專利名稱：甘油二酯的生產方法
技術領域：
本發明涉及有效生產高純度甘油二酯的方法。
背景技術：
甘油二酯可作為一種添加劑，提高油或脂肪的可塑性，或用于食品、藥品、化妝品等領域。近來，食品利用甘油二酯優良的生理活性受到關注。
甘油二酯典型的生產過程需要酯化反應或酯交換反應。例如，在固定化1，3-特異脂肪酶存在下，通過脂肪酸或它的低碳烷基酯和甘油反應，減壓從體系中取出上面反應產生的水或低級醇的過程是已知(特開昭6-65311)。
因為不僅甘油二酯，而且甘油三酯均是用1，3-特異脂肪酶通過酯化反應制備的，反應收率的升高降低甘油二酯的純度。另一方面，反應收率的降低升高甘油二酯的純度，但殘留大量未反應的甘油或脂肪酸。為了升高甘油二酯的純度，因此酯化反應后必然需要純化步驟，例如汽提。
一個克服上述問題的方法，提出通過使用不作用于甘油三酯的偏甘油酯脂肪酶制備不含甘油三酯的甘油酯(特開平61-181390)。然而這種方法不適合制備高純度甘油二酯，因為單酸甘油酯是此方法的主要產物。
工業上應用的傳統酯化反應需要從體系中除去反應過程中產生的水，并移動反應平衡來增加反應收率。當使用偏甘油酯脂肪酶的酯化反應減壓除去體系中的水時，包括的問題例如，在終止前停止酯化反應。同樣建議一種方法(特開昭1-137989)，用偏甘油酯脂肪酶作用于含偏甘油酯和脂肪酸的油或脂肪合成甘油三酯，使用固定化酶在低水含量下進行酯化反應。這是減少單酸甘油酯和甘油二酯的甘油三酯合成過程，與制備高純度的甘油二酯的方法有本質上的區別。
當通過酯化反應合成甘油二酯時，高收率得到高純度甘油二酯的最適宜反應終點依賴于底物比，如脂肪酸或其對應甘油的酯的原料、反應溫度、酶的濃度等。特別是當為了提高反應速率而提高脂肪酸或其對應甘油的酯的比率時，通過延長反應來提高反應收率導致例如甘油三酯的生成引起的甘油二酯純度的降低的問題。
發明內容
因此本發明的一個目的是提供一種甚至在減壓時也不損傷脂肪酶的活性，有效生產高純度甘油二酯的方法。
本發明的另一個目的是提供一種特別是當脂肪酸/甘油比率高時，不受脂肪酸/甘油比率、反應溫度或酶濃度的變化的影響，生產高純度甘油二酯的方法。
發明人發現和存在不固定的偏甘油酯脂肪酶的反應相比，通過存在固定化偏甘油酯脂肪酶時，脂肪酸或它的低碳烷基酯與甘油反應，同時除去反應體系中反應產生的水，甘油二酯的產生率大幅增加，并且可以高收率的獲得高純度的甘油二酯。發明人還發現當反應混合物的酸度落入預先確定的與脂肪酸或其低碳烷基酯對甘油的填料比率相關的范圍內時終止反應，可以在盡可能高的產率下產生高純度的甘油二酯。
因此本發明的一個方面是提供一種制備甘油二酯的方法，其包括存在固定化偏甘油酯脂肪酶時，使脂肪酸或它的低碳烷基酯與甘油反應，同時除去反應體系中反應產生的水。
本發明的另一個方面也是提供上述制備甘油二酯的方法，其中當反應混合物的酸度(AV)落入50R-55＞AV＞70R-150(條件是AV＞0)的范圍內時終止反應。
最佳實施方式本發明中使用的偏甘油酯脂肪酶是一種水解偏甘油酯，如單酸甘油酯和甘油二酯，但不水解甘油三酯的脂肪酶。這種偏甘油酯脂肪酶的例子包括來源于動物器官如大鼠的小腸或豬的脂肪組織的單酸甘油酯脂肪酶或甘油二酯脂肪酶、來源于Bacillus sp.H-257(J.Biochem.，127，419-425，2000)的單酸甘油酯脂肪酶、來源于Pseudomonas sp.LP7315(Journal of Bioscience and Bioengineering，91(1)，27-32，2001)的單酸甘油酯脂肪酶、來源于Penicillium cyclopium(J.Biochem.，87(1)，205-211，1980)的脂肪酶和來源于Penicillium camembertii U-150(J.Fermentation and Bioengineering，72(3)，162-167，1991)的脂肪酶。它的可購得的產品的例子包括“單酸甘油酯脂肪酶(MGLPII)”(Asahi Kasei公司產品)和“Lipase G Amano 50”(Amino Enzyme有限公司產品)。特別是當用多元不飽和脂肪酸(意味著具有至少四個雙鍵的不飽和脂肪酸)或它的低碳烷基酯作為反應底物時，優選使用最適宜溫度在30℃或更高，但低于50℃的范圍內的偏甘油酯脂肪酶。
本發明中使用的固定化偏甘油酯脂肪酶含有固定到載體上的上述偏甘油酯脂肪酶。固定載體的例子包括無機載體，例如C鹽、硅藻土、高嶺土、硅膠、分子篩、多孔玻璃、活性炭、碳酸鈣和陶瓷；有機聚合物，例如纖維素粉、聚乙烯醇、聚丙烯、聚氨基葡糖、離子交換樹脂、疏水吸附樹脂、螯合樹脂或合成吸附樹脂。從保水能力來考慮特別優選固定到合成吸附樹脂上的偏甘油酯脂肪酶。
