專利名稱：芽孢桿菌種(dsm 14390)的新型堿性蛋白酶以及包含該新型堿性蛋白酶的洗滌產品和清 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及枯草芽孢桿菌種(DSM 14390)的新的枯草直菌素型堿性蛋白酶及其十分相關的蛋白和衍生物。本發明還涉及含有此枯草芽孢桿菌的新的枯草桿菌素型堿性蛋白酶、十分相關的蛋白及其衍生物的洗滌產品和清潔產品，相應的洗滌和清潔方法以及其在洗滌和清潔產品中的用途，以及可能的其他技術用途。
枯草桿菌素(subtilisin)型蛋白酶(Subtilase，枯草桿菌肽酶，EC3.4.21.62)，特別是枯草桿菌素由于催化活性的氨基酸被劃歸為絲氨酸蛋白酶。其是由微生物，特別是芽孢桿菌種天然產生和分泌的。它們起著非特異內肽酶的作用，也就是說它可水解任何位于肽或蛋白質內部的酰胺鍵。其最適pH大多處于明顯的堿性范圍。有關該家族的綜述例如可見R.Bott和C.Betzel主編，New York，1996年出版的“Subtilisinenzymes”第75-95頁中由R.Siezen撰寫的文章“Subtilases枯草桿菌素樣-蛋白酶(Subtilisin-like Proteases)”。枯草桿菌素適合于多種可能的技術應用，如用作化妝品的組分，特別是用作洗滌劑或清洗劑的活性成分。
酶是洗滌和清潔產品中已確立的活性成分。在這方面，蛋白酶分解待清潔材料，諸如織物或硬表面上的類蛋白質(proteinaceous)污漬。在有利情形下，在酶和相關產品的其他成分之間存在協同效應。這例如描述在US 6008178中。由于它們有利的酶特性，諸如穩定性或最適合pH，枯草蛋白素在洗滌和清潔產品蛋白酶中脫穎而出。最重要的枯草蛋白素及其技術開發方面的最重要對策如下所述。
洗滌產品蛋白酶的開發是基于優選由微生物產生的天然酶。它們被本身已知的誘變方法，例如點突變、缺失、插入或與其他蛋白或蛋白部分融合，或者通過其他修飾方法而得以優化用于洗滌和清潔產品。
因此，例如，根據申請WO 93/07276，蛋白酶164-A1得自芽孢桿菌種164-A1，并由Chemgen Corp.，Gaithersburg，MD，USA和VistaChemical Company，Austin，TX，USA提供，適用于洗滌和清潔產品中。其他例子為來自芽孢桿菌種PD138的堿性蛋白酶，Novozymes的NCIMB 40338(WO 93/18140)，Kao Corp.，Tokyo，Japan的來自芽孢桿菌種ferm.BP-3376的蛋白酶K-16(US 5344770)，以及根據WO 96/25489(Procter & Gamble，Cincinnati，OH，USA)，來自嗜冷生物體大比目魚黃桿菌(Flavobacterium balustinum)的蛋白酶。其他微生物源、適用于洗滌和清潔產品的蛋白酶從下列專利文獻中也是已知的例如來自假單胞菌(Pseudomonas)(WO 00/05352)，來自綠僵菌(Metarrhizium)(EP 601005)，來自親堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)DMS 6845或DSM 5466(DE 4411223)和其他多種微生物(WO 95/07350，EP 1029920，EP 578712，WO 01/00764，US 6197740，WO 01/16285)。
枯草桿菌素BPN’分別來自解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，已公開在下列文獻中Vasantha等(1984)，J.Bacteriol.，第159卷，第811-819頁和J.A.Wells等(1983)，Nucleic Acids Research，第11卷，第7911-7925頁。枯草桿菌素BPN’用作枯草桿菌素的對照酶，尤其有關位置的編號。申請CA2049097公開了這種分子的多種變體，尤其是有關它們在洗滌和清潔產品中的穩定性。變體在該酶的環區中通過點突變而獲得，并且同時以水解速率增加的方式與底物結合降低，例如示出在專利申請WO 95/07991和WO 95/30010中。含有這種BPN’變體的洗滌產品例如公開在專利申請WO 95/29979中。
蛋白酶枯草桿菌素Carlsberg由E.L.Smith等人(1968)在J.Biol.Chem.，第243卷，第2184-2191頁和由Jacobs等人(1985)在Nucl.AcidsRes.，第13卷，第8913-8926頁的出版物中進行了介紹。其天然來自于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，并分別可從GenencorInternational Inc.，Rochester，New York，USA以商品名Maxatase以及從丹麥Novozymes A/S公司，Bagsvaerd以商品名Alcalase購得。通過點突變所獲得的變體在提高水解速率的同時對底物的結合減少，公開在例如申請WO 96/28566 A2中。在這些變體分子的環區中進行了一個或多個的替換。
蛋白酶PB92天然產自于親堿細菌芽孢桿菌新種92和以商品名Maxacal從荷蘭的Gist-Brocades公司，Delft獲得。其原始序列已在專利申請EP 283075 A2中述及。已通過點突變獲得并適用于洗滌劑和清洗劑中的所述酶的變體，例如，在申請WO 94/02618和EP 328229中公開。
枯草桿菌蛋白酶147和309被Novozymes公司分別以商品名Esperase以及Savinase銷售。其來源于芽孢桿菌菌株，在申請GB1243784中作了公開。例如在申請WO 94/02618(參見上文)，WO89/06279，WO 95/30011和WO 99/27082中公開了通過點突變開發的該酶的變體在洗滌產品和清洗產品中使用的情況。申請WO 89/06279旨在獲取更高的氧化穩定性，增加的水解速率以及改善的洗滌性能。該申請揭示了在特點位置上的取代改變了枯草桿菌素147或309分子的物理或化學特性。申請WO 95/30011介紹了在分子環區中具有點突變的枯草桿菌素309的變體，并因此展示對底物的吸附減少，同時水解速率增加。申請WO 99/27082通過例子方式開發了枯草桿菌素309的變體，其洗滌性能通過插入至少一個氨基酸擴大活性環而得以增強。
遲緩芽孢桿菌(B.lentus)的堿性蛋白酶為得自于芽孢桿菌種(Bacillus species)的高堿性蛋白酶。野生型酶衍生自親堿性芽孢桿菌菌株，其自身顯示對氧化具有相對高的穩定性和去污劑的作用。根據申請WO 91/02792(EP 493398和US 5352604)，該菌株的保藏號為DSM 5483。根據同樣申請，該酶可在地衣芽孢桿菌宿主中異源表達。其三維結構描述在下列文獻中Goddette等(1992)，J.Mol.Biol.，第228卷，第580-595頁“遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶枯草桿菌素BL的1.4分辨率的晶體結構(The crystal structure of the Bacillus lentusalkaline protease，Subtilisin BL，at 1.4 resolution)”。該酶的變體可通過點突變獲得，并適用于洗滌和清潔產品中，公開在WO 92/21760(US 5340735，US 5500364和US 5985639)和WO 95/23221(US 5691295，US 5801039和5855625)。WO 95/23221中的對策，即精心改變靠近底物結合口袋處的電荷條件，解釋在US 6197589中。該蛋白酶的其他變體描述在尚未公布的申請DE 10121463和DE 10153792中。
枯草桿菌素DY最初描述在Nedkov等1985，Biol.Chem Hoppe-Seyler，第366卷，第421-430頁。根據申請WO 96/28557，例如，其可通過在活性環中的特異性點突變而得以優化，產生具有吸附減少而水解速率增加的變體，用于洗滌劑和清洗劑中。
酶thermitase確定為subtilase，不再確定為枯草桿菌素(參照，R.Siezen，第75-95頁，“枯草桿菌素酶(Subtilisin enzymes)”，由R.Bott和C.Betzel公開，New York，1996)，并且由普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris)天然產生，最初由Meloun等(FEBS Lett.1983，第195-200頁)描述。例如，申請WO 96/28558公開了由環區中的替換產生具有吸附減少和水解速率增加的變體。然而，thermitase為一種分子，其序列整體上相當大地偏離了其他枯草桿菌素的那些分子。
蛋白酶K也是一種例如與遲緩芽孢桿菌(B.lentus)堿性蛋白酶具有相對低的同源性的subtilase。蛋白酶K最初來自微生物林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)并且已在下列文獻中加以描述K.-D.Jany和B.Mayer 1985，Biol.Chem.Hoppe-Seyler，第366卷，第485-492頁。申請WO 96/28556公開了多種蛋白酶K的變體，這些變體通過點突變獲得并具有對底物的吸附降低和水解速率的增加。
最后，WO 88/07581公開了非常相似的蛋白酶TW3和TW7，尤其是用于洗滌和清潔產品中。
例如，申請EP 199404，EP 251446，WO 91/06637和WO 95/10591描述了其他蛋白酶，這些蛋白酶適合于技術用途，尤其用于洗滌劑和清洗劑。申請EP 199404的蛋白酶為多種不同的BPN’變體，基于專利EP 130756。EP 251446公開了許多BPN’變體，這些變體通過替換單個氨基酸獲得。申請WO 91/06637的蛋白酶的特征為BPN’在位置123和/或位置274的點突變。WO 95/10591揭示了主要為遲緩芽孢桿菌蛋白酶的變體，這些變體在位置76發生突變，并且在其他位置也有突變。
其他已知的蛋白酶例如為可獲自Novozymes公司的商品名為Durazym，Relase，Everlase，Nafizym，Natalase和Kannase，Genencor公司的商品名為Purafect，Purafect OxP和Properase，印度AdvancedBiochemicals Ltd.公司，Thane的商品名為Protosol和中國Wuxi SnyderBiopruducts Ltd.的商品名為Wuxi的蛋白酶。
一個改善枯草桿菌素洗滌功效的對策為在已知分子中隨機或特異性用其他氨基酸替換單個氨基酸以及測試所獲得變體對洗滌功效的作用。該對策的獲取來自上述各個申請，例如EP 130756中所示的一些其他進展。酶的變應原性(allergenicity)例如根據WO 99/49056，WO 99/49057和WO 01/07575，采用某些氨基酸替換或缺失而得以提高。
為改善枯草桿菌素的洗滌功效，許多申請運用了將其它氨基酸插入在活性環中的對策，例如除已述的申請WO 99/27082外，還有以下述公布號WO 00/37599，WO 00/37621至WO 00/37627和WO 00/71683至WO 00/71691所公開的申請。因此，所述對策在原理上應該適用于所有枯草桿菌素，這些枯草桿菌素隸屬于亞組I-S1(真正枯草桿菌素)或I-S2(高堿性枯草桿菌素)。
另一提高性能的對策為修飾分子的表面電荷和/或等電點，由此改變它們與底物的相互作用。例如在下列文獻中公開了這種變化US 5665587和申請EP 405901，EP 945502 A1，WO 91/00334和WO 91/00345。WO 92/11348公開了在分子電荷中減少pH依賴性變化的點突變。從該原理中，申請WO 00/24924衍生出一種識別變體的方法，這些變體推測適用于洗滌和清潔產品中；所有在此公開的變體具有至少一個在位置103的替換，優選多個含有與本申請無關的替換的變體。根據WO 96/34935，為了提高洗滌和清潔產品的性能，也可能增加分子的疏水性，而這會影響酶的穩定性。
申請WO 99/20727公開了如通過申請WO 00/24924的方法所得到的枯草桿菌素變體它們全部包含至少一個在位置103的取代，以及多個其他可能的替換。申請WO 99/20723和WO 99/20726公開了相同的用于洗滌和清潔產品的突變體，這些突變體另含有淀粉酶或漂白劑。
調節蛋白酶效率的另一方法是形成融合蛋白。因此，例如，申請WO 98/13483和WO 00/01831公開了包括蛋白酶和抑制劑，諸如鏈霉菌枯草桿菌素抑制劑的融合蛋白。例如，根據WO 97/28243或WO 99/57250，另一可能的方法是結合到來自纖維素酶的纖維素結合區(CBD)中，從而增加活性酶在底物的直接鄰近處中的濃度。根據WO 99/48918，變應原性或免疫原性通過結合肽接頭及其上的聚合物而得以減少。
例如，在WO 99/20769中，揭示了由于隨機產生的氨基酸替換和隨后的選擇，變體的性能改善。例如在申請WO 97/09446中，揭示了基于噬菌體展示體系的隨機方法，用于開發蛋白酶在洗滌和清潔產品中的應用。
現代的酶發展方向是將已知蛋白的相互有關的元件通過統計方法結合成到新酶中，使其具有乞今未達到的性能。這樣的方法也概括地稱為指導演化法，并包括例如下述的方法StEP-法(Zhao等人(1998)，Nat.Biotechnol.，第16卷，第258-261頁)，隨機引發重組法(Shao等人(1998)，Nucleic Acids Res.，第26卷，第681-683頁)，DNA-改組(shuffling)法(Stemmer，W.P.C.(1994)，Nature，第370卷，第389-391頁)或回歸序列重組法(RSR；WO 98/27230，WO 97/20078，WO 95/22625)或RACHITT(Coco，W.M.等人(2001)，Nat.Biotechnol.，第19卷，第354-359頁)。這些方法的綜述提供在下列在先文章中“GerichteteEvolution und Biokatalyse”，Powell等(2001)，Angew.Chem.，第113卷，第4068-4080頁。
另一特別的補充對策為提高所涉及蛋白酶的穩定性和由此增加其作用效能。例如在US 5230891中敘述了通過與聚合物結合提高了蛋白酶在化妝品中的穩定性；所述穩定性伴隨著皮膚相容性的增強。尤其對洗滌劑和清洗劑而言，與其不同，常用的穩定法是借助于點突變。因此按照US 6087315和US 6110884，采用其他氨基酸殘基替換特定的酪氨酸殘基可使蛋白酶穩定。WO 89/09819和WO 89/09830描述了通過氨基酸替換獲得的相對熱穩定的BPN’變體。其他通過點突變來提高穩定性的可能的例子為-根據WO 92/19729，和分別根據EP 583339和US 5858757，以及根據EP 516200，以脯氨酸替換特定的氨基酸殘基；-按照EP 525610，EP 995801和US 5453372向分子表面引入更高極性或較多電荷的基團；-增強金屬離子的結合，特別是通過突變鈣結合位點，例如按照申請WO 88/08028和WO 88/08033的教導；-通過修飾或突變阻斷自消化，例如根據WO 98/20116或US 5543302；-組合如在申請EP 398539 A1中公開的多個穩定對策；-根據US 5340735，US 5500364，US 5985639和US 6136553，與穩定性相關的位置可通過分析三維結構而找到。
為了增加洗滌或清潔性能，例如文獻EP 755999和WO 98/30669公開了蛋白酶可與α-淀粉酶和其他洗滌產品用酶一起使用。例如，EP 791046公開了與脂肪酶組合的可能性。例如，申請WO 95/10592揭示了先前在WO 95/10591中描述的用于洗滌產品中的變體也適用于漂白劑。例如，US 6121226公開了同時把蛋白酶和去污劑用于洗滌產品中。
例如，申請WO 97/07770公開了一些已確定用于洗滌產品中的蛋白酶也適用于化妝品目的。例如在申請EP 380362 A1中描述了蛋白酶其他可能的技術應用。這涉及有機化學合成，并且根據該申請，據說適用于此的枯草桿菌素是那些通過點突變而穩定的枯草桿菌素。
在此以示例方式提出的各種技術領域要求具有不同特性的蛋白酶，所述特性例如涉及反應條件，穩定性或底物特異性。相反，蛋白酶技術應用的可能性例如在洗滌或清潔產品配方的情形下，依賴于其他因素，諸如酶對溫度的穩定性，對氧化劑的穩定性，通過表面活性劑的變性，折疊作用或者與其他成分所需的協同效應。
因此，對蛋白酶繼續存在大量需求，所述蛋白酶技術上可用，并且由于其眾多的應用領域，在整體上覆蓋大范圍的特性，包括性能上非常細小的差別。
這種需求的基礎通過新型蛋白酶而擴大，而新型蛋白酶反過來又能夠進一步開發靶向具體的應用領域。
因此，本發明目的是基于發現另一尚未知曉的蛋白酶。預計野生型酶優選的特征在于，當用于合適的產品中時，它至少接近于已確定用于此目的的酶。在這方面，尤其感興趣的是有助于洗滌或清潔產品性能的提高。
另一次要目的是提供編碼此種蛋白酶的核酸，并且提供載體，宿主細胞以及可用來獲得此種蛋白酶的制備方法。其進一步的目的是提供相應的產品，尤其是洗滌和清潔產品，相應的洗滌和清潔方法，還有相應的此種蛋白酶的可能用途。最后，旨在限定所發現的蛋白酶的可能的技術應用。
目的的實現來自枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列與SEQID NO.2所示的氨基酸序列具有至少98.5％的同一性。
在各種情況下，那些與來自芽孢桿菌種(DSM 14390)的新型堿性蛋白酶的同一性程度提高的酶優選性增加。
因此，在本發明各種內在的方面，其他目的或次要目的的實現包括核酸，所述核酸的序列與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或編碼本發明蛋白酶的核苷酸序列具有足夠的相似性，并且包括合適的載體，細胞或宿主細胞以及制備方法。本發明還提供相應的產品，尤其是洗滌和清潔產品，相應的洗滌和清潔產品，以及相應的此種蛋白酶的可能的應用。最后，限定了所發現的蛋白酶的可能的技術用途。
根據本申請，蛋白表示由天然氨基酸組成的聚合物，基本上為線性結構，并且通常采用三維結構發揮其功能。本申請是指19種生成蛋白的天然L-氨基酸，國際上以1-字和3-字代碼表示。任意這些名稱和數字的組合表示特定蛋白在各自位置所攜帶的氨基酸殘基。相同的命名建立在點突變上。除非另有所述，所示的位置是指相關蛋白的各種成熟形式，即無信號肽(參見下文)。
根據本申請，酶是指一種蛋白質，它起著某種生化功能。蛋白酶或者具有蛋白酶解功能的酶例如，通常理解為那些水解蛋白質的酰胺鍵(特別是那些位于蛋白質內部的鍵)的蛋白酶或酶，因此它們也被叫做內肽酶。枯草桿菌素蛋白酶就是這樣的內肽酶，其由革蘭氏陽性菌天然形成并且一般是分泌型的，或者是由其例如通過分子生物方法從后者衍生的，并且經部分區域例如形成結構的或者攜帶官能團的區域與天然枯草桿菌素蛋白酶成為同系物。它們被指定為subtilase。例如描述在R.Siezen的文章“Subtilases枯草桿菌素樣-蛋白酶”，《枯草桿菌素酶》(“Subtilisin enzymes”)第75至95頁，由R.Bott和C.Betzel編輯，New York，1996。
很多蛋白質，作為所謂的蛋白前體(Praproteine)，與一個信號肽一起形成。在這種情況下，信號肽表示這種蛋白的N-末端，其功能通常是保證形成的蛋白質從生產細胞釋放到胞質或者周圍的介質中，和/或保證其正確的折疊。然后信號肽在自然狀態下被一種信號肽酶從原始蛋白上切下來，從而使蛋白在初始沒有N末端氨基酸的情況下具有其真正的催化活性。
由于它們的酶活性，成熟的肽即合成后經處理的酶比起蛋白前體來說在技術應用上更受青睞。
前體蛋白(Pro-Proteine)就是沒有活性的蛋白前體。其具有信號序列的前體(Vorlaufer)被稱作前體蛋白的前體(Pra-Pro-Proteine)。
根據本申請，核酸是那些天然由核苷酸組成并被稱作信息載體的分子，其用于編碼蛋白質或酶中的線性氨基酸序列。它們可能是單鏈的，也可能是互補于此單鏈的單鏈，或者是雙鏈。對于分子生物學工作而言，作為天然永久的信息載體，這些核酸DNA更適用于分子生物學工程。相比之下，為了在自然環境中例如在正在表達的細胞中實施本發明，形成RNA，從而對于本發明有很重要作用的RNA分子亦代表本發明的實施方案。反過來，例如通過反轉錄，(c)DNA分子可從中得以衍生。
根據本申請，對應于蛋白質的核酸信息單元被稱作基因。在DNA中，所有三種可能的讀碼框中的兩條互補鏈的序列都必須考慮到。此外，需要注意的是，不同的密碼三聯體可編碼同一種氨基酸，因此，某種特定氨基酸序列可以從許多不同的并且也許僅有非常低同一性的核苷酸序列(遺傳密碼子的簡并性)得到。除此以外，不同的生物在應用密碼子上也存在差異。由于這些原因，不管是氨基酸序列還是核苷酸序列都必須列入保護范圍，并且公開的核苷酸序列在每種情況下應只被看作編碼某氨基酸序列的舉例。
在目前常用方法的幫助下，如化學合成或者聚合酶鏈式反應(PCR)，結合分子生物學和/或蛋白質化學的標準方法，專業技術人員已經能夠根據已知DNA和/或氨基酸序列生產完整的基因。這種方法是已知的，例如公開在“生化百科全書(Lexikon der Biochemie)”，Spektrum Akademischer Verlag，Berlin，1999，第1卷，第267-271頁和第2卷，第227-229頁上。具體而言，如果采用保藏在菌種保藏機構的菌株，這也是可能的。例如，利用基于已知序列合成的PCR引物或通過分離的mRNA分子，有可能進行合成，克隆以及如果需要進一步加工，例如從這些菌株中突變處理目的基因。
核苷酸序列的變化，諸如那些通過本身已知的分子生物學方法得到的變化被稱為突變。根據變化的類型，已知突變分為例如缺失突變、插入突變、替代突變，或者不同的基因或基因的不同部分被相互融合在一起(“改組”)的突變；這些就是基因突變。與此相關的生物就稱為突變體。從這些突變核酸中得到的蛋白被稱為變體。例如，缺失突變、插入突變、替代突變或者融合導致了基因的缺失突變、插入突變、替代突變或融合，以及在蛋白質水平上，導致對應的缺失變體、插入變體或者替代變體或者融合蛋白。
