專利名稱：表達系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種在用于生產靶蛋白的表達系統中有用的新宿主細胞。
可以獲得許多表達系統用于在細菌宿主細胞中生產靶蛋白的目的。這些系統中的許多系統來自象大腸桿菌的乳糖(lac)和色氨酸(trp)操縱子那樣天然存在的內源調節系統。也有幾個利用象λ噬菌體λ啟動子(PL)系統那樣噬菌體表達調節網絡組分的系統。
然而，在實驗室水平用于在大腸桿菌中重組靶蛋白表達的最廣泛和最常規使用的系統之一是T7噬菌體表達系統。該表達系統可以從Novagen股份有限公司(Madison WI)買到，并且被描述在美國專利No.4,952,496中。該表達系統包含含有已整合噬菌體溶原體的宿主細胞。接著用在噬菌體啟動子的控制下的非整合基因轉化宿主細胞，其中非整合基因編碼選擇的靶蛋白。
λDE3溶原體是具有在lacUV5啟動子控制下T7RNA聚合酶克隆的重組噬菌體。通過用λDE3噬菌體溶菌產物、輔助噬菌體溶菌產物和選擇噬菌體溶菌產物共感染宿主細胞制備λDE3溶原體。共感染的結果是產生具有被結合到宿主細胞染色體的λDE3噬菌體的宿主細胞。盡管λDE3噬菌體在λ整合位點被整合到宿主染色體中，但是λDE3噬菌體在其溶解的能力上是缺陷的。因而，DE3溶原體應當是穩定的，不應隨后溶解細胞產生感染噬菌體。一旦誘導表達系統，宿主細胞就從DE3溶原體中制造T7RNA聚合酶。T7RNA聚合酶接著結合非整合靶基因的噬菌體啟動子并且啟動靶蛋白的合成。
T7表達系統提供許多使其十分適合表達靶蛋白的好處。例如，靶基因的T7或T7lac啟動子是噬菌體獨有的并且不被宿主細胞RNA聚合酶識別的噬菌體啟動子。因而，僅僅當存在T7RNA聚合酶時才能啟動靶蛋白的表達。這有助于減少先于誘導的靶蛋白表達的潛力。因為一些靶蛋白對于宿主細胞的生長具有有害的影響，因而減少靶蛋白生產的最大量，因此不期望先于誘導的靶蛋白的表達。
另一個使T7表達系統適合表達靶蛋白的的實例是已經改變了T7啟動子以包含乳糖操縱子(lac0)。lac0是乳糖操縱子阻遏物的結合位點。乳糖操縱子阻遏物結合lac0，防止T7RNA聚合酶結合T7lac啟動子，因此有效地抑制靶蛋白的表達。一旦向宿主細胞中添加誘導劑，抑制就可被逆轉。誘導劑將乳糖阻遏物從lac0上去除，并且允許T7RNA聚合酶結合到T7lac啟動子上并且啟動靶蛋白的表達。lac0的包圍使靶蛋白表達的啟動幾乎嚴格10倍。這也助于減少先于誘導的靶蛋白表達的潛力，因為一些靶蛋白對宿主細胞的生長具有有害的影響，因而減少靶蛋白生產的最大量。乳糖阻遏物是從稱作lacI的內源宿主細胞基因中產生的。然而，具有lacI基因的宿主菌株不能產生足夠多的乳糖阻遏物來有效地抑制靶蛋白表達的。因而，為了獲得靶蛋白的適當調節，宿主菌株也應當含有額外的lacI基因或者使用包含lacIQ1啟動子的過量表達的宿主細胞。
表達系統極為有利的特性很可能是T7RNA聚合酶比宿主細胞RNA聚合酶更持續合成幾乎12倍。T7RNA聚合酶的高持續合成能力能夠導致超過細胞總蛋白60％的蛋白作為靶蛋白，使該系統成為可得到的效率最高的表達系統之一。
然而，本發明的根據是發現如在一些情況下靶蛋白被大量產生，在發酵液中能夠檢測到感染的噬菌體。這暗示DE3噬菌體已經恢復了其溶解的能力。在發酵期間達到的高細胞密度可能是通過低水平的重組或導致溶原體刪除的非常規重組(逆轉)產生了可感染的噬菌體。然而，調節劑(regulatory agencies)阻止含有靶蛋白的發酵液向前加工成具有可檢測到噬菌體顆粒水平的藥品而被使用。
根據這個問題，本發明提供改進的T7表達系統。在本發明中，使用不同的整合機制將7RNA聚合酶基因整合到宿主細胞的染色體中。本發明通過同源重組而不是用缺陷噬菌體感染宿主細胞的方式將T7RNA聚合酶基因拷貝整合到宿主細胞染色體的非必需位點。宿主細胞進而包括編碼選擇的靶蛋白的非整合基因。編碼T7RNA聚合酶的整合基因是在宿主細胞的內源調節系統的控制下，而編碼靶蛋白的非整合基因是在噬菌體調節系統的控制下。當宿主細胞被誘導時，宿主細胞RNA聚合酶能夠結合到宿主細胞啟動子上并且啟動T7RNA聚合酶的合成。新合成的T7RNA聚合酶結合到T7或T7lac啟動子上并且啟動靶蛋白的合成。結果得到含有靶蛋白的無噬菌體的發酵液。
本發明提供包含被整合到宿主染色體中在lac啟動子控制下的同源重組T7RNA聚合酶基因的宿主細胞。沒有使用噬菌體溶原體將T7RNA聚合酶整合到宿主細胞染色體中，結果沒有摻入額外的噬菌體DNA。同源重組能夠在任何選擇的非必需基因中發生，而噬菌體溶原僅僅在被感染過程驅動的位點上整合。啟動子會是野生型的lac啟動子或者是象lacUV5那樣被修飾的lac啟動子。