作為離子交換樹脂，優選多孔陰離子交換樹脂。此樹脂顆粒的尺寸優選100到1000μm，同時理想的孔的尺寸是100到1500。當樹脂是孔狀時，酶吸附的表面積變大，導致吸附的量增加。苯酚-甲醛、聚苯乙烯、丙烯酰胺和二乙烯基苯可用作此樹脂的原料。特別期望的是酚醛樹脂(商品名“Duolite A-568”)。
在酶不失活的范圍內偏甘油酯脂肪酶固定的溫度沒有限制，可以是0到60℃，特別優選5到30℃。用于固定的酶的水溶液的pH值可落在不導致酶變性的范圍內，優選3到9。特別是當使用的脂肪酶的最適宜pH是酸性的時，為了獲得最大活性，pH值優選調整到4到6。作為制備酶的水溶液的緩沖液，可使用通常采用的緩沖液例如醋酸緩沖液、磷酸緩沖液和Tris-HCL緩沖液。從固定有效性的角度，偏甘油酯脂肪酶在酶水溶液中的濃度優選低于此酶的溶解度但卻是有效的濃度。如果需要，離心分離除去不溶的部分后，上清可使用。相對于1重量份的固定載體，偏甘油酯脂肪酶的優選使用量是0.05到10重量份，特別是0.1到5重量份。
在本發明中，為了賦予固定載體一種允許高活性出現的吸附狀態，優選固定前用一種或多種親脂脂肪酸或其衍生物處理固定載體。它們可以單獨使用，但兩種或多種聯合使用將更有效。作為這些親脂脂肪酸或其衍生物與固定載體的接觸方法，可以將它們加到水或有機溶劑里，或可選的，為了改善親脂脂肪酸或其衍生物的分散性，它們可以先分散或溶解在有機溶劑里，然后加入分散在水里的固定載體中。此有機溶劑的例子包括氯仿、己烷和乙醇。相對于1重量份的固定載體，這些親脂脂肪酸或其衍生物可加入的量為0.01到1重量份(干重)，特別優選0.05到0.5重量份。接觸溫度的范圍在1到100℃，特別優選20到60℃。接觸時間可以從5分鐘到5小時。上述處理后過濾收集固定載體。收集后將其干燥。干燥溫度范圍優選室溫到100℃。干燥也可以在減壓下進行。
用于處理固定載體的親脂脂肪酸的例子包括具有4到24個碳原子，可被羥基取代的直鏈或支鏈，飽和或不飽和脂肪酸。優選例包括C8-18脂肪酸，含直鏈飽和脂肪酸，例如癸酸、月桂酸和肉豆蔻酸，不飽和脂肪酸，例如油酸和亞油酸，羥脂肪酸，例如蓖麻油酸，和支鏈脂肪酸，例如異硬脂酸。親脂脂肪酸的衍生物的例子包括C8-18脂肪酸和含羥基的化合物的酯，例如一元醇酯、多元醇酯、磷脂和通過在作為例子的酯上加氧丙環得到的衍生物。一元醇酯的例子包括甲酯和乙酯，同時那些多元醇酯包括單酸甘油酯、甘油二酯、這些甘油酯的衍生物、聚甘油脂肪酸酯、失水山梨糖醇脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯。從這個處理步驟便利的角度考慮，這些脂肪酸或其衍生物優選常溫下的液體狀態。對于這些脂肪酸或其衍生物，可使用上述脂肪酸的混合物，例如天然脂肪酸，如大豆脂肪酸。
存在固定化的偏甘油酯脂肪酶時，本發明的反應中使用的脂肪酸或其低碳烷基酯和甘油之間的反應用的脂肪酸，優選是飽和的或不飽和的C4-22脂肪酸。例子包括丁酸、戊酸、己酸、enantoic acid、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、肉豆蔻酸、軟脂酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、反油酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十二烷酸、芥酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。作為可以和上述脂肪酸形成酯的低級醇，優選具有1到3個碳原子的低級醇。C1-3低級醇的例子包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇。上述脂肪酸或其低碳烷基酯可以聯合使用。也可以使用脂肪酸的混合物，例如天然脂肪酸，如大豆脂肪酸。
上述反應中脂肪酸或其酯和甘油反應優選的摩爾比R[R＝脂肪酸或其低碳烷基酯(mol)/甘油(mol)]為1.5到2.6，更優選1.6到2.5，特別是1.8到2.3。
存在固定化的偏甘油酯脂肪酶，同時從體系中除去反應產生的水，脂肪酸或其酯和甘油之間的反應可以實現。更具體的是此反應在基本上無水的條件下進行(除了脂肪酶制劑中含的水外)，通過例如減壓，使用吸收劑，如沸石或分子篩，或向反應罐內通入干燥惰性氣體除去酯化反應產生的水。
酯化反應的溫度根據原料或產物的熔點，或使用的酶的熱穩定性而不同，但優選20到80℃，根據反應性特別優選30到70℃。特別是當多元不飽和脂肪酸或其烷基酯用作反應底物時，反應溫度優選設在30℃或更高，但低于50℃。從工業生產的角度，反應時間優選在10小時以內。
