專利名稱：秀麗新桿線蟲中真核生物蛋白質和核酸分子的生產的制作方法
技術領域：
本發明一般涉及秀麗新桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中翻譯后修飾的真核生物蛋白質和具體涉及人類蛋白質的生產。本發明也包括翻譯后修飾的核酸分子如tRNA的生產。本發明進一步包括用可鑒定的標記如2H、13C、15N、硒代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸或非天然氨基酸對表達的蛋白質進行共翻譯標記。類似地，用2H、13C和15N對核酸分子進行標記。
背景有幾種在不同表達系統中生產真核生物蛋白質的選擇。目前應用下面的表達系統。
細菌許多大腸桿菌表達系統是商業上可購得的。一些例子為pET(Promega)、pQE(Qiagen)、pGEX(Amersham Pharmacia)、ptrcHIS(Invitrogen)、pDUAL(Stratagene)。大腸桿菌的優點是價格低廉且易于應用。主要的缺點是許多真核生物蛋白質當在大腸桿菌中表達時不能正確折疊并形成不溶性聚集體。密碼子選擇與高等真核生物的非常不同。真核生物蛋白質常常必須在翻譯后進行修飾，以能夠折疊為正確的結構和/或變為活化的。大腸桿菌不能進行專由真核生物細胞進行的復雜翻譯后修飾，如乙酰化、N-和O-連接的糖基化和酰化和磷酸化。
表達水平因蛋白質不同而有巨大變化。1升大腸桿菌培養物中重組蛋白質的產量一般為約10mg。在極少數情形中，可獲得每升大腸桿菌培養物中數百毫克重組蛋白質的量。
酵母巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)是公認的表達重組蛋白質的系統。幾個公司銷售相關的質粒載體。例如，Invitrogen Corp.銷售pPIC質粒系列。畢赤氏酵母屬的優點是作為真核生物，其翻譯后修飾與那些發生于人類或高等真核生物中的更相似。畢赤氏酵母屬可容易且快速地進行轉化。它也易于大規模培養。表達水平有相當大的變化。已報道了高達12克/升的水平。
昆蟲細胞昆蟲細胞也可用于表達重組蛋白質。幾個公司銷售相關的質粒載體和細胞系。Invitrogen的系統為DES、InsectSelect和MaxBac。昆蟲細胞的優點在于，作為多細胞真核生物，昆蟲比酵母更類似于人類。缺點為(i)昆蟲細胞比細菌或酵母細胞更難以培養和維持(ii)它們的培養更加昂貴(iii)它們需要無菌的培養箱(iv)表達水平比酵母或細菌系統的更低。
人類細胞系也可應用人類細胞系，但它們需要生長因子以使其存活。現今，人類生長因子是非常昂貴的，這使得人類細胞系成為如生產生長因子的不利候選物。
線蟲線蟲，即小的線蟲，是一枝迄今尚未開發用于大規模蛋白質或核酸生產的真核生物。線蟲是非常簡單的動物，且自1949年以來已用作發育的模型系統(Dougherty EC和Nigon V.，J.Parasitol.(1949)35，11；Brenner S在1963年6月5日給Max Perutz的信中)。尤其是秀麗新桿線蟲中959個細胞中的每一個的發育均得到充分鑒定，且最近對其整個基因組進行了測序并目前可供公眾使用(“The C.elegans Sequencing Consortium ”秀麗新桿線蟲的基因組序列研究生物學的一個平臺(Genome Sequence of the nematode C.elegansA platform for investigating biology).Science(1998)282，2012-2018)。線蟲是在遺傳上比細菌更與人類密切相關的真核生物，其蛋白質的約60％與人類蛋白質同源。
使得用作生產真核生物特別是人類蛋白質的蛋白質表達系統的線蟲引起關注的是如下事實，即它們具有進行翻譯后蛋白質修飾所必需的機制。因此，在線蟲中生產的蛋白質(肽藥物)事實上與天然的人類蛋白質相同，且從而具有更低的不利副作用和更高的比活性，而需要更低的劑量。線蟲表達系統的其他優點包括高的表達蛋白質產量、低的維持成本、易于應用及人們易于擴大生產。
C.D.Link已描述了人類β-淀粉樣肽在轉基因秀麗新桿線蟲中的表達，以生產與抗-β-淀粉樣多克隆和多克隆抗體免疫反應的肌肉特異性沉積物(Link C.D.，人類β-淀粉樣肽在轉基因秀麗新桿線蟲中的表達(Expression of human beta-amyloid peptide in transgenicCaenorhabditis elegans)，Proc.Natl.Acad.Sci.(1995)92，9368-9372)，且他建議其無脊椎動物模型可用于體內研究調節淀粉樣蛋白形成的因子。
國際專利申請WO 00/54815公開了通過應用包含啟動子的表達載體而在秀麗新桿線蟲中表達DNA或蛋白質，該啟動子指導基因在秀麗新桿線蟲排泄細胞中的表達。蛋白質表達的原因不是為了生產和分離蛋白質，而是為了發現參與細胞運動性、細胞形狀和細胞向外生長過程的新分子，即藥物，并確定其功能。
發明描述本發明提供了一種生產真核生物如人類蛋白質和核酸分子的體內表達系統，該表達系統易于操作、價格低廉、遺傳上穩定且易于擴大。本發明的線蟲表達系統適合于大規模生產超純的重組人類蛋白質。生產的蛋白質和核酸分子將含有高等生物(真核生物)所有典型的修飾，如乙酰化、N-和O-連接的糖基化和酰化、磷酸化及信號序列的切割等。這些修飾對于信號通路中醫藥上有用的蛋白質的特異性是重要的。
新的線蟲蛋白質表達系統組合了真核生物細胞的優點如翻譯后修飾和已知大腸桿菌發酵操作的簡便性。
表達系統包含秀麗新桿線蟲。由于可同時注射入秀麗新桿線蟲中的不同質粒的數目超過20，這使得能夠同時表達具有大復合物的例如不同亞基的多個質粒，該大復合物含有蛋白質和/或核酸。
應用本發明可在工業規模上生產的真核生物蛋白質的例子包括用于干細胞基礎研究和醫學應用的人類生長因子、生長因子受體(膜結合的或可溶性部分)，該醫學應用如心臟病、糖尿病、癌癥和神經系統疾病的基于干細胞的治療，該神經系統疾病包括帕金森氏病和阿爾茨海默氏病。此外有單克隆抗體、G-蛋白、G-蛋白偶聯的受體和大的多亞基蛋白質-RNA復合物，如聚合酶、端粒酶和剪接因子復合物。除潛在的醫學應用之外，生產的蛋白質和核酸可用于通過X-射線晶體學、電子晶體學或NMR對結構進行鑒定，其中人們可以研究翻譯后修飾的蛋白質和核酸。秀麗新桿線蟲表達系統也可用于為了晶體學的應用而用2H、13C、15N、Se-Met、Se-Cys或非天然氨基酸對真核生物蛋白質進行標記，或者為了NMR實驗用2H、13C或15N進行標記。