宿主細胞進一步可包含編碼靶蛋白的非整合基因，其中非整合基因是在T7或T7lac啟動子的控制下。優選地T7啟動子是T7lac。優選地靶蛋白是甲狀旁腺激素(PTH)(1-84)或其活性片段，包括N-端片段1-34、1-31、1-28，或其類似物或衍生物。在另一個實施例中，靶蛋白是胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，或其類似物或衍生物。
本發明進一步提供用于生產包括靶蛋白的無噬菌體發酵液的表達系統，其中該表達系統包含在宿主細胞染色體上非必需基因中具有同源整合T7RNA聚合酶基因的宿主細胞和編碼靶蛋白的非整合基因。
本發明進一步提供制備包含同源整合T7RNA聚合酶基因的宿主細胞的過程。T7RNA聚合酶基因被整合到宿主染色體的任何非必需基因中，優選地，宿主染色體的半乳糖操縱子。T7RNA聚合酶基因能被整合到選自pHMM209、pHMM220、pHMM223和pHMM228的質粒的半乳糖操縱子中。
本發明進一步提供制備靶蛋白的方法，其包括在包含同源整合T7RNA聚合酶基因的宿主細胞中表達靶蛋白，其中靶蛋白是無噬菌體的。優選地，靶蛋白是甲狀旁腺激素(PTH)(1-84)或其活性片段，包括N-端片段1-34、1-31、1-28，或其類似物或衍生物。在另一個實施例中，靶蛋白是胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，或其類似物或衍生物。
圖1顯示來自整合質粒pHMM228的T7RNA聚合酶同源重組到宿主染色體的圖解描述。
為了本發明的目的，如公開的和這里要求的，下面定義下列普通分子生物學術語和縮寫。除非另有所指，在本說明書中使用的術語和縮寫具有其通常的含義。氨基酸縮寫如在37C.F.R.§1.822(b)(2)(1994)提出的。
這里使用的“堿基對”(“base pair”或“bp”)指DNA。當縮寫A、C、G和T在DNA分子中存在時，分別相當于(脫氧)腺苷、(脫氧)胞苷、(脫氧)鳥苷和胸苷的5’-單磷酸形式。在雙鏈DNA中，堿基對可能涉及A和T或C和G的配對關系。“千堿基”(“Kilo-base”和“kb”)指一千(1000)個堿基對。
“質粒”指包含核酸的染色體外遺傳因子。質粒通常通過小寫字母“p”后面跟著字母和/或數字來命名。在這里起始質粒是可以買到、不受限制的公開得到，或者根據公開的過程能夠從可獲得的質粒構建獲得。另外，與那些已描述的質粒相等的質粒在現有技術中是已知的，并且對普通技術人員將是顯而易見的。質粒包含能夠或已經被加入一個或更多額外DNA片段的DNA分子。一些質粒是溫度敏感的，而其它質粒則不是。這意味著在允許的溫度，一些質粒進行自我復制，在非允許的溫度，一些質粒不進行自我復制。
這里使用的“表達質粒”指任何已經結合了控制插入的DNA轉錄的啟動子的非溫度敏感質粒。T7表達質粒包括控制編碼靶蛋白的靶基因表達的T7或T7lac啟動子。T7表達質粒對于普通技術人員來說是非常熟知的。T7表達質粒是可以從Novagen股份有限公司(Madison，WI)買到，包括但不限于pET系列表述質粒。
這里使用的“整合質粒”指任何已經結合了控制插入的DNA轉錄的啟動子的溫度敏感質粒。另外，整合質粒將特定的DNA片段插入到細胞的染色體中。整合質粒是來自pMAK700和pMAK705。質粒pMAK700和pMAK705如Hamilton等在J.Bacteriol.1714617-4622，(1989)中描述的方法制備，其在這里全文引入作為參考。本發明的整合質粒pHMM228、pHMM209、pHMM220和pHMM223將在下面詳細描述。這些整合質粒包含控制編碼T7RNA聚合酶的T7RNA聚合酶基因表達的lac啟動子。
“轉化”指將質粒引入到生物體中使質粒作為染色體外遺傳因子或通過染色體的整合能夠復制。在現有技術中轉化細菌和真核宿主的方法是公知的，在J.Sambrook等，分子克隆實驗室指南(1989)中概括了這些方法中的許多方法。當在宿主細胞內發生這種質粒操作的任何跡象時，通常認為是成功的轉化。例如，當用允許抵抗的質粒轉染宿主細胞時，敏感宿主細胞將抵抗選擇劑。
“允許溫度”是轉化到宿主細胞后質粒能夠不依賴細胞的復制而進行自我復制的溫度。在本發明中被定義的允許溫度是典型地低于44℃的溫度，通常在大約20℃和40℃之間，優選地在大約25℃和40℃之間，更優選地在大約25℃和35℃之間，最優選地大約30℃。
“非允許溫度”是轉化到宿主細胞后質粒不能夠不依賴細胞的復制而進行自我復制的溫度。在本發明中被定義的非允許溫度是典型地高于40℃的溫度，通常在大約40℃和大約50℃之間，優選地大約44℃。
“轉錄”指在DNA的核苷酸序列中所包含的信息通過RNA聚合酶被轉移到互補RNA序列的過程。例如大腸桿菌RNA聚合酶將T7RNA聚合酶基因轉移到接著被翻譯成T7RNA聚合酶的互補RNA序列。同樣地，例如，T7RNA聚合酶將靶基因轉移到接著被轉錄成靶蛋白的互補RNA序列。
這里使用的“翻譯”指信使RNA(mRNA)的遺傳信息被用于指定和指導多肽鏈合成的過程。