本發明的方法可以生產具有80wt％或更高，更優選85wt％或更高，特別優選90wt％或更高甘油二酯純度[甘油二酯/(甘油二酯+甘油三酯)x100]的甘油二酯，反應產率(反應混合物中甘油二酯和甘油三酯的總重量的百分比)高達60wt％或更高，優選65wt％或更高，更優選70wt％或更高。
為了提高獲得的甘油二酯的純度，反應進行中在合適時間間隔測定反應混合物的酸度(AV)。為了獲得60wt％或更高的反應產率和80wt％或更高的甘油二酯純度，優選當酸度落入下面范圍內時終止反應50R-55＞AV＞70R-150(條件是AV＞0)。為了獲得70wt％或更高的反應產率和85wt％或更高的甘油二酯純度，更優選當酸度落到下面范圍內時終止反應50R-70＞AV＞70R-145(條件是AV＞0)，為了獲得80wt％或更高的反應產率和90wt％或更高的甘油二酯純度，特別優選當酸度落到下面范圍內時終止反應50R-80＞AV＞70R-140(條件是AV＞0)。
當反應在上述條件下進行時，可以以盡可能高的反應產率產生高純度的甘油二酯，而不受各種變化的影響，即便是反應條件中如原料底物比率、反應溫度或酶的濃度。當反應終止于高于上述范圍的酸度時，因為雖然有高甘油二酯純度，但反應產率低，無法得到高產率。另一方面，當反應終止于低于上述范圍的酸度時，反應混合物中甘油三酯的比率提高，導致無法得到足夠的甘油二酯純度。因此不優選將反應終止于上述范圍外的酸度。
實施例實施例110克“Duolite A-568”(Rohm & Haas產品，平均顆粒尺寸480μm)在0.1mol/L氫氧化鈉水溶液中攪拌1小時。攪拌后，用100mL的500mM的醋酸緩沖液(pH5)2小時建立起反應混合物的pH平衡。然后用100mL的50mM的醋酸緩沖液(pH5)2小時建立起pH平衡。過濾混合物收集載體，接下來用50mL乙醇進行乙醇取代30分鐘。過濾后，加入50mL含有10克蓖麻油酸的乙醇，使此蓖麻油酸吸附到載體上30分鐘。過濾收集后，載體用50mM的醋酸緩沖液(pH5)50mL洗滌四次。然后除去乙醇，過濾殘余，收集載體。接著，溶解于180mL的50mM醋酸緩沖液(pH5)中的20克可購得的偏甘油酯脂肪酶(脂肪酶G“Amano”50，Amano Enzyme有限公司產品)的溶液和載體接觸2小時，使脂肪酶固定在載體上。過濾收集固定化的酶，用50mM的醋酸緩沖液(pH5)50mL洗滌除去沒有固定的酶或蛋白質。上述操作均在20℃進行。從固定后酶溶液的剩余活性和固定前酶溶液的活性的差異測定固定率，結果為95％。實際反應中加入大豆脂肪酸(40克)作為底物，接下來40℃減壓脫水。然后從大豆脂肪酸中過濾分離殘余，由此得到固定化酶。
在200mL的四頸燒瓶中稱取這樣得到的固定化酶(20克，干重8克)。加入大豆脂肪酸和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為2.0)，隨后40℃減壓酯化反應7小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為9.6。三甲硅烷基化作用后，反應混合物進行氣相色譜，分析甘油酯成分和未反應的底物。結果見表1。可見反應產率為90.4％，二酰基甘油(DG)的純度高達96.7％。
實施例2和實施例1的方式類似，使用破碎成平均顆粒尺寸為320μm的“Duolite A-568”作為載體制備固定化酶。
在200mL的四頸燒瓶中稱取這樣得到的固定化酶10克(干重4克)。加入大豆脂肪酸和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為2.0)，隨后50℃減壓酯化反應7小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為8.6。用和實施例1類似的方式分析反應混合物，結果反應產率為89.1％，DG的純度高達96.9％。
實施例3在200mL的四頸燒瓶中稱取實施例1中得到的固定化酶10克(干重4克)。加入大豆脂肪酸和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為2.0)，隨后50℃減壓酯化反應3小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為33.4。用和實施例1類似的方式分析反應混合物，結果反應產率為71.0％，DG的純度高達99.1％。
