專利名稱：新的肌醇六磷酸酶和制造這些新肌醇六磷酸酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的肌醇六磷酸酶，尤其是真菌來源，也涉及它們各自的制造方法。本發(fā)明更特定涉及獲得自青霉屬真菌的新肌醇六磷酸酶，尤其是青霉屬CBS109899菌株，也涉及編碼這些肌醇六磷酸酶的多核苷酸。發(fā)明還涉及含這些多核苷酸的載體、在組織中表達(dá)所述肌醇六磷酸酶的轉(zhuǎn)化的宿主生物。
本發(fā)明的肌醇六磷酸酶特別適合用于動物營養(yǎng)物的飼養(yǎng)組合物。此適當(dāng)性與它們的性質(zhì)相關(guān)，尤其是它們在溫度和pH條件下的活性，這些條件對應(yīng)于制備所述組合物的條件以及動物消化系統(tǒng)中所遇到的條件。
磷是對于所有生物體生命必要的元素。它特別對于農(nóng)場動物飼者非常重要，用于確定他們的動物消化足夠量以最優(yōu)化它們的生長和發(fā)育。大部分農(nóng)場動物用以植物為基礎(chǔ)的飼養(yǎng)組合物喂養(yǎng)。這些植物包含大量磷酸鹽，它們將磷酸鹽以貯藏化合物形式肌醇六磷酸保存在它們的組織中。肌醇六磷酸平均包含植物中存在的50％到70％的磷。肌醇六磷酸自然轉(zhuǎn)移且其所含磷酸鹽在大部分農(nóng)場動物中釋放，尤其是反芻動物。然而，肌醇六磷酸不被單胃動物代謝，如豬和家禽。因此在這些動物中，它們食物攝取中所含的肌醇六磷酸隨著排泄物釋放，飼者需要用無機(jī)磷酸鹽補充所述攝入，從而使他的動物消化足夠量磷。此策略造成飼者額外的花費且非吸收的肌醇六磷酸釋放到環(huán)境中產(chǎn)生污染。此污染在飼養(yǎng)密集區(qū)域增加更快。
同樣已知肌醇六磷酸是食物攝入中所含重要營養(yǎng)成分的螯合劑，例如鎂、鈣、鋅或鐵。此性質(zhì)導(dǎo)致食物攝入的營養(yǎng)質(zhì)量下降，給予肌醇六磷酸抗?fàn)I養(yǎng)劑的性質(zhì)。
為對應(yīng)于多種與單胃動物缺乏肌醇六磷酸吸收相關(guān)的缺點，考慮將酶肌醇六磷酸酶導(dǎo)入這些家畜動物的食物攝入中。肌醇六磷酸酶水解肌醇六磷酸，釋放肌醇和無機(jī)磷酸鹽。肌醇六磷酸酶和編碼這些肌醇六磷酸酶的基因從許多生物中體被分離。肌醇六磷酸酶主要從真菌中分離(Howsor和Davis，1983，Enzyme Microb.Technol.5，377-382；Wyss等，1999，Appli.Environ.Microbiol.，65(2)，359-366)。在這些產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的真菌中，提到的真菌有曲霉屬，尤其是A.ficcum(Ullah和Gibson，1987，Preparative Biochemistry 17(1)，63-91；Ullah和Dischinger，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.，192(2)，747-753)、土曲霉(A.terreus)(Mitchell等，1997，Microbiology，143(第1部分)，245-252)、黑曲霉(A.niger)(Dvorakova等，1997，F(xiàn)olia Microbiol(Praha)，42(4)，349-352)、煙曲霉(A.fumigatus)(Pasamontes等，1997，Appli.Environ.Microbiol.，63(5)，1696-1700)；青霉屬，尤其是P.caseicolum；Myceliophthora，尤其是M.thermophila(Mitchell等，1997，Microbiology，143(第1部分)，245-252；Talaromyces，尤其是嗜熱籃霉菌(T.thermophila)，脈孢菌屬，尤其是粗糙脈孢菌(N.crass)和好食脈孢菌(N.sitophila)；高溫霉菌屬(Therrnomyce)，尤其是T.Lanuginosus(Berka等，1998，Appli.Environ.Microbiol.64(11)，4423-4427)；或紅曲霉屬，尤其是M.anka。肌醇六磷酸酶也在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)。作為例子，提到的細(xì)菌有芽孢桿菌屬，尤其是枯草芽孢桿菌(B.subtilis)(Powar和Jagannathan，1982，J.Bacteriol.151(3)，102-1108；Shimizu，1992，Biosci.Biotech.Biochem.56(8)，1266-1269；Keruvo等，1998，Appli.Environ.Microbiol.64(6)，2079-2085)；假單胞菌屬(Cosgrove，1970，Austral.J.Biol.Sci.23，1207-1220)；埃希氏菌屬，尤其是大腸桿菌(E.coli)(Golovan等，2000，Can.J.Microbiol.46，59-71)；腸桿菌屬(yoon等，1996，Enzyme and microbial.Technol.