“分離的氨基酸序列”指任何氨基酸序列，不管是構建的還是合成的，其在位置上完全不同于自然存在的序列。
“分離的DNA化合物”指任何DNA序列，不管是構建的還是合成的，在位置上完全不同于其在基因組DNA中的天然位置。
“啟動子”指結合RNA聚合酶并且指導DNA向RNA轉錄的DNA序列。這里使用的啟動子的實例是lac、lacUV5、T7、T7lac、lacIQ1。
“PCR”指眾所周知的使用溫度穩定DNA聚合酶的多聚酶鏈式反應。
“引物”指其功能是在PCR中作為酶促延長或合成延長起始底物的核苷酸片段。
“親代細胞”指缺乏溶原體并且在體外能夠自我復制的細胞。親代細胞也應當具有可測定的并且應當是大約2kb長的宿主細胞染色體的DNA序列。這些序列進而應當在細胞的非必需區。優選地，親代細胞是細菌。優選地，親代細胞包含半乳糖操縱子或其片段的DNA序列。優選地，親代細胞是大腸桿菌E.coli。優選的大腸桿菌親代細胞可以從幾個供應商，例如Novagen股份有限公司(Madison WI)中買到，包括但不限于BL21、AD494、BLR、HMS174、Origami和Tuner。
在本發明中“宿主細胞”指包含在lac啟動子控制下同源整合T7RNA聚合酶基因的親代細胞。啟動子可是野生型lac啟動子或象lacUV5那樣經過修飾的lac啟動子。宿主細胞進一步可包含在T7啟動子控制下的非整合基因。啟動子會是野生型T7啟動子或象T7lac那樣經過修飾的T7啟動子。非整合基因編碼選擇的靶蛋白。一旦誘導宿主細胞，就產生T7RNA聚合酶。T7RNA聚合酶接著用于在無噬菌體的發酵液中生產靶蛋白。
“無噬菌體”指當用發酵液培養時在細菌的菌苔上沒有可見的噬菌斑。在現有技術中用于檢驗噬菌體污染的分析是公知的。
“同源整合基因”指通過同源重組的方法被整合到宿主細胞染色體上的基因。同源重組的方法在宿主細胞染色體上的DNA序列和轉化后存在于細胞內的整合質粒上攜帶的互補序列之間進行。優選地，同源重組的方法根據Hamilton等在New method for generatingdeletions and gene replacements in Escherichia coli.J.Bacteriol.1714617-4622，1989中的教導進行，其被引入這里作為參考。
這里使用的“互補”指在雙鏈核酸中通過氫鍵聯系的堿基對(嘌呤和嘧啶)。下列堿基對是互補的鳥嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；以及腺嘌呤和尿嘧啶。
根據本發明通過同源重組整合的基因是T7RNA聚合酶基因。T7RNA聚合酶基因是從T7噬菌體中獲得并且是在異丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)誘導型lacUV5啟動子的控制下。該基因能夠從質粒pAR1219、美國典型培養物保藏中心(ATCC)39563、美國專利No.4,952,496中獲得。pAR1219中的BamHI片段含有包含在IPTG誘導型lacUV5啟動子控制下的T7RNA聚合酶基因的T7表達盒，和在其天然啟動子控制下的lacI基因。
T7RNA聚合酶基因編碼在現有技術中公知的并且在美國專利No.4,952,496中詳細描述的T7RNA聚合酶，其在這里被引入作為參考。當宿主細胞被誘導時，宿主細胞RNA聚合酶能夠結合到lacUV5啟動子上并且啟動T7RNA聚合酶的合成。
“非整合基因”指沒有被整合到宿主細胞染色體中，但在表達質粒中攜帶的基因。表達質粒是通過常規的和慣用的轉化方法被引入到宿主細胞中，并且在允許的溫度在宿主細胞內自主復制。因而，質粒能夠在缺乏宿主細胞復制時在宿主細胞中自我復制。在表達質粒中攜帶的非整合基因編碼感興趣的靶蛋白。非整合基因是在異丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)誘導型T7或T7lac啟動子的控制下。從整合基因中新合成的T7RNA聚合酶能夠結合到T7或T7lac啟動子上，并且啟動靶蛋白的合成。
“靶蛋白”指能夠在宿主細胞中合成的蛋白。優選地靶蛋白與宿主細胞蛋白是異源的。蛋白的實例包括但不限于降鈣素、促紅細胞生成素(EPO)、IX因子、VIII因子、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、趨化因子、生長激素釋放激素(GRF)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、生長激素、胰島素、瘦激素、干擾素、白細胞介素、促黃體素釋放激素(LHRH)、促卵泡素(FSH)、生長抑素、加壓素、糊精、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、甲狀旁腺激素(PTH)、exendin-3、exendin-4和α-1抗胰蛋白酶。本發明的靶蛋白任選地可以是前體蛋白或原蛋白(pro-protein)。前體蛋白或原蛋白的實例包括但不限于胰島素原和GLP-1(1-37)。
