供了通過微囊封裝對硅酸鹽溶膠凝膠上的固定化的膽固醇氧化酶(ChOx)和介質進行包被來制備酶電極的方法。
背景技術：
膽固醇及其脂肪酸酯是對人類非常重要的化合物，因為它們不僅是神經和腦細胞的組成物質，也是其它生物物質如膽汁酸和甾類激素的前體(P.L.Yeagle，Biology of Cholesterol，CRC PressIts function andmetabolism in biology and medicinePlenumNew York，1972)。
因為過量攝取導致的血液中膽固醇及其脂肪酸酯的累積足以致命，因此血液中膽固醇的測定對心臟病的臨床診斷十分重要(D.Noble，Anal.Chem.，1993，65，1037A-41A)。血漿中總膽固醇值的正常范圍是3-6mM，而在高血脂的情況下該水平可增至10mM。因此需要開發可以方便快速地測定膽固醇的技術。
為了制備酶電極，本領域曾經使用各種方法來使酶在碳糊中穩定和固定化，或使酶以共價的方式與玻璃碳電極表面連接，或者將其固定化于聚合物膜中。近年來，將酶在溶膠凝膠基質中固定化并保持其活性的方法已經成為開發新型生物傳感器的潛在工具。Avnir等公開了通過用聚合前體引入有機化合物從而將該有機化合物在無機載體中固定化的方法[J.Phys.Chem.，88(1984)，5969]。
溶膠凝膠處理過的物質因其在用于導電、光學、機械及光電應用的陶瓷膜開發方面的用途而廣為人知[Brinker，C.j.，and Scherer，G.W.，Sol-Gel Science，Academic Press，New York，(1989)；Klein，L.G.，Annu.Rev.Mater.Sci.，23(1993)437]。Braun等報道稱堿性磷酸酶固定化于溶膠凝膠基質中時仍保持其活牲[Mater.Lett.，10(1990)1]。
本領域已經公開了將包括葡糖氧化酶在內的酶在溶膠凝膠基質中固定化的方法[Yamanaka et.al，Chem.Mater.4(1992)495；Shtelzer et al，Biochem.Biotechnol.，19(1994)293；Narang et al，Anal.Chem.，66(1994)3139]。
Audebert和Sanchez報道了在TMOS和各種粒度的商品硅膠基礎上用兩級溶膠凝膠制備方法制作二茂鐵為媒介的溶膠凝膠生物傳感器[Chem.Mater.5(1993)911]。根據這篇文獻，超過80％的葡糖氧化酶在凝膠中保持活性，并且該電極的法拉第反應的結果與基于這一活性進行的理論計算相吻合。
Lev等公開了溶膠凝膠法制得的復合硅碳電極的用途，并宣稱具有硅基質多孔性和硬度以及石墨導電性的雙重優點[Anal.Chem.，66(1994)1747]。在該公開內容中，先將葡糖氧化酶吸附到碳粉表面，然后用于在玻璃碳電極上制備溶膠凝膠膜。Kurokawa等報道了類似的方法，其中由諸如纖維素或丙氧化鈦的各種復合纖維制得摻雜葡糖氧化酶的溶膠凝膠復合物[Biotechnol，Bioeng.，42(1993)394；Biotechnology 7(1993)5]。
例如在Analytica Chimica Acta，Vol.414 23pp，2000已經公開了膽固醇氧化酶和辣根過氧化酶在溶膠凝膠膜中的共固定化，所公開的方法包括物理吸附，物理包埋的夾心結構以及使用微囊封裝技術在四正硅酸鹽衍生的溶膠凝膠膜上固定化膽固醇和辣根過氧化酶的方法。膽固醇測定的響應時間超過100分鐘。使用物理包埋的酶夾心結構溶膠凝膠膜通過安培法測出的響應時間為50秒。此外，據報道該酶電極只能穩定8周的時間。