根據本申請，載體被認為是由核酸組成的元件，這些元件包括一個目的基因作為特征核酸區。它們能夠在物種或細胞系中經若干代或細胞分裂作為穩定的遺傳元件建立所述基因，所述遺傳元件能夠獨立于基因組的其他部分復制。載體是特殊的質粒，即環形的遺傳元件，尤其是它們被用于細菌的時候。在基因工程中，用于儲存進而進行基因操作的載體(即所謂的克隆載體)與在宿主細胞中生成目的基因即促進特定蛋白表達的載體是有區別的。這些載體都被認為是表達載體。
包括所述載體的細菌細胞和真核生物細胞不管其差異，都統稱為細胞。含有載體，特別是表達載體并因此可被誘導表達轉基因的細胞稱為宿主細胞，因為它們內含相關的基因體系。
同源化是一種核酸或氨基酸序列與已知基因或蛋白的比較。例如，通過比對進行。同源性的度量為同一性的百分比，如通過下列文獻中所示方法可加以確定D.J.Lipman和W.R.Pearson，Science227(1985)，第1435-1441頁。該信息在各種情況下可指完整蛋白或待指定的區域。比同源性概念更寬的是相似性，也包括保守變異，即具有相似化學活性的氨基酸，因為考慮到它們在蛋白內通常具有相似的化學活性。對核酸而言，僅僅知道同一性的百分比。
通過同源化，從氨基酸或核苷酸序列中有可能推測出單個序列區域的功能，以及所涉及的完整酶的活性。不同蛋白之間的同源區域具有可比較的功能，這些功能在一級氨基酸序列中可被識別為同一性或保守替換。它們包括單個氨基酸，稱作盒的非常小的區域，其在氨基酸一級序列中的長度有數個氨基酸，一直至長的區域。因此，同源區的功能理解上也包括由完整蛋白所實施功能的非常小的部分功能，例如單個氫鍵的形成或底物的絡合或者過渡絡合物。不參與真正酶法反應的蛋白的其他區域可對它們進行定性或定量修飾。例如，這涉及酶的穩定性，活性，反應條件或底物特異性。
因此，術語蛋白水解酶或蛋白酶表示除催化活性部位的少量氨基酸殘基的功能外的所有功能，這些功能是通過其余蛋白質全部或其一部分或大部分對真正的催化活性區域的影響而產生的。根據本發明，這些修飾的功能或部分活性，只要它們有助于蛋白酶解反應，單獨也被認為是蛋白酶解活性。輔助功能或者部分活性包括，例如底物的結合、中間產物或者終產物的結合、激活或抑制或介導對水解活性的控制效果。另一種可能的例子是形成遠離活性中心的結構單元。對于本發明的水解蛋白質來說，第二個前提條件正是通過真正的活性殘基本身的化學行為或者附加地通過修飾部分的作用獲得肽鍵的水解。此外同樣可以通過例如本發明蛋白質的一個或多個部分定性或定量地修飾其它蛋白酶的活性。其它因素的影響也被認為是蛋白酶解活性。活性蛋白酶同樣也是那些其活性在給定的時間例如通過抑制劑而封閉的酶。它們主要適于進行相應的蛋白酶解反應是至關重要的。
片段是指那些比天然蛋白質或那些對應于完全翻譯的基因更短并且例如也可通過合成得到的任何蛋白或者肽。由于它們的氨基酸序列，它們可涉及相應的完整蛋白。例如它們可以具有相同的結構，或可發揮蛋白水解活性或者部分活性。片段及初始蛋白的缺失變體基本上是一樣的。然而，片段是相對較小的，缺失變體只是缺失小區域因此僅缺乏個別的部分功能。
根據本申請，嵌合或者雜交蛋白是由那些來自相同或不同生物的不同多肽鏈天然產生的元件組成的蛋白。這個過程也就是改組或融合突變。融合的目的是例如，在融合部分本發明的蛋白的幫助下生成或者修飾某種酶的功能。
通過插入突變得到的蛋白被稱為是變體，這種變體能夠通過本身已知的方法把核酸片段或蛋白片段插入到起始序列中而得到。因為它們的原理相同，應將它們規類為嵌合蛋白中。在這些嵌合蛋白中，區別僅在于蛋白的不變部分與整個蛋白的大小比例不同。在插入突變蛋白中，外源蛋白的比例低于嵌合蛋白。
倒置突變，即部分序列的倒置，被看作一種缺失和插入的特殊形式。同樣適用于分子不同部分的重組，這與原始的氨基酸序列相異。這也可以被看作是一種缺失變體，作為原始蛋白的插入變體或者改組變體。
根據本申請，衍生物是指其純的氨基酸鏈已經化學修飾的蛋白。這種衍生化作用可通過宿主生物以生物方法結合蛋白合成進行。分子生物學的方法可以用于此目的，例如與確保相關修飾的基因共轉化。然而，這些衍生物也可以化學方法來實施，例如將氨基酸的側鏈化學轉化或者通過共價結合將另一個化合物結合到蛋白上。該化合物可以是如通過雙官能化合物與本發明所述的蛋白結合的其他蛋白。當結合的底物是抑制劑時，這種修飾例如可以影響底物的特異性或者與該底物的結合強度，或者導致酶活性的暫時性凍結。例如這對于儲存的時間也是有用的。衍生化作用也被認為對大分子支持物的共價結合。
根據本發明，所有的酶、蛋白、片段、融合蛋白及衍生物被集體的冠以上位概念蛋白，除非它們需要清晰的指稱。
酶的性能在各種情形下被認為是在所屬技術領域里的功效，優選在相應定向的產品的范圍。所述性能是基于實際的酶解活性，但是也依賴于其他與這個過程相關的因素。這些因素包括例如穩定性、底物結合、與攜底物的物質相互作用或與其他成分相互作用，尤其是協同作用。
根據本申請，洗滌劑的洗滌或清潔性能是指所涉及的產品對含污物品例如織物或者具有硬表面的物體所發揮的效果。評價這些產品中的單個組分例如單個酶對完整的洗滌或清潔產品的洗滌或清潔性能的作用。畢竟由一種酶的酶解性能不可能輕易地推斷出所述酶對產品的洗滌功效的作用。在除去污物時，在這里發揮作用的其它因素例如有穩定性、底物結合、待洗滌物與所述洗滌或清潔產品中的其它成分的結合和相互作用，尤其是協同效應在除去污漬時也起重要作用。
本發明的基礎是天然生成的枯草桿菌素型堿性蛋白酶，如從實施例中確認的，可獲自菌株芽孢桿菌種(DSM 14390)的培養上清液。
依據1997年4月28日鑒定的布達佩斯條約對微生物保藏機構的國際認可，該菌株于2001年3月1日保藏在德意志微生物保藏中心(theDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH)(DSMZ)Mascheroder Weg 1b，38124 Brunswick(http//www.dsmz.de)。其名稱為ID 01-191，保藏號為DSM 14390。有關該生物材料特征的標準信息，如2001年4月19日DSMZ對保藏菌株所確定的，編輯在表1(實施例1)中。
本專利申請遵循的對策是在天然產地發現一種產蛋白酶的微生物，以及由此發現最大可能地滿足所述的要求的一種天然產生的酶。
可發現這樣一種酶，如本申請的實施例中所述，其以堿性蛋白酶的形式存在，來自芽孢桿菌種(DSM 14390)。
正如所確立的，超出了由德意志微生物保藏中心(DSMZ)所進行的生化鑒定，并且顯示在實施例1的表1中，該菌株分泌蛋白水解活性。根據本申請的示例性實施方案，這一直加以研究，并可進行如下描述根據SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，其為26kD的蛋白，等電聚焦確定等電點為11。對底物AAPF的比活性為69U/mg。在50℃確定時，其最適pH為11。
根據本發明，芽孢桿菌種(DSM 14390)的新型堿性蛋白酶的核苷酸序列以SEQ ID NO.1示于本申請的序列表中。其包含1143bp。從其衍生的氨基酸序列示于SEQ ID NO.2中。其包含380個氨基酸，后面為終止密碼子。前111個氨基酸極可能不存在于成熟蛋白中，因此，成熟蛋白的長度預計為269個氨基酸。
如實施例2中所述，將這些序列與已知蛋白酶序列比較，這些已知序列一般來自可達的數據庫Swiss-Prot(Geneva Bioinformatics(GeneBio)S.A.，Geneva，Switzerland；http//www.genebio.com/sprot.html)和GenBank(National Center for Biotechnology Information NCBI，National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA)。
通過該途徑，在DNA水平上，下列3種基因被鑒定成最相似的完整基因(1)來自親堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)(ID ELYA_BACAO)的枯草桿菌素P92具有90％的同一性，(2)來自芽孢桿菌Ya-B(ID ELYA_BACSP)的堿性彈性酶具有72％的同一性以及(3)來自仙臺芽孢桿菌(Bacillus Sendai)(ID Q45522)的仙臺枯草桿菌素具有69％的同一性。
在氨基酸水平，那些鑒定成最相似的完整前體蛋白的前體為(1)來自親堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)(ID ELYA_BACAO)的枯草桿菌素P92具有98％的同一性，(2)來自芽孢桿菌Ya-B(ID ELYA_BACSP)的堿性彈性酶具有80％的同一性，以及(3)來自仙臺芽孢桿菌(BacillusSendai)(ID Q45522)的仙臺枯草桿菌素具有73％的同一性。
在氨基酸水平，那些被鑒定成最相似的成熟蛋白為(1)來自遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)(ID SUBS_BACLE)的枯草桿菌素309(Savinase)具有99％的同一性，也就是說在成熟蛋白內只有3種不同的氨基酸；接著是親堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)(ID ELYA_BACAO)的枯草桿菌素P92具有98％的同一性，或者有5個不同的位置，以及(3)遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)DSM5483(ID SUBB_BACLE)的遲緩桿菌堿性蛋白酶具有97％的同一性，或者有8個氨基酸不同。
其他相似的酶列在實施例2中的表2中，并且在
圖1中對成熟蛋白的氨基酸序列與本發明來自芽孢桿菌種(DSM 14390)的堿性蛋白酶進行比對。
在鑒定的一致性以及與其他所示枯草桿菌素的關系基礎上，這種堿性蛋白酶被認為是枯草桿菌素。
因此，本發明的一個主題為每一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少98.5％的同一性。
其中，愈加優選的是那些酶的氨基酸序列與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列分別具有至少98.6％，98.7％，98.75％，98.8％，98.9％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％和100％的同一性。
這是因為，可以預計其特性與芽孢桿菌種(B.sp.)(DSM 14390)的堿性蛋白酶具有增加的相似性。
如上所述，在比較N-端序列的基礎上，第1-111位氨基酸假設為前導肽，并且根據SEQ ID NO.2，成熟蛋白設想從112位延伸到380位。因此，位置381被一個終止密碼子占據，由此實際上不對應氨基酸。然而，由于有關編碼區終點的信息可被視為氨基酸序列的重要組分，因此，根據本發明，該位置包括在對應于成熟蛋白的區域中。
因此，在這方面，本發明的一個實施方案為每一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列在112位至381位與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少99.3％的同一性。
其中，愈加優選的是那些酶的氨基酸序列在112位到381位與SEQID NO.2所示的氨基酸序列分別具有至少99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％和100％的同一性。
例如，通過N-端測序由芽孢桿菌種(DSM 14390)體內釋放的酶解蛋白，根據SEQ ID NO.2，如果出現切割位點不位于的111位和112位之間，則在此情形下，這些敘述涉及實際的成熟蛋白。
在這方面，本發明的一個實施方案為每一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其衍生自一種核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少92.5％的同一性，尤其在對應于SEQ ID NO.2中所示位置112到位置381的部分區域上。
其中，愈加優選的是那些酶衍生的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中所示核苷酸序列分別具有至少93％，93.5％，94％，94.5％，95％，95.5％，96％，96.5％，97％，97.5％，98％，98.2％，98.4％，98.6％，98.8％，99％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％和100％的同一性，尤其是在對應于SEQ ID NO.2中所示位置112到位置381的部分區域上。
這是因為，可以預計，這些核酸編碼蛋白，其特性逐漸相似于那些來自芽孢桿菌種(DSM 14390)的堿性蛋白酶，尤其是成熟蛋白。如果出現蛋白的切割位點位于上述位置以外的其他地方，在這種情形下亦是如此，至于下列所有實施方案，這些敘述涉及實際的成熟蛋白也是真實的。
在這方面，本發明的最優選的實施方案為每一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列整體上與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列是相同的，優選在其112位到381位相同，和/或其氨基酸序列整體上與從SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中衍生的氨基酸序列是相同的，優選在SEQ ID NO.2所示的位置112到位置381中相同。
這是因為，這樣一種序列構成了本申請可提供的新發現的芽孢桿菌種(DSM 14390)的堿性蛋白酶。
這種蛋白酶在現有技術中是尚未知曉的。如實施例中所述，其可進行分離，制備和使用。同樣如實施例中所記載的，它另外的特征為在適當產品的應用中，接近或者在某些情況下甚至超過為此目的建立的酶的性能。
作為微生物天然產生的酶，其可用作出發點，以開發工業用蛋白酶，所述蛋白酶可具體用于洗滌產品中，目的是通過本身已知的突變方法，例如點突變，片段化，缺失，插入或與其他蛋白或蛋白部分融合，或者通過其他修飾方法來優化目的用途。這種優化作用可例如適用于溫度效應，pH變化，氧還條件和/或其他與應用技術領域相關的影響因素。迫切需要的例子是如下改進對氧化的抗性，對變性劑或蛋白酶降解的穩定性，對高溫，酸性或強堿性條件的穩定性，對鈣離子或其他輔助因子的靈敏度的變化，以及免疫原性或變應原作用的減少。
為此目的，例如應用WO 00/36069的教導，通過靶向的點突變，可改變參與催化或底物結合的表面電荷或環。后者公開在例如WO 95/30011，WO 99/27082，WO 00/37599，WO 00/37621至WO 00/37627和WO 00/71683至WO 00/71691中。例如應用申請WO 92/21760和WO 95/23221的教導，可以進行尤其是通過基因工程方法導入的其他修飾。為此的出發點是本申請中圖1所示的比對。這使得目的位置成為可能，這些位置描述在所述申請中，因為芽孢桿菌種(DSM 14390)的蛋白酶推導自已知酶，并且通過本身已知的方法適當加以改變。
突變方法是基于SEQ ID NO.1中所示的相關核苷酸序列，或者與其足夠相似的核苷酸序列，并且在下文描述成本發明的單獨主題。適當的分子生物學方法描述在現有技術中，例如Fritsch，Sambrook和Maniatis“分子克隆實驗室手冊”，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，New York，1989。
在特別優選的實施方案中，點突變導致在相應蛋白酶的性能中的改善，尤其是導致其對相應產品的洗滌或清潔性能的貢獻的改善。本申請的實施例顯示，本發明芽孢桿菌種(DSM 14390)的蛋白所顯示的性能在某些情況下好于非常相似的Savinase酶和遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶。正如可從圖1的比對中推導出的，芽孢桿菌種(DSM 14390)的蛋白酶與Savinase在3個位置上有區別位置224(根據本發明蛋白酶的氨基酸編號，如SEQ ID NO.1所示)，V代替A；位置250，G代替S；以及位置253，N代替S。通過與遲緩芽孢桿菌(DSM 5483)的堿性蛋白酶比較，存在同樣的差異。該酶的其他差異為位置97的S代替D(根據本發明蛋白酶的氨基酸編號，如SEQ ID No.1中所示)，位置99的S代替R，位置101的S代替A，位置102的V代替I，以及位置157的G代替S。因此，特別優選落入上述保護范圍內的蛋白酶，其具有一個或多個對應于芽孢桿菌種(DSM 14930)的蛋白酶的氨基酸位置。其中，更特別優選的是那些在位置224，250和253分別具有三種氨基酸V，G和/或N中的一個或多個的蛋白酶。
本發明的其他實施方案為通過片段化或缺失突變而衍生自上述本發明枯草桿菌型堿性蛋白酶的所有蛋白或片段，并具有愈加優選的至少225，230，235，240，245，250，260，265，270，275，280，285，290，300，310，320，330，340，343，350和360個氨基酸，它們已經連接在初始分子中，并位于出發氨基酸序列的開始，內部或結束處，或者那些具有愈加優選的40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，220，240，260，280，300，320，340，343和360個氨基酸，它們已經連接在初始分子中，并且包括根據SEQ ID NO.1所示氨基酸編號的位置224。
從圖1的比對中顯而易見，芽孢桿菌種(DSM 14390)的成熟蛋白酶的氨基酸序列根據SEQ ID NO.1中的氨基酸編號直到位置224或者根據比對編號直到位置230與遲緩芽孢桿菌的蛋白酶(SUBS_BACLE，Savinase)都是相同的。因此，通過片段化或缺失突變而衍生的本發明的蛋白或片段具有相對大的區域，這些區域與已知蛋白酶是不相同的，或者那些具有此位置適于區分的區域。為此，正如從芽孢桿菌Ya-B的彈性酶比較中顯而易見，后者的長度必須至少有40個氨基酸。這是因為，在比對編號的位置230處同樣具有V的最相似的蛋白酶在總共39個位置的該區域中與芽孢桿菌種(DSM 14390)是相同的。
所述片段和/或缺失變體優選對應于SEQ ID NO.2的氨基酸112到381的區域，也就是成熟蛋白。
在各種情形下，有愈加優選的通過片段化或缺失突變而衍生的蛋白或片段，這些蛋白或片段與SEQ ID NO.2所示的同源序列分別具有至少99.3％，99.5％，99.75％和100％的同一性。
本發明的片段表示所有小于同源蛋白的蛋白或肽，所述同源蛋白對應于SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2，但在適當的部分序列上與它們相一致。這些片段例如可以是單一結構域或區段，所述區段與結構域不相一致。這樣的區段可以以較低成本生產，不再具有某些出發分子可能的不利特性，諸如可能的活性降低調節機制，或展示更有利的活性分布圖。這樣的蛋白片段也可以以非生物合成的方式但例如通過化學方法生產。例如當合成后需要進行化學修飾時，化學合成是有利的。
通過缺失突變獲得的蛋白也被指定為片段，因為它們在原理上是類似的。缺失突變特別值得用來缺失抑制區域。缺失的結果既可與專一化相關，也可與延伸蛋白應用的范圍相關。
通過消除N-端氨基酸從前提蛋白獲得的蛋白以及信號肽也可被視為天然形成的片段或缺失突變的蛋白。這樣一種切割機制可用來例如借助于被信號肽酶所識別的特定序列區域的幫助，在重組蛋白中規定特異的切割位點。因此，有可能在體外進行本發明蛋白的激活和/或鈍化。
本發明的其他實施方案是所有通過插入突變，通過替換突變和/或通過與至少一種其他蛋白或蛋白片段融合而衍生自上述本發明枯草桿菌素型堿性蛋白酶的蛋白。
本發明的嵌合蛋白在最大意義上展示蛋白水解活性。這可通過衍生自本發明蛋白的分子部分實施或修飾。因此，嵌合蛋白也可位于上述區域之外的整個長度上。借助于本發明的蛋白上融合的部分，這樣的融合點例如導入或修飾特定功能或部分功能。就此而論，對于本發明的目的而言，它是非實質的，不管這樣的嵌合蛋白是否由單個多肽鏈或多個亞基組成。為了實施上述的替代法，例如，在翻譯后或僅在純化步驟之后通過特異蛋白酶解切割，有可能將單個嵌合多肽鏈降解成多個亞基。
因此，例如，基于WO 99/57254，通過肽接頭或直接作為與其他蛋白的結合區，例如纖維素結合區的融合蛋白，有可能提供本發明的蛋白或其部分，從而使得底物的水解更有效。這樣的結合區也可源自蛋白酶，例如為了增強本發明的蛋白與蛋白酶底物的結合。這提高了蛋白酶的局部濃度，在個別應用中可能是有利的，例如在原料的處理中。對于本發明的蛋白同樣有可能加以連接到例如淀粉酶或纖維素酶，以執行雙重功能。
通過插入突變獲得的本發明的蛋白由于在原理上是相似的，因此被指定為本發明的嵌合蛋白。這些嵌合蛋白也包括替換變體，也就是說其中分子的單個區域已被其他蛋白的元件所替換的那些變體。
正如在雜交體形成的情況下，插入和替換突變的點是將本發明蛋白的單獨特性，功能或部分功能與其他蛋白相結合。這也包括例如通過改組或重組不同蛋白酶的部分序列而獲得的變體。以此方式有可能獲得以前未曾描述的蛋白。這種技術允許從顯著的活性調制到很精細的活性調制的作用。
這種突變優選通過隨機方法進行，以指定到定向演化的領域，例如，通過StEP方法(Zhao等(1998)，Nat.Biotechnol.，第16卷，第258-261頁)，隨機引發重組(Shao等(1998)，Nucleic Acids Res.，第26卷，第681-683頁)，DNA改組(Stemmer，W.P.C.(1994)，Nature，第370卷，第389-391頁)或回歸序列重組(RSR；WO 98/27230，WO 97/20078，WO 95/22625)或RACHITT法(Coco，W.M.等(2001)，Nat.Biotechnol.，第19卷，第354-359頁)。在突變和表達之后，將這些類型的方法便利地與選擇方法或篩選方法結合，以鑒定具有所需特性的變體。由于這些技術應用在DNA水平上，在各種情形下有關的新生成的基因提供生物技術生產的出發點。