整合構建物通過同源重組構建允許將重組的靶基因整合到期望宿主細胞染色體中的有用質粒。這種整合能夠通過使用經過修飾的pMAK構建物來完成。優選地起始pMAK構建物是pMAK700和pMAK705。更優選地起始pMAK構建物是pMAK705。pMAK構建物包含溫度敏感的復制起點。這允許構建物在象30℃允許的溫度進行復制，但是構建物在象44℃非允許的溫度將不進行復制。pMAK構建物也包含氯霉素抗性(Cmr)基因。因而，含有包含Cmr基因的質粒的宿主細胞將抵抗氯霉素，并且將在存在氯霉素的允許溫度時進行復制。
通過將與在宿主細胞染色體上發現的核酸序列同源的核酸序列插入到pAMK構建物中修飾pMAK構建物。被用在宿主細胞染色體上發現的同源核酸序列插入的pMAK構建物在本發明中被稱為pHMM構建物。pHMM構建物的同源序列包含半乳糖操縱子(galETK)的不同片段。在現有技術中半乳糖操縱子是公知的。pHMM構建物和宿主細胞的同源序列足夠長以致于能夠相互雜交并且進行重組。當在象宿主細胞的環境中存在來自整合構建物的互補鏈時，雜交通常依賴變性染色體DNA再退火的能力。優選地同源序列長于約1kb。更優選地，同源序列在約1kb和約10kb之間。甚至更優選地，同源序列在約1kb和約4kb之間。最優選地，同源序列是約2kb。因為重組事件能夠破壞序列使得序列會成為無用的，因此宿主細胞的同源序列會是任何對宿主細胞非必需的序列。例如，如果同源序列是在基因中負責細胞壁的合成，那么在宿主細胞這個序列中與整合質粒的重組將破壞包含細胞壁蛋白的合成并且導致不能生活的宿主細胞。
pHMM構建物進一步會通過將T7RNA聚合酶基因和lacUV5啟動子插入到pHMM構建物中而被修飾。在lacUV5啟動子控制下的T7RNA聚合酶基因能夠從質粒pAR1219、美國典型培養物保藏中心(ATCC)39563、美國專利No.4,952,496中獲得。
優選地，通過將T7RNA聚合酶基因和lacUV5啟動子克隆到pHMM構建物中刪除pMAK質粒的原始lac啟動子。lac啟動子的復制會導致形成第二結構的潛力，這將出現序列決定和干擾同源重組可能性的問題。
任選地，pHMM構建物能夠通過將lacI基因插入到pHMM構建物而被進一步修飾。除了T7RNA聚合酶基因和lacUV5啟動子，pAR1219質粒進一步包含含有在其天然啟動子控制下的lacI基因的DNA片段。在表達系統中lacI基因的拷貝能提供幫助控制T7RNA聚合酶和靶蛋白表達的乳糖阻遏物的額外表達。
任選地，來自T7表達盒(expression cassette)的lacI基因被lacIQ1啟動子驅動。在現有技術中lacIQ1啟動子是公知的。lacIQ1啟動子被修飾用以過度表達lacI基因。結果是lacI阻遏物的產量是被其天然啟動子驅動的lacI基因的約100倍。
另外，pHMM構建物進一步包含第二抗性基因。優選地第二抗性基因是卡那霉素(Kmr)。因此，含有包含Kmr基因質粒的宿主細胞將抵抗卡那霉素并且在卡那霉素存在時將進行復制。優選地，第二抗性基因的方向與T7RNA聚合酶的方向相反。卡那霉素抗性基因提供另外一種獨特地鑒定宿主細胞的方法。卡那霉素抗性基因能夠從質粒pACYC177中獲得。pACYC177可以從“Stratagene Cloning Systems”目錄(1993)(Stratagene，La Jolla，Calif.)中獲得。來自pACYC177的卡那霉素抗性基因包括Tn903轉座反向重復序列(IR)。由于通過這些反向重復序列的存在導致轉座而產生的潛在的不穩定性，因此優選包含卡那霉素抗性基因但不是包含反向重復序列的盒。
整合整合構建物能夠根據常規的方法被轉化到期望的宿主菌株中，并且單個菌落在允許的溫度下在存在選擇劑，例如Cm或Km的液體生長基中過夜生長。將產生的過夜培養物在存在選擇劑的液體生長基中稀釋，并且在非允許的溫度，例如44℃培養，直到對數期。接著將培養物鋪到含有選擇劑的瓊脂平板上，在非允許的溫度過夜培養以篩選形成的共合體。形成共合體在同源重組中是起始步驟，并且當整合構建物整合到宿主染色體中時發生。因為整合質粒不能在非允許的溫度和含有選擇劑的培養物中自我復制，因此在這些條件下存活的宿主細胞將僅僅是那些將整合構建物整合到宿主細胞染色體上的宿主細胞。將產生的培養物鋪到含有選擇劑的瓊脂平板上，在非允許的溫度過夜培養以篩選共合體。
挑出共合體菌落，轉移到液體生長基中，在共合體分離的允許溫度過夜培養。分離為發生第二次重組事件提供了一種方法，其中整合質粒被從染色體上刪除并在宿主細胞中被改造。被刪除和在宿主細胞中被改造的整合質粒是原始整合質粒的全部或是仍然被整合到宿主細胞染色體中減去T7RNA聚合酶的原始整合質粒。第二次重組事件的目的是刪除整合質粒中包含來自宿主細胞染色體復制起始點的部分，但是留下整合到宿主細胞染色體中的T7RNA聚合酶。這個過程的圖示顯示在圖1中。在整合質粒進一步包括其它基因，例如lacI或Km的情況中，第二次重組事件的目的是刪除整合質粒中含有來自宿主細胞染色體復制起始點的部分，但是留下整合到宿主細胞染色體中的T7RNA聚合酶和其它基因，例如lacI或Km。因為整合的復制起始點對宿主細胞是有害的，因此希望去除整合質粒的復制起始點。這種通過用選擇劑傳代培養和在允許的溫度維持的刪除過程任選地可能持續幾天。優選地傳代培養和維持少于三天，更優選地傳代培養和維持持續兩天。