現有生物傳感器在穩定性和保存期方面有諸多缺陷。已經報道了多種將生物識別元件固定化用于化學傳感研究的方法[R.F.Taylor，ProteinImmobilizing Fundamentals and ApplicationsMarcel Dicker，New York(1975)Chapter 8，263-303和H.H.Weetall，Immobilized Enzyme；Antihen，Antibodies and Peptides Preparation and CharacterizationMarcel Dicker，New York(1975)Chapter6，263-303]。文獻中報道的方法通常可劃歸于以下類別之一(1)物理吸附，(2)共價連接或(3)包埋，其中物理吸附是最簡單的固定化方式。
這些固定化方法存在一些缺點，例如與生物識別元件(例如蛋白質和酶)的大尺寸有關的問題。物理吸附造成了多種生物識別元件取向和表觀親和性。此外物理吸附常常產生大量對目標分析物完全沒有響應的生物識別元件。所固定的物質對目標分析物完全沒有響應。由于沒有共價鍵，所固定的物質經常從感應界面流失或解吸。共價法通常能得到更穩定和均勻(過渡的生物識別取向)的界面，且酶流失也達到最小。但是，共價連接會涉及到一種或多種化學變化，一般耗時長且可能成本高。
美國專利第6,342,364號提供了一種感應器，其只需給樣一次即可通過電化學法測定低密度脂蛋白中的膽固醇。該感應器含有安裝在絕緣基板上的至少包含工作電極和反電極的電極系統、在帶有該電極系統的所述基板上形成的酶層及安置在所述酶層前的位于向所述電極系統提供樣品溶液的路徑上的試劑層。所述酶層至少包括氧化還原酶和電子介質。所述試劑層含有可抑制不同于含所述氧化還原酶的低密度脂蛋白的脂蛋白中的膽固醇活性的試劑，例如，可以和不同于所述低密度脂蛋白的其它脂蛋白結合生成水溶性復合物的試劑。然而，此種感應器的保存時間太短。
美國專利第6,214,612號公開了用于定量測定膽固醇的包括電極系統和反應試劑系統的膽固醇感應器。所述電極系統包括測量電極如碳電極和反電極，而所述反應試劑系統包括膽固醇脫氫酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和氧化的電子介質。電子介質包括鐵氰化物、1，2-萘醌-4-磺酸鹽、2，6-二氯酚靛酚、二甲基苯醌、1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸鹽(1-methoxy-5-methylphenazinium sulfate)、亞甲基藍、棓花青、勞氏紫、N-甲基吩嗪(硫酸單甲酯)鹽和麥爾多拉藍(Meldola’s blue)。也可含有心肌黃酶、膽固醇酯酶和表面活性劑。
上面所述的電極系統位于絕緣基板上，該基板上有帶凹槽的覆蓋部件，該凹槽為從基板末端延伸到所述電極系統的供應樣品的通道。在所述基板或覆蓋部件上，或同時在所述電極系統和覆蓋部件上有包含干燥形式的所述反應試劑系統的反應層和親水聚合物層，從而使其暴露于所述樣品供應槽。在操作過程中，所述電子介質被還原同時樣品中的膽固醇被膽固醇脫氫酶氧化，使所述電子介質發生電化學再氧化所需的電流量與樣品中的膽固醇量成正比。然而，此感應器的保存時間較短，并且可能會出現所述介質和酶的流失。
美國專利第6,071,392號公開了一種膽固醇感應器，包括含有形成于絕緣基板上的測量電極和反電極的電極系統，用于覆蓋該電極系統的電極涂層以及形成于該電極涂層上或其附近的反應試劑層，其中所述反應試劑層至少包含用于催化膽固醇氧化的酶，具有膽固醇酯水解活性的酶和表面活性劑，所述電極涂層包含水溶性纖維素衍生物和糖類兩者中至少一種，且其濃度能給予樣品溶液足夠的粘度，從而當所述電極涂層溶解于提供給所述感應器的樣品溶液時，能夠阻止所述表面活性劑侵入所述電極系統。此專利的感應器致力于消除由電極退化造成的感應器響應減弱，其中所述電極退化是由表面活性劑侵入所述電極系統造成的。雖然據稱此感應器的響應時間更短，但同樣因為潛在的酶流失，其保存時間仍然不夠長。
美國專利第6,117,289號公開了一種膽固醇感應器，其包括至少含有測量電極和反電極的位于電絕緣基板上的電極系統，和形成于該電極系統上或其附近的反應層。該反應層包括用于催化從膽固醇酯到膽固醇的轉化的膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和表面活性劑。響應時間最長為9分鐘。此外，表面活性劑的存在能夠導致電極的退化。