本發明的一個方面涉及用于在秀麗新桿線蟲中表達的質粒載體，該載體以5’到3’的轉錄方向包含可操作地相互連接的熱激啟動子核苷酸序列；任選地含有用于在秀麗新桿線蟲和大腸桿菌之間有效穿梭的Shine-Dalgarno序列的合成內含子核苷酸序列；任選的編碼核定位信號或分泌信號，如選自天然存在的信號序列的，如來自秀麗新桿線蟲的，或要進行表達的蛋白質或核酸分子的信號序列的核苷酸序列；編碼可識別的標記的核苷酸序列；任選的編碼熒光蛋白質的核苷酸序列；編碼蛋白酶切割位點的核苷酸序列；含有編碼真核生物如人類的蛋白質或核酸分子的核苷酸序列的多克隆位點以及編碼翻譯終止的核苷酸序列。
可對質粒中的核苷酸序列順序進行更改，以使得多克隆位點之后為編碼蛋白酶切割位點的核苷酸序列、任選的編碼熒光蛋白質的核苷酸序列、任選的編碼核定位信號或分泌信號的核苷酸序列和編碼可識別的標記的核苷酸序列。
編碼蛋白酶切割位點的核苷酸序列的例子包括蛋白酶TEV、凝血酶和凝血因子Xa。
在質粒載體的一個實施方案中，合成的內含子核苷酸序列含有Shine-Dalgarno序列AGGAG，編碼核定位信號的核苷酸序列是SEQ IDNO3，編碼可識別的標記的序列是編碼6-His標記、10-His標記或12-His標記的序列，即使得在Ni螯合的柱上易于純化的6、10或12個組氨酸殘基，編碼熒光蛋白質的核苷酸序列是編碼綠色熒光蛋白質的具有SEQ ID NO8序列的核苷酸序列，編碼蛋白酶切割位點的核苷酸序列是編碼使得以后能夠切除6、10或12個組氨酸殘基的蛋白酶切割位點的序列。
在一個優選實施方案中，缺乏編碼真核生物蛋白質或核酸分子的核苷酸序列的質粒具有核苷酸序列SEQ ID NO1。該質粒不具有編碼核定位信號的核苷酸序列。人工的內含子起始于480而終止于521(gtatgtttcga atgatactaa cataacatag aacattttca g)，隨后為547～564的6-His-標記序列(cat cac cat cac cat cac)和565～594的連接體序列，該連接體序列連接His-標記與595～618的編碼TEV蛋白酶識別位點的序列。然后為單多克隆位點(MCS)(起始于619)。
在另一個優選實施方案中，缺乏編碼真核生物蛋白質或核酸分子的核苷酸序列的質粒具有核苷酸序列SEQ ID NO2。人工的內含子起始于480而終止于521(gtatgtttcga atgatactaa cataacatagaacattttca g)，隨后為起始于位置533而終止于580的編碼核定位信號(NLS)的核苷酸序列(ctagtgctca gaaaaaatga ctgctccaaagaagaagcgt aaggtgcc)。在NLS后為588～605的6-His標記序列(catcaccatc accatcac)。一個連接體序列(606～635)連接該標記序列與636～656的編碼TEV蛋白酶識別位點的序列，其后為多克隆位點(起始于658)。
為了克隆的目的，用于質粒中的NLS比基本的NLS DNA序列稍長。(將NLS克隆入用限制酶Nhe I和Nco I預先切割的質粒中)。基本的NLS序列(558～568ccaaagaagaagcgtaaggtgcc c，[最后的c來自Nco I切割的載體])翻譯為蛋白質序列PKKKRKV，該序列可由核輸入機制識別。
核定位信號NLS由于下述原因而是有用的。當對線蟲進行熱激并以這樣的方式強制該線蟲超量生產需要的人類蛋白質時，指導生產的蛋白質進入細胞核中是更安全的。這正是NLS所執行的。將蛋白質轉運入核中的優點是其中不存在蛋白酶。這些蛋白酶可以存在于細胞質中，且尤其濃縮于稱作溶酶體的細胞器中。通過應用NLS將表達的蛋白質送入核內，它們被轉運到與潛在危險的蛋白酶有一定距離。
綠色熒光蛋白質GFP的DNA序列在SEQ ID NO8中含有額外的3個內含子。它主要用作發光標記，以使得秀麗新桿線蟲表達預期的蛋白質“可見”。在存在該DNA序列的質粒中，該序列在6His-標記之后如當整合入質粒SEQ ID NO1中時的6His-GFP-TEV-MCS，或如當整合入質粒SEQ ID NO2中時的NLS-6His-GFP-TEV-MCS。
在另一個優選實施方案中，缺乏編碼真核生物蛋白質或核酸分子的核苷酸序列的質粒具有核苷酸序列SEQ ID NO9。相對于質粒SEQ IDNO1中的序列對質粒中序列的順序進行了更改，并包括了具有序列SEQID NO8的綠色熒光蛋白質。序列順序為MCS-TEV-GFP-6His。
在另一個優選實施方案中，缺乏編碼真核生物蛋白質或核酸分子的核苷酸序列的質粒具有核苷酸序列SEQ ID NO10。相對于質粒SEQ IDNO2中的序列對質粒中序列的順序進行了更改，并包括了具有序列SEQID NO8的綠色熒光蛋白質。序列順序為MCS-TEV-GFP-NLS-6His。
在多克隆位點(MCS)后插入綠色熒光蛋白質(GFP)使得可能快速檢查正確的蛋白質折疊。如果表達的目標蛋白質如人類生長因子未正確折疊，這將使得其后的綠色熒光蛋白質也不能正確折疊，從而人們不能看到綠色熒光。這是蛋白質折疊的快速檢驗。此外，通過根據公認的GFP規程應用離子交換層析或者作為應用固定的抗-GFP抗體的親和標記，可將GFP用作純化標記。
本發明優選的質粒也計劃用于大腸桿菌中。因此將它們命名為“穿梭載體”。對上文中公開的質粒序列的唯一修飾是使所謂的“Shine-Dalgarno”序列處于轉錄起始密碼子ATG前約10個核苷酸的中央。Shine-Dalgarno序列AGGAG是大腸桿菌的翻譯起始信號，而對秀麗新桿線蟲無影響。
因而，在質粒SEQ ID NO1中，Shine-Dalgarno序列處于ATG-6His前10個核苷酸序列的中央；在質粒SEQ ID NO2中，Shine-Dalgarno序列處于ATG-NLS前10個核苷酸序列的中央；而在質粒SEQ ID NO9和10中，Shine-Dalgarno序列處于MCS(該MCS含有ATG)前10個核苷酸序列的中央。
質粒SEQ ID NO1、2、9和10含有使大腸桿菌細菌對抗生素如氨芐青霉素或carbicillin或卡那霉素有抗性的蛋白質。然而，這些蛋白質對秀麗新桿線蟲無影響(如它們不向秀麗新桿線蟲提供任何抗生素抗性)。