接著將培養物稀釋到含有無選擇劑液體生長培養基的預熱瓶中，在非允許的溫度通過將不太期望的質粒序列從宿主細胞的染色體上刪除以啟動整合體的自愈。將培養物被鋪在含有選擇劑的瓊脂平板上并且在允許的溫度生長。用技術人員熟知的方法，例如PCR和Southern印跡法篩選存在整合事件的菌落。將含有整合體的菌落用于接種液體基質培養物中，隨后在非允許的溫度連續生長幾天以促進自愈。接著將培養物鋪到瓊脂平板上，在允許的溫度過夜培養。隨后將單個菌落鋪在任選地含有兩種選擇劑，例如Cm和Km的瓊脂平板上。進一步將單個菌落鋪到僅僅含有第二種選擇劑，例如Km的瓊脂平板上。具有整合序列的期望克隆對Cm敏感和對Km抵抗。
在另一個實施例中，整合質粒優選地被整合到宿主細胞的半乳糖操縱子中。更優選地，整合質粒被整合到宿主細胞的galE基因座中。進行了多次整合到galK基因座的嘗試，然而沒有成功地獲得理想的整合。
靶蛋白在本發明的表達系統中使用的編碼重組靶蛋白的非整合基因是通過分子生物學領域中普通技術人員可用的方法獲得的。基本步驟是a)分離天然的DNA序列或者構建合成的或半合成的DNA序列，其中DNA序列包含編碼感興趣靶蛋白的靶基因，b)以適合表達靶蛋白的方式將DNA序列克隆到可獲得的T7表達質粒中，c)用包含感興趣靶基因的T7表達質粒轉化前面描述過的本發明的表達宿主，d)在非誘導狀態培養經過轉化的表達宿主一段時間，接著在誘導狀態培養一段時間，和e)回收和純化靶蛋白。
優選地，靶蛋白是甲狀旁腺激素(PTH)。更優選地，甲狀旁腺激素是人甲狀旁腺激素。在現有技術中，甲狀旁腺激素是已知具有84個氨基酸的蛋白并且在美國專利No.5,496,801中被描述。在現有技術中甲狀旁腺激素的N-端片段也是公知的，包括但不限于1-34，1-31和1-28。而且，PTH和PTH片段的類似物和衍生物也被考慮。PTH片段、類似物和衍生物的實例被描述在WO99/29337、US20020132973、美國專利Nos.5,556,940；6,472,505；和6,417,333。
在另一個實施例中，靶蛋白是胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，或其類似物或衍生物。在現有技術中，GLP-1類似物和衍生物的實例是公知的，并且被描述在WO01/98331，和美國專利Nos.6,268,343；5,977,071；5,545,618；5,705,483；6,133,235。GLP-1類似物也包括如在WO99/07404，WO99/25727，WO99/25728，WO99/43708，WO00/66629和US2001/0047084A1中描述的Exendin-3和Exendin-4激動劑。
修飾分離的靶蛋白用作治療蛋白。任選地靶蛋白能夠在宿主細胞外被進一步修飾以賦予靶蛋白用作治療蛋白的額外的物理特性。修飾包括但不限于酶促或化學裂解、酰化作用、結晶、鹽加成，等等。
制劑液體生長培養基是TB培養基(T Broth)TB培養基＝(每升)10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉，pH7.5。
T瓊脂平板＝向TB培養基中加15g/L瓊脂。
SM緩沖液＝(每100ml 10X溶液)20ml 1M Tris-鹽酸(pH7.4)，20ml 5M氯化鈉，10ml 1M硫酸鎂氯霉素(Cm)(25μg/ml)溶于乙醇卡那霉素(Kam)(15-50μg/ml)溶于水萘啶酮酸(20μg/ml)溶于氫氧化鈉鏈霉素(50μg/ml)溶于水整合質粒pHMM209整合質粒pHMM209是pMAK705的衍生物。在pHMM209構建中，起始步驟是將寡核苷酸接頭(adapter)，BamHI到ClaI，克隆到pMAK705主鏈(backbone)上。這個接頭含有StruI位點，其在產生的構建物中是唯一的。將galK側翼作為SalI到XbaI的插入片段克隆到pMAK705主鏈上產生pHMM主鏈。pHMM主鏈在galK側翼中包含唯一的BamHI和ClaI位點。接著將來自pAR1219，包含在其天然啟動子序列表達下的lacI基因和在lacUV5啟動子調節下的T7RNA聚合酶基因的T7表達盒作為BamHI片段克隆到pHMM主鏈上。T7表達盒的方向與galETK操縱子的方向相反，以防止從galE上游序列的轉錄連讀。下一步，將卡那霉素抗性基因作為來自pACYC177的StuI片段克隆到先前被克隆到pMAK705主鏈的接頭的StuI位點。卡那霉素基因的方向與T7表達盒的方向相反。產生的整合質粒是pHMM209。