電化學聚合的導電聚合物在過去的二十年中也得到了相當多的關注。這些材料的非凡的從導電的氧化態(摻雜的)到絕緣的還原態(未摻雜的)的轉換能力是許多應用的基礎。
例如，由于具有諸如可通過使單體電化學氧化而直接、簡便地沉積于感應電極上，通過電荷沉積來控制厚度，以及用于傳感器應用的聚合物的氧化還原導電性(redox conductivity)和聚合電解質特性的優點，聚共軛導電聚合物被考慮用于生物傳感方面的應用。
因此，迫切需要開發可以方便、快速地測定膽固醇的生物傳感器。
發明目的本發明的主要目的是提供用來評估水性媒質中的膽固醇的基于溶膠凝膠的新型酶電極。
本發明的另外一個目的是提供制備新型酶電極的方法，該酶電極能準確快速地評估溶液中的膽固醇。
本發明的再一目的是提供酶穩定的成本高效的高靈敏酶電極。
本發明的再一目的是提供可以在30秒的短時間內準確測定膽固醇的酶電極。
本發明的再一目的是提供至少可以使用五次的基于溶膠凝膠的新型酶電極。
發明概述因而，本發明涉及用于評估水性媒質中的膽固醇的酶電極，該電極包括i)導電基板，ii)沉積在所述導電基板上的溶膠凝膠衍生材料，步驟b)所述的溶膠凝膠衍生物為用電子介質微囊封裝的膽固醇氧化酶。
在本發明的一實施方案中，所述酶電極具有如下性能所述封裝的酶和所述電子介質零流失，響應時間30秒，至少可重復使用5次，以及保存時間6個月。
在本發明的另一實施方案中，所用的導電基板選自銦錫氧化物包被的玻璃板和銀包被的不導電聚合物表面。
在本發明的另一實施方案中，所述不導電聚合物表面選自膜和片。
在本發明的另一實施方案中，所用的不導電聚合物表面選自聚丙烯酰胺，聚氯乙烯和聚乙烯。
在本發明的另一實施方案中，所用溶膠材料為硅溶膠。
在本發明的另一實施方案中，所用硅溶膠選自原硅酸四乙酯和原硅酸四甲酯。
在本發明的另一實施方案中，所用電子介質選自鐵氰化鉀、二茂鐵和普魯士藍。
在本發明的另一實施方案中，所述酶電極的靈敏度為0.4伏特。
在本發明的另一實施方案中，所用膽固醇氧化酶的濃度范圍是3-5IU每平方厘米表面積。
在本發明的另一實施方案中，所述酶電極的工作pH值范圍為6.5-7.2。
本發明還涉及制備用于評估水性媒質中的膽固醇的酶電極的方法，包括a.使用已知的方法制備硅酸鹽溶液。
b.通過同時將含有3-5IU膽固醇氧化酶的0.05-0.1M的磷酸鹽緩沖液以及約0.01M的電子介質緩緩加入上面步驟a)所述的硅酸鹽溶液中，將膽固醇氧化酶和電子介質固定化。
c.將上述得到的混合物靜置直至觀察到混濁現象，此時表明酶和電子介質封裝完畢，d.使用常規方法將得到的混濁混合物涂布在導電的基板上。
e.將所述導電基板與涂布的混濁混合物在25-30℃的溫度范圍內干燥至少24小時的時間，從而得到所需的酶電極。
在本發明的實施方案中，所用的硅酸鹽溶膠選自原硅酸四乙酯和原硅酸四甲酯。
在本發明的另一實施方案中，所用磷酸鹽緩沖液的pH值范圍為6.5-7.2。
在本發明的另一實施方案中，制備酶電極的方法是一步法。
附圖的簡要說明

圖1顯示了所述酶電極響應對膽固醇溶液濃度的函數關系。
發明的詳細描述本發明主要包括如下階段制備溶膠，并向同時溶膠中加入位于緩沖溶液中的介質以及膽固醇氧化酶。將溶膠和固定化酶的混合物靜置，直至實現酶的完全封裝為止。此階段的判斷依據為觀察到混合物開始變混濁。一旦混合物開始變混濁，就可以將其沉積在基體上來制備所需的電極。當在25-30℃的溫度范圍內干燥約24小時的較長時間后，所涂布的混合物形成具有所述膽固醇感應性能的薄膜。