倒置突變，即部分序列倒置，可被視作缺失和插入的特殊形式。這種類型的變體同樣可以靶向或隨機的方式生產。
優選迄今提到的所有蛋白，蛋白片段或融合蛋白，其特征在于，它們本身能夠水解蛋白。
這樣的實體根據IUBMB官方1992年酶命名法被分類為3.4(肽酶)。其中，優選內肽酶，尤其是組3.4.21絲氨酸蛋白酶，3.4.22半胱氨酸蛋白酶，3.4.23天冬氨酸蛋白酶和3.4.24金屬蛋白酶的內肽酶。其中，絲氨酸蛋白酶(3.4.21)是尤其優選的，并且其中又優選subtilase，而其中最優選枯草桿菌素(參照“Subtilases枯草桿菌素-樣蛋白酶”，R.Siezen，第75-95頁，“枯草桿菌素酶(Subtilisin enzymes)”，R.Bott和C.Betzel編，New York，1996)。其中，依次優選組IS-2枯草桿菌素，其為高堿性枯草桿菌素。
就此而論，活性分子優選失活分子，這是因為，水解的進行例如在下述的應用領域中是尤其重要的。
上述片段在最廣意義上也具有酶解活性，例如，為了絡合底物，或為了形成對水解所必需的結構元件。當它們自身可用于水解另一蛋白而無需其他蛋白酶組分存在的時候，它們是優選的。這涉及可通過蛋白酶本身進行的活性，同時可能必須存在的緩沖液物質，輔助因子等保留未受此影響。
分子不同部分對蛋白水解的相互影響天然在缺失突變體中存在比在片段中多，尤其是出現在融合蛋白中，更特別是那些由相關蛋白改組而衍生的蛋白。其中這導致維持，修飾，說明或第一達到最廣意義上的酶解功能，缺失變體和融合蛋白是本發明的蛋白。其中在這方面，本發明優選的代表是那些本身能夠水解蛋白底物而無需存在其他蛋白酶組分的蛋白。
優選的實施方案由迄今所述的所有蛋白，蛋白片段或融合蛋白表示，其特征在于，它們另被衍生化。
衍生物表示那些通過其他修飾而衍生自上述蛋白的蛋白。這樣的修飾可影響例如穩定性，底物特異性，或對底物的結合強度或者酶活性。它們也可用于減少蛋白的變應原性和/或免疫原性，從而增加例如其與皮膚的相容性。
這些衍生化作用可例如通過生物學方法發生，例如通過生成的宿主生物體與蛋白生物合成相聯系。諸如脂或寡糖的低分子量化合物的偶聯應該在此連接中受到特別強調。
然而，衍生化作用也可通過化學方法，例如通過化學轉化側鏈或通過把另一個例如大分子化合物共價結合到蛋白上而進行。化學修飾描述在例如申請DE 4013142中。酶中的胺與羧基偶聯改變等電點，例如公開在WO 95/26398中。例如，可例如通過雙官能團化學化合物，將諸如蛋白質的大分子與本發明蛋白連接起來。因此，例如，有可能通過應用WO 99/57154至WO 99/57159，WO 00/18865和WO 00/57155的教導，通過含有特異結合區的接頭來提供本發明的蛋白。這樣的衍生物特別適用于洗滌或清潔產品中。也可能以類似于WO 00/01831的方式將蛋白酶抑制劑與本發明的蛋白通過接頭，尤其是氨基酸接頭連接起來。與其他諸如聚乙二醇的大分子化合物的偶聯改善了該分子的其他有關特性，諸如穩定性或與皮膚的相容性。這樣一種修飾例如描述在美國專利5230891中，將蛋白酶用于化妝品中。
本發明蛋白的衍生物也以最廣意義表示這些酶的制備物。取決于分離，加工或制備方法，蛋白可以與多種不同的其他物質相結合，例如與來自產蛋白酶的微生物的培養物中的物質相結合。蛋白也可與其他某些物質已經故意混合，例如以增加其儲存穩定性。因此，本發明也涉及本發明蛋白的所有制備物。這也獨立于此酶活性是否真正展示在特定的制備物中。這是因為，對其來說，期望的是在儲存過程中僅具有一點點活性或沒有活性，而在使用時展示其酶解功能。例如通過適當的相伴物質，這可得以控制。蛋白酶與其抑制劑的共同制備物在現有技術(WO 00/01826)中尤其是已知的。
優選的實施方案由迄今所述的所有蛋白，蛋白片段或融合蛋白表示，其特征在于它們另被穩定化。
這增加了它們在儲存過程和/或使用過程中的穩定性，例如在洗滌處理中，以便使它們的活性能更持久，并因此活性得以增強。本發明蛋白酶的穩定性可通過例如偶聯到聚合物上而得以提高。這種方法描述在例如US 5230891中。用前，它需要在適當的試劑中，通過化學偶聯步驟，將蛋白連接到這些聚合物上。
優選通過點突變分子本身而獲得的可能的穩定化作用，因為它們在獲得蛋白后不需要任何其他的操作步驟。一些適用于此的點突變是本身已知的現有技術。因此，按照US 6087315和US 6110884，采用其他氨基酸殘基替換特定的酪氨酸殘基可使蛋白酶穩定。
其他可能性例如為-按照EP 583339用脯氨酸替換特定的氨基酸殘基；-按照EP 995801向分子表面引入更高極性的或帶更多電荷的基團；-改變金屬離子的結合，特別是鈣結合位點，例如按照申請WO88/08028和WO 88/08033的教導。
根據上述第一個文獻，參與鈣結合的一個或多個氨基酸殘基不得不被帶有負電荷的氨基酸所替換；根據申請WO 88/08033的教導，點突變將不得不同時通過鈣結合導入兩個殘基精氨酸/甘氨酸的序列中的至少一個殘基中；-根據US 5453372，蛋白可受到表面上特定突變的保護，以防止諸如表面活性劑的變性劑的作用。
其他可比較的可能性描述在US 5340735，US 5500364，US 5985639和US 6136553中。
另一針對高溫和表面活性劑作用的穩定化作用的可能性將是應用WO 92/21760以及尚未公布的申請DE 10121463和DE 10153792的教導，對那些蛋白酶通過交換位于N端附近的氨基酸而得以穩定化，使得通過非共價相互作用與剩余分子接觸，從而有助于維持球形結構。
優選的實施方案是那些其中分子以多種途徑被穩定化的蛋白酶。這是因為，例如，根據WO 89/09819，采用多個穩定突變，可認為有額外的作用。
優選的實施方案由迄今所述的所有蛋白，蛋白片段或融合蛋白或衍生物表示，其特征在于它們與上述本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或其衍生物之一具有至少一種共同的抗原決定簇。
這是因為，蛋白的二級結構元件及其三維折疊對酶活性至關重要。因此，在它們一級結構中彼此有明顯區別的結構域可形成在空間上基本一致的結構，從而使得相同的酶行為成為可能。這種在二級結構中的共同特征通過抗血清或純的抗體或單克隆抗體，通常被識別為符合抗原決定簇。彼此相似的蛋白或衍生物因此通過免疫化學交叉反應可被檢測和指定。為此，從它們在一級結構中的同源性水平不可能，但從它們的免疫化學關系則可能被指定到上述定義的本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或其衍生物，也尤其包括在本發明的保護范圍內。
優選的實施方案由迄今所述的所有蛋白，蛋白片段或融合蛋白或衍生物表示，其特征在于它們可獲自天然來源，尤其是來自微生物。
這些微生物可以例如是單細胞真菌或細菌。這是因為它們通常比多細胞生物或來自多細胞生物的細胞培養物更容易分離和操作；盡管后者對特定實施方案而言可代表值得做的選擇，并且因此原則上不排除在本發明的主題之外。
雖然天然存在的生產菌能制備本發明的酶，但是酶在初始建立的條件下僅有小部分可被表達和/或釋放到周圍介質中。但是，這不排除在通過實驗確立的合適環境條件或其他因素影響下，對它們進行刺激從而經濟上值得生產本發明蛋白的可能性。這樣一種調節機制可有意用于生物技術生產中。如果后者也是不可能的，則它們仍可用于分離相關基因。
其中，那些來自革蘭氏陽性細菌的酶是尤其優選的。
這是因為它們沒有外膜，因此將分泌的蛋白直接釋放到周圍介質中。
那些來自芽孢桿菌屬的革蘭氏陽性細菌的酶是尤其優選的。
芽孢桿菌蛋白酶從一開始就具有對各種可能的技術用途的有利特性。這些特性包括對高溫，氧化劑或變性劑的一定穩定性。此外，利用微生物蛋白酶，對其生物技術生產例如所涉及的構建合適的克隆載體，選擇宿主細胞和生長條件或者諸如變應原性的風險的評估，已經獲得最多經驗。芽孢桿菌還被確立成生產生物體，其在工業處理中具有特別高的生產效率。對這些蛋白酶的制備和應用所獲得的知識量的好處還在于促進開發這些酶，例如涉及它們與諸如洗滌或清潔產品成分中的其他化學化合物的相容性。
在那些來自芽孢桿菌種的酶中，又優選那些來自芽孢桿菌種的酶，尤其是來自菌株芽孢桿菌種(DSM 14390)的酶。
這是因為，本發明酶的實施方案最初是從中獲得的。其相關序列示于序列表中，而其酶特性描述在實施例中。從該菌株或從相關菌株中具體通過應用諸如PCR和/或本身已知的點突變的分子生物學標準方法可制備上述的變體。
本發明的其他目的實現，因而也是本發明的固有方面，由用于實施本發明的核酸所代表。
核酸是蛋白的幾乎所有分子生物學研究，開發及其生產的出發點，尤其包括基因測序和衍生相應的氨基酸序列，以及任何一種蛋白的突變(參見上文)和表達。
用于開發具有特定性質的蛋白的突變也稱作“蛋白質工程”。將要優化的特性的例子上文已經提及。這樣一種突變可以靶向方式或通過隨機方法進行，例如采用后續的針對克隆基因上的活性的識別和/或選擇方法(篩選和選擇)，例如通過與核酸探針雜交，或者針對基因產物蛋白，例如通過其活性。本發明蛋白酶的進一步開發具體也可定位在下列出版物中所提出的理念上“Protein engineering”，P.N.Bryan(2000)，Biochim.Biophys.Acta.，第1543卷，第203-222頁。
因此，本發明的一個主題是每一種編碼枯草桿菌素型堿性蛋白酶的核酸，該堿性蛋白酶的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列具有至少92.5％的同一性，尤其是在位置334到位置1143的部分區域上。
其中，愈加優選的是那些酶的核苷酸序列與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列分別具有至少93％，93.5％，94％，94.5％，95％，95.5％，96％，96.5％，97％，97.5％，98％，98.2％，98.4％，98.6％，98.8％，99％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％和100％的同一性，尤其是在位置334到位置1143的部分區域上。上述同一性相應也適用于成熟蛋白的位置和終止密碼子。
這是因為，可以預計這些核酸編碼蛋白，其特性與來自芽孢桿菌種(DSM 14390)的堿性蛋白酶逐漸相似。
在這方面，本發明的其他代表是所有核酸，其編碼上述本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或其衍生物中的一種。
編碼上述優選形式的核酸是相應優選的，通過突變獲得的核酸也是尤其優選的。
具體而言，編碼蛋白片段的核酸專門包括在本發明的保護范圍內。采用這種寡核苷酸，所有三種讀碼框，無論有義還是反義方向，都必須考慮到。這是因為，尤其通過聚合酶鏈式反應(PCR)，它們可用作合成相關核酸的起始點，例如用作從天然生物體中擴增相關基因的起始點。通過基于PCR的改組方法，它們也可用于生產嵌合體。其他改組方法，例如公開在申請WO 00/09679中的重組連接反應(RLR)也是基于寡核苷酸，所述寡核苷酸對應于隨機或特異性選定的蛋白片段。反義寡核苷酸也可用于例如調節表達。
根據上文所述，在上述的本發明核酸中，下列核酸是愈加優選的-那些特征在于它們獲自天然來源，尤其是獲自微生物的核酸；-其中，那些特征在于微生物是革蘭氏陽性細菌的核酸；-其中，那些特征在于革蘭氏細菌是一種芽孢桿菌屬的核酸；以及-其中，那些特征在于芽孢桿菌種是芽孢桿菌，尤其是芽孢桿菌種(DSM 14390)的核酸。
包含上述定義的本發明的一種核酸區域的載體，尤其是包含一種編碼上文定義的本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一的核酸區域的載體，構成本發明的固有方面。
為了操作與本發明相關的核酸，并且因此特別是為了制備該核酸用于生產本發明的蛋白，將它們方便地連接到載體中。這些載體及其相關的操作方法詳細描述在現有技術中。載體可以大量和多種選擇從市場上獲得，既用于克隆也用于表達。這些載體包括例如，衍生自細菌質粒的載體，衍生自噬菌體的載體，或衍生自病毒的載體，或主要是合成的載體。此外，根據載體能夠建立自身的細胞類型的性質，它們可區分成例如革蘭氏陰性細菌載體，革蘭氏陽性細菌載體，酵母載體或高等真核生物載體。它們是例如合適的分子生物學和生化研究的出發點，也是有關基因表達或者相應蛋白的出發點。
在一個實施方案中，本發明的載體是克隆載體。
克隆載體除了儲存，生物學擴增或選擇目的基因之外，還適用于其他分子生物學鑒定。同時，它們是要求保護的核酸的可轉運和可儲存的形式，并且也是不與細胞連接的分子生物學技術的出發點，所述技術諸如PCR或體外突變方法。
優選地，本發明的載體是表達載體。
這種表達載體是在生物生產體系中用于實施相應核酸并由此生產相應蛋白的基礎。本發明這種主題的優選實施方案是攜帶對表達所必需的遺傳元件的表達載體，所述遺傳元件例如是最初位于所述基因上游的天然啟動子或另一生物體的啟動子。所述元件可以例如排列成“表達盒”的形式。或選的可能性是在各種情形下，由宿主細胞提供的一種或所有的調節元件。表達載體尤其優選地適用于其他特性，例如對選擇表達系統，尤其是宿主細胞的最適拷貝數(參見下文)。
為了得到高表達率，對表達載體而言如果可能僅包含相關基因作為插入物以及沒有相對大的5’或3’非編碼區，這是特別有利的。當用限制性酶隨機處理出發菌株的染色體DNA所獲得的片段在測序之后和整合到表達載體之前經再次故意切割時，可獲得這種插入體。
表達載體的一個例子為pAWA22，其描述在本申請的圖2中，并且可如在實施例2中所公開的那樣加以使用。其他載體為專業技術人員從現有技術中可獲得，并且可大量從市場上獲得。
包含上述定義的本發明的一種核酸區域的細胞，尤其是一種優選在上述本發明的載體之一上包含一種編碼上文定義的本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一的核酸區域的細胞，構成本發明的固有方面。
這是因為，這些細胞含有合成本發明蛋白的遺傳信息。它們使得例如相應基因的擴增，突變處理或轉錄和翻譯成為可能，并且最終也使得相關蛋白通過生物技術生產成為可能。這種遺傳信息可存在于染色體外，作為固有的遺傳元件，即存在于細菌中位于質粒上，或者被整合到染色體中。挑選合適系統取決于目的，例如基因或者生物體的儲存方式和持續時間或者突變或選擇的方式。因此，突變和選擇方法例如基于噬菌體及其特異宿主細胞，被描述用于開發在現有技術(WO 97/09446)中洗滌產品用酶。
優選宿主細胞，其表達或可被誘導表達任何本發明上述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，尤其是通過利用上述本發明的核酸區域，更特別是通過利用上述的表達載體。
制備所述蛋白的宿主細胞使得通過生物技術生產該蛋白成為可能。為此目的，它們必須方便地與上述的一種載體一起已經接受了有關基因，并且能夠進行轉錄，翻譯以及優選的其他可能的修飾步驟。
蛋白表達的合適的宿主細胞原則上是所有生物體，即原核生物，真核生物或藍藻(Cyanophyta)。優選的宿主細胞是那些可容易進行遺傳操作，例如有關的表達質粒轉化及其穩定建立以及表達調控的細胞，如單細胞的真菌或者細菌。此外，優選的宿主細胞的特征在于良好的微生物和生物技術操作性。這例如涉及易培養性、高生長率、對發酵培養基的低需求、良好的生產率以及外源蛋白質的分泌。尤其優選針對表達的試驗菌株。這些菌株可商購，或一般從菌種保藏機構獲得。通過這種方法，本發明的任何蛋白質理論上可以從大量宿主生物中得到。必須通過試驗，根據現有技術，從可得到的不同系統的豐度中才能確定哪種表達系統對個別情況最適合。
宿主細胞本身是蛋白酶陰性的，因此不會降解產生的蛋白，這是尤其有利的。一種這樣的菌株枯草芽孢桿菌DB 104用于實施例2中。
優選的實施方案是那些宿主細胞，其活性由于存在適當的遺傳元件可得以調控，例如，通過控制加入化學化合物，改變培養條件或以特定的細胞密度作為函數。這種可控表達使得非常經濟地生產目的蛋白成為可能。方便的是，基因，表達載體和宿主細胞例如對表達所需的遺傳元件(核糖體結合位點，啟動子，終止子)，或對密碼子應用彼此匹配。后者例如可被優化，在基因中通過用特定宿主最常用的那些密碼子替換僅被有關宿主翻譯較差的那些密碼子，而在各種情形下意思相同。
其中優選這些宿主細胞，其特征在于它們是細菌，尤其是那些將產生的蛋白分泌到周圍介質中的細菌。
細菌本身的特征在于短的傳代時間，以及對培養條件的低的要求。這使得建立成本效應的方法成為可能。此外，可獲得細菌發酵技術中的大量經驗。對于在個別情況下有待通過試驗確定的多種理由而言，革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌可以適用于特定生產，所述理由諸如營養源，產物形成速率，所需時間等。
諸如大腸桿菌(E.coli)的革蘭氏陰性細菌，例如分泌多種蛋白到胞質空間中。對于特殊應用這可能是有利的。相反，諸如芽孢桿菌的革蘭氏陽性細菌，例如立即將分泌的蛋白釋放到細胞周圍的營養介質中，根據另一優選實施方案，本發明的表達蛋白可從中直接加以純化。
申請WO 01/81597公開了一種方法，根據該方法，表達的蛋白也實現了通過革蘭氏陰性細菌的輸出。這種系統也適用于生產本發明的蛋白。因此，優選的宿主細胞是大腸桿菌(Escherichia coli)或克雷伯氏菌(Klebsiella)，尤其是菌株E.coli JM 109，E.coli DH 100B，E.coliDH 12S或植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)(參照物)。它們要求在本申請中所述的適當的微生物修飾和/或合適的載體，以便使得產生的蛋白能夠釋放。
細菌優選作為宿主細胞的特征在于，它們為革蘭氏陽性細菌，尤其是它們屬于芽孢桿菌屬，更特別屬于遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或親堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)。
本發明的一個實施方案利用芽孢桿菌種，尤其是芽孢桿菌(DSM 14390)自身，從而(同源性)表達本發明蛋白。然而，另一方面，優選異源表達，為此優選芽孢桿菌屬的細菌，因為對生產而言，在革蘭氏陽性細菌中它們是被最充分鑒定的。在此具體包括的是地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或其他芽孢桿菌種或親堿芽孢桿菌(B.alcalophilus)菌株。這是因為，例如從申請WO 91/02792的教導中，可獲得涉及用這些菌種生產蛋白酶的相關經驗。該申請還公開了眾多可能的表達載體。這些相關菌種另具有相似的密碼子用法，并且它們自身能生產可比較的枯草桿菌素，從而蛋白合成系統被天然適當地定向。
另一優點是通過該方法可能獲得本發明蛋白與由宿主菌株內源性產生的枯草桿菌素的混合物。這樣一種共表達同樣公開在申請WO 91/02792中。如果這不需要，則天然存在于宿主細胞的蛋白酶基因將需要進行永久性或短暫性失活(參見上文)。
進一步優選宿主細胞，其特征在于它們是真核細胞，尤其是那些翻譯后對產生的蛋白進行修飾的真核細胞。
合適的真核生物的例子為真菌，如放線菌(Actinomyceten)或者酵母如糖酵母(Saccharomyces)或克魯伯氏酵母(Kluyveromyces)。嗜熱真菌表達系統在例如WO 96/02653中提出。它們尤其適合于表達耐熱的變體。真核系統中進行的修飾，尤其與蛋白合成相連的修飾，包括結合諸如膜錨分子(anchor)或寡糖的低分子化合物。這種寡糖修飾可以是期望的，例如，用于減少變應原性。與由這樣的細胞天然產生的酶，如纖維素酶共表達可能也是有利的。
本發明蛋白的制備方法是本發明的單獨主題。
因此，利用上述本發明的核酸和/或利用上述本發明的載體和/或利用上述的本發明的一種細胞，每一種生產上述本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物的方法都被要求保護。
這些包括例如化學合成方法，這些方法尤其對較短片段在經濟上是值得的。
然而，所有分子生物學，微生物學或生物技術學生產方法的各個方面在上文中已得以提及，并且在現有技術中被確立，其對后者是優選的。因而，根據分子生物學本身已知的方法，例如基于上述的DNA和氨基酸序列，如所推導的，例如也來自序列表，優選基于SEQ ID NO.1和2本身，可合成相應的寡核苷酸和寡肽，直至完整的基因和蛋白。
從已知枯草桿菌素生產微生物出發，例如，遵循本申請中的實施例，可鑒定和分離其他天然的枯草桿菌素產生菌，根據本文所述的條件，來確定它們的枯草桿菌素基因和/或氨基酸序列，并且開發它們。這種細菌菌種利用適當的生產方法也可進行培養。類似地，新的表達載體根據在申請WO 91/02792中所公開的載體模型，可進行開發。其中在體外進行蛋白生物合成的不含細胞的表達系統基于相應的核酸序列，也可能是本發明的實施方案。上文已經闡明的任何元件也可被組合生成新的方法，用于制備本發明蛋白。就此而論，對每種本發明的蛋白而言，多種可能的方法步驟組合是可以想象的，從而最適方法針對各個特定的個案必須通過試驗才能加以確定。
本發明的單獨主題包含產物，其特征在于它們包括上述本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物。
所有類型的產物，尤其是混合物，制劑，溶液等，它們的效用通過加入上述本發明的蛋白而得以改善，在此包括在本發明的保護范圍內。取決于應用領域，它們可以是例如固體混合物，例如含有凍干或膠囊化的蛋白的粉劑，或凝膠狀產品或液體產品。優選的制劑包括例如緩沖物質，穩定劑，蛋白酶的反應物和/或其他輔助因子和/或與蛋白酶有協同作用的其他成分。這些成分應該理解包括在下文詳述的應用領域的特定產品中。其他應用領域從現有技術中也是一目了然的，并且描述在例如手冊“工業用酶及其應用(Industrial enzymes and theirapplications)”，H.Uhlig，Wiley出版，New York，1998。