整合質粒pHMM220整合質粒pHMM220是pMAK705的衍生物。在pHMM220的構建中，起始步驟是將寡核苷酸接頭，BamHI到ClaI，克隆到pMAK705主鏈上。這個接頭含有StruI位點，其在產生的構建物中是唯一的。將galK側翼作為SalI到XbaI的插入片段克隆到pMAK705主鏈上產生pHMM主鏈。pHMM主鏈在galK側翼中包含唯一的BamHI和ClaI位點。接著將包含在其天然啟動子序列表達下的lacI基因和在lacUV5啟動子調節下的T7RNA聚合酶基因的T7表達盒作為來自pAR1219的BamHI片段克隆到pHMM主鏈上。T7表達盒的方向與galETK操縱子的方向相反，以防止從galE上游序列的轉錄連讀。下一步，通過PCR獲得作為StuI片段的卡那霉素抗性基因。在pACYC177模板卡那霉素基因中存在的反向重復序列的內部設計用于擴增抗性基因的PCR引物。PCR引物在其尾部含有StuI限制酶切位點，并且在擴增反應中使用。將產生的大約1kb的PCR產物直接克隆到PCR克隆質粒中，通過直接鋪到含有卡那霉素的T瓊脂平板上篩選推定的克隆。將產生的卡那霉素抗性基因作為StuI片段亞克隆到先前被克隆到pMAK705主鏈上的接頭的StruI位點。卡那霉素基因的方向與T7表達盒的方向相反。產生的整合質粒是pHMM220。
整合質粒pHMM223象pHMM220一樣構建整合質粒pHMM223。下一步，因為lacI基因具有整合到宿主染色體lacI基因座的潛力，因此除去pHMM22中T7表達盒的lacI基因。通過用BglI酶消化質粒，將lacI基因從pHMM220中刪除。將合成的DNA接頭克隆到BglI位點重新組成在BglI酶消化過程中被刪除的lacUV5啟動子。將產生的克隆測序，發現含有帶有兩個核苷酸改變例外的期望lacUV5序列。這些改變是在T7表達盒5’非翻譯區，對T7RNA聚合酶的表達不是關鍵的。下一步，消除pHMM220中存在的lacI啟動子。這是通過插入完全取代lacI啟動子序列的PstI到AseI的接頭來完成。
pHMM220的BglI刪除也除去了下游galK側翼。為了重新組成這個區域以及結合無反向重復序列的卡那霉素抗性基因，將BamHI到XbaI片段亞克隆到整合質粒的BglII到XbaI位點。這樣產生了稱為pHMM223的整合質粒，其含有無lacI基因拷貝和lacI的T7表達盒啟動子、無反向重復序列的卡那霉素抗性基因、以及完整的galK側翼。pHMM223被用于試圖整合到染色體的galK基因座中。
整合質粒pHMM228整合質粒pHMM228是pMAK705的衍生物。在pHMM228的構建中，起始步驟是將寡核苷酸接頭，PstI到EagI，克隆到pMAK705主鏈中。這個接頭含有唯一的SalI和XbaI位點。將大約2kb的galE基因作為XbaI插入片段克隆到pMAK705主鏈中產生pHMM主鏈。pHMM主鏈包含基因中唯一的BamHI和ClaI位點。接著將包含在其天然啟動子序列表達下的lacI基因和在lacUV5啟動子調節下的T7RNA聚合酶基因的T7表達盒作為來自pAR1219的BamHI片段克隆到pHMM主鏈上。T7表達盒的方向與galETK操縱子的方向相反，以防止從galE上游序列開始的轉錄連讀。下一步，通過PCR獲得作為StuI片段的卡那霉素抗性基因。在pACYC177模板卡那霉素基因中存在的反向重復序列的內部設計用于擴增抗性基因的PCR引物。PCR引物在其尾部含有StuI限制酶切位點，并且在擴增反應中使用。將產生的大約1kb的PCR產物直接克隆到PCR克隆質粒中，并且通過直接鋪到含有卡那霉素的T瓊脂平板上篩選推定的克隆。將產生的卡那霉素抗性基因作為StuI片段亞克隆到先前被克隆到pMAK705主鏈上的接頭的StruI位點。卡那霉素基因的方向與T7表達盒的方向相反。最后，按照獲得pHMM223描述的那樣基本上除去T7表達盒的lacI基因。通過使用BglI酶消化質粒刪除lacI基因。將合成的DNA接頭克隆到BglI位點重新組成在BglI酶消化過程中被刪除的lacUV5啟動子。下一步，通過插入完全替代lacI啟動子序列的PstI到AseI的接頭消除lacI啟動子。BglI的刪除也除去了下游galE側翼。為了重新組成這個區域和結合無反向重復序列的卡那霉素抗性基因，將BamHI到XbaI片段亞克隆到整合質粒的BglII到XbaI位點。這樣產生了稱為pHMM228的整合質粒，其含有無lacI基因拷貝和lacI啟動子的T7表達盒、無反向重復序列的卡那霉素抗性基因、以及完整的galK側翼。pHMM228被用于試圖整合到染色體的galE基因座中。