溶膠的制備優選采用硅酸四乙酯在純水和HCl中進行。但硅酸四甲酯也可以使用。用于制備所述溶膠的水優選為純水，更優選超過15Mohms的去離子水。也可采用任何本領域所屬技術人員公知的常規方法制備所述溶膠。例如，通過將4.5ml的原硅酸四乙酯(TEOS)、1.4ml的H2O以及100μl 0.1M的HCl在玻璃小瓶中混合制得溶膠凝膠儲備溶液。將所得混合物均勻攪拌直至得到澄清的溶液。此溶液將在整個實驗中使用，需要的時候可進行稀釋。通過將0.5ml的所述儲備溶液和0-0.2ml的去離子水混合制得特定的鑄塑溶液。
下一關鍵步驟包括含有固定化的膽固醇氧化酶的溶膠凝膠的制備。該步驟的特點是向溶膠中逐漸加入所述介質及所述酶的緩沖液的過程中，同時實現所述酶的封裝和固定化。所使用的酶是膽固醇氧化酶，其濃度范圍為3-5IU每平方厘米表面積。所使用的介質優選為鐵氰化鉀。為了固定化膽固醇氧化酶(ChOx)，將80μl儲備溶液加入在含3U ChOx的0.1M磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7)中制得的20μl 0.01M的鐵氰化鉀溶液中，從而同時對所述酶進行封裝，且鐵氰化鉀在不斷增長的形成硅網絡的水解凝膠中作為介質。將溶液放置一旁，直到所述酶及介質被完全封裝于不斷增長的網絡中一旦制備得到包含所述固定化和微囊封裝的酶的溶膠凝膠，就可以很容易地在導電基板上沉積形成膜。該導電基板可以是導電膜如銦錫氧化物(ITO)包被的玻璃板，也可以是任何其他基體如聚合物膜或片。這些基體上可沉積銀膜，其用做沉積所述含封裝酶的溶膠凝膠膜的導電表面。在薄膜鑄塑前，先用HNO3對銦錫氧化物(ITO)包被的玻璃板處理大約2小時，然后用Millipore水清洗三次。最后，在薄膜鑄塑前，用正丙醇對所述玻璃板進行清洗。可采用任何本領域所屬技術人員公知的常規手段制備所述膜，而且優選保持在空氣中以在25-30℃的溫度范圍內干燥。然后采用所述水溶膠凝膠稀釋方案，在所述ITO玻璃上鑄塑不同厚度的摻雜ChOx的膜。將所述膜在25℃下干燥，并在4℃儲存。
通過將3mg膽固醇溶解在12.8ml 2-丙醇中，并與5.85ml Triton X-100表面活性劑混合來制備標準膽固醇溶液。勻化后用0.1M的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.0)將混合液的總體積稀釋至100ml，并在35℃恒溫。此標準溶液進一步用水稀釋成不同的膽固醇溶液。
使用安培響應研究法(Amperometric response study)用上面制備的標準膽固醇溶液對所述酶包被的基體的性質進行檢測。安培法是本領域所屬技術人員公知的方法。在該方法中，基本上使用三電極電池體系。所用電極為工作電極，即本發明的酶電極。通常所述酶電極是在ITO包被的玻璃上制成的。第二個電極是Ag/AgCl參比電極。在實際測量中，使用在pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液中濃度在0.5-10mM之間變化的膽固醇溶液及上述的兩個電極。每100秒檢測由于酶作用生成H2O2而產生的電流。通常，對濃度檢測響應時間(秒)。
反應產生電流是基于以下過程實驗的結果如圖l所示。為了檢查膽固醇中是否存在對所述酶電極的響應有任何不利影響的干擾試劑如葡萄糖或抗壞血酸，用混有所述干擾試劑的膽固醇溶液進行重復實驗。結果發現這些干擾試劑對所述酶電極的響應沒有任何影響。
在改進現有技術公開的膽固醇測量方法的缺陷的嘗試中，生物分子在溶膠凝膠法中被固定化，且保存時間相對變長。這是因為以下事實(i)多種酶被封裝在溶膠凝膠基質中形成透明的玻璃狀物質(ii)所述酶在這類基質中非常穩定(iii)這些酶在溶膠凝膠玻璃狀物質中發生性質可逆反應(iv)可以很容易地用光譜法定量測定溶膠凝膠玻璃狀物質中發生的光譜變化。所述溶膠凝膠技術的優越性在于無需或者僅需極少量的熱。這些酶分子被包埋在共價網絡中，而不是通過化學方式連接在無機基體上，因為所述基體的化學鍵可能會干擾所述分子的活性。干燥玻璃內的細孔網絡(＜10nm)不會散射可見輻射，但允許小分子擴散到所述電極表面。多孔無機干凝膠如原硅酸四乙酯(TEOS)衍生的溶膠凝膠是特別有吸引力的用于電化學生物傳感器的基質，因為其結合了物理上較堅硬、在水溶液中膨脹可忽略不計、化學惰性和熱穩定性的特點。這些生物傳感器總體來說靈敏度高、響應時間短，并且不存在任何損害酶活性的問題。