包括在本發明主題中的優選實施方案是洗滌或清潔產品，其特征在于它們包括上述的本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一。
這是因為，如在本發明的示例性實施方案中所示，令人驚奇地已經發現，特別優選的芽孢桿菌(DSM 14390)的堿性蛋白酶，也就是說，甚至是野生型酶，其特征在于，在相應的洗滌或清潔產品中使用時，在它們對洗滌或清潔性能的貢獻方面，其至少接近為此目的確定的酶，或者在某些情形下事實上超過它們。
所有可能類型的洗滌產品，既包括濃縮物也包括不用稀釋加以使用的產品均屬于本發明的主題；商業規模的使用，用于洗衣機或用于手洗或手工清潔。對此包括例如用于織物、地毯或天然纖維的洗滌產品，在本發明對此使用術語洗滌產品。它們也包括例如用于洗碗機的洗碗劑或用于硬表面，例如金屬、玻璃器皿、瓷器、陶器、瓦片、寶石、涂漆面、塑料、木制品或皮革的手工洗碗劑或清洗劑。對于這些來說，在本發明使用術語清潔產品。任何類型的洗滌或清潔產品都是本發明的實施方案，只要其中加入本發明的蛋白質，蛋白片段，融合蛋白或衍生物。
本發明的實施方案包含任何按照現有技術中確定的和/或適當的本發明洗滌或清潔產品的提供形式。它們包括例如固體、粉末、液體、膠狀或膏狀劑，如果需要由若干相組成，擠壓式或非擠壓式；其他例子還包括包裝在大容器內和小份中的壓出膠、顆粒、片劑及小袋。
在優選的實施方案中，本發明的洗滌或清潔產品包括上述本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，其用量每克產品為2μg至20mg，優選5μg至17.5mg，更優選20μg至15mg，尤其更優選50μg至l0mg。
這種產品中的蛋白酶活性可以按照在Tenside，第7卷(1970)，第125-132頁中描述的方法測定，并以蛋白酶單位(PE＝蛋白酶-單元)給出。
除了本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之外，如果需要，本發明的洗滌或清潔產品還包含其他成分，例如酶穩定劑，表面活性劑，如非離子、陰離子和/或兩性表面活性劑，和/或漂白劑，和/或助洗劑(builder)以及任選下文所列的其他常規成分。
優選的非離子表面活性劑為烷氧基化的，有利的是乙氧基化的，特別優選含有8-18個碳原子以及平均每mol醇1-12mol環氧乙烷(EO)的伯醇，其中醇殘基可以是直鏈的，或優選在位置2上被甲基支化的，優選以混合形式含有直鏈和甲基支鏈的殘基，所以其通常以羰基合成醇殘基存在。然而，尤其優選的是包含具有12-18碳原子、天然來源的醇的直鏈殘基以及平均每mol醇2-8EO的脂肪醇乙氧基化物，例如椰子油醇、棕櫚油醇、牛油醇或油醇。優選的乙氧基化醇包括，例如含有3或4EO的C12-14醇、含有7EO的C9-11醇、含有3EO、5EO、7EO或8EO的C13-15醇、含有3EO、5EO或7EO的C12-18醇及其混合物，例如含有3EO的C12-14醇和含有5EO的C12-18醇的混合物。上述乙氧化的程度是統計平均值，對于特殊產品來說，這個平均值可能是整數或分數。優選的醇乙氧基化物具有窄的同系物分布(窄范圍乙氧基化物，NRE)。除了這些非離子表面活性劑之外，也可以使用高于12EO的脂肪醇。這類脂肪醇的例子是包含14EO、25EO、30EO或40EO的牛油醇。
另一類或作為非離子表面活性劑單用或與其他非離子表面活性劑合用的優選非離子表面活性劑是烷氧基化的、優選乙氧基化的、或乙氧基化和丙氧基化的優選包含1-4個碳原子的烷基鏈的脂肪酸烷酯，特別是脂肪酸甲酯。
另一類優選使用的非離子表面活性劑是烷基多葡糖苷(APG)。合適的烷基多葡糖苷對應于通式RO(G)z，其中R是直鏈或支鏈的，特別是2-甲基支鏈的、飽和或不飽和的、含有8-22個以及優選12-18個碳原子的脂族基，G是含有5或6個碳原子的糖單元，優選是葡萄糖。糖苷化的程度z介于1.0-4.0之間，優選在1.0-2.0之間，以及更優選在1.1-1.4之間。優選使用直鏈烷基多葡糖苷，即烷基多葡糖苷，其中多糖基部分是葡萄糖單元以及烷基部分是正-烷基基團。
氧化胺類的非離子表面活性劑，例如N-椰油烷基-N，N-二甲胺氧化物以及N-牛油烷基-N，N-二羥乙胺氧化物，和脂肪酸鏈烷醇酰胺類也適用。這些非離子表面活性劑的所用量優選不多于乙氧基脂肪醇量，尤其不多于其量的一半。
其它合適的表面活性劑為多羥基脂肪酸酰胺，對應于通式(II) 其中RCO是包含6-22個碳原子的脂族酰基，R1是氫、含有1-4個碳原子的烷基或羥烷基基團，以及[Z]是直鏈或支鏈的、包含3-10個碳原子和3-10個羥基的多羥烷基。多羥基脂肪酸酰胺為已知物質，其通常可通過將還原糖用氨、烷基胺或鏈烷醇胺加以還原性胺化，繼而用脂肪酸、脂肪酸烷酯或氯代脂肪酸加以酰化而獲得。
這組多羥基脂肪酸酰胺還包括對應于式(III)的化合物 其中R是含有7-12個碳原子的直鏈或支鏈烷基或者鏈烯基，R1是含有2-8個碳原子的直鏈、支鏈或環化的烷基基團或者芳香基團，以及R2是含有1-8個碳原子的直鏈、支鏈或環化的烷基基團或芳香基團或者是烷氧基基團，但優選C1-4的烷基或者苯基基團，以及[Z]是直鏈的多羥基烷基基團，其烷基鏈至少被2個羥基取代，或者該基團的烷氧基化，優選乙氧基化或丙氧基化的衍生物。優選由還原糖例如葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、甘露糖或木糖的還原性胺化而獲得。然后通過例如以醇鹽作為催化劑與脂肪酸甲酯反應，可將N-烷氧基或N-芳氧基取代的化合物轉化成所需的多羥基脂肪酸酰胺。
合適的陰離子表面活性劑是例如那些磺酸酯和硫酸酯類。合適的磺酸酯類表面活性劑優選是C9-13的烷基苯磺酸酯、烯烴磺酸酯，即烯烴和羥烷基磺酸酯的混合物，以及例如通過氣態三氧化硫的磺酸化接著堿化或酸化磺酸化產物而從帶有中間或末端雙鍵的C12-18單烯烴中獲得的二磺酸酯。其它合適的磺酸酯類表面活性劑是例如通過氯磺化作用或磺化氧化作用接著水解或中和而從C12-18烷烴中獲得的鏈烷磺酸酯。α-磺基脂肪酸的酯(磺酸酯)，例如氫化椰子油、棕櫚核油或牛油脂肪酸的α-磺酸化甲酯也適用。
其它合適的陰離子表面活性劑有硫酸化脂肪酸甘油酯。本發明上下文中的脂肪酸甘油酯指單酯、二酯和三酯及其混合物，其由單甘油與1-3mol的脂肪酸的酯化作用或者在甘油三酯和0.3-2mol的甘油發生酯交換反應進行生產而得來的。優選的硫酸化脂肪酸甘油酯是含6-22個碳原子的飽和脂肪酸的硫酸化產物，例如己酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸或山萮酸。
優選的烷(鏈烯)基硫酸鹽是堿金屬鹽，以及具體是C12-18的脂肪醇的硫酸半酯的鈉鹽，例如椰油脂肪醇、牛油脂肪醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鯨蠟醇或硬脂醇或C10-20的羰基合成醇以及具有同樣鏈長仲醇的對應的半酯。其它優選的烷(鏈烯)基硫酸鹽是那些具有上述鏈長、含有基于石化產品的合成的、直鏈烷基鏈，并且它們的降解行為類似于基于油化品原料的對應的化合物。C12-16烷基硫酸酯、C12-15烷基硫酸酯以及C14-15烷基硫酸酯從洗滌技術的觀點出發而優選。其它合適的陰離子表面活性劑是2，3-烷基硫酸酯。
用1-6mol的環氧乙烷乙氧基化的直鏈或者支鏈C7-21醇例如含有平均3.5mol環氧乙烷(EO)的2-甲基支鏈的C9-11醇或者是含有1-4EO的C12-18脂肪醇的硫酸單酯也同樣適用。鑒于他們高的發泡能力，他們僅以相對小的量使用，例如按重量計在清洗劑中的量為1％-5％。
其它合適的陰離子表面活性劑是烷磺基琥珀酸的鹽，其也已知是磺基琥珀酸鹽或磺基琥珀酸酯，以及表示磺基琥珀酸與醇，優選脂肪醇，以及特別是乙氧基化的脂肪醇而形成的單酯或/或二酯。優選的磺基琥珀酸酯含有C8-18脂肪醇殘基或其混合物。特別優選的磺基琥珀酸酯含有衍生自乙氧基化的脂肪醇的脂肪醇部分，其在分離中考慮時，代表非離子的表面活性劑(描述參見上文)。在這些磺基琥珀酸鹽中，那些衍生自窄范圍乙氧基化的脂肪醇的脂肪醇部分尤其優選。在烷(鏈烯)基鏈中優選含有8-18個碳原子的烷(鏈烯)基琥珀酸或其鹽也同樣適用。
其它合適的陰離子表面活性劑尤其是肥皂。合適的肥皂是飽和脂肪酸肥皂，如月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、氫化芥子酸和山萮酸的鹽，以及尤其衍生自天然脂肪酸如椰油、棕櫚核油或牛油脂肪酸的肥皂混合物。
陰離子表面活性劑包括肥皂可以鈉、鉀或銨鹽及作為有機堿如單-、二-或三乙醇胺的可溶性鹽的形式存在。陰離子表面活性劑優選以鈉或鉀鹽的形式存在，更優選的是鈉鹽形式。
表面活性劑在本發明的清潔或洗滌產品中存在的總量優選5-50重量％，特別是8-30重量％，以最終產品計。
本發明的洗滌或清潔產品可包含漂白劑。在那些能在水中產生H2O2而充當漂白劑的化合物中，過碳酸鈉，過硼酸鈉鹽四水合物和過硼酸鈉一水合物是特別的重要。其它有用的漂白劑有例如過氧焦磷酸鹽、檸檬酸的過水合物和產生H2O2的過酸鹽或過酸，如過硫酸鹽或過硫酸。也可使用脲過氧水合物過尿素，其化學式為H2N-CO-NH2·H2O2。如果需要，產品中也可含有有機類的漂白劑，特別是用于清洗硬表面，例如在洗碗機中，雖然原則上有機漂白劑也可用于洗衣劑。典型的有機漂白劑是二酰基過氧化物，例如二苯甲酰基過氧化物。其它典型的有機漂白劑是過氧酸，其中烷基過氧酸和芳基過氧酸作為例子特別提及。優選的代表是過氧苯甲酸及其環取代的衍生物，例如烷基過氧苯甲酸，還有過氧-α-萘甲酸和單過鄰苯二甲酸鎂鹽，脂族或取代的脂族過氧酸，例如過氧月桂酸、過氧硬脂酸、ε-苯二(甲)酰亞氨基過氧己酸(PAP)、o-羧基苯甲酰氨基過氧己酸、正壬烯氨基過酸性脂肪酸和正壬烯氨基過琥珀酸鹽，以及脂族和芳脂族的過氧二羧酸，例如1，12-二過氧羧酸、1，9-二過氧壬二酸、二過氧癸二酸、二過氧巴西基酸、二過氧苯二甲酸、2-癸基二過氧丁烷-1，4-二酸、N，N-對苯二甲酰-二(6-氨基過氧己酸)。
漂白劑在洗滌或清潔產品中的含量是1-40重量％，特別是10至20重量％，其中有利地使用過硼酸鹽一水合物或者過碳酸鹽如果洗滌溫度等于或者低于60℃，以及特別是對衣物進行預處理，為了提高漂白效果，洗滌劑中可含有漂白活化劑。合適的漂白活化劑是形成脂族過氧羧酸的化合物，所述脂族過氧羧酸優選含有1-10個碳原子，以及更優選含有2-4個碳原子和/或在過水解條件下任選取代的過苯甲酸。攜帶具有上述碳原子數的O-和/或N-酰基和/或任選取代的苯甲酰基的物質是適用的。優選的漂白活化劑是聚酰化的烷撐二胺，特別是四乙酰基乙烯二胺(TAED)、酰化的三嗪衍生物，特別是1，5-二乙酰基-2，4-二氧代六氫-1，3，5-三嗪(DADHT)、酰化的甘脲，特別是1，3，4，6-四乙酰基甘脲(TAGU)、N-酰基亞胺，特別是正壬酰基琥珀酰亞胺(NOSI)、酰化的苯酚磺酸鹽，特別是正壬酰基或者是異壬酰基羥苯磺酸鹽(正-或異-NOBS)、酰化羥羧酸，例如三乙基-O-乙酰基檸檬酸鹽(TEOC)、羧酸酐，特別是鄰苯二甲酸酐、靛紅酸酐和/或琥珀酸酐、羧酸酰胺，例如N-甲基二乙酰胺、乙交酯、酰化多元醇，特別是三醋精、乙二醇二乙酸酯、異丙烯基乙酸酯、2，5-雙乙酸基-2，5-二氫呋喃和烯醇酯，它們從德國專利申請DE 196 16 693和DE 196 16 767中得知，乙酰化的山梨醇和甘露醇及其混合物(SORMAN)，它們在歐洲專利申請EP 0 525 239中描述，酰化糖衍生物，特別是五乙酰基葡萄糖(PAG)、五乙酰基果糖、四乙酰基木糖和八乙酰基乳糖，以及乙酰化的任選N-烷基化葡糖胺和葡糖酸內酯、三唑和三唑衍生物和/或粒狀的己內酰胺和/或己內酰胺衍生物，優選的是N-乙酰化內酰胺，例如N-苯甲酰己內酰胺和N-乙酰己內酰胺，這些是從國際專利申請WO 94/27970、WO 94/28102、WO 94/28103、WO 95/00626、WO 95/14759和WO 95/17498中得來。從德國專利申請DE 196 16 769中得知的取代的親水性酰基乙縮醛和在德國專利申請DE 196 16 770以及國際專利申請WO 95/14075中描述的酰基內酰胺也優選采用。與從德國專利申請DE 44 43 177中得知的常規漂白活化劑組合也可采用。腈衍生物，例如氰基吡啶、四腈(Nitrilquats)，例如N-烷基銨乙腈，和/或氨腈衍生物也可使用。優選的漂白活化劑為4-(辛酰氧基)-苯磺酸鈉、正壬酰或異壬酰氧基苯磺酸酯(正或異-NOBS)、十一酰氧基苯磺酸酯(UDOBS)、十二酰氧基苯磺酸鈉(DOBS)、十一酰氧基苯甲酸(DOBA，OBC 10)和/或十二酰氧基苯磺酸酯(OBS 12)以及N-甲基嗎啉鎓乙腈(MMA)。這類漂白活化劑常用量占整個組成的0.01-20重量％，優選0.1-15重量％，以及更優選1-10重量％。
除了或代替上述的常規漂白活化劑，所謂的漂白催化劑也可摻入。漂白催化劑是促進漂白的過渡金屬鹽或者是過渡金屬配合物如錳、鐵、鈷、釕或者鉬-Salen配合物或者羰基配合物。具有含氮的三角配體的錳、鐵、鈷、釕、鉬、鈦、釩和銅的配合物，以及鈷、鐵、銅、釕-氨合物的復合物體也可以用做漂白催化劑，優選使用在DE19709284 A1中描述的化合物。
本發明的洗滌或清潔產品通常含有一種或多種助洗劑(Builder)，特別是沸石、硅酸鹽、碳酸鹽、有機共助洗劑以及磷酸鹽，假使根據生態環境對使用這些磷酸鹽沒有反對意見的話。磷在洗碗機洗滌劑中是尤其優選的主要材料。
可在此提及的化合物為晶體層狀硅酸鈉，對應于通式NaMSixO2x+1·yH2O，其中M是鈉或者氫，x是1.6-4，優選1.9至4.0之間的數，以及y是0-20之間的數，x值優選為2、3或4。這樣的晶體層狀硅酸鹽記載在如歐洲專利申請EP 164514中。對應于上述通式的優選的晶體層硅酸鹽是其中M為鈉、x為2或3的那些。β-和δ-二硅酸鈉Na2Si2O5·yH2O均特別優選。這些化合物可從市場上購得，如SKS(Clariant)。因此SKS-6主要是δ-二硅酸鈉，其化學式為Na2Si2O5·yH2O，而SKS-7主要是β-二硅酸鈉。通過與酸(例如檸檬酸或碳酸)反應，δ-二硅酸鈉生成kanemite NaHSi2O5·H2O，其以SKS-9和SKS-10(Clariant)在市場上銷售。對這些層狀硅酸鹽進行化學修飾也有優勢。例如，層狀硅酸鹽的堿度可受到適度的影響。與δ-二硅酸鈉相比，摻雜磷酸或者碳酸的層狀硅酸鹽已經修飾了晶體形態，他們溶解更快而且顯示出與δ-二硅酸鈉相關的鈣結合能力增加。層狀硅酸鹽具有一般的經驗式xNa2O·yH2O·zP2O5，其中x與y的比例對應于0.35-0.6，x和z的比例對應于1.75-1200，以及y和z的比例對應于4-2,800，它們在專利申請DE 196 01 063中有記載。層狀硅酸鹽的溶解度還可通過利用特別精細顆粒的層狀硅酸鹽來提高。晶體層狀硅酸鹽和其他成分的化合物也可采用。尤其引人關注的是與纖維素衍生物組成的化合物，其在崩解效果上具有優勢，并尤其用于洗滌劑片劑中，以及與聚羧酸如檸檬酸或聚合的聚羧酸組成的化合物，例如丙烯酸的共聚物。
其他有用的助洗劑是無定形硅酸鈉鹽，其模量(Na2O∶SiO2比率)為1∶2-1∶3.3，優選為1∶2-1∶2.8，以及更優選是1∶2-1∶2.6，其可以延遲崩解并表現多重洗滌循環特性。與常規的無定形硅酸鈉相關的溶解推遲可由多種方法獲得，例如表面處理、混合/壓實或通過過干燥法。在本發明的上下文中，術語“無定形”同樣可理解為包括“X-射線無定形”。換一種說法，硅酸鹽并不產生任何強烈的X-射線反射，這在X-射線衍射實驗中是晶體物質的特征，但最多有一個或多個具有幾度衍射角寬的散射X-輻射的最大值。然而，在電子衍射實驗中，當硅酸鹽粒子產生彎曲或者甚至尖銳的衍射最大值時，甚至可獲得特別好助洗劑特性。這個可解釋表示這些產品具有微晶區域，大小介于10至數百nm，優選上限為50nm以及更優選上限達20nm。尤其優選壓實的無定型硅酸鹽、混合的無定型硅酸鹽以及干燥的X-射線-無定形硅酸鹽。
如果需要，本發明可使用的精細晶體、含有結合水的合成沸石優選是沸石A和/或沸石P。沸石MAP(Crosfield公司的銷售產品)是尤其優選的P-型沸石。然而，沸石X和A、X和/或P的混合物也可適用。依照本發明，優選的是使用例如，商業上可得到的沸石X和沸石A的共晶體化物(約80重量％的沸石X)，其由CONDEA Augusta S.p.A.公司以VEGOBOND AX商品名銷售，并可由下式描述nNa2O·(1-n)K2O·Al2O3·(2-2.5)SiO2·(3.5-5.5)H2O。
適合的沸石的平均粒子尺寸小于10μm(體積分布，測量方法Coulter Counter)，并優選含有18-22重量％，以及更優選的20-22重量％的結合水。
眾所周知的磷酸鹽當然也可用作助洗劑，倘若它們的應用對處于生態環境的理由不應避免。在大量市場上可得到的磷酸鹽中，堿金屬磷酸鹽在洗滌劑工業中最為重要，三磷酸五鈉和三磷酸五鉀(鈉和鉀的三磷酸鹽)尤其優選。
“堿金屬磷酸鹽”是各種磷酸的堿金屬(特別是鈉和鉀)鹽的集合術語，包括偏磷酸(HPO3)n和正磷酸(H3PO4)以及更高分子量的代表。磷酸鹽兼有各種優點他們充當堿性載體，阻止石灰沉積在機器零件上以及在織物上石灰結殼，此外，有助于清潔效果。
磷酸二氫鈉(NaH2PO4)以二水化合物(密度1.91gcm-3，熔點60°)和一水化合物(密度2.04gcm-3)存在。這兩種鹽都是白色非常易溶于水的粉末，加熱后失去結晶水，并在200℃下轉化為弱酸性的二磷酸鹽(二磷酸氫二鈉，Na2H2P2O7)，以及在更高溫度時轉化為三偏磷酸鈉(Na3P3O9)和長鏈高分子量偏磷酸鈉(Maddrell鹽)(參見下文)。NaH2PO4顯示酸性反應。用氫氧化鈉調整磷酸到pH值4.5，然后噴霧干燥所得“漿”就可形成NaH2PO4。磷酸二氫鉀(原或者一元磷酸鉀、磷酸氫鉀、KDP)KH2PO4是白色鹽，其密度為2.33gcm-3，熔點253°(分解形成多磷酸鉀(KPO3)x)，并且易溶于水。
硫酸氫二鈉(次磷酸鈉)Na2HPO4是無色、易溶于水的晶體鹽。以無水、帶2mol水(密度2.066gcm-3，95℃時失水)、帶7mol水(密度1.68gcm-3，熔點48°時失去5水)以及12mol水(密度1.52gcm-3，熔點35°失去5水)的形式存在，在100°時變成無水，在急劇加熱下，就會轉變成二磷酸鹽Na4P2O7。以酚酞作指示劑，用蘇打水中和磷酸就能制備磷酸氫二鈉。磷酸氫二鉀(次級或者二元磷酸鉀)K2HPO4是無定型的白色鹽、易溶于水。
磷酸三鈉，叔磷酸鈉，Na3PO4，是無色晶體，作為十二水合物，其密度是1.62gcm-3，熔點是73-76℃(分解)，作為十水合物，其熔點為100℃(對應于19-20％P2O5)，無水形式的密度為2.536gcm-3(對應于39-40％P2O5)。通過堿性反應磷酸三鈉易溶于水，其制備方法是通過蒸發濃縮恰好1mol磷酸二鈉和1mol氫氧化鈉的溶液。磷酸三鉀(三級或者三元磷酸鉀)K3PO4是白色易潮解的顆粒粉末，密度2.56gcm-3，熔點1340°，通過堿性反應易溶于水。例如如果托馬斯(Thomas)礦渣與煤和硫酸鉀一起加熱，就形成磷酸三鉀。盡管價格更高，但由于它們更易溶，所以在洗滌劑工業中，高效磷酸鉀通常比相應的鈉化合物更受歡迎。
二磷酸四鈉(焦磷酸鈉)Na4P2O7以無水形式(密度2.534gcm-3，熔點988℃，有時是880℃)和十水合物的形式存在(密度1.815-1.836gcm-3，熔點94℃時失水)。這兩個物質都是無色晶體，通過堿性反應溶于水中。當磷酸氫二鈉加熱到200°以上，或通過磷酸與蘇打以化學計量比反應并噴霧干燥該溶液就形成焦磷酸鈉。十水合物絡合重金屬鹽和硬鹽，由此減少了水的硬度。二磷酸鉀(焦磷酸鉀)K4P2O7以三水合物的形式存在，是一種無色吸濕性粉末，密度2.33gcm-3，溶于水，在25°時，1％溶液pH值為10.4。
相對高分子量的磷酸鈉和磷酸鉀是通過濃縮NaH2PO4和KH2PO4形成的。它們可劃分成環型，即鈉和鉀的偏磷酸鹽，以及鏈型，即鈉和鉀的多磷酸鹽。特別是鏈型有很多不同的名稱熔合或煅燒的磷酸鹽、格雷姆鹽(Graham鹽)、四聚偏磷酸鉀(Kurrol鹽)以及Maddrell鹽。所有更高的鈉和鉀的磷酸鹽都統稱為濃縮的磷酸鹽。
在工業上有重要用途的三磷酸五鈉Na5P3O10(三聚磷酸鈉)是非吸濕性白色水溶性鹽，其不帶水或帶6個水分子結晶，具有通式NaO-[P(O)(ONa)-O]n-Na，其中n＝3。在室溫條件下，大約17克無結晶水的鹽溶于100克的水中，在60°時是約20克，而在100°時大約是32克。將這種溶液加熱2小時到100°，大約8％的正磷酸鹽和15％的二磷酸通過水解形成。在制備三磷酸五鈉時，將磷酸與蘇打水溶液或者氫氧化鈉以化學計量比反應，并將溶液噴霧干燥。同格雷姆鹽和磷酸氫鈉相似，三磷酸五鈉溶解許多不溶性的金屬化合物(包括石灰肥皂等)。市場上的三磷酸五鈉K5P3O10例如按重量計都是50％溶液(＞23％P2O5，25％K2O)的形式。多磷酸鉀廣泛應用于洗滌劑工業中。還存在三磷酸鉀鈉，根據本發明，也可使用。例如當三偏磷酸鈉用氫氧化鉀水解時形成三磷酸鉀鈉(NaPO3)3+2KOHNa3K2P3O10+H2O根據本發明，它們可以完全相同的方式用作三聚磷酸鈉、三聚磷酸鉀或者它們的混合物。根據本發明，三聚磷酸鈉和三聚磷酸鈉鉀兩者的混合物或者三聚磷酸鉀和三聚磷酸鉀鈉兩者的混合物或者三聚磷酸鈉和三聚磷酸鉀和三聚磷酸鈉鉀三者的混合物也可使用。
本發明的洗滌和清潔產品中的有機共助洗劑尤其包括多羧酸鹽或多羧酸、聚體多羧酸鹽、多天冬氨酸、聚乙縮醛、任選氧化糊精、其他有機共助洗劑(參見下文)和膦酸酯。下面描述這些類物質。
有用的有機助洗劑例如為以其鈉鹽形式使用的多羧酸，其中多羧酸應理解為攜帶一個以上酸官能團的羧酸。只要對生態是安全的，這些羧酸包括例如檸檬酸、己二酸、丁二酸、戊二酸、蘋果酸、酒石酸、馬來酸、反丁烯二酸、糖酸、氨基羧酸、次氮基三乙酸(NTA)及其混合物。優選的鹽是多羧酸的鹽，如檸檬酸、己二酸、丁二酸、戊二酸、酒石酸、糖酸及其混合物。