實施例4在200mL的四頸燒瓶中稱取實施例1中得到的固定化酶10克(干重4克)。加入大豆脂肪酸和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為2.0)，隨后50℃減壓酯化反應2.6小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為44.4。用和實施例1類似的方式分析反應混合物，結果反應產率為65.6％，DG的純度高達99.2％。
實施例5在200mL的四頸燒瓶中稱取實施例1中得到的固定化酶20克(干重8克)。加入大豆脂肪酸和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為1.83)，隨后40℃減壓酯化反應8小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為5.2。用和實施例1類似的方式分析反應混合物，結果反應產率為82.9％，DG的純度高達92.9％。
實施例6在200mL的四頸燒瓶中稱取實施例1中得到的固定化酶20克(干重8克)。加入大豆脂肪酸和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為2.25)，隨后40℃減壓酯化反應4小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為22.6。用和實施例1類似的方式分析反應混合物，結果反應產率為84.0％，DG的純度高達90.5％。
實施例7在200mL的四頸燒瓶中稱取實施例1中得到的固定化酶20克(干重8克)。加入大豆脂肪酸和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為2.47)，隨后40℃減壓酯化反應3.3小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為33.2。用和實施例1類似的方式分析反應混合物，結果反應產率為80.2％，DG的純度高達90.0％。
對比實施例1在200mL的四頸燒瓶中稱取4克1，3-特異脂肪酶“LipozymeRMIM”(Novozymes產品)。加入大豆脂肪酸和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為2.0)，隨后50℃減壓酯化反應7小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為2.6。用類似的方式分析反應混合物，結果反應產率為90.8％，DG的純度低至72.6％。
對比實施例2在200mL的四頸燒瓶中稱取2克可購得的未固定的偏甘油酯脂肪酶(Lipase G“AMANO”50，Amano Enzyme有限公司產品)。加入大豆脂肪酸和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為2.0)，隨后40℃減壓酯化反應7小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為140.4。用類似的方式分析反應混合物，結果反應產率為14.6％。反應沒有繼續進行，剩余大量沒有反應的底物。
對比實施例3在200mL的四頸燒瓶中稱取實施例1中得到的固定化酶10克(干重4克)。加入大豆脂肪酸和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為2.0)，隨后50℃減壓酯化反應2.2小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為57.0。用和實施例1類似的方式分析反應混合物。結果DG的純度高達99.3％，但反應產率低至59.8％。
對比實施例4在200mL的四頸燒瓶中稱取實施例1中得到的固定化酶20克(干重8克)。加入大豆脂肪酸和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為2.25)，隨后40℃減壓酯化反應11小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為7.0。用和實施例1類似的方式分析反應混合物，結果反應產率是94.4％，DG的純度低至71.4％。
對比實施例5在200mL的四頸燒瓶中稱取實施例1中得到的固定化酶20克(干重8克)。加入大豆脂肪酸和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為2.47)，隨后40℃減壓酯化反應8小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為18.0。用和實施例1類似的方式分析反應混合物，結果反應產率是89.8％，DG的純度低至66.3％。
表1