；18，449-454)或鏈霉菌屬。酵母肌醇六磷酸酶也被分離(Dvorakova，1998，F(xiàn)olia Microbiol.43(4)，323-338)，如酵母Schwaniiomyces occidentalis和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。最后，肌醇六磷酸酶在植物中發(fā)現(xiàn)，尤其是大豆(Ullah和Gibson，1988，Arch.Biochem.Biophys.，260(2)，514-20)、玉米(Maugenest等，1997，Biochem J.，322(第2部分)，511-7；Maugenest等，1999，Plant Mol.Biol.，39(3)，503-14)或擬南芥(Arabidopsis)(Mullaney和Ullah，1998，Biochem.Biophys.Res.Commun.，251(1)，252-5)。
能確定肌醇六磷酸酶特征的性質(zhì)包括關(guān)于肌醇六磷酸的米氏常數(shù)(Km)、活性的最適pH和最適溫度以及在特定pHs和溫度的活性的穩(wěn)定性。涉及肌醇六磷酸酶結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)也可使用，如分子量(MW)、等電點(pI)或肽序列。為能在動物營養(yǎng)物中使用，肌醇六磷酸酶的性質(zhì)必須與用于此營養(yǎng)的飼料加工過程相容。特定的是，所用肌醇六磷酸酶的活性在制備這些飼料方法的溫度和pH條件以及消化這些飼料的動物消化道中存在的條件下，必須維持且如果可能需為最佳。這些限制導(dǎo)致主要搜尋的肌醇六磷酸酶所具有的活性能抵擋高溫條件如制備飼料組合物方法中所用條件，抵擋酸性pH條件如家畜動物消化道中存在的條件。
為符合這些標(biāo)準(zhǔn)，在生物體中尋找肌醇六磷酸酶，尤其是微生物，其生長的環(huán)境中溫度和pH條件與這些標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)。此策略能分離抵擋高溫的肌醇六磷酸酶，例如專利申請WO 97/35016或EP 0 684 313所述，也分離具低Km的肌醇六磷酸酶，例如專利申請EP 0 960 934所述。另一種策略是通過定點突變來人工修飾已知肌醇六磷酸酶序列以賦予其優(yōu)勢性質(zhì)。此策略特定描述于專利申請WO 99/48380、EP 0 897 985和EP 0897 010。
附圖簡述
圖1青霉屬CBS 109899的肌醇六磷酸酶活性作為pH的函數(shù)。100％相對活性的值對應(yīng)于特定pH的肌醇六磷酸酶最佳活性。
圖2青霉屬CBS 109899的肌醇六磷酸酶活性作為溫度的函數(shù)。100％相對活性的值對應(yīng)于特定溫度的肌醇六磷酸酶最佳活性。
概述本發(fā)明涉及編碼肌醇六磷酸酶的分離的多核苷酸，肌醇六磷酸酶由序列標(biāo)識符SEQ ID NO3描述。此肌醇六磷酸酶和編碼它的多核苷酸也來源自青霉屬的真菌菌株，尤其是青霉屬CBS 109899菌株。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“多核苷酸”所指核酸分子包括天然或人造堿基序列，堿基可以是DNA或RNA類型，優(yōu)選DNA類型，尤其是雙鏈。當(dāng)所述多核苷酸是天然的時，要清楚理解發(fā)明不涵蓋天然環(huán)境中的此多核苷酸，但包括從其天然發(fā)現(xiàn)的活生物體基因組分離和純化的相同多核苷酸。此多核苷酸可通過提取和純化直接獲得，或通過復(fù)制間接獲得。然而，本發(fā)明包括所述多核苷酸，當(dāng)它被人工整合到非其天然存在的活生物體基因組中或當(dāng)它被人工重導(dǎo)入其來源的活生物體時，作為此生物體基因組中一個或多個拷貝。當(dāng)此多核苷酸是探針時，它一般是單鏈。
因此發(fā)明包括編碼肌醇六磷酸酶肽序列的多核苷酸，肌醇六磷酸酶由序列標(biāo)識符SEQ ID NO3描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知此定義包括所有多核苷酸，盡管所含核苷酸序列由于遺傳密碼簡并性而不同，多核苷酸編碼相同氨基酸并因而編碼相同肌醇六磷酸酶，肌醇六磷酸酶由序列標(biāo)識符SEQ ID NO3表示。