這些酸本身就可使用。除了它們助洗效應以外，這些酸也通常具有使成分酸化的性質，因此在洗滌劑或清洗劑中用來建立相對較低和適中的pH值，除非pH值要求通過混合其他成分而得到。在這方面特別提及系統相容性和對環境安全的酸，如檸檬酸、乙酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙醇酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、葡萄酸以及它們的任意混合物。然而，無機酸尤其是硫酸，或堿尤其是銨或堿金屬的氫氧化物也可用作pH調節劑。這些調節劑存在于本發明的產品中，其量優選不高于20重量％，以及特別為1.2-17重量％。
其他合適的助洗劑有聚合的多羧酸鹽，例如是聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的堿金屬鹽，例如那些相對分子量為500-700,000g/mol的。
本說明書中提及的聚合多羧酸鹽的分子量是各自酸形式的重均分子量Mw，其主要利用紫外檢測儀通過凝膠滲透色譜法(GPC)測定。測定根據聚丙烯酸的外標進行，所述外標依靠其與所研究聚合物的結構相似性而提供實際的分子量值。這些值完全不同于以聚苯乙烯磺酸為標準測定的分子量值。以聚苯乙烯磺酸為標準測定的分子量一般高于本說明書中給出的分子量。
尤其合適的聚合物是聚丙烯酸酯，其優選具有2,000-20,000g/mol的分子量。由于具有優良的溶解性，該組優選的代表是短鏈聚丙烯酸酯，其分子量為2,000-10,000g/mol，以及特別為3,000-5,000g/mol。
此外，合適的還有共聚合的聚羧酸酯，特別是丙烯酸與甲基丙烯酸的那些共聚合的聚羧酸酯，以及丙烯酸或甲基丙稀酸與馬來酸的那些共聚合的聚羧酸酯。證明含有50-90重量％丙烯酸以及50-10重量％馬來酸的丙烯酸/馬來酸共聚物尤其合適。以游離酸計，它們的相對分子量一般為2,000to70,000g/mol，優選在20,000-50,000g/mol，更優選在30,000-40,000g/mol。(共)聚合的聚羧酸酯可以粉末形式或者水溶液的形式利用。(共)聚合的聚羧酸酯在清洗劑中所占的含量為0.5-20重量％，特別為1-10重量％。
為了改善水中的溶解度，這些聚合體也可包含烯丙基磺酸，如烯丙基羥苯磺酸以及甲代烯丙基磺酸作為單體。
特別優選的聚合物是由2種以上不同單體單元構成的可生物降解的聚合物，如那些含有丙烯酸和馬來酸以及乙烯醇或乙烯醇衍生物作為單體的，或者那些含有以丙烯酸和2-烷基烯丙基磺酸和糖衍生物作為單體的。
其他優選的共聚物是那些優選含有丙烯醛和丙烯酸/丙烯酸鹽或丙烯醛和乙烯基醋酸酯作為單體的共聚物。
其他優選的助洗劑是聚合的氨基二元羧酸、其鹽或其前體。聚天冬氨酸或者鹽及其衍生物是特別優選的。
其他合適的助洗劑是聚縮醛，它們可通過二醛與含有5-7個碳原子和至少3個羥基的多羥基羧酸反應得到。優選的聚縮醛可從二醛如乙二醛、戊二醛、對苯二醛及其混合物得到，以及從多羥基羧酸如葡糖酸和/或葡庚糖酸獲得。
其他合適的有機助洗劑是糊精，如碳水化合物的低聚物或聚合物，它們可由部分水解淀粉獲得。通過常規方法如酸或者酶催化的方法進行水解反應。水解產物優選平均分子量為400-500,000g/mol。優選具有右旋糖當量(DE)0.5-40，特別為2-30的多糖，其中與DE為100的右旋糖比較，該DE是衡量多糖的還原效果的常用尺度。DE為3-20的麥芽糊精和DE為20-37的干葡萄糖糖漿以及具有相對高的分子量為2,000-30,000g/mol的所謂黃、白糊精都可采用。
這些糊精的氧化衍生物是它們與氧化劑的反應產物，所述氧化劑能將糖環的至少一個醇官能團氧化成羧酸官能團。本發明產品中尤其優選的有機助洗劑是根據EP 472 042、WO 97/25399和EP 755944的氧化淀粉或其衍生物。
其他合適的共助洗劑是羥二琥珀酸鹽以及其他二琥珀酸的衍生物，優選二琥珀酸化乙二胺。乙二胺-N，N’-二琥珀酸鹽(EDDS)優選以鈉鹽或者鎂鹽形式使用。就此而論，丙三醇二琥珀酸酯和丙三醇三琥珀酸酯也是優選對象。在含沸石、碳酸鹽和/或含硅酸鹽的產品中使用量為3-15重量％。
其它有用的有機助洗劑是例如乙酰化的羥基羧酸及其鹽，其可任選以內酯形式出現并含有至少4個碳原子、至少一個羥基和最多2個酸性基團。
具有共助洗劑特性的另一類物質是膦酸鹽。對此特別是羥基鏈烷和氨基鏈烷膦酸鹽。在羥基鏈烷膦酸鹽中，1-羥基乙烷-1，1-二膦酸鹽(HEDP)作為共助洗劑尤為重要。優選使用鈉鹽，其中二鈉鹽顯示中性反應，以及四鈉鹽顯示堿性反應(pH9)。優選的氨基鏈烷膦酸鹽有乙二胺四亞甲基膦酸鹽(EDTMP)、二乙基三胺五亞甲基膦酸鹽(DTPMP)及其更高的同系物。優選使用中性反應的鈉鹽形式，如EDTMP的六鈉鹽或者DTPMP的七-和十鈉鹽。在膦酸鹽中，HEDP優選用作助洗劑。另外，氨基鏈烷膦酸鹽具有顯著的重金屬結合能力。因此，尤其如果洗滌劑里亦含有漂白劑，有益的是可利用氨基鏈烷膦酸鹽，特別為DTPMP，或者上述膦酸鹽的混合物。
另外，任何能與堿土金屬離子形成復合物的化合物都可用作共助洗劑。
本發明的洗滌或清潔產品中可任選包含其量高達90重量％的助洗劑。其含量優選高達75重量％。本發明洗滌劑中的助洗劑含量尤其為5-50重量％。在本發明的洗滌劑用于硬表面清潔，特別是用于餐具的機械洗滌時，助洗劑的含量尤其為5-88重量％，其中在這種洗滌劑中優選不含水不溶性的助洗劑。在一優選實施方案中，本發明的特別用于洗碗機的洗滌劑包含20-40重量％的水溶性有機助洗劑，特別是堿金屬檸檬酸鹽，含有5-15重量％的堿金屬碳酸鹽以及20-40重量％的堿金屬二硅酸鹽。
在液體至凝膠形式的洗滌和清潔產品的組成中可用的溶劑來源于例如一元醇或者多元醇、烷醇胺或乙二醇醚的基團，條件是在指定的濃度范圍內它們能與水混合。這些溶劑優選選自乙醇，正或異丙醇，丁醇，乙二醇甲醚，乙二醇乙醚，乙二醇內醚，乙二醇一-正丁醚，二乙二醇甲醚，二乙二醇二乙醚，丙二醇甲基、乙基或丙基醚，二丙二醇單甲基或單乙基醚，二異丙二醇單甲基或單乙基醚，甲氧基、乙氧基或丁氧基三甘醇，1-丁氧基乙氧基-2-丙醇，3-甲基-3-甲氧基丁醇，丙二醇叔-丁醚以及這些溶劑的混合物。
在本發明的液體至凝膠形式的洗滌和清潔產品中，溶劑的含量為0.1-20重量％，優選低于15重量％，以及特別低于10重量％。
為了調節粘度，可向本發明產品中加入一種或者多種增稠劑，例如增稠體系。這些高分子量物質也稱為膨脹劑通常吸收大量液體并且在此過程中膨脹，以便最終變成粘滯的純溶液或膠狀溶液。
合適的增稠劑是無機或者聚合的有機化合物。無機增稠劑包括例如聚硅酸、粘土礦物如蒙脫石、沸石、硅石和膨潤土。有機增稠劑來源于天然聚合物、改性的天然聚合物和完全合成的聚合物。天然存在的聚合物的例子有瓊脂、角叉菜、黃蓍膠、阿拉伯膠、藻酸鹽、果膠、聚糖、瓜耳膠、刺槐豆膠、淀粉、糊精、明膠以及干酪素。可用作增稠劑的改性天然聚合體主要來源于改性淀粉和纖維素。這里例如是羧甲基纖維素及其他纖維素醚、羥基乙基和羥基丙基纖維素以及樹膠醚。完全合成的增稠劑包括聚合物，如聚丙烯和聚甲基丙烯化合物、乙烯基聚合物、聚羧酸、聚醚、聚亞胺、聚酰胺和聚氨基甲酸酯。
以最終的產品計，增稠劑的用量最高達5重量％，優選0.05-2重量％，以及特別優選為0.1-1.5重量％。
本發明的洗滌和清潔產品可任選含有螯合劑、電解液和其他助劑，如熒光增白劑、泛灰抑制劑、銀腐蝕抑制劑、染料轉移抑制劑、泡沫抑制劑、研磨劑、染料和/或香精，以及微生物活性成分和/或紫外吸收劑作為它的補充成分。
本發明的織物洗滌劑可包含二氨基1，2-二苯乙烯二磺酸的衍生物或其堿金屬鹽作為熒光增白劑。合適的熒光增白劑有例如4，4’-雙-(2-苯胺基-4-嗎啉基-1，3，5-三嗪基-6-氨基)-1，2-二苯乙烯-2，2’-二磺酸的鹽或者相似組成的化合物，所述化合物的嗎啉基可被二乙醇氨基、甲氨基、苯胺基或者2-甲氧基乙氨基替代。也可使用取代的二苯基苯乙烯基型的增白劑，如4，4’-雙-(2-磺苯乙烯基)-二苯基、4，4’-雙-(4-氯-3-磺苯乙烯基)-二苯基或者4-(4-氯苯乙烯基)-4’-(2-磺苯乙烯基)-二苯基的堿金屬鹽。上述熒光增白劑的混合物也可以使用。
泛灰抑制劑的作用是使從織物纖維上溶解出的污物保持懸浮于洗滌液中。合適的泛灰抑制劑是大多數的天然有機物的水溶性膠體，如淀粉、動物膠、明膠、淀粉或纖維素的羧酸乙醚或者磺酸乙醚的鹽，也可以是纖維素或淀粉的酸性硫酸酯的鹽。包含酸性基團的水溶性聚酰胺也適用此目的。淀粉衍生物除了上面提及的以外，例如還有乙醛淀粉等也都可使用。纖維素乙醚如羧甲基纖維素(鈉鹽)、甲基纖維素、羥烷基纖維素以及混合醚，如甲基羥乙基纖維素、甲基羥丙基纖維素、甲基羧甲基纖維素及其混合物優選使用，例如以該洗滌劑計，其用量為0.1-5重量％。
為了保護銀器免遭腐蝕，可以在本發明的洗碗洗滌劑中使用銀腐蝕抑制劑。現有技術中，銀腐蝕抑制劑是已知的，并包括例如，苯并三唑、氯化鐵(III)以及硫酸鈷。例如，從歐洲專利EP 0 736 084 B1已知，特別適合與酶一起使用的銀腐蝕抑制劑有錳、鈦、鋯、鉿、釩、鈷或鈰鹽和/或絡合物，在這些絡合物中上述金屬元素以氧化數II、II、IV、V或VI的一種形式存在。這些化合物的例子有MnSO4、V2O5、V2O4、VO2、TiOSO4、K2TiF6、K2ZrF6、Co(NO3)2、Co(NO3)3及其混合物。
污漬釋放劑或污漬驅除劑通常是聚合物，當這些聚合物用于洗滌劑中時，它們就給洗滌的纖維提供污漬排斥特性和/或支持洗滌劑的其他成分懸浮污漬的能力。在這些聚合物用于硬表面的清洗劑中時，也能觀測到可比的效果。
特別有效并且長期以來已知的污漬釋放活性劑是具有二羧酸、烷撐二醇以及聚亞烷基二醇單元的共聚酯。例子為聚對苯二甲酸乙二酯和聚乙二醇的共聚物或混合聚合物(DT 16 17 141或DT 22 00 911)。DE22 53 063中提到酸性組合物，其中含有由二堿性羧酸和亞烷基或環亞烷基聚乙二醇組成的共聚物。在DE 28 57 292、DE 33 24 258以及EP 0253 567中描述了對苯二甲酸亞乙酯和聚環氧乙烷-對苯二甲酸酯的共聚物和它們在洗滌劑中的應用。歐洲專利EP 066 944涉及一種組合物，其含有由乙二醇、聚乙二醇、芳族二羧酸與磺化芳族二羧酸以一定摩爾比構成的共聚酯。歐洲專利EP 0 185 427描述了甲基-或乙基-末端的聚酯，其含有對苯二甲酸亞乙酯和/或亞丙酯單元和聚環氧乙烷-對苯二甲酸酯單元，以及描述了含有此種污漬釋放聚合物的洗滌劑。歐洲專利EP 0 241 984涉及聚酯，這種聚酯除了含有氧乙烯基團和對苯二甲酸單元以外，還包含取代的亞乙基單元和甘油單元。歐洲專利EP 0241 985公開了一種聚酯，其除了含有氧乙烯基團和對苯二甲酸以外，還含有1，2-亞丙基、1，2-亞丁基和/或3-甲氧基-1，2-亞丙基和甘油單元，并且其以C1-4烷基為末端。歐洲專利申請EP 0 272 033描述了包含聚對苯二甲酸亞丙酯和聚對苯二甲酸乙二醇酯單元的至少部分以C1-4烷基或酰基為末端的聚酯。歐洲專利EP 0 274 907描述了包含以磺乙基為末端的對苯二甲酸酯的污漬釋放聚酯。根據歐洲專利申請EP 0357280，包含對苯二甲酸、亞烷基二醇和聚-C2-4-乙二醇單元的污漬釋放聚酯可通過不飽和端基的磺化來制備。國際專利申請WO 95/32232涉及酸性芳族污漬釋放聚酯。國際專利申請WO 97/31085描述用于棉織物的未聚合的污漬驅除劑，其含有若干官能團單元第一單元例如可能是陽離子的，能通過靜電相互作用吸附到棉表面，以及第二單元是疏水的，負責遺留在水/棉界面上的活性物質。
適用于本發明的洗衣店用洗滌劑中的染料轉移抑制劑尤其包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯咪唑、聚合的N-氧化物，如聚-(乙烯基吡啶-N-氧化物)和乙烯基吡咯烷酮與乙烯基咪唑的共聚物。
在機器清洗過程中使用時，將泡沫抑制劑加入到洗滌劑中會大有好處。合適的泡沫抑制劑例如是具有較高含量的C18-24脂肪酸的天然或合成來源的皂類。合適的非表面活性劑類的泡沫抑制劑是例如有機聚硅氧烷及其與微細的任選硅烷化的硅酸以及石臘、臘、微晶臘的混合物，以及它們與硅烷化的硅酸或者二-硬脂酰亞乙基二酰胺的混合物。不同泡沫抑制劑的混合物，如硅酮、石蠟和蠟的混合物也可以被有效的利用。泡沫抑制劑，特別是含硅氧烷-和/或含石蠟-的泡沫抑制劑優選固定到粒狀水溶性的或水分散的支持物上。尤其優選石蠟和雙-硬脂酰亞乙基二酰胺的混合物。
另外，本發明的硬表面清洗劑可含有研磨劑組分，特別是選自石英粉、鋸末、塑料粉、白堊和玻璃微珠以及它們的混合物。存在于本發明清洗劑中的研磨劑，其量優選不超過20重量％，特別為5-15重量％。
將染料和香精加入到本發明的洗滌劑/清洗劑中以改善產品的美學吸引力，并給消費者不僅提供所需要的洗滌和清潔功效而且還提供了視覺和感官上“特別和不易錯認”的產品。合適的芳香油或香料包括個別的芳香化合物，如酯、醚、醛、酮、醇和烴類的合成產品。酯類的芳香化合物例如是乙酸芐酯、異丁酸苯氧基乙基酯、乙酸p-叔丁基環己酯、乙酸芳樟酯、乙酸二甲基芐基原酯、乙酸苯基乙酯、苯甲酸芳樟酯、甲酸芐基酯、氨基乙酸乙基甲基苯酯、丙酸烯丙基環己酯、丙酸甲基苯基原酯和水楊酸芐酯。醚包括例如芐基乙基醚；醛包括例如含有8-18個碳原子的直鏈鏈烷醛(Alkanale)、檸檬醛、香茅醛、香茅基含氧乙醛、仙客來醛、羥基香茅醛、鈴蘭醛和Bourgeonal；酮包括例如紫羅酮、α-異甲基紫羅酮以及甲基柏木酮；醇包括茴香腦、香茅醇、丁子香酚、香葉醇、沉香醇、苯乙基醇和松油醇；以及烴最主要包括萜烯，如苧烯和蒎烯。然而，優選使用各種香精的混合物一起產生誘人的香味。象這樣的芳香油也可包含天然香精混合物，這些混合物可得自植物源如松樹、柑橘屬植物、茉莉、綠葉刺蕊草、玫瑰或衣蘭衣蘭油。還可適用的有鼠尾草油、春黃菊油、丁香油、蜜蜂花油、薄荷油、肉桂葉油、酸橙花油、杜松子油、巖蘭油、乳香油、楓子香油和巖薔薇油，以及橙花油、苦橙油、桔皮油和檀香油。洗滌劑/清洗劑的染料含量通常低于0.01重量％，而香料卻可占到整個組合物的2重量％。
香料可直接摻入到洗滌和清潔產品中，然而，有利地是將香味涂覆到載體上，所述載體能夠增強香氣在洗滌物上的附著力，并通過緩慢釋放香氣給處理過的織物特別提供持久的芳香。合適的載體物質例如是環糊精，其中環糊精/香料復合物還可附加地用其它助劑涂覆。另一優選的芳料載體是已描述過的沸石X，它也能夠代替表面活性劑或與表面活性劑混合吸收香氣。因此，含有所述沸石X的洗滌和清潔產品是優選的，其中所述香料至少部分吸收在沸石上。
專業人員毫無困難地選擇的優選的染料具有高的儲藏穩定性，不受產品中的其他常規成分和受光的影響，并且對織物纖維不顯示顯著的直接染色性從而不給它們上色。
為了控制微生物，洗滌或清潔產品可以含有抗菌活性成分。依賴抗菌譜和作用機理，抗菌劑分為細菌抑制劑和殺菌劑、真菌抑制劑和殺真菌劑等。這些組的重要代表是例如苯扎氯胺、烷芳基磺酸鹽、鹵代苯酚和苯酚醋酸汞化物。在本發明教導的范圍中，術語“抗微生物活性”和“抗微生物活性物質”具有本領域的常規意義，如K.H.Wallhuβer在“Praxis der Sterilisation，Desinfektion-KonservierungKeimidentifizierung-Betriebshygiene”(第5版，Stuttgart/New YorkThieme，1995)中所定義，其中所述的任何具有抗微生物活性的物質均可使用。合適的抗微生物活性成分優選選自醇、胺、醛、抗微生物的酸及其鹽、羧酸酯、酰胺、苯酚、苯酚衍生物、聯苯、聯苯基烷、尿素衍生物、氧和氮縮醛和縮甲醛、芐脒、異噻唑啉、鄰苯二甲酰亞胺衍生物、吡啶衍生物、抗微生物的表面活性化合物、胍、抗微生物的兩性化合物、喹啉、1，2-二溴代-2，4-二氰基丁烷、碘代-2-丙基丁基氨基甲酸酯、碘、碘遞體、過氧化合物、鹵化合物以及上述的任意混合物。
因此殺菌活性成分可選自乙醇、正丙醇、異丙醇、1，3-丁二醇、苯氧基乙醇、1，2-丙二醇、甘油、十一烯酸、苯甲酸、水楊酸、二氫乙酸(Dihydracetic acid)、鄰-苯基酚、N-甲基嗎啉乙腈(MMA)、2-芐基-4-氯酚、2，2’-亞甲基-雙-(6-溴代-4-氯酚)、4，4’-二氯-2’-羥基聯苯乙醚(Dichlosan)、2，4，4’-三氯-2’-羥基二苯基醚(Trichlosan)、Chlorohexidine、N-(4-氯苯基)-N-3，4-二氯苯基)-脲、N，N′-(1，10-癸烷二基二-1-嘧啶基-4-亞基)-雙-(1-辛胺)-二氫氯化物、N，N′-雙-(4-氯苯基)-3，12-二亞氨基-2，4，11，13-四氮雜四癸烷二亞氨基酰胺、葡糖魚精蛋白、抗微生物的表面活性季化合物、胍包括二胍和聚胍，如1，6-雙-(2-乙基己基二胍基己烷)-二氫氯化物、1，6-雙-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-苯基-N1，N1-甲基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-鄰-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，6-二氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-[N1N1′-β-(對-甲氧基苯基)-二胍基-N5，N5′]-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1N1′-α-甲基-β-苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-對-硝基苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、ω:ω-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-二-正丙基醚二氫氯化物、ω:ω′-二-(N1，N1′-對-氯苯基二胍基-N5，N5′)-二-正丙基醚四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，4-二氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-對-甲基苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，4，5-三氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、1，6-二-[N1，N1′-α-(對-氯苯基)-乙基二胍基-N5，N5′]-己烷二氫氯化物、ω:ω-二-(N1，N1′-對-氯苯基二胍基-N5，N5′)-間-二甲苯二氫氯化物、1，12-二-(N1，N1′-對-氯苯基二胍基-N5，N5′)-十二烷二氫氯化物、1，10-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-癸烷四氫氯化物、1，12-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-十二烷四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-鄰-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-鄰-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、乙烯-雙-(1-甲苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(對-甲苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(3，5-二甲基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(對-叔戊基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(壬基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(正丁基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(2，5-二乙氧基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(2，4-二甲基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(鄰-聯苯雙縮胍)、乙烯-雙-(混合-戊基萘基雙縮胍)、正丁基乙烯-雙-(苯基雙縮胍)、三亞甲基-雙-(鄰-甲苯基雙縮胍)、正丁基三亞甲基-雙-(苯基雙縮胍)以及相應的鹽，如醋酸鹽、葡糖酸鹽、氫氯化物、氫溴化物、檸檬酸鹽、亞硫酸氫鹽、氟化物、聚馬來酸鹽、正椰油烷基肌氨酸鹽、亞磷酸鹽、次亞磷酸鹽、過氟辛酸鹽、硅酸鹽、山梨酸鹽、水楊酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、亞氨基醋酸鹽、肉桂酸鹽、硫氰酸鹽、精氨酸鹽、苯四酸鹽、四羧基丁酸鹽、安息香酸鹽、戊二酸鹽、單氟磷酸鹽、過氟丙酸鹽和它們的混合物。鹵化二甲苯和甲酚衍生物，如對-氯-間-甲酚或對-氯-間-二甲苯，并且植物起源的天然殺菌劑(如香料和香草)以及動物和微生物起源的天然抗菌劑也是合適的。優選的抗菌劑有抗菌性表面活性的四元化合物、植物起源和/或動物起源的天然抗菌劑，以及最優選的是至少一個植物起源的抗菌劑，其來自咖啡因、可可堿和茶堿以及香精油如丁子香酚、麝香草酚和香葉醇，和/或至少一個動物起源的抗菌劑，其來自酶如牛奶蛋白、溶菌酶以及乳過氧化物酶和/或至少一個抗菌性表面活性的四元化合物，其包含銨、锍、鏻、碘鎓或砷鎓基、過氧化合物和氯化合物。微生物起源的物質即所謂的“殺菌素”也可以使用。
適合用作抗微生物活性成分的季銨化合物(QAC)具有通式(R1)(R2)(R3)(R4)N+X-，其中R1-R4可以相同或不同，并代表C1-22烷基、C7-28芳烷基或雜環基，其中兩個或在芳香化合物如吡啶的情況下甚至是三個基團與氮原子一起形成雜環基，如吡啶鎓或咪唑鎓化合物，以及X-代表鹵離子、硫酸根離子、氫氧根離子或類似的陰離子。為了達到最佳抗微生物活性，這些取代基中至少一個優選具有8-18，更優選12-16個碳原子的鏈長。
QAC可以通過叔胺與烷基化試劑反應得到，所述烷基化試劑如氯代甲烷、芐基氯、硫酸二甲酯、十二烷基溴，以及環氧乙烷。帶有一個長烷基鏈和兩個甲基的叔胺的烷基化尤其簡單，同樣在氯代甲烷的幫助下在溫和條件下可以進行含兩個長鏈基團和一個甲基的叔胺的季銨化。含三個長烷基或者羥基取代的烷基的胺缺乏活性，并優選采用硫酸二甲酯來季銨化。