FA脂肪酸 Gly甘油MG單酸甘油酯DG甘油二酯TG甘油三酯本發明的制備方法(實施例1到7)可以以極高產率制備甘油二酯的純度為90％或更高的甘油二酯。
實施例8實施例1的固定化酶用含多元不飽和脂肪酸的脂肪酸(DHA含量44wt.％)洗滌，所述酸是實際反應的底物。在200mL的四頸燒瓶中稱取得到的固定化酶20克(干重8克)。加入含多元不飽和脂肪酸的脂肪酸(DHA含量44wt.％)和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為2.30)，隨后40℃減壓酯化反應45小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為27.8。然后反應混合物進行HPLC，分析甘油酯成分和未反應的底物。另外，展開點了反應混合物的TLC板(展開劑∶氯仿/丙酮/甲醇＝93.5/4.5/2.0vol.％)，以分開每一種甘油酯。乙酸乙酯洗脫和去溶劑后，脂肪酸成分用GC分析。結果見表2。可見反應產率為74.2％，甘油二酯(DG)的純度高達85.3％，同時甘油二酯中DHA的含量高達44％。
實施例9在200mL的四頸燒瓶中稱取洗滌后的實施例1中得到的固定化酶20克(干重8克)。加入含多元不飽和脂肪酸的脂肪酸(DHA含量44％)和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為1.87)，隨后40℃減壓酯化反應165小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為3.6。然后用和實施例8類似的方式分析反應混合物，結果反應產率是83.8％，DG的純度高達88.3％，同時DG中DHA的含量高達37％。
對比實施例6在200mL的四頸燒瓶中稱取4克可購得的固定化酶1，3-特異脂肪酶“Lipozyme RMIM”(Novozymes生產)。加入含多元不飽和脂肪酸的脂肪酸(DHA含量44％)和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為2.36)，隨后50℃減壓酯化反應48小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為45.2。用和實施例8類似的方式分析反應混合物，結果反應產率為57.1％，DG的純度低至65.8％。
對比實施例7在200mL的四頸燒瓶中稱取洗滌后的實施例1中得到的固定化酶20克(干重8克)。加入含多元不飽和脂肪酸的脂肪酸(DHA含量44％)和甘油(總共80克，脂肪酸/甘油的摩爾比為2.66)，隨后40℃減壓酯化反應18小時，同時在合適的時間間隔測量反應混合物的酸度。當時反應混合物的酸度為30.6。然后用和實施例8類似的方式分析反應混合物，結果反應產率是77.2％，DG的純度低至66.2％。
表2
權利要求
1.一種制備甘油二酯的方法，所述方法包括存在固定化偏甘油酯脂肪酶時，使脂肪酸或它的低碳烷基酯與甘油反應，同時除去反應體系中反應產生的水。
2.如權利要求1所述的方法，其中脂肪酸或其低碳烷基酯和甘油的反應摩爾比R[R＝脂肪酸或其低碳烷基酯(mol)/甘油(mol)]的范圍為1.5到2.6。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中通過將偏甘油酯脂肪酶固定到預先用親脂脂肪酸或其衍生物處理過的固定載體上得到固定化偏甘油酯脂肪酶。
4.如權利要求1至3中任意一項所述的方法，其中以反應產率(反應混合物中甘油二酯和甘油三酯的總重量百分比)為60wt％或更高生產甘油二酯純度[甘油二酯/(甘油二酯+甘油三酯)×100]為80wt％或更高的甘油二酯。
5.如權利要求1至4中任意一項所述的方法，其中反應混合物的酸度(AV)落入下面范圍時終止反應50R-55＞AV＞70R-150(條件是AV＞0)。
全文摘要
本發明提供了甘油二酯的制備方法，其包括存在固定化偏甘油酯脂肪酶時，使脂肪酸或它的低碳烷基酯與甘油反應，同時除去反應體系中反應產生的水。優選當反應混合物的酸度(AV)落入下面范圍時終止反應50R－60＞AV＞70R－150(條件是AV＞0)。本發明可以甚至在減壓時也不損傷脂肪酶的活性，而有效生產高純度甘油二酯。本發明的實施不受反應條件如脂肪酸/甘油比率、反應溫度或酶濃度的變化的影響。具體地說，甚至當脂肪酸/甘油比率很高時，可以以高反應產率生產高純度的甘油二酯。
文檔編號C12P7/62GK1615365SQ0282709
公開日2005年5月11日 申請日期2002年12月27日 優先權日2002年1月15日
發明者佐藤學, 清水雅美, 小堀純, 加瀨實, 渡邊高明, 小野塚和洋 申請人:花王株式會社