本發(fā)明也包括與上述多核苷酸同源的多核苷酸、所述編碼肌醇六磷酸酶的同源多核苷酸，肌醇六磷酸酶與序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶同源。根據(jù)發(fā)明，術(shù)語“同源”指編碼肌醇六磷酸酶的多核苷酸，其序列具有相對編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸的修飾。同源多核苷酸特征是與編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸有一定程度的同一性。兩種相應(yīng)多核苷酸間的同一性程度通過比較它們的序列來獲得，一般由這些序列間相同的核苷酸百分比表示。測量特定序列長度的同一性程度，比較的較短序列確定測量同源序列同一性程度的序列長度。因此發(fā)明涵蓋的多核苷酸具有一個或多個相對編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸的修飾，編碼的肌醇六磷酸酶性質(zhì)相當(dāng)于序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的性質(zhì)。
根據(jù)發(fā)明，表達(dá)“等價肌醇六磷酸酶”或“具相等性質(zhì)的肌醇六磷酸酶”本質(zhì)上指有肌醇六磷酸酶活性的蛋白質(zhì)，這不取決于它們的內(nèi)在性質(zhì)如Km、活性的最適pH或活性的最適溫度。肌醇六磷酸酶活性水平可通過任何方法測量以確定肌醇六磷酸酶活性的特征。術(shù)語“肌醇六磷酸酶”所指酶的催化活性包括水解肌醇六磷酸，用于釋放肌醇和無機(jī)磷酸鹽。然而由于大部分肌醇六磷酸酶不完全水解肌醇六磷酸(包括6個磷酸鹽)，根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶催化活性可導(dǎo)致無機(jī)磷酸鹽和肌醇磷酸酯釋放，所述酯取決于肌醇六磷酸酶水解能力，可能是肌醇一、二、三、四或五磷酸酯。作為例子，肌醇六磷酸酶活性可根據(jù)Shimizu(1992，Biosci.Biotech.Biochem.56(8)，1266-1269)的方法測量，特定如實施例2所述。然而，任何確定肌醇六磷酸酶活性特征的方法或通過測量底物量減少或通過測量來自酶反應(yīng)的產(chǎn)物積聚，可用于測量肌醇六磷酸酶活性。特定的是，使用例如另外底物或其它反應(yīng)物的類似方法也能測量所述肌醇六磷酸酶活性。
同源多核苷酸中存在的序列修飾可以是加入、缺失或取代天然或常規(guī)突變技術(shù)獲得的核苷酸。已知這種同源多核苷酸編碼具相等功能的蛋白質(zhì)，多核苷酸天然存在于不同活種類的基因組中，甚至存在于不同種族、品種或菌株的基因組中。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易根據(jù)發(fā)明使用編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肽序列的多核苷酸，用熟知的分子雜交技術(shù)分離這種同源多核苷酸(Sambrook等，1989，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第2版，NolanC.編，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press)。
分子雜交是在互補多核苷酸鏈間發(fā)生的配對反應(yīng)，互補鏈的核苷酸序列間有一定程度同一性。因此使用編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸，雜交能在非它們獲得自的活生物體基因組中鑒定與這些多核苷酸同源的多核苷酸，例如其它真菌，尤其是青霉菌的其它菌株如繩狀青霉(P.funicolosum)IMI134756，編碼的肌醇六磷酸酶具有與序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶相等的性質(zhì)。多核苷酸間序列同一性越高，所述多核苷酸間雜交的可能性越高且更容易，多核苷酸編碼具相等性質(zhì)蛋白質(zhì)的可能性越高。用于使多核苷酸間雜交的方法廣泛描述于文獻(xiàn)中(Sambrook等，1989，《分子克隆實驗室手冊》，第2版，Nolan C.編，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press)且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。例如，它們以篩選基因組或cDNA文庫為基礎(chǔ)，文庫創(chuàng)建自活生物體或來自此生物體的組織。完成篩選所用的探針由已知多核苷酸或其片段組成，用于鑒定這些文庫中與所述探針同源的多核苷酸，探針會和它雜交。根據(jù)發(fā)明，探針由多核苷酸或其片段組成，多核苷酸編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶。為鑒定與探針雜交