在本發明最優選的實施方案中，編碼人類蛋白質的核苷酸序列是編碼人類生長因子蛋白質的序列。一些人類生長因子蛋白質的特定例子是稱作Wnt2b的生長因子序列SEQ ID NO4(智人(Homo sapiens)無翅型MMTV整合位點家族2B成員)，稱作FGF10的生長因子序列SEQ ID NO5(智人角質形成細胞生長因子2(FGF10))，稱作KLS的生長因子序列SEQ ID NO6(智人KIT配體可溶性組分)，和稱作BMP10的生長因子序列SEQ ID NO7(智人骨形態發生蛋白10)。
本發明的另一個方面涉及在線蟲中生產真核生物如人類的蛋白質或核酸分子的方法，該方法包含如下步驟，即，優選地同時將根據本發明的一種或幾種質粒載體注射入秀麗新桿線蟲雌雄同體的生殖腺中，于低于25℃的溫度在生長培養基中培養線蟲，隨后將培養溫度改變為30和33℃之間的值，以在幾百個體細胞中誘導蛋白質或核酸分子的表達，在神經元和表皮細胞中具有最高表達水平，并從該細胞中分離真核生物蛋白質或核酸分子。
在本發明方法的一個實施方案中，生長培養基包含細菌如大腸桿菌作為線蟲的飼料。由于秀麗新桿線蟲可以專一地以分散在基本培養基中的細菌為食物，所以可利用該事實來標記在秀麗新桿線蟲中生產的蛋白質。通過向蟲子飼喂根據現有規程預先標記的細菌(如用2H、13C、15N、Se-Met、Se-Cys或某些非天然氨基酸對蛋白質的表達進行標記，及用2H、13C、15N對核酸分子的表達進行標記)，各種標記將摻入新生產的蛋白質和核苷酸中。
在一個優選實施方案中，在質粒包括編碼核定位信號的核苷酸序列的情形中，可通過謹慎地打開線蟲的細胞而進行分離，如通過應用“珠攪拌器(bead beater)”(＝充滿小的鋯珠的攪拌器)——從而使含有表達的蛋白質或核酸分子的細胞核保持完整。這之后為分離細胞核，并通過溶解核膜以釋放表達的蛋白質，及將混合物進行層析純化。對于蛋白質，這包括特異性地與可識別的標記結合的固定相，如10-His-標記的蛋白質與填充入純化柱中的Ni-螯合的珠結合，隨后洗掉未結合的蛋白質，并在從柱中釋放真核生物如人類蛋白質的條件下進行洗脫，該條件如釋放10-His-標記的蛋白質的咪唑梯度。然后通過提供特異性的蛋白酶而切除可識別的標記，該特異性的蛋白酶相應于由所用質粒編碼的蛋白酶切割位點并具有未切割的可識別標記如6-His-標記，同時，對從固定相釋放標記的低濃度試劑進行透析(如果用400-700mM咪唑進行洗脫則適合應用約10-50mM)，將切割混合物轉移到新標記特異性的柱子上，該切割混合物含有具切除標記的真核生物蛋白質和自身具有未切割的可識別標記如6-His-標記的蛋白酶，洗脫柱子以獲得含有真核生物蛋白質的洗脫液，而留下切除的可識別標記如10-His標記和可識別標記的如6-His-標記的蛋白酶結合于固定相上。
在另一個優選實施方案中，在質粒缺乏編碼核定位信號的核苷酸序列的情形中，可通過搗碎線蟲而進行分離，以釋放表達的真核生物蛋白質，并將混合物進行層析純化，該層析純化具有特異性地與可識別的標記結合的固定相，隨后進行洗滌及在從固定相中釋放真核生物蛋白質的條件下進行洗脫，如在前述段落中示例的。
在所用質粒缺乏核定位信號的情形中，或者在需要防止真核生物蛋白質受到存在于細胞中的非特異性蛋白酶攻擊的額外預防情形中，如對于蛋白質是降解敏感性的情形，保護表達的蛋白質抗蛋白酶降解的可選擇的或補充途徑是注射獨立的質粒，如缺乏編碼蛋白酶切割位點的核苷酸序列和含有編碼通用蛋白酶抑制劑如α2-巨球蛋白(α2-M)的核苷酸序列SEQ ID NO11的SEQ ID NO1或2。
因而，在本發明方法額外優選的實施方案中，該方法包含額外注射質粒載體以共表達通用的蛋白酶抑制劑，該質粒載體包含可操作地相互連接的熱激啟動子核苷酸序列；任選地含有Shine-Dalgarno序列的合成內含子核苷酸序列；任選的編碼核定位信號的核苷酸序列；編碼可識別的標記的核苷酸序列；任選的編碼熒光蛋白質的核苷酸序列；編碼通用蛋白酶抑制劑的核苷酸序列，如編碼α2-巨球蛋白的通用蛋白酶抑制劑SEQ ID NO11；以及編碼翻譯終止的核苷酸序列。在該情形中，可識別的標記仍然位于表達的通用蛋白酶抑制劑上，且它將與標記特異性的柱子結合(在第二個和最后一個特異性柱步驟中連同(如6-His-)標記的蛋白酶和從真核生物蛋白酶中切除的(如10-His-)標記一起)。
秀麗新桿線蟲表達系統，包括質粒及在本發明的線蟲中生產真核生物如人類蛋白質或核酸分子的方法特別適合于大規模生產超純的重組真核生物蛋白質，特別是人類生長因子。生產的蛋白質將含有高等生物(真核生物)典型的修飾，如乙酰化、N-和O-連接的糖基化和酰化、磷酸化及信號序列的切割等。這些修飾對于信號通路中醫藥上有用的蛋白質的特異性是重要的。可應用本發明在工業規模上生產的人類(真核生物)蛋白質的例子包括用于干細胞基礎研究和醫學應用的人類生長因子、生長因子受體(膜結合的或可溶性部分)。此外有單克隆抗體、G-蛋白、G-蛋白偶聯受體。特別地，該系統設計為能夠在秀麗新桿線蟲和大腸桿菌之間進行穿梭，以研究翻譯后修飾的作用。它也使得能夠通過用預先標記的細菌飼喂線蟲而用可鑒定的標記(如2H、13C、15N、Se-Met、Se-Cys等)對秀麗新桿線蟲生產的蛋白質和核酸分子進行標記以進行NMR和X-射線晶體學研究。此外，秀麗新桿線蟲中真核生物蛋白質如人類蛋白質或核酸分子的表達也可依賴于選擇的信號肽而導向于細胞核保護性的蛋白酶降低的環境中或細胞的某些區室中。該系統也使得如果需要大的多亞基蛋白質-RNA復合物如聚合酶、端粒酶和剪接因子復合物的重建，則能夠同時從超過20個質粒中表達蛋白質。
本發明現在將進一步通過實驗描述進行闡明，且應理解為權利要求的范圍不受任何特定敘述的細節的限制。
實驗對秀麗新桿線蟲進行的所有操作均應用Methods in Cell Biology第84卷中“秀麗新桿線蟲生物的現代生物學分析(Caenorhabditiselegansmodern biological analysis of an organism)”(Epstein和Shakes編，Academic Press，1995)中的技術，或應用在此處描述的方法的小的修改。
通過將質粒DNA連同編碼unc-36(+)和hmp-1(+)的質粒一起注射入基因型為unc-36(e251)；hmp-1(zu278)/daf-11(m8ts)sma-1(e30)的蟲子中而構建了轉基因秀麗新桿線蟲品系(Costa等人，Journal of Cell Biology 141297-308 1998)。hmp-1(zu278)導致了胚胎致死表型(Costa等人，1998)。確立了基因型為unc-36(e251)；hmp-1(zu278)；svEx[unc-36(+)hmp-1(+)hs-gen-1(+)]的品系，其中“gen-1”指編碼人類生長因子的基因。