合適的QAC是例如芐烷銨氯化物(N-烷基-N，N-二甲基芐基氯化銨，CAS No.8001-54-5)、Benzalkon B(m，p-二氯芐基二甲基-C12-烷基氯化銨，CAS No.58390-78-6)、苯佐氯銨(芐基-十二基-雙-(2-羥乙基)-氯化銨)、十六烷三甲基溴化銨(N-十六烷基-N，N-三甲基溴化銨，CASNo.57-09-0)、苯索氯銨(N，N-二甲基-N-[2-[2-[對-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯氧基]-乙氧基]-乙基]-芐基氯化銨，CAS No.121-54-0)、二烷基二甲基氯化銨，如二-正癸基二甲基氯化銨(CAS No.7173-51-5-5)、二癸基二甲基溴化銨(CAS No.2390-68-3)、二辛基二甲基氯化銨、1-十六烷基氯化吡啶鎓(CAS No.123-03-5)和噻唑啉碘化物(CAS No.15764-48-1)以及它們的混合物。尤其優選的QAC是含有C8-18烷基的芐烷氯化銨，特別是C12-14-烷基-芐基-二甲基-氯化銨。
苯扎鹵銨和/或取代的苯扎鹵銨是商業上可獲得的，如來自Lonza的Barquat、來自Mason的Marquat、來自Witco/Sherex的Variquat以及來自Lonza的Hyamine和來自Lonza的Bardac。其他商業上可獲得的抗微生物活性成分有N-(3-氯烯丙基)-hexaminium氯化物，如來自Dow的Dowicide和Dowicil，芐索氯銨，如來自Rohm & Haas的Hyamine1622，甲基苯索氯銨，如來自Rohm & Haas的Hyamine10X，十六烷基吡啶鎓氯化物，如來自Merrell Labs的氯化十六烷基吡啶。
該殺菌活性成分的用量在0.0001-1重量％的范圍內，優選在0.001-0.8重量％的范圍內，更優選在0.005-0.3重量％的范圍內，以及最優選在0.01-0.2重量％的范圍內。
另外，本發明的洗滌或清潔產品可任選含有紫外吸收劑，所述吸收劑可吸附到經處理的織物上，并增強纖維和/或其他組成成分的光穩定性。紫外吸收劑是有機物質(濾光劑)，它們能吸收紫外線并以長波輻射如熱的形式釋放吸收的能量。
具有這些所需特性的化合物是例如通過無輻射鈍化作用而具有所需特性的化合物以及具有位置2和/或位置4取代基的二苯甲酮的衍生物。此外其他合適的紫外吸收劑是取代的苯并三唑、3-苯基-取代的丙烯酸鹽(位置2上任選用氰基取代的肉桂酸衍生物)、水楊酸鹽、有機Ni復合物和天然物質，如傘形酮和內生的尿刊酸。聯苯基以及主要是1，2-二苯乙烯衍生物具有特別的意義，例如在EP 0728749 A中所述的商業上以TinosorbFD和TinosorbFR ex Ciba可得到的。合適的UV-B吸收劑包括3-苯亞甲基樟腦或3-苯亞甲基降樟腦和它的衍生物，如在EP 0693471 B1中所述的3-(4-甲基苯亞甲基)-樟腦；4-氨基苯甲酸衍生物，優選4-(二甲基氨基)-苯甲酸-2-乙基己基酯、4-(二甲基氨基)-苯甲酸-2-辛基酯和4-(二甲基氨基)-苯甲酸戊基酯；肉桂酸的酯，優選4-甲氧基肉桂酸-2-乙基己基酯、4-甲氧基肉桂酸丙基酯、4-甲氧基肉桂酸異戊基酯、2-氰基-3，3-苯基肉桂酸-2-乙基己基酯(氰雙苯丙烯酸辛酯)；水楊酸的酯，優選水楊酸-2-乙基己基酯、水楊酸-4-異丙基芐基酯、水楊酸高薄荷基酯；二苯甲酮的衍生物，優選2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基-4′-甲基二苯甲酮、2，2′-二羥基-4-甲氧基二苯甲酮；亞芐基丙二酸的酯，優選4-甲氧基亞芐基丙二酸二-2-乙基己基酯；三嗪衍生物，如2，4，6-三苯胺-(對-羰基-2′-乙基-1′-己氧基)-1，3，5-三嗪和EP 0818450 A1中所述的辛基三嗪酮或者二辛基丁氨基三嗪酮(UvasorbHEB)；丙烷-1，3-二酮如1-(4-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-丙烷-1，3-二酮；如EP 0694521 B1中所述的酮三環(5.2.1.0)癸烷衍生物。其他合適的UV-B吸收劑有2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和堿金屬、堿土金屬、銨、烷基銨、烷醇銨及其葡糖銨鹽；二苯甲酮的磺酸衍生物，優選2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸及其鹽；3-苯亞甲基樟腦的磺酸衍生物，如4-(2-氧代-3-亞龍腦基甲基)-苯磺酸和2-甲基-5-(2-氧代-3-亞龍腦基)-磺酸及其鹽。
典型的UV-A過濾劑具體有苯甲酰甲烷的衍生物，如1-(4′-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-丙烷-1，3-二酮、4-叔丁基-4′-甲氧基聯苯甲酰甲烷(Parsol 1789)、1-苯基-3-(4′-異丙基苯基)-丙烷-1，3-二酮和DE19712033 A1(BASF)中所述的烯胺化合物。UV-A和UV-B過濾劑當然可以混合物的形式利用。除了上面提到的可溶性物質外，不溶的光封閉色素，也就是細分散的優選“毫微化的”金屬氧化物或鹽也可以用于這種目的。適合的金屬氧化物的例子具體有氧化鋅、二氧化鈦以及鐵、鋯、硅、鎂、鋁和鈰的氧化物以及它們的混合物。硅酸鹽(滑石)、硫酸鋇和硬脂酸鋅也可作為鹽使用。氧化物和鹽以色素的形式應用在護膚的乳劑和裝飾性化妝品上。顆粒直徑平均小于100nm，優選在5-50nm之間，以及更優選在15-30nm之間。它們一般為球形，盡管橢圓或其他非球形顆粒也能用。這些色素也可經表面處理，也就是說親水性的或疏水性的。典型的例子是包覆的二氧化鈦，如Titandioxid T805(Degussa)和EusolexT2000(Merck)。合適的疏水型包覆材料首要是硅氧烷，以及其中尤其是三烷氧基辛硅烷或者二甲硅油。微粉化的氧化鋅優選使用。其他合適的UV過濾劑可以在P.Finkel，SFW-Journal122，第543頁(1996)的綜述中找到。
UV吸收劑的常用量在0.01-5重量％的范圍內，以及優選在0.03-1重量％的范圍內。
通常用于洗滌產品和清潔產品中的成分還包括清潔劑和清洗活性的酶。
因此，以除上述本發明的蛋白質，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之外的其它酶為特征的洗滌產品或清潔產品是本發明優選的實施方案。這些酶尤其包括其它蛋白酶，淀粉酶，纖維素酶，半纖維素酶，諸如β-葡聚糖酶，氧還酶，諸如蟲漆酶，角質酶和/或脂肪酶，還有酯酶，以及本應用領域現有技術中所述的其他所有酶。
數十年來，將酶例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶或纖維素酶作為洗滌產品和清潔產品中的活性組分使用。它們各自對有關試劑的洗滌或清潔功效的作用是在蛋白酶的情況下降解含蛋白質污物的能力，在淀粉酶的情況下降解含淀粉的污物，在脂肪酶的情況下裂解脂肪的活性。纖維素酶除其去污即基本洗滌和清潔功效外，特別由于其對洗滌劑的二次洗滌功效的作用和由于其對織物的纖維作用優選在洗滌劑中使用。特定的水解產物被洗滌劑和清潔劑中的常規組分損壞、溶解、乳化或懸浮或者由于其高的溶解度被洗液沖洗出，因此獲得酶和其他組分之間的協同作用效果。
蛋白酶在天然纖維，特別是棉或絲上具有與纖維素酶對組合物的二次洗滌功效可比的效果。由于它們對織物表面結構的影響，可以對該材料產生柔順的影響，并因此防止糾結。
其它酶通過它們特殊的酶功效增加相應產品的清洗功效。這些酶的例子包括半纖維素酶，諸如β-葡聚糖酶(WO 99/06515和WO99/06516)，氧還酶，諸如蟲漆酶(WO 00/39306)或者果膠溶解酶(WO00/42145)，這些具體用于特殊的清洗產品中。
在本發明的洗滌或清潔產品中首先考慮使用從微生物例如細菌或真菌獲得的酶。他們以本身已知的方法從合適的微生物中通過發酵方法而獲得，這些微生物例如在德國公開申請DE 1940488和DE2121397，在美國專利US 3,623,957和US 4,264,738，在歐洲專利申請EP 006 638和在國際專利申請WO 91/02792中有所描述。
本發明的蛋白質和/或其他蛋白質特別在儲存期間可用穩定劑來保護，例如避免通過物理作用、氧化或蛋白酶解而造成其變性、分解或失活。這適用于本發明所有的產品，尤其是洗滌和清潔產品。
一組穩定劑是可逆的蛋白酶抑制劑，它能在洗滌劑稀釋之后在洗液中解離。芐脒氫氯化物和亮抑酶肽就為此目的而確立。硼砂、硼酸或它們的鹽或酯也經常用于這種目的，它們首先包括例如在WO95/12655中由芳香基鄰位取代的苯基硼酸、在WO 92/19707中由芳香基間位取代的苯基硼酸和在US 5,972,873中由芳香基對位取代的苯基硼酸或它們的鹽或酯。在WO 98/13460和EP 583 534中公開了肽醛，也就是具有還原C末端的寡肽，特別是那些含有2-50個單體的，用于可逆性抑制洗滌劑蛋白酶。肽的可逆性蛋白酶抑制劑尤其包括卵類粘蛋白(WO 93/00418)。例如，WO 00/01826公開了針對蛋白酶枯草桿菌素的特異性可逆的肽抑制劑，用于含蛋白酶的組合物中，而WO00/01831公開了相應的蛋白酶和抑制劑的融合蛋白質。
其他酶的穩定劑有氨基醇，如單-、二-、三-乙醇-和-丙醇胺和它們的混合物、例如從EP 0 378 261和WO 97/05227中得知的最多達C12的脂族羧酸，如琥珀酸，其他羧酸或上述酸的鹽。德國專利申請DE19650537中為此目的公開了封端的脂肪酸酰胺烷氧酸鹽。如WO97/18287中所公開，某些用作助洗劑的有機酸額外能夠穩定存在的酶。
除了多元醇如甘油、乙二醇、丙二醇或山梨醇以外，低級脂族醇也是其他常用的酶穩定劑。同樣可以使用鈣鹽，例如醋酸鈣和在EP 0028 865中為此目的公開的甲酸鈣，以及例如根據歐洲專利申請EP 0378 262的鎂鹽也可使用。
聚酰胺寡聚物(WO 99/43780)或者聚合物，例如木質素(WO97/00932)，水溶性乙烯基共聚物(EP 828 762)或者如EP 702 712中所公開的纖維素乙醚、丙烯酸聚合物和/或聚酰胺可對酶制劑產生穩定作用，以克服物理影響或者pH值的變化。包含了聚胺-N-氧化物的聚合物(EP 587 550和EP 581 751)同時擔當酶穩定劑和染料轉移抑制劑。其它聚合物穩定劑是除了在WO 97/05227所公開的其他成分以外的直鏈C8-18聚氧化烯。如WO 97/43377和WO 98/45396所公開，烷基聚糖苷可穩定本發明產品中的酶成分，甚至提高它們的功效。如WO98/17764所公開，交聯的含氮化合物擔當著污漬釋放劑和酶穩定劑的雙重作用。根據WO 97/32958，疏水性非離子聚合物與其它穩定劑的混合物對纖維素酶有穩定的作用，因此這些或者相似的組分也同樣適合本發明中所必需的酶。
如EP 780 466所公開，還原劑和抗氧化劑將增加酶對氧化分解的穩定性。含硫的還原劑例如從EP 0 080 748和EP 0 080 223中得知。其它的例子是亞硫酸鈉(EP 533 239)和還原糖類(EP 656 058)。
在很多情況下，還采用穩定劑的組合，例如在WO 96/31589中多元醇、硼酸和/或硼砂的組合，在EP 126 505中硼酸或硼酸鹽、還原鹽與丁二酸或其它二羧酸的組合，或者硼酸或硼酸鹽與多羥基或多氨基化合物的組合以及與如EP 080 223中所披露的還原鹽的組合。根據WO 98/13462，肽/乙醛穩定劑的效果可通過與硼酸和/或硼酸衍生物和多元醇的組合來增強，根據WO 98/13459，其還可通過添加鈣離子而進一步增強。
具有穩定的酶活性的產品代是本發明的優選實施方案。特別優選的是含有以上面提到的幾種方法而加以穩定的酶的產品。
因為本發明的產品可以任何可想到的形式提供，所以在任何適合于加入特定產品的配方中的本發明酶，均是本發明的實施方案。其例子包括液體制劑、固體顆粒或膠囊。
膠囊化形式是保護酶或其它成分免遭其它組分例如漂白劑的影響，或者使緩釋成為可能的途徑。膠囊按照大小可以劃分為毫膠囊、微膠囊或者納膠囊，其中對于酶來說尤其優選微膠囊。例如，這樣的膠囊在專利申請WO 97/24177和DE 19918267中公開。另一可能的膠囊化方法是從蛋白質溶液與淀粉或淀粉衍生物的溶液或懸浮液的混合物開始，將蛋白質包封在該物質中。申請WO 01/38471描述了這樣一種膠囊化方法。
在固體產品的情況下，該蛋白質可以以例如干燥的、造粒的和/或膠囊化的形式使用。它們可以單獨即作為單相添加，或者與其它組分一起在同相中以壓實或未壓實形式添加。如果微膠囊化的酶以固態形式生產，則可按照現有技術已知的方法從污跡獲得的水溶液中除去水，例如噴霧干燥、離心去除或者再溶解。以這種方式獲得的顆粒大小通常為50-200μm。
可以從按照現有技術進行的蛋白質回收和制備開始將酶和本發明必需的蛋白質以濃縮的水或非水溶液、懸浮液或乳液加入本發明的液體、凝膠狀或膏狀產品中，同樣也可以以凝膠狀或膠囊化或作為干燥粉末加入。本發明的這種洗滌產品或者清洗產品一般通過簡單混合成分來制備，所述成分以固體物質本身或作為溶液加入自動攪拌器中。
除基本洗滌性能外，在洗滌產品中包含的蛋白酶還可以滿足通過蛋白酶解裂解活化其它酶組分或者在相應的作用時間之后使其失活的功能，例如在申請WO 94/29426或EP 747 471中所公開的。通過本發明的蛋白也可以獲得可比的調節功能。此外，本發明的另一實施方案涉及那些具有由蛋白酶敏感材料制成的膠囊的產品，其例如在預期的時間點被本發明蛋白質水解并釋放出其內容物。在其它多相產品的情況下也可以獲得可比的效果。
用于處理紡織原料或者織物保養的產品，其特征在于，其僅含有或者除其它活性成分外還包含上述的任何本發明蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物。本發明特別優選的實施方案是這種用于纖維或含有天然組分的織物和特別是用于具有羊毛或絲的織物的產品。
特別是天然纖維例如羊毛或絲的特征為其獨特的微觀表面結構。正如R.Breier在其文章“Melliand Textilberichte”1.4.2000(第263頁)中用羊毛的實例所說明的，所述表面結構能長期能導致不希望的效果，例如一些糾結。為了避免這種效果，使用本發明的產品處理這些天然原材料，這些產品例如有助于使基于蛋白質結構的魚鱗狀表面結構光滑并因此防止糾結。
在本發明的實施方案中，含有本發明蛋白酶的產品被這樣設計，即其一般可以作為保養劑使用，例如通過在洗滌過程中加入，在洗滌之后使用或者其應用不依賴于洗滌。所需的效果是長時間獲得光滑的織物表面結構和/或預防和/或減少對織物的損壞。
本發明的一個單獨主題是機械清潔織物或硬表面的方法，其特征在于，在洗滌方法的至少一個步驟中使上述本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物活化，其加入量每次應用是40μg至4g，優選50μg至3g，更優選100μg至2g，以及最優選200μg至1g。
這些方法包括手工和機械方法，優選機械方法，因為它們可對例如用量和作用時間更精確加以控制。
織物清洗的方法的特征通常在于若干個方法步驟，所述步驟包括將各種不同的具有清潔活性的物質施用到待清洗物上，并且在作用時間之后漂洗，或者以其它的方式將該待清洗物用清潔劑或該清潔劑的溶液處理。這同樣適合于機械清洗其他所有如織物的材料，這些材料被概括為術語硬表面。這種方法可以在所有可想到的洗滌或清潔方法中的至少一個洗滌步驟中加入本發明的蛋白質，并且這些方法成為本發明的實施方案。
因為本發明優選的酶已經自然具有溶解蛋白質的活性，并且它們也可以在本來不具有清洗力的介質(例如單純的緩沖液)中顯示所述活性，所以這種機械清洗織物的方法中的單個分步驟可由在所需的情況下除穩定的化合物、鹽或緩沖物質外加入本發明的酶作為唯一具有清洗活性的組分所組成。這是本發明特別優選的實施方案。
在這種方法的進一步優選的實施方案中，本發明的相關酶提供在本發明產品，尤其是本發明的洗滌或清潔產品的上述一種配方中。
本發明主題的優選實施方案是處理紡織原料或用于紡織品保養的方法，其特征在于，在至少一個方法步驟中，使本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物活化，尤其是對紡織原料，纖維或含有天然組分的紡織品，更尤其是對那些含有羊毛或絲的紡織品。
上述本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物對清潔紡織品或硬表面的應用是本發明的單獨主題。
上述濃度范圍優選適用于此用途。
根據上述特性和上述方法，本發明的蛋白尤其可用于從紡織品或硬表面上去除類蛋白質(proteinaceous)污漬。實施方案例如由從紡織品或硬表面上手洗或手工去除斑點或者與機械方法相結合的用途來代表。
在此應用的優選實施方案中，本發明的相關酶提供在本發明產品，尤其是洗滌或清潔產品的上述一種配方中。
上述本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物對激活或鈍化洗滌或清潔產品中的成分的應用是本發明主題的其他實施方案。
正如所知，洗滌或清潔產品的蛋白組分可由蛋白酶的作用而失活。本發明具體涉及使用這種本來不希望的作用。如上所述，通過蛋白酶解同樣可能真正使其它的組分活化，例如當所述組分是一種由真正的酶和其相應的抑制劑組成的雜合蛋白質時，如在申請WO 00/01831中所公開。這種調節的另一實例是其中的活性組分已包封在一種易受蛋白水解酶攻擊的材料中以保護或控制其活性。因此本發明的蛋白質可用于鈍化、活化或釋放反應，尤其在多相產品中。
盡管有多樣性，將洗滌和清潔問題之外的所有其他技術方法，用途和相應試劑組合在下文本發明的一個主題中，只要其特征為本發明的蛋白。該匯編不應理解成唯一目錄，而只是列出了本發明蛋白酶最重要的當前可辨別的可能的應用。其他同樣包括的可能應用指示例如由下列手冊提供H.Uhlig，“工業用酶及其應用(Industrial enzymes andtheir applications)”，Wiley，紐約，1998。如果通過利用本發明的蛋白酶，其他應用領域證明能夠進一步加以開發，則所述領域也包括在本發明的保護范圍之內。
本發明主題的一個實施方案由上述本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在生化分析或合成低分子量化合物或蛋白中的應用來表示。
該用途優選發生在相應產品或方法的范圍內。根據本發明和Rmpp，“Lexikon Chemie”(Version 2.0，Stuttgart/New YorkGeorgThieme Verlag，1999)，酶分析是指利用特定的酶或底物來一方面測定底物身份或其濃度或者另一方面測定酶身份或活性的任何生物化學分析。應用領域是所有與生物化學相關的領域，尤其是與分子生物學和蛋白質化學相關的領域。該用途優選發生在酶分析方法的范圍之內。本發明主題的優選實施方案是在序列分析領域中用于測定端基。
本發明的主題是本發明蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物的應用，其用于制備、純化或合成天然物質或生物價值物質。
該用途優選發生在相應產品或方法的范圍內。所以，例如在天然物質或生物價值物質的純化過程中需要從所述物質中清除蛋白質污染物，其例子為低分子量化合物，任何細胞組分或儲存物質或蛋白質。這不但在實驗室規模而且在工業規模上，例如在價值物質的生物技術生產后來進行。
例如當計劃把蛋白質片段相互結合或者將氨基酸連接到不是主要由蛋白質組成的化合物上時，本發明的蛋白水解酶通過使其天然催化的反應逆向，用于合成蛋白質或其它低分子量化合物。例如根據申請EP 380362，這種應用是可能的。
本發明主題的其他實施方案由上述本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在處理天然原料，尤其是對于處理表面，更尤其是在處理皮革的方法中的應用所代表。
該用途優選發生在相應產品或方法的范圍內。例如當蛋白污染物一定要從天然原料中去除時，這是必需的。這意思主要是非生物方法獲得的原料，例如那些來自農業的原料，但是也可以是通過發酵由生物技術方法生產的物質，如抗生素。
優選的實施方案是用于表面處理，特別是在處理經濟上有意義的原料皮革的方法中。因此，在鞣革處理過程中，特別是在堿性柔化步驟中借助于蛋白水解酶從皮革材料中除去水溶性蛋白質(Rmpp，“Lexikon Chemie”，Version 2.0，Stuttgart/New YorkGeorg ThiemeVerlag，1999)。本發明的蛋白質，尤其在堿性條件下和/或采用變性劑時，對此是特別適合的。
本發明主題的另一實施方案是將上述本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在制造紡織品中用于獲得或處理原料或中間體，尤其是用于從織物中去除保護層。
該用途優選發生在相應產品或方法的范圍內。在制造紡織品中獲取或處理原料的例子是加工棉花，在被稱作制漿的步驟中需要從中去除莢組分；另一實例是處理羊毛；類似地也可用于加工粗絲。酶方法或應用，特別對環境相容性而言，優于可比的化學方法。
在優選的實施方案中，本發明的蛋白質用于除去紡織品，特別是中間產品或有價值物質的保護層，或者使其表面光滑，接著在隨后的工藝步驟中進行進一步處理。
在本發明主題的其他實施方案由上述本發明的蛋白質，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在處理紡織原料或用于紡織品保養，特別是用于處理羊毛或絲或含羊毛或絲的混紡織品中的應用來表示。
該用途優選發生在相應產品或方法的范圍內。根據上文所述，相關紡織品原料通過蛋白酶處理后不含污染物；此外，至少部分由蛋白組成的材料得益于蛋白水解酶的表面光滑和保養特性。為此原因，用于保養相關材料的用途也包括在內。因此，尤其要求保護羊毛或絲或含有羊毛或絲的混紡織品的表面處理。這不但適用于這種紡織品的生產而且適用于使用期間的保養，例如在該紡織品清洗時(參見上文)。