觀察到的另一優于現有技術的酶電極的明顯優點是酶和介質的零流失。本發明電極的響應時間縮短到30秒，并可重復使用。還觀察到所述電極的保存時間變長了，在25-30℃的常溫條件下可保存約6個月。
本發明的創造性步驟在于使用微囊封裝技術將膽固醇氧化酶(ChOx)和電子介質在硅酸鹽溶膠凝膠中固定化，并將上述微囊封裝的酶和電子介質溶膠凝膠膜沉積到導電銦錫氧化物(ITO)包被的玻璃板上，從而制成用于測定溶液中的膽固醇的酶電極。
下面的實施例以示例的方式給出，因此不應構成對本發明保護范圍的任何形式的限制。
實施例1酶活性的測定將0.05cm36mM的膽固醇溶液溶于2-丙醇溶液中，并與3cm3體積的0.1M的磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.0)混合，并在35℃恒溫。將ChOx固定化的溶膠凝膠膜包被的ITO玻璃板浸入上述溶液中，并孵育2分鐘，取出玻璃板用雙光束光譜儀在240nm測量所述溶液的吸收，從而測定由酶反應產生的膽固醇。通過以下方法根據所述酶固定化的溶膠凝膠玻璃板孵育前后溶液光吸收的變化來評估表觀酶活性(Ucm3)。
Σappenz(Ucm-2)=AV/ϵts]]>其中A為孵育前后溶液光吸收的變化，V是總體積(3.05cm3)，ε是膽固醇的毫摩爾消光系數(12.2)，t是反應時間(min)，s是溶膠凝膠膜的表面積(cm2)。一個酶活性單位(Ucm3)定義為每分鐘產生1μl mol膽固醇的活性。酶活性測量是在所述酶(ChOx/HRP)固定化的溶膠凝膠膜上進行的。沒有觀察到酶(ChOx/HRP)從所述酶固定化的溶膠凝膠膜流失。
實施例2用膽固醇氧化酶固定化的溶膠-凝膠-ITO(ChOx/sol-gel/ITO)電極通過電化學法測定含有干擾試劑的膽固醇。
循環伏安法當膽固醇與含有固定化于TEOS衍生的溶膠凝膠膜中的ChOx的酶電極接觸時，發生下面的酶反應和電化學反應
記錄H2O2的氧化電流作為安培生物傳感器中的傳感器響應。因為酶的直接固定化，傳感器的性質如時間和靈敏度是所述固定化酶的反映。循環伏安法實驗是在含不同濃度的膽固醇(0.5mM至10mM)的0.1M的磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.0)中，用鑄塑在ITO玻璃板上的酶固定化的溶膠凝膠膜作為工作電極，Ag/AgCl作為參比電極，鉑絲作為反電極的條件下進行的。上述實驗在作為干擾試劑的0.1mM抗壞血酸和0.5mM葡萄糖存在及不存在的兩種情況下進行。所述循環伏安法實驗在750mV處顯示出氧化峰，且其陽極電流隨著膽固醇濃度從0.5mM增加至10mM而不斷上升。這種上升是由于H2O2在所述ITO包被的玻璃表面上直接氧化。然而，在有0.1mM抗壞血酸存在時，隨著陽極電流上升，位于0.75V處的氧化峰向陽極偏移了150mV達到相對Ag/AgCl電極0.9V處。當0.5mM葡萄糖存在于所述膽固醇溶液(1mM)中時，陽極電流也有增加但對H2O2的氧化電勢沒有明顯影響，這說明膽固醇中存在0.1mM抗壞血酸和0.5mM葡萄糖對測得的陽極電流均有很大的影響實施例3安培響應研究使用類似于循環伏安法實驗中所用的三電極電池體系通過安培法來測定磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.0)中的膽固醇。將工作電極(在ITO玻璃上含有膽固醇氧化酶ChOx固定化的溶膠凝膠)在相對Ag/AgCl電極0.9V條件下極化，并且用安培計校準酶作用生成的H2O2來測量對膽固醇(0.5-10mM)的安培響應。在電池中配好不同濃度的膽固醇溶液(2mM-10mM)后，每100秒監測一次電流。5.0μA的最大電流出現在10mM膽固醇時，超過該濃度時沒有觀測到電流的明顯變化。觀察到的對總膽固醇的響應時間為90秒。