應用公認的程序將蟲子在33℃熱激2小時。(Stringham EG和Candido，EPM，Environmental Toxicology and Chemistry131211-1220 1994)。
表達載體構建為了在秀麗新桿線蟲中表達蛋白質，我們已基于質粒pPD49、78-umu、SEQ ID NO1、2、9和10構建了4個質粒載體，這使得基因能夠在許多不同細胞中進行熱誘導型表達。載體含有用于異位表達外源蛋白質的秀麗新桿線蟲熱激啟動子。該啟動子在低于25℃時是無活性的。然而，將培養溫度改變為30和33℃之間的值導致在幾百個體細胞中誘導蛋白質高水平的表達，在神經元和表皮細胞中具有最高表達水平。
設計載體以制備翻譯融合物。ATG的下游是質粒SEQ ID NO1和2中編碼6-His-標記的序列，其后為TEV蛋白酶切割位點和多克隆位點。
微注射和選擇為了確定單個蛋白質的表達水平，我們制備了幾個質粒，其中每一個均含有不同的檢驗基因及單獨的質粒的適當遺傳選擇標記。
我們將質粒連同編碼unc-36(+)和hmp-1(+)的質粒一起注射入基因型為unc-36(e251)；hmp-1(zu278)/daf-11(m8ts)sma-1(e30)的雌雄同體中。hmp-1(zu278)導致了胚胎致死表型(Costa等人，1998)。確立了基因型為unc-36(e251)；hmp-1(zu278)；svEx[unc-36(+)hmp-1(+)hs-gen-1(+)]的品系，其中“gen-1”指要檢驗的基因。
超過600bp的不同質粒之間的重組發生于體內，并獲得了轉化的第一代F1子代，其中不同注射的質粒一起形成附加體(稱作染色體外陣列)。10個F1轉化體中約有1個產生穩定的品系，其中染色體外陣列不變地從一代傳遞到下一代。染色體外陣列是相對穩定有絲分裂的，從而在任何轉化的動物中，大多數細胞含有該陣列。通過應用適當的編碼基本基因的共注射標記，可能獲得如下品系，其中群體中的所有成體和幼蟲均含有該陣列。
蛋白質表達秀麗新桿線蟲在20℃溫度控制的搖床上的錐形瓶中的液體培養基中進行培養。該液體生長培養基含有緩慢生長的大腸桿菌株OP50，線蟲以該品系為飼料。培養蟲子7日，其后將培養溫度從20℃改變為33℃而誘導熱激啟動子控制的蛋白質生產。
1升初始培養物中培養的濕蟲子的產量為約10g。綠色熒光蛋白質(GFP)在約25％的細胞中表達，并導致在熒光光學顯微鏡下可見的熒光信號。
10～20g培養的和誘導的蟲子中純蛋白質的產量約為0.2～1.0mg。
稱作Wnt2b的人類生長因子(智人無翅型MMTV整合位點家族2B成員)成功表達于蟲子中，該生長因子來自在多克隆位點包含核苷酸序列SEQ ID NO4的質粒SEQ ID NO1。
簡言之，線蟲是在簡單的液體培養基中培養的。它們生長于發酵罐或錐形瓶中。蟲子具有約2-3日的世代時間，且成體蟲子生長至約1mm長。每一個雌雄同體每世代生產約300-500只卵。它們可在-80℃重復的長時間貯藏。在向雌雄同體的生殖腺中注射高達20個不同質粒后可選擇穩定的品系。
序列表<110>Sauer，Uwe H.
Tuck，Simon<120>秀麗新桿線蟲中真核生物蛋白質和核酸分子的生產.
<130>110068601<140>
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<160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>3914<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明修飾的質粒<400>1atgaccatga ttacgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tcaagagcat 60ttgaatcaga atatggagaa cggagcatga gcattttcga agttttttag atgcactaga 120acaaagcgtg ttggcttcct ctgagcccgc tttccttata tacccgcatt ctgcagcctt 180acagaatgtt ctagaaggtc ctagatgcat tcgtttgaaa atactcccgg tgggtgcaaa 240gagacgcaga cggaaaatgt atctgggtct ctttattgtg tacactactt ttccatgtac 300cgaatgtgag tcgccctcct tttgcaacaa gcagctcgaa tgttctagaa aaaggtggaa 360aatagtataa ataccgttga aaataaatac cgaacaacat ttgctctaat tgtgaaatta 420gaaatcttca aactataatc atctcactgg atccccggga ttggccaaag gacccaaagg 480tatgtttcga atgatactaa cataacatag aacattttca ggaggacctt ggctagcaaa 540atgaaacatc accatcacca tcaccccatg agcgattacg acatccccac tactgagaat 600ctttattttc agggcgccat gggcgccagg cctcgagata tcgatgatca gatctggtac 660caagctccgc atcggccgct gtcatcagat cgccatctcg cgcccgtgcc tctgacttct 720aagtccaatt actcttcaac atccctacat gctctttctc cctgtgctcc caccccctat 780ttttgttatt atcaaaaaaa cttcttctta atttctttgt tttttagctt cttttaagtc 840acctctaaca atgaaattgt gtagattcaa aaatagaatt aattcgtaat aaaaagtcga 900aaaaaattgt gctccctccc cccattaata ataattctat cccaaaatct acacaatgtt 960ctgtgtacac ttcttatgtt ttttttactt ctgataaatt ttttttgaaa catcatagaa 