pHMM209的整合/篩選將整合質粒pHMM209轉化到包含半乳糖操縱子的大腸桿菌親代細胞系中，平鋪到含有氯霉素的T瓊脂平板上，并且在30℃過夜培養。挑出菌落，轉移到含有氯霉素的TB培養基中，在30℃過夜生長。在存在氯霉素的TB培養基中稀釋產生的過夜培養物，在44℃培養直到培養物達到對數期。接著將培養物鋪到包含氯霉素的T瓊脂平板上，在44℃過夜培養以誘導形成共合體。挑出共合體菌落，轉移到250ml含有氯霉素的TB培養基中，在30℃過夜培養用于刪除和分離。通過用含有氯霉素的TB培養基在1∶500稀釋傳代培養和在30℃孵育培養瓶，將這種培養物再維持兩天。在第四天，將培養物傳代培養到44℃預熱的TB培養基瓶中。使這種培養物在44℃連續三天生長和傳代培養以促進pHMM209質粒的自愈。接著將暫時經過整合、刪除和自愈的培養物鋪到含有卡那霉素的T瓊脂平板上，在30℃過夜培養。隨后將單個菌落鋪到含有Cm和Km的T瓊脂平板上，接著鋪到含有Km的T瓊脂平板上，接著鋪到T瓊脂平板上。陽性整合體應當是Cms和Kmr。
檢驗了近1000個單個菌落，僅僅形成了一個整合體。這個整合體被稱為RQ209。進一步分析表明RQ209株具有通過添加IPTG而被誘導的功能T7RNA聚合酶。然而，當在RQ209株菌上進行PCR作圖時，發現T7RNA聚合酶沒有特異性地整合到染色體的galK或lacI區。
pHMM228的整合/篩選基本上按照上面在pHMM209的整合/篩選中描述的方法進行整合實驗。下面的表格顯示了形成的共合體的數量。
表1pHMM228的共合體
TNTC數不勝數ND沒有測定隨后使在44℃平板上生長的菌落于44℃在TB培養基中生長。除了一種培養物是從代表約二分之一整個平板的菌落中收集的外，長出了九個單個分離菌。將這10個培養物在氯霉素選擇下，44℃過夜振(315rpm)蕩培養。第二天通過離心從每個培養物中收獲100μl樣品用于隨后的PCR分析。另外，預熱到44℃的平板被用于為來自這些培養物的單個分離菌劃線，在44℃過夜培養。PCR和限制性內切酶圖析結果顯示幾乎所有10種液體培養物都含有與預期的整合事件一致的擴增產物。
通過在44℃重新鋪平板篩選單個克隆。使#2單個分離菌在30℃含有氯霉素的TB培養基中過夜生長以促進pHMM228的刪除。過夜生長后，收集100μl細胞樣品，用作PCR反應的模板。選擇來自galE側翼外側的引物使得擴增僅僅是pHMM228被刪除的形式。因此如果刪除事件重新產生了pHMM228，那么將能預料到大約7kb的PCR產物。然而，如果由于第二次交換事件在染色體上留下T7RNA聚合酶所導致的刪除，那么將能預料到大約1.5kb的PCR產物。如所預料的，觀察到了刪除產物的混合物。隨后將刪除的培養物劃線培養以獲得用于篩選是否存在1.5kb PCR產物的單個分離菌。
接著使三個分離菌在無選擇劑的TB培養基中44℃過夜生長以促進經過刪除的pHMM228的自愈。在44℃過夜生長后，將單個菌落從劃線的T瓊脂平板中分離，將來自三個原始分離菌各自的72個單個菌落鋪到加上Cm的T平板、加上Km的T平板和T平板上以檢測那些已經成功治愈刪除pHMM228的菌落。下表詳細列舉了這些實驗的結果。
表2自愈效率
隨后從#1分離菌中選出對卡那霉素敏感被稱為RQ228的單個個體，劃線純化兩次并且核實表型。下表顯示了表型分析的結果。
表3表型結果
接著選出已經確定表型的RQ228菌株的菌落，過夜生長得到10ml培養物用于當地保藏和長期保藏以及用于制備感受態細胞。在整合完整性PCR作圖中使用這種相同的菌落。
T7活性和調節分析除了核實表型特征和整合事件的完整外，也檢查RQ228菌株表達功能性T7RNA聚合酶的能力以及這和表達被調節的能力。按照下面描述的方法檢查RQ228拯救缺陷型T7試驗噬菌體的能力。
T7RNA聚合酶分析為了檢測RQ209菌株或RQ228菌株是否擁有功能T7RNA聚合酶使用T7RNA聚合酶活性分析。使RQ209菌株或RQ228菌株在補加0.2％麥芽糖和10mM硫酸鎂的TB培養基中在大約37℃過夜生長。將過夜生長的培養物在再次補加0.2％麥芽糖和10mM硫酸鎂的TB培養基中稀釋回OD600＝0.05，振蕩生長到OD600＝0.5，并且將每個細菌培養物的100μl培養物加到100μl T7試驗噬菌體10-6SM緩沖液中。將樣品用手指輕輕渦旋混勻，在37℃培養20分鐘以允許噬菌體吸附。接著向樣品中加入3ml 0.4％T頂層瓊脂糖(補加0.2％麥芽糖和10mM硫酸鎂)，渦旋混允并倒在預熱的T瓊脂平板上。每個樣品制成兩份以便一份被鋪到T瓊脂平板上，另一份被鋪到含有400μM IPTG的T瓊脂平板上。T7試驗噬菌體能夠附著到細胞上，但是能夠復制和溶解僅僅那些被其感染具有可獲得功能T7RNA聚合酶的細胞。由于T7RNA聚合酶表達是在lacUV5啟動子的控制下，因此表達應當僅僅在存在誘導劑IPTG時發生。在含有IPTG的平板上有噬菌斑以及在無IPTG平板上沒有噬菌斑構成了T7RNA聚合酶可控表達的陽性指征。
整合完整性的最終PCR確定分析RQ228菌株以確定整合事件的完整性/特異性。進行PCR擴增以檢查galE-靶向整合事件的功能和確定全部整合盒的大小。