實施例4用膽固醇氧化酶和鐵氰化鉀固定化的溶膠-凝膠銦錫氧化物(ChOx/Fe3+/sol-gel/ITO)作為電極，采用電化學法在有抗壞血酸(0.1mM)和葡萄糖(0.5mM)干擾試劑影響的情況下測定膽固醇。
循環伏安法循環伏安法實驗是在含不同濃度膽固醇的0.1M的磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.0)中，用膽固醇氧化酶和鐵氰化鉀固定化的溶膠-凝膠銦錫氧化物(ChOx/Fe3+/sol-gel/ITO)膜作為工作電極，Ag/AgCl作為參比電極，鉑絲作為反電極的條件下進行。發生了下列反應
記錄氧化電流作為安培生物傳感器中的傳感器響應。因為酶的直接固定化，所述傳感器的性質如時間和靈敏度是所述固定化的酶的反映。用不含介質的酶固定化的溶膠凝膠膜作為電極時，在實施例2中在相對Ag/AgCl電極0.9V處觀測到的氧化峰在此實驗中向陰極偏移了300mV達到相對Ag/AgCl電極0.4V處，且其隨著膽固醇濃度的增加(2-10mM)而上升。膽固醇溶液中存在0.1mM抗壞血酸和0.5mM葡萄糖對測得的氧化電勢沒有明顯影響。
實施例5安培響應研究使用類似于循環伏安法實驗中所用的三電極電池體系通過安培法測定磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.0)中的膽固醇。將所述工作電極(在ITO玻璃上含有膽固醇氧化酶ChOx固定化的溶膠凝膠)在相對Ag/AgCl電極0.4V條件下極化，并且測量了對濃度從2mM至10mM變化的膽固醇的安培響應。在電池中配好不同濃度的膽固醇溶液(2mM-10mM)后每100秒監測一次電流(圖1)。在6mM膽固醇溶液(1mL)以在0.4V極化的ChOx/Fe3+/sol-gel/ITO電極測得的陽極電流在30秒內達到穩定狀態，且這一對膽固醇溶液的響應在5％之內具有重復性。安培法得到的膽固醇濃度的電流檢出下限為0.5mM。
本發明的主要優點為1.本發明制備的酶電極顯示出可以忽略的酶流失。
2.本發明制備的酶電極對溶液中的膽固醇顯示出快速響應。
3.本發明制備的酶電極可在較長時間內保持穩定。
4.本發明制備的酶電極對膽固醇高度敏感。
權利要求
1.用于評估水性媒質中的膽固醇的酶電極，所述電極包括i)導電基板，ii)沉積在所述導電基板上的溶膠凝膠衍生材料膜，iii)步驟b)所述的溶膠凝膠衍生材料為用電子介質微囊封裝的膽固醇氧化酶，所述酶電極具有如下性能所述封裝的酶和所述電子介質零流失，響應時間30秒，對濃度范圍1-8mM的膽固醇為安培線性響應，至少可重復使用5次，以及保存時間6個月。
2.如權利要求1所述的酶電極，其中所用的導電基板選自銦錫氧化物包被的玻璃板和銀包被的不導電聚合物表面。
3.如權利要求1所述的酶電極，其中所用的不導電聚合物表面選自膜和片。
4.如權利要求1所述的酶電極，其中所用的不導電聚合物表面選自聚丙烯酰胺、聚氯乙烯和聚乙烯。
5.如權利要求1所述的酶電極，其中所用的溶膠材料是硅溶膠。
6.如權利要求1所述的酶電極，其中所用的硅溶膠選自原硅酸四乙酯和原硅酸四甲酯。
7.如權利要求1所述的酶電極，其中所用的電子介質選自鐵氰化鉀、二茂鐵和普魯士藍。
8.如權利要求1所述的酶電極，其中所述酶電極的靈敏度為0.4伏特。
9.如權利要求1所述的酶電極，其中所用的膽固醇氧化酶的濃度范圍是3-5IU每平方厘米表面積。
全文摘要
本發明涉及用于評估水性媒質中的膽固醇的酶電極。該電極包括i)導電基板，ii)沉積在所述導電基板上的溶膠凝膠衍生材料，步驟b)所述的溶膠凝膠衍生物為用電子介質微囊封裝的膽固醇氧化酶。
文檔編號C12Q1/00GK1739026SQ02830186
公開日2006年2月22日 申請日期2002年12月31日 優先權日2002年12月31日
發明者阿倫·庫馬爾, 拉杰什, 班西·達爾·馬爾霍特拉 申請人:科學與工業研究委員會