1020aaaaccgcac acaaaatacc ttatcatatg ttacgtttca gtttatgacc gcaattttta 1080tttcttcgca cgtctgggcc tctcatgacg tcaaatcatg ctcatcgtga aaaagttttg 1140gagtattttt ggaatttttc aatcaagtga aagtttatga aattaatttt cctgcttttg 1200ctttttgggg gtttccccta ttgtttgtca agagtttcga ggacggcgtt tttcttgcta 1260aaatcacaag tattgatgag cacgatgcaa gaaagatcgg aagaaggttt gggtttgagg 1320ctcagtggaa ggtgagtaga agttgataat ttgaaagtgg agtagtgtct atggggtttt 1380
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<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明修飾的質粒<400>2atgaccatga ttacgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tcaagagcat 60ttgaatcaga atatggagaa cggagcatga gcattttcga agttttttag atgcactaga 120acaaagcgtg ttggcttcct ctgagcccgc tttccttata tacccgcatt ctgcagcctt 180acagaatgtt ctagaaggtc ctagatgcat tcgtttgaaa atactcccgg tgggtgcaaa 240gagacgcaga cggaaaatgt atctgggtct ctttattgtg tacactactt ttccatgtac 300cgaatgtgag tcgccctcct tttgcaacaa gcagctcgaa tgttctagaa aaaggtggaa 360aatagtataa ataccgttga aaataaatac cgaacaacat ttgctctaat tgtgaaatta 420gaaatcttca aactataatc atctcactgg atccccggga ttggccaaag gacccaaagg 480tatgtttcga atgatactaa cataacatag aacattttca ggaggacctt ggctagtgct 540cagaaaaaat gactgctcca aagaagaagc gtaaggtgcc catgaaacat caccatcacc 600atcaccccat gagcgattac gacatcccca ctactgagaa tctttatttt cagggcgcca 660tgggcgccag gcctcgagat atcgatgatc agatctggta ccaagctccg catcggccgc 720tgtcatcaga tcgccatctc gcgcccgtgc ctctgacttc taagtccaat tactcttcaa 780catccctaca tgctctttct ccctgtgctc ccacccccta tttttgttat tatcaaaaaa 840acttcttctt aatttctttg ttttttagct tcttttaagt cacctctaac aatgaaattg 900tgtagattca aaaatagaat taattcgtaa taaaaagtcg aaaaaaattg tgctccctcc 960ccccattaat aataattcta tcccaaaatc tacacaatgt tctgtgtaca cttcttatgt 1020tttttttact tctgataaat tttttttgaa acatcataga aaaaaccgca cacaaaatac 1080cttatcatat gttacgtttc agtttatgac cgcaattttt atttcttcgc acgtctgggc 1140ctctcatgac gtcaaatcat gctcatcgtg aaaaagtttt ggagtatttt tggaattttt 1200caatcaagtg aaagtttatg aaattaattt tcctgctttt gctttttggg ggtttcccct 1260attgtttgtc aagagtttcg aggacggcgt ttttcttgct aaaatcacaa gtattgatga 1320gcacgatgca agaaagatcg gaagaaggtt tgggtttgag gctcagtgga aggtgagtag 1380aagttgataa tttgaaagtg gagtagtgtc tatggggttt ttgccttaaa tgacagaata 1440cattcccaat ataccaaaca taactgtttc ctactagtcg gccgtacggg ccctttcgtc 1500tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 1560cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 1620ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 1680accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcggc 1740cttaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 1800tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 1860taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 1920tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 