使用RQ228的甲狀旁腺激素PTH的表達使用常規方法將包含編碼甲狀旁腺激素PTH基因的表達質粒轉化到RQ228或DE3宿主細胞中。使兩個菌株在37℃含有四環素的TB培養基中生長，通過添加IPTG到10μM進行誘導。將培養物繼續培養6小時。培養物的樣品顯示兩個宿主細胞都表達甲狀旁腺激素。然而，僅僅在RQ228宿主細胞中生產的PTH是無噬菌體的，而在DE3宿主細胞中生產的PTH在發酵液中有可以檢測到水平的噬菌體污染。
使大腸桿菌在補加0.2％麥芽糖和10mM硫酸鎂的TB培養基中37℃過夜生長以達到飽和。將過夜生長的培養物在再次補加0.2％麥芽糖和10mM硫酸鎂的TB培養基中稀釋回OD600＝0.05，振蕩生長到OD600＝0.5，將100μl大腸桿菌培養物加到100μl發酵液中。將樣品用手指輕輕渦旋混勻，在37℃培養20分鐘以允許噬菌體吸附。向樣品中加入3ml 0.4％T頂層瓊脂糖(補加0.2％麥芽糖和10mM硫酸鎂)，渦旋混允并倒在預熱的T瓊脂平板上。將平板在37℃培養12小時。無噬菌體的發酵液將不產生可見的噬菌斑。
權利要求
1.包含在lac啟動子控制下的同源整合的T7RNA聚合酶基因的宿主細胞。
2.權利要求1的宿主細胞，其中不使用噬菌體溶原體將T7RNA聚合酶整合到宿主細胞染色體中。
3.權利要求2的宿主細胞，其中lac啟動子是lacUV5啟動子。
4.權利要求2或3的宿主細胞，其中T7RNA聚合酶基因被整合到宿主染色體的半乳糖操縱子中。
5.權利要求4的宿主細胞，其中T7RNA聚合酶基因被整合到來自選自pHMM209、pHMM22、pHMM223和pHMM228的整合質粒的半乳糖操縱子中。
6.權利要求2-5中任一權利要求的宿主細胞，其中宿主細胞進一步包含編碼在T7lac啟動子控制下的靶蛋白的非整合基因。
7.權利要求6的宿主細胞，其中靶蛋白是甲狀旁腺激素(PTH)。
8.權利要求7的宿主細胞，其中PTH是1-84的N-端片段。
9.權利要求8的宿主細胞，其中N-端片段是1-34。
10.權利要求6的宿主細胞，其中靶蛋白是胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，或GLP-1類似物或衍生物。
11.用于在無噬菌體的發酵液中生產靶蛋白的表達系統，其中表達系統包含在宿主細胞的非必需基因中具有同源整合T7RNA聚合酶基因和編碼靶蛋白的非整合基因的宿主細胞，其中非整合基因是在T7lac啟動子的控制下。
12.權利要求11的表達系統，其中T7RNA聚合酶基因被整合到宿主染色體的半乳糖操縱子中。
13.權利要求12的表達系統，其中T7RNA聚合酶基因被整合到來自選自pHMM209、pHMM22、pHMM223和pHMM228的整合質粒的半乳糖操縱子中。
14.權利要求13的表達系統，其中靶蛋白是甲狀旁腺激素(PTH)。
15.權利要求14的表達系統，其中PTH是1-84的N-端片段。
16.權利要求15的表達系統，其中N-端片段是1-34。
17.權利要求13的表達系統，其中靶蛋白是胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，或GLP-1類似物或衍生物。
18.制備宿主細胞的方法，包括將在lacUV5啟動子控制下的T7RNA聚合酶基因同源整合到宿主的非必需基因中，以使得一旦誘導T7RNA聚合酶基因，發酵液將是無噬菌體的。
19.權利要求18的方法，其中T7RNA聚合酶基因被整合到半乳糖操縱子中。
20.權利要求19的方法，其中T7RNA聚合酶基因被整合到來自選自pHMM209、pHMM22、pHMM223和pHMM228的整合質粒的半乳糖操縱子中。
21.制備靶蛋白的方法，其包括a.制備宿主細胞，包括將在lacUV5啟動子控制下的T7RNA聚合酶基因同源整合到宿主的非必需基因中，b.用編碼靶蛋白的非整合基因轉化宿主細胞，其中非整合基因是在T7lac啟動子的控制下，c.誘導宿主細胞產生T7RNA聚合酶，d.在發酵液中培養宿主細胞充分長的時間以允許T7RNA聚合酶產生靶蛋白，其中發酵液將是無噬菌體的。
22.權利要求21的方法，其中靶蛋白是甲狀旁腺激素(PTH)。
23.權利要求22的方法，其中PTH是1-84的N-端片段。
24.權利要求23的方法，其中N-端片段是1-34。
25.權利要求21的方法，其中靶蛋白是胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，或GLP-1類似物或衍生物。
全文摘要
本發明提供用于在宿主細胞中生產靶蛋白的表達系統，包含編碼T7RNA聚合酶的同源整合基因和編碼靶蛋白的非整合基因。
文檔編號C12N9/12GK1604960SQ02825017
公開日2005年4月6日 申請日期2002年12月3日 優先權日2001年12月12日
發明者C·C·弗賴伊, C.L.赫爾斯伯格 申請人:伊萊利利公司