本發明主題的另一實施方案是本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物用于處理照相膠片，特別是除去含明膠或類似的保護層。
該用途優選發生在相應產品或方法的范圍內。膠片例如X線膠片被這樣的保護層，特別是由含銀鹽的明膠乳液制成的保護層涂覆。這些層在背景材料曝光之后必須去除。為此，特別是在堿性或略微變性的反應條件下可以使用本發明的蛋白酶。
本發明主題的另一實施方案是上述本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在制備食品或動物飼料中的應用。
該用途優選發生在相應產品或方法的范圍內。所以，自古以來蛋白酶已經被用于食品生產。對此的實例是凝乳酶用于奶酪或其它奶制品的熟化過程。可以加入本發明的蛋白質或者完全采用本發明的蛋白質進行該過程。用于非營養目的富含碳水化合物的食品或食品原料，例如面粉或糊精，同樣可以用合適的蛋白酶處理，以便從其中除去相伴的蛋白質。本發明的蛋白酶也適合于這種應用，尤其當其在堿性或略微變性的條件下進行時。
相應地也適用于動物飼料的生產。這里除完全除去蛋白質外，還感興趣的是用蛋白酶僅短時間地處理類蛋白質原料或原料混合物，以便使其對于家禽來說更易消化。這樣的處理也可用于例如生產培養基成分，例如用于發酵微生物。
在本發明主題的另一實施方案中，上述本發明的蛋白用于化裝品目的。
本發明要求保護的主題是含有上述本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物的化妝品或者摻入上述本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物的化妝用方法，或者上述本發明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物用于化妝目的，特別是在相應的方法或相應的產品的框架內。
因為蛋白酶在人類皮膚的細胞再生過程中扮演重要的角色(T.Egelrud等，Acta Derm.Venerol.，第71卷(1991)，第471至474頁)，因此蛋白酶也作為生物活性組分被用于護膚產品中以便促進干性皮膚中日益增多的橋粒結構的退化，例如根據申請WO 95/07688或WO99/18219。例如在WO 97/07770中描述了枯草桿菌素蛋白酶用于化妝目的。本發明的蛋白酶，特別是那些例如在突變后或由于添加合適的與其相互作用的物質來控制其活性的蛋白酶同樣適合在皮膚或頭發洗滌或氧護產品中作為活性組分。特別優選這些酶的制品，其如上所述，例如通過連接在大分子支持物上而被穩定(參照US 5230891)和/或通過在高變應原性位置的點突變而被衍生化，所以它們與人皮膚的相容性增加。
因此，本發明的主題還包括這種蛋白水解酶用于化妝目的，特別是在相應產品中的應用，例如香波、皂或洗浴液，或者在以霜的形式提供的護理產品中的應用。同樣在脫皮藥物或其制劑中的應用也包括在本發明的權利要求中。
如上已解釋，來自芽孢桿菌種(DSM 14390)的本發明蛋白酶與來自遲緩芽孢桿菌(B.lentus)(Savinase和遲緩芽孢桿菌(B.lentus)堿性蛋白酶)的已確立的蛋白酶差異分別在于氨基酸224V，250G和253N，以及97S，99S，101S，102V，157G，224V，250G和253N。正如從實施例中顯而易見的，在一些應用中，令人驚奇地展示了比這些已確立的蛋白酶具有更好的洗滌或清潔性能。為此，將一個或多個的這些位置有意導入蛋白酶中，優選導入subtilases，更尤其優選導入枯草桿菌素，被視為改善其性能的有前途的方法。這尤其涉及對相應產品的洗滌或清潔性能的各自貢獻。這種變化可通過現有技術中確立的突變方法來進行。
在來自遲緩芽孢桿菌DSM 5483的堿性蛋白酶的情況下，這樣一些替換例如可在野生型酶上進行，所述野生酶描述在圖1的比對中，或可在變體上進行，這些變體就洗滌和清潔產品中的性能，與野生型比較，反過來已得到改善。可能提及的這樣一些變體的例子為描述在申請WO 95/23221中的那些變體，尤其M130，M131和F49。后者在本申請的實施例中用作對照酶。其他候選對象被視為在尚未公布的申請DE 10121463和DE 10153792中的變體。
所以，所有改善蛋白酶的性能的方法作為本發明的主題被要求保護，尤其有關相應產品的洗滌和/或清潔性能，其特征在于所述蛋白酶通過點突變根據SEQ ID NO.1中的氨基酸編號獲取一種或多種的氨基酸97S，99S，101S，102V，157G，224V，250G和253N，也就是說成熟蛋白，優選一種或多種的氨基酸224V，250G和253N。
該保護范圍也相應適用于所有蛋白酶，其特征在于它們通過點突變根據SEQ ID NO.1中的氨基酸編號已經獲取一種或多種的氨基酸97S，99S，101S，102V，157G，224V，250G和253N，優選一種或多種的氨基酸224V，250G和253N。
同樣包括在該保護范圍內的是相應的單個或多個保守替換，例如疏水性氨基酸而非V在位置102和224，堿性氨基酸而非N在位置253，T在位置97，99，101和/或A在位置157和250。
實施例所有分子生物學操作步驟遵循如下列手冊所述的標準方法，Fritsch，Sambrook和Maniatis，“分子克隆實驗室手冊”，Cold SpringHarbour Laboratory Press，New York，1989，或者可比較的相關著作。根據各個生產商的說明書使用酶和試劑盒。
實施例1具有蛋白水解活性的細菌菌株的分離和鑒定將0.1g的土壤樣品懸浮在1ml的無菌0.9％NaCl溶液中，并涂鋪于含有奶粉的瓊脂平板(1.5％瓊脂，0.5％NaCl，0.1％K2HPO4，0.1％酵母提取物，2％蛋白胨(來自ICN，Eschwede，目錄號104808)，1％奶粉(脫脂乳；來自Difco，Heidelberg，目錄號232100)，pH10)上。在30℃保溫72小時后，帶有透明區的菌落在乳狀瓊脂中顯而易見。從中移出單菌落，并培養在Horikoshi培養基(0.1％K2HPO4，0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，0.02％MgSO4，0.3％Na2CO3，pH9)的錐形瓶(Erlenmeyer flask)中37℃下以200rpm振蕩。
這些菌落之一于2001年3月1日保藏在DSMZ。在此其命名為ID01-191，保藏號為DSM 14390。有關該生物材料的特征的標準信息，如DSMZ保藏結構于2001年4月19日所確定，編輯在下表1中。
表1Bacillus sp.(DSM 14390)的微生物特性。
(于2001年4月19日由DSMZ所確定)
實施例2成熟蛋白酶的克隆和測序將通過標準方法從Bacillus sp.(DSM 14390)制備染色體DNA，經限制性酶Sau 3A處理后，將得到的片段克隆到載體pAWA22中。這是一種衍生自pBC16的表達載體，用于芽孢桿菌種(Bernhard等(1978)，J.Bacteriol.，第133卷(2)，第897-903頁)中。使該載體轉化到不含蛋白酶的宿主菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)DB 104(Kawamura和Doi(1984)，J.Bacteriol.，第160卷(1)，第442-444頁中。
將轉化子首先再生在DM3培養基(8g/l瓊脂，0.5M丁二酸，3.5g/lK2HPO4，1.5g/l KH2PO4，20mM MgCl2，5g/l酪蛋白氨基酸(casiaminoacids)，5g/l酵母提取物，6g/l葡萄糖，0.1g/l BSA)中，然而轉移到TBY脫脂乳平板(10g/l蛋白胨，10g/l奶粉(參見上文)，5g/l酵母提取物，5g/l NaCl，15g/l瓊脂)上。含有蛋白酶水解活性的克隆從其裂解區中鑒定出來。從所得的具有蛋白酶水解活性(p/B-5)的菌落中挑選一種，并通過標準方法分離其質粒，以及對插入物進行測序。
插入物的大小約為2.9kb，含有1kb左右的可讀框。其序列顯示在序列表中，標題為SEQ ID No.1。它包含1143bp。從其衍生的氨基酸序列包括380個氨基酸，后面為終止密碼子。其以SEQ ID NO.2顯示在序列表中。前111個氨基酸極有可能不存在于成熟蛋白中，從而成熟蛋白的長度預計為269個氨基酸。
2001年8月，將這些序列與從通常可達的數據庫Swiss-Prot(Geneva Bioinformatics(GeneBio)S.A.，Geneva，Switzerland；http//www.genebio.com/sprot.html)和GenBank(National Center forBiotechnology Information NCBI，National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA)中獲得的蛋白酶序列進行比較。由此鑒定的最相似的酶總結在下表2中。
表2Bacillus sp.(DSM 14390)的堿性蛋白酶與最相似蛋白和其他代表性蛋白的同源性(百分比數據四舍五入)。
其中的意思為ID數據庫Genbank和Swiss-Prot中的登錄號；Ident.DNA DNA水平上的同一性％；Ident.propre.氨基酸水平上的同一性，基于前體蛋白的前體，以％表示；Ident.mat.prot.氨基酸水平上的同一性，基于成熟蛋白，以％表示；n.未示于數據庫中。
這些蛋白酶的氨基酸序列在圖1的比對中也相互進行比較。
實施例3堿性蛋白酶的純化和鑒定將100ml的Horikoshi培養基(參見上文)加入到500ml錐形瓶(Erlenmeyer flask)，用實施例2中轉化的細菌菌株的一個菌落接種，并且在37℃下培養72小時直到達到生長的靜止期。
通過下列純化步驟，可從該培養物的上清液中分離到單個蛋白水解酶將上清液對pH7.6的20mM HEPES/NaOH緩沖液透析；在Q-Sepharose上進行陰離子交換層析(來自Pharmacia-Amersham Biotech，Sweden)；在S-Sepharose上通過陽離子交換層析(來自Pharmacia-Amersham)，用pH為7.6，梯度為0-1M NaCl的HEPES/NaOH緩沖液洗脫。在0.2M NaCl處洗脫蛋白酶，然后在Resource S(來自Pharmacia-Amersham)上通過陽離子交換層析，并以HEPES/NaOH(pH7.6)為洗脫劑而得以濃縮。
根據SDS凝膠電泳和考馬斯亮蘭染色，以此方式獲得純的蛋白。
實施例4SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦如實施例2和3中所獲得的芽孢桿菌種(DSM 14390)的堿性蛋白酶通過Pharmacia-Amersham Biotech，Sweden提供的PHAST系統在變性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳條件下所顯示的分子量為26kD。
根據等電聚焦，同樣通過Pharmacia-Amersham Biotech，Sweden提供的PHAST系統，芽孢桿菌種(DSM 14390)的堿性蛋白酶的等電點為11。
實施例5酶特性比活如實施例2或3中所純化的芽孢桿菌種(DSM 14390)的堿性蛋白的比活利用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-對硝基苯胺(AAPF；來自BachemBiochemica GmbH，Heidelberg)底物進行測定。結果顯示，在pH8.6和25℃下溫育5分鐘后的活性為69U/mg。在此情況下，1U等于每分鐘切割1μmol的底物。
pH依賴性芽孢桿菌種(DSM 14390)的堿性蛋白酶的pH分布圖在pH為6-12的范圍內進行記錄。為此，以酪蛋白為底物，在50℃對各個pH整數值下的活性進行測定。根據該測定，最適pH為11。在50℃溫育15分鐘后的活性分別為在pH12時5％，在pH6時17％以及在pH9時69％。
實施例6對洗滌性能的貢獻織物以標準化的方式已被污漬處理，并獲自EidgenssischeMaterial-Prüfungs-und-Versuchsanstalt，St.Gallen，Switzerland(EMPA)或Wschereiforschungsanstalt，Krefeld，Germany，用于該實施例。使用下列污漬和織物A(在棉織物上的血跡/牛奶/煙灰)、B(在棉織物上的血跡/牛奶/墨汁)、C(在聚酯-棉-混紡織物上的血跡/牛奶/墨汁)、D(在棉織物上的牛奶/可可飲料)以及E(在棉織物上的血跡)。
利用耐洗牢度試驗儀(launderometer)，將這些試驗材料用于檢測各種洗滌產品配方的清洗功效。為此目的，調整清洗液比為1∶12，并將織物在40℃下清洗30分鐘。劑量為每升清洗液中特定洗滌產品為5.88g。水硬度為16°德國制硬度。
具有下列組成的洗滌產品基本配方作為對照洗滌產品(用重量百分比表示)4％直鏈烷基苯磺酸鹽(鈉鹽)、4％C12-18脂肪醇硫酸鹽(鈉鹽)、5.5％C12-18脂肪醇X7EO、1％皂鈉、11％碳酸鈉、2.5％無定型二硅酸鈉(sodium disilicate)、20％過硼酸鈉四水合物、5.5％TAED、25％沸石A、4.5％聚羧酸酯、0.5％膦酸鹽、2.5％粒狀泡沫抑制劑、5％硫酸鈉，其余為水、熒光增白劑和鹽。對于各種測試系列，將下列的蛋白酶加入到對照洗滌產品中，從而在每升清洗液中蛋白酶解活性的最終濃度分別為2.250PE遲緩芽胞桿菌堿性蛋白酶F49(WO 95/23221；制造商Biozym，Kundl，Australia)、Savinase(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)以及本發明來自芽孢桿菌種(DSM 14390)的蛋白酶。
清洗后，以硫酸鋇的白度作為標準100％，與之對比測出洗過織物的白度。測量用的是Datacolor SF500-2分光光度計，測試條件為460nm(紫外阻擋濾光片3)、孔徑30mm、無光澤面、光源類型D65、10°、d/8°。下表3中給出了測試結果，以反射率％表示，即和硫酸鋇比較的百分數，表3還列出各自的起始值。所示值分別是4次測量的平均值。它們是其中包含的酶對所用洗滌產品的清洗功效貢獻的直接指標。
表3
數據顯示，本發明的芽孢桿菌種(DSM 14390)的蛋白酶與確定的蛋白酶遲緩芽胞桿菌堿性蛋白酶F49和Savinase相比在所有測試的污漬上均表現出明顯更好的性能，或者至少與它們接近。
實施例7當使用低活性時，對洗滌性能的貢獻在標準化條件下將具有硬的光滑表面的容器與混合淀粉(F和G)以及與肉末(H)混合，并采用市售的家用洗碗機洗滌。樣品F和H在45℃下用MieleG 676型洗碗機的正常操作程序清洗，而樣品G在55℃下用BoschSGS 4002型洗碗機的正常程序清洗。洗碗劑的用量每一洗碗循環為20g；水的硬度為16°德國制硬度。
下列基本配方用于洗碗劑(所有值按重量百分比計)55％三聚磷酸鈉(以無水計算)、4％無定型二硅酸鈉(以無水計算)、22％碳酸鈉、9％過硼酸鈉、2％TAED、2％非離子表面活性劑，其余為水、染料和香精。對于各種測試，將各種蛋白酶酶，即遲緩芽胞桿菌堿性蛋白酶F49、Properase以及本發明芽孢桿菌種(DSM 14390)的蛋白酶以相同活性加入到基本配方中，每一洗碗循環活性分別為10000PE。這相當于每克洗滌產品濃縮物中有約0.1毫克的蛋白酶。
清洗后，對測試F和G，污漬的除去按重量測定，以％表示。為此，受污后然后清洗的容器的重量與所述容器的初始重量之間的差異和未清洗的容器與其初始重量之間的差異有關。這種關系可看成是去除百分率。對污漬H，在清洗之后按照0(＝不變，即十分嚴重的污漬)到10(＝無可辨別的污漬)等級進行目測評估。下表4列出了所獲得的結果。這里給出的是8次測量的平均值。它們是包含的酶對所用洗滌產品的清洗功效貢獻的直接指標。
表4
這些結果顯示，本發明芽孢桿菌種(DSM 14390)的蛋白酶在機洗碗劑中的性能至少等于其他測試蛋白酶的性能，甚至在使用相對低活性下也是如此。
實施例8當使用較高活性時，對洗滌性能的貢獻如實施例7所述，以標準化方式，將容器用牛奶(I)和肉末(J)進行污漬處理，并分別以相同的清洗產品配方和方式清洗。將它們在45℃下利用MieleG 676型洗碗機的標準程序進行洗滌。與實施例7的唯一區別在于，在每種情況下蛋白酶各自的用量是20000PE。這相當于在每種情況下洗滌產品濃縮物中含有約0.2毫克的蛋白酶。
在清洗之后，以與實施例7中的同樣方式，按照0(＝不變，即十分嚴重的污漬)到10(＝無可辨別的污漬)等級進行目測評估。下表5列出了所獲得的結果。這里給出的是8次測量的平均值。
表5
當所用的蛋白酶活性較高時，顯而易見，本發明的蛋白酶對相關產品的總體清潔性能的貢獻與對機洗碗產品來說確立的遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶F49和蛋白酶Properase相比，是更高或者至少可比的。
附圖描述圖1來自芽孢桿菌種(DSM 14390)的本發明蛋白酶的氨基酸序列與表2中所列的相似和最重要的已知枯草桿菌素分別在成熟即加工形式下的比對。
下列數字代表下列蛋白酶(括號分別為數據庫進入的ID；也參照
12枯草桿菌素J 來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermo-philus)(SUBT_BACST)13枯草桿菌素E 來自枯草芽孢桿菌(B.subtilis)(SUBT_BACSU)14枯草桿菌素 來自短小芽孢桿菌(B.pumilus)(SUBT_BACPU)15枯草桿菌素DY來自枯草芽孢桿菌(B.subtilis)DY(SUBT_BACSD)圖2表達載體pAWA22，其衍生自pBC16并具有地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(PromPLi)的啟動子及其下游，Bcl I限制性切割位點(參照實施例2和Bernhard等(1978)，J.Bacteriol.，133(2)，第897-903頁)。
有關保藏的微生物或其它生物材料的說明(PCT細則13之二)
表PCT/RO/134(1992年7月)
序列表<110>漢高兩合股份公司(Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien)<120>芽孢桿菌種(DSM 14390)的新型堿性蛋白酶以及包含該新型堿性蛋白酶的洗滌產品和清潔產品(Neue Alkalische Protease aus Bacillus sp.(DSM 14390)und Wasch-und Reinigungsmittel enthaltend diese neueAlkalische Protease)<130>SCT041997-47<140>
<141>
<150>DE 10163883.3<151>2001-12-22<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1143<212>DNA<213>芽孢桿菌種(DSM 14390)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1143)<220>
<221>mat_肽<222>(334)..(1143)<400>1atg aag aaa ccg ttg ggg aaa att gtc gca agc acc gca cta ctc att 48Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile-110-105-100tct ggt gct ttt agt tca tcg atc gca tcg gct gct gag gaa gca aaa 96Ser Gly Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys-95 -90 -85 -80gaa aaa tat tta att ggc ttt aat gag cag gaa gca gtt agt gag ttt 144Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe-75 -70 -65gta gag caa ata gag gca aat gac gat gtc gcg att ctc tct gag gaa 192