1980gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 2040gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 2100cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 2160tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 2220tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 2280atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 2340ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 2400gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 2460gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc 2520
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<223>人工序列說明綠色熒光蛋白編碼序列<400>8atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg ggtaagttta 180aacatatata tactaactaa ccctgattat ttaaattttc agccaacact tgtcactact 240ttctgttatg gtgttcaatg cttctcgaga tacccagatc atatgaaacg gcatgacttt 300ttcaagagtg ccatgcccga aggttatgta caggaaagaa ctatattttt caaagatgac 360gggaactaca agacacgtaa gtttaaacag ttcggtacta actaaccata catatttaaa 420ttttcaggtg ctgaagtcaa gtttgaaggt gatacccttg ttaatagaat cgagttaaaa 480ggtattgatt ttaaagaaga tggaaacatt cttggacaca aattggaata caactataac 540tcacacaatg tatacatcat ggcagacaaa caaaagaatg gaatcaaagt tgtaagttta 600aacttggact tactaactaa cggattatat ttaaattttc agaacttcaa aattagacac 660aacattgaag atggaagcgt tcaactagca gaccattatc aacaaaatac tccaattggc 720gatggccctg tccttttacc agacaaccat tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa 780gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt 840acacatggca tggatgaact atacaaatag 870<210>9<211>4718<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明修飾的質粒<400>9atgaccatga ttacgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tcaagagcat 60ttgaatcaga atatggagaa cggagcatga gcattttcga agttttttag atgcactaga 120acaaagcgtg ttggcttcct ctgagcccgc tttccttata tacccgcatt ctgcagcctt 180
acagaatgtt ctagaaggtc ctagatgcat tcgtttgaaa atactcccgg tgggtgcaaa 240gagacgcaga cggaaaatgt atctgggtct ctttattgtg tacactactt ttccatgtac 300cgaatgtgag tcgccctcct tttgcaacaa gcagctcgaa tgttctagaa aaaggtggaa 360aatagtataa ataccgttga aaataaatac cgaacaacat ttgctctaat tgtgaaatta 420gaaatcttca aactataatc atctcactgg atccccggga ttggccaaag gacccaaagg 480tatgtttcga atgatactaa cataacatag aacattttca ggaggaccct tggctagcga 540attcaaaatg atatcagaga atctttattt tcagggcagt aaaggagaag aacttttcac 600tggagttgtc ccaattcttg ttgaattaga tggtgatgtt aatgggcaca aattttctgt 660cagtggagag ggtgaaggtg atgcaacata cggaaaactt acccttaaat ttatttgcac 720tactggaaaa ctacctgttc catgggtaag tttaaacata tatatactaa ctaaccctga 780ttatttaaat tttcagccaa cacttgtcac tactttctgt tatggtgttc aatgcttctc 840gagataccca gatcatatga aacggcatga ctttttcaag agtgccatgc ccgaaggtta 900tgtacaggaa agaactatat ttttcaaaga tgacgggaac tacaagacac gtaagtttaa 960acagttcggt actaactaac catacatatt taaattttca ggtgctgaag tcaagtttga 1020aggtgatacc cttgttaata gaatcgagtt aaaaggtatt gattttaaag aagatggaaa 1080cattcttgga cacaaattgg aatacaacta taactcacac aatgtataca tcatggcaga 1140caaacaaaag aatggaatca aagttgtaag tttaaacttg gacttactaa ctaacggatt 1200atatttaaat tttcagaact tcaaaattag acacaacatt gaagatggaa gcgttcaact 1260agcagaccat tatcaacaaa atactccaat tggcgatggc cctgtccttt taccagacaa 1320ccattacctg tccacacaat ctgccctttc gaaagatccc aacgaaaaga gagaccacat 1380ggtccttctt gagtttgtaa cagctgctgg gattacacat ggcatggatg aactatacaa 1440acatcaccat caccatcact aatgagagct ccgcatcggc cgctgtcatc agatcgccat 1500ctcgcgcccg tgcctctgac ttctaagtcc aattactctt caacatccct acatgctctt 1560tctccctgtg ctcccacccc ctatttttgt tattatcaaa aaaacttctt cttaatttct 1620ttgtttttta gcttctttta agtcacctct aacaatgaaa ttgtgtagat tcaaaaatag 1680aattaattcg taataaaaag tcgaaaaaaa ttgtgctccc tccccccatt aataataatt 1740ctatcccaaa atctacacaa tgttctgtgt acacttctta tgtttttttt acttctgata 1800aatttttttt gaaacatcat agaaaaaacc gcacacaaaa taccttatca tatgttacgt 1860ttcagtttat gaccgcaatt tttatttctt cgcacgtctg ggcctctcat gacgtcaaat 1920catgctcatc gtgaaaaagt tttggagtat ttttggaatt tttcaatcaa gtgaaagttt 1980atgaaattaa ttttcctgct tttgcttttt gggggtttcc cctattgttt gtcaagagtt 2040tcgaggacgg cgtttttctt gctaaaatca caagtattga tgagcacgat gcaagaaaga 2100tcggaagaag gtttgggttt gaggctcagt ggaaggtgag tagaagttga taatttgaaa 2160gtggagtagt gtctatgggg tttttgcctt aaatgacaga atacattccc aatataccaa 2220acataactgt ttcctactag tcggccgtac gggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat 2280gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 2340gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 2400tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 2460ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc ggccttaagg gcctcgtgat 2520acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac 2580ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat 2640gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag 2700tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc 2760tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc 2820acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc 2880cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc 2940ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt 3000ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt 3060
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<223>人工序列說明修飾的質粒<400>10atgaccatga ttacgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tcaagagcat 60ttgaatcaga atatggagaa cggagcatga gcattttcga agttttttag atgcactaga 120acaaagcgtg ttggcttcct ctgagcccgc tttccttata tacccgcatt ctgcagcctt 180acagaatgtt ctagaaggtc ctagatgcat tcgtttgaaa atactcccgg tgggtgcaaa 240gagacgcaga cggaaaatgt atctgggtct ctttattgtg tacactactt ttccatgtac 300cgaatgtgag tcgccctcct tttgcaacaa gcagctcgaa tgttctagaa aaaggtggaa 360aatagtataa ataccgttga aaataaatac cgaacaacat ttgctctaat tgtgaaatta 420gaaatcttca aactataatc atctcactgg atccccggga ttggccaaag gacccaaagg 480tatgtttcga atgatactaa cataacatag aacattttca ggaggaccct tggctagcga 540