Val Glu Gln Ile Glu Ala Asn Asp Asp Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu-60 -55 -50gag gaa gtc gaa att gaa ttg ctt cat gag ttt gaa acg att cct gtt 240Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val-45 -40 -35tta tct gtt gag tta agt cca gaa gat gtg gac gag ctt gag ctc gat 288Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Glu Leu Glu Leu Asp-30 -25 -20cca acg att tcg tat att gaa gag gat gca gaa gta acg aca atg gcg 336Pro Thr Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala-15 -10 -5 -1 1caa tca gtg cca tgg gga att agc cgt gta caa gcc cca gct gcc cat 384Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His5 10 15aac cgt gga ttg aca ggt tct ggt gta aaa gtt gct gtc ctc gat acg 432Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr20 25 30ggt att tcc acc cat cca gac tta aat att cgc ggt ggt gct agc ttt 480Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe35 40 45gtg cca gga gaa cca tcc act caa gat gga aat gga cat ggc acg cat 528Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His50 55 60 65gtg gca ggg acg att gct gct tta aac aat tcg att ggc gtt ctg ggc 576Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly70 75 80gta gca ccg agc gcg gaa cta tac gct gta aaa gta tta ggc gcg agc 624Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Ser85 90 95ggt tca ggt tcg gtc agc tcg att gcc caa gga ttg gaa tgg gca ggg 672Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly100 105 110aac aat ggc atg cac gtt gcg aat ttg agt tta gga agc ccg tcg ccg 720Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro115 120 125agt gca aca ctt gag caa gct gtt aat agc gct act tct aga ggc gtt 768Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val
130 135 140 145ctt gtc gta gca gca tct ggt aat tca ggt gca ggc tca atc agc tat 816Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser Tyr150 155 160ccg gcc cgt tat gcg aac gca atg gca gtc ggg gcc act gac caa aac 864Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn165 170 175aac aac cgc gct agc ttt tca cag tat gga gct ggg ctt gac att gtc 912Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val180 185 190gcg cca ggt gtc aat gtg cag agc aca tac cca ggt tca aca tat gcc 960Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala195 200 205agc tta aac ggt aca tcg atg gct act cct cat gtt gca ggt gta gca 1008Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val Ala210 215 220 225gcc ctt gtt aaa caa aag aat cca tct tgg tcc aat gta caa atc cgc 1056Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg230 235 240aat cat cta aag aat acg gca acg ggt tta gga aac acg aac ttg tat 1104Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Gly Leu Gly Asn Thr Asn Leu Tyr245 250 255gga agc ggg ctt gtc aat gca gaa gcg gca aca cgc taa 1143Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg260 265 270<210>2<211>380<212>PRT<213>芽孢桿菌種(DSM 14390)<400>2Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile1 5 10 15Ser Gly Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys20 25 30Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe35 40 45Val Glu Gln Ile Glu Ala Asn Asp Asp Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu50 55 60
Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val65 70 75 80Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Glu Leu Glu Leu Asp85 90 95Pro Thr Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala100 105 110Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His115 120 125Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr130 135 140Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe145 150 155 160Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His165 170 175Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly180 185 190Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Ser195 200 205Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly210 215 220Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro225 230 235 240Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val245 250 255Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser Tyr260 265 270Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn275 280 285Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val290 295 300Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala305 310 315 320Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val Ala325 330 335Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg340 345 350Asn His Leu Lys Ash Thr Ala Thr Gly Leu Gly Asn Thr Asn Leu Tyr355 360 365Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg370 375 380
權利要求
1.一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少98.5％的同一性。
2.一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少98.75％的同一性。
3.一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列在位置112到位置381與SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少99.3％的同一性。
4.一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列在位置112到位置381與SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少99.5％的同一性。
5.一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其衍生自一種核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列具有至少92.5％的同一性，尤其在對應于SEQ IN NO.2中的位置112到位置381的部分區域上。
6.一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其衍生自一種核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性，尤其在對應于SEQ IN NO.2中的位置112到位置381的部分區域上。
7.一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列整體上相同，尤其是在位置112到位置381，和/或其氨基酸序列與衍生自SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列的氨基酸序列整體上相同，尤其是在SEQ ID NO.2的位置112到位置381。
8.一種蛋白或片段，通過片段化或缺失突變而衍生自如權利要求1-7中任一項所述的枯草桿菌素型堿性蛋白酶，并且具有至少225，優選至少250，尤其優選至少275個已經連接在出發分子中的氨基酸，或者那些具有至少40，優選至少100，尤其優選至少150個已經連接在出發分子中的氨基酸，根據SEQ ID NO.1中的氨基酸編號，包括位置224。
9.一種蛋白，通過插入突變，通過替換突變和/或通過與至少一種其他蛋白或蛋白片段融合而衍生自枯草桿菌素型堿性蛋白酶，或來自如權利要求1-8中任一項所述的衍生蛋白或片段。
10.如權利要求1-9中任一項所述的蛋白，蛋白片段或融合蛋白，其特征在于其本身能夠水解蛋白。
11.如權利要求1-10中任一項所述的蛋白，蛋白片段或融合蛋白，其特征在于其另外被衍生化。
12.如權利要求1-11中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，其特征在于其另外被穩定化。
13.一種蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，其特征在于其與權利要求1-12中所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一具有至少一種共同的抗原決定簇。
14.如權利要求1-13中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，其特征在于其可從天然來源獲得，尤其是從微生物獲得。
15.如權利要求14所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，其特征在于所述微生物為革蘭氏陽性細菌。
16.權利要求15所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，其特征在于所述革蘭氏細菌為芽孢桿菌屬中的一種。
17.權利要求16所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，其特征在于芽孢桿菌種為Bacillus sp.，尤其是Bacillus sp.(DSM14390)。
18.一種核酸，其編碼枯草桿菌素型堿性蛋白酶，并且其核苷酸序列與SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列具有至少92.5％的同一性，尤其在位置334到位置1143的部分區域上。
19.一種核酸，其編碼枯草桿菌素型堿性蛋白酶，并且其核苷酸序列與SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性，尤其在位置334到位置1143的部分區域上。
20.一種核酸，其編碼枯草桿菌素型堿性蛋白酶，并且其核苷酸序列與SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列相同，尤其在位置334到位置1143的部分區域上。
21.一種核酸，其編碼權利要求1-14所定義的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一。
22.如權利要求18-21中任一項所述的核酸，其特征在于其從天然來源獲得，尤其是從一種微生物獲得。
23.如權利要求22所述的核酸，其特征在于所述微生物為革蘭氏陽性細菌。
24.如權利要求23所述的核酸，其特征在于所述革蘭氏細菌為芽孢桿菌屬中的一種。
25.如權利要求24所述的核酸，其特征在于所述芽孢桿菌種為Bacillus sp.，尤其為Bacillus sp.(DSM 14390)。
26.一種載體，其包括權利要求18-25中所定義的核酸區域，尤其是一種編碼權利要求1-17中所定義的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一的核酸區域。
27.一種克隆載體，如權利要求26中所述。
28.一種表達載體，如權利要求26中所述。
29.一種細胞，其包括權利要求18-25所定義的核酸區域，尤其是一種編碼權利要求1-17所定義的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一的核酸區域，優選在如權利要求26-28中任一項所述的載體上。
30.一種宿主細胞，其表達或可被誘導表達任何權利要求1-17所定義的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，尤其通過利用權利要求18-25中任一項所述的核酸區域，更尤其通過利用如權利要求28所述的表達載體。
31.如權利要求30所述的宿主細胞，其特征在于其是一種細菌，尤其是一種將產生的蛋白分泌到周圍介質中的細菌。
32.如權利要求31所述的細菌，其特征在于其是一種革蘭氏陽性細菌，尤其是芽孢桿菌屬中的一種，更尤其是遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或親堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)。
33.如權利要求29或30所述的細胞，其特征在于其是一種真核細胞，尤其是一種翻譯后對產生的蛋白進行修飾的真核細胞。
34.一種生產權利要求1-17所定義的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一的方法，所述方法利用如權利要求18-25中任一項所述的核酸和/或利用如權利要求26-28中任一項所述的載體和/或利用如權利要求29-33中任一項所述的細胞。
35.一種產品，其特征在于其包括如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物。
36.一種洗滌或清潔產品，其特征在于其包括如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物。
37.如權利要求36所述的產品，其特征在于其包括的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物的量每克產品為2μg至20mg，優選5μg至17.5mg，尤其優選20μg至15mg，更尤其優選50μg至10mg。
38.如權利要求36或37所述的產品，其特征在于其另外包括其他酶，尤其是其他蛋白酶，淀粉酶，纖維素酶，半纖維素酶，氧化還原酶和/或脂肪酶。
39.一種用于處理紡織品原料或用于紡織品保養的產品，其特征在于其單獨包括或除了其他活性成分外還包括如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，尤其是用于處理含有天然組分的纖維或紡織品，并且更尤其用于處理那些含有羊毛或絲的纖維或紡織品。
40.一種用于機械清潔紡織品或硬表面的方法，其特征在于在至少一個方法步驟中，使如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物活化，每次應用的量優選為40μg至4g，優選50μg至3g，尤其優選100μg至2g，以及更尤其優選200μg至1g。
41.一種用于處理紡織品原料或用于紡織品保養的方法，其特征在于在至少一個方法步驟中，使如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物活化，尤其用于處理紡織品原料，含有天然組分的纖維或紡織品，以及更尤其用于那些含有羊毛或絲的纖維或紡織品。
42.如權利要求1-17中任一項所述的酶水解活性蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在清潔紡織品或硬表面上的應用，每次應用的量尤其為40μg至4g，優選50μg至3g，尤其優選100μg至2g，以及更尤其優選200μg至1g。
43.如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在激活或鈍化洗滌或清潔產品成分中的應用。
44.如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在生化分析或合成低分子量化合物或蛋白中的應用。
45.如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在制備，純化或合成天然物質或生物價值物質中的應用。
46.如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在處理天然原料，尤其在處理表面，更尤其在處理皮革的方法中的應用。
47.如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物的應用，用于在制造紡織品中獲得或處理原料或中間體，尤其用于從織物中去除保護層。
48.如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在處理紡織品原料或紡織品保養，尤其在處理羊毛，絲，或含有羊毛或絲的混紡織品中的應用。
49.如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在處理照相膠片，尤其在去除含凝膠或類似保護層中的應用。
50.如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在制備食物或動物飼料中的應用。
51.一種化妝品，其含有如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，或者一種化妝用方法，其摻入如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，或者如權利要求1-17中任一項所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在化妝用目的，尤其在相應方法的框架中或在相應產品中的應用。
52.一種改善蛋白酶性能，尤其有關含有該蛋白酶的產品的洗滌和/或清潔性能的方法，其特征在于所述蛋白酶通過點突變，根據SEQID NO.1的氨基酸編號，獲得一個或多個的氨基酸97S，99S，101S，102V，157G，224V，250G和253N，尤其是一個或多個的氨基酸224V，250G和253N。
53.一種蛋白酶，其特征在于其通過點突變，根據SEQ ID NO.1的氨基酸編號，已經獲得一個或多個的氨基酸97S，99S，101S，102V，157G，224V，250G和253N，尤其是一個或多個的氨基酸224V，250G和253N。
全文摘要
本發明涉及一種新的來自芽孢桿菌種(DSM14390)的芽孢桿菌素型堿性蛋白酶及其各種不同的相關蛋白和衍生物。本發明進一步涉及包含此新的枯草桿菌素型堿性蛋白酶及其各種不同的相關蛋白和衍生物的洗滌劑和清洗劑，相應的洗滌和清潔方法，以及在洗滌劑和清洗劑中的應用，和其它技術用途。
文檔編號C12N15/09GK1606626SQ02825541
公開日2005年4月13日 申請日期2002年12月12日 優先權日2001年12月22日
發明者安格里特·韋伯, 安哥拉·黑勒布蘭特, 蘇珊·施米茨, 卡爾-海因茨·毛雷爾, 貝婭特麗克絲·科特維茨 申請人:漢高兩合股份公司