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1.用于在秀麗新桿線蟲中表達的質粒載體，該載體以5’到3’的轉錄方向包含可操作地相互連接的熱激啟動子核苷酸序列；任選地含有Shine-Dalgarno序列的合成內含子核苷酸序列；任選的編碼核定位信號或分泌信號的核苷酸序列；編碼可識別的標記的核苷酸序列；任選的編碼熒光蛋白質的核苷酸序列；編碼蛋白酶切割位點的核苷酸序列；含有編碼真核生物如人類的蛋白質或核酸分子的核苷酸序列的多克隆位點以及編碼翻譯終止的核苷酸序列。
2.權利要求1的質粒載體，其中對核苷酸序列順序進行更改，以使得多克隆位點之后為編碼蛋白酶切割位點的核苷酸序列、任選的編碼熒光蛋白質的核苷酸序列、任選的編碼核定位信號或分泌信號的核苷酸序列和編碼可識別的標記的核苷酸序列。
3.權利要求1或2的質粒載體，其中合成的內含子核苷酸序列含有Shine-Dalgarno序列AGGAG，編碼核定位信號的核苷酸序列是SEQID NO3，編碼可識別的標記的序列是編碼6-His、10-His或12-His標記的序列，編碼熒光蛋白質的核苷酸序列是編碼綠色熒光蛋白質的具有序列SEQ ID NO8的核苷酸序列，編碼蛋白酶切割位點的核苷酸序列是編碼TEV蛋白酶切割位點的序列。
4.權利要求1或3的質粒載體，其中缺乏編碼真核生物蛋白質或核酸分子的核苷酸序列的質粒具有核苷酸序列SEQ ID NO1。
5.權利要求1或3的質粒載體，其中缺乏編碼真核生物蛋白質或核酸分子的核苷酸序列的質粒具有核苷酸序列SEQ ID NO2。
6.權利要求2或3的質粒載體，其中缺乏編碼真核生物蛋白質或核酸分子的核苷酸序列的質粒具有核苷酸序列SEQ ID NO9。
7.權利要求2或3的質粒載體，其中缺乏編碼真核生物蛋白質或核酸分子的核苷酸序列的質粒具有核苷酸序列SEQ ID NO10。
8.權利要求1-7中任何一項的質粒載體，其中編碼真核生物蛋白質的核苷酸序列是編碼人類生長因子蛋白質的序列。
9.權利要求8的質粒載體，其中編碼人類生長因子蛋白質的序列選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。
10.在線蟲中生產真核生物如人類的蛋白質或核酸分子的方法，該方法包含如下步驟，即，將一種或幾種權利要求1-9中任何一項的質粒載體注射入秀麗新桿線蟲雌雄同體的生殖腺中，于低于25℃的溫度在生長培養基中培養線蟲，隨后將培養溫度改變為30和33℃之間的值，以在幾百個體細胞中誘導蛋白質或核酸分子的表達，在神經元和表皮細胞中具有最高表達水平，并從該細胞中分離真核生物蛋白質或核酸分子。
11.權利要求10的方法，其中生長培養基包含任選地進行標記的細菌作為線蟲的飼料。
12.權利要求11的方法，其中用可鑒定標記對細菌進行標記，對于蛋白質的表達，該標記選自2H、13C、15N、Se-Met、Se-Cys和非天然氨基酸，對于核酸分子的表達，該標記選自2H、13C、15N的可鑒定標記。
13.權利要求10的方法，其中在質粒包括編碼核定位信號的核苷酸序列的情形中，可通過謹慎地打開線蟲以打開含有表達的蛋白質的細胞而進行分離，從而使細胞核保持完整，隨后分離細胞核，并溶解核膜以釋放表達的蛋白質或核酸分子，及將混合物進行層析純化，該純化對于蛋白質包括特異性地與可識別的標記結合的固定相，隨后進行洗滌，并在通過提供特異性蛋白酶而從可識別的標記蛋白釋放真核生物蛋白質的條件下進行洗脫，該特異性蛋白酶相應于由所用質粒編碼的蛋白酶切割位點且具有未切割的可識別標記，同時，對從固定相釋放標記的低濃度試劑進行透析，將切割混合物轉移到新標記特異性的柱子上，該切割混合物含有具切除標記的真核生物蛋白質和具有未切割的可識別標記的蛋白酶，洗脫柱子以獲得含有真核生物蛋白質的洗脫液，而留下切除的可識別標記和含有可識別標記的蛋白酶結合于固定相上。
14.權利要求10的方法，其中在質粒缺乏編碼核定位信號的核苷酸序列的情形中，通過搗碎線蟲而進行分離，以釋放表達的蛋白質或核酸分子，并將混合物進行層析純化，該層析純化對于蛋白質包括特異性地與可識別的標記結合的固定相，隨后進行洗滌及在從固定相中釋放真核生物蛋白質的條件下進行洗脫。
15.權利要求10-14中任何一項的方法，該方法包含額外注射質粒載體以共表達通用的蛋白酶抑制劑，該質粒載體包含可操作地相互連接的熱激啟動子核苷酸序列；任選地含有Shine-Dalgarno序列的合成內含子核苷酸序列；任選的編碼核定位信號的核苷酸序列；編碼可識別的標記的核苷酸序列；任選的編碼熒光蛋白質的核苷酸序列；編碼通用蛋白酶抑制劑的核苷酸序列，以及編碼翻譯終止的核苷酸序列。
16.權利要求15的方法，其中編碼通用蛋白酶抑制劑的核苷酸序列是編碼α2-巨球蛋白的SEQ ID NO11。
全文摘要
描述了一種秀麗新桿線蟲中的質粒表達載體，該載體具有熱誘導型啟動子核苷酸序列、任選地含有用于在秀麗新桿線蟲和大腸桿菌之間有效穿梭的Shine－Dalgarno序列的合成內含子核苷酸序列、任選的編碼核定位信號或分泌信號的核苷酸序列、編碼可識別的標記的核苷酸序列、任選的編碼熒光蛋白質的核苷酸序列、編碼蛋白酶切割位點的核苷酸序列、含有編碼真核生物如人類的蛋白質或核酸分子的核苷酸序列的多克隆位點以及編碼翻譯終止的核苷酸序列。也描述了在線蟲中特別大規模地生產真核生物如人類的蛋白質和核酸分子的方法。該方法包含將一種或幾種不同的質粒載體注射入秀麗新桿線蟲雌雄同體的生殖腺中，于低于25℃的溫度在生長培養基中培養線蟲，任選地包含作為線蟲飼料的標記的細菌，隨后改變為30－33℃，以在幾百個體細胞中誘導真核生物蛋白質或核酸分子的表達，在神經元和表皮細胞中具有最高表達水平，并從該細胞中分離真核生物蛋白質或核酸分子。
文檔編號C12P21/02GK1617930SQ02827596
公開日2005年5月18日 申請日期2002年11月26日 優先權日2001年11月27日
發明者烏韋·H·索爾, 西蒙·塔克 申請人:內克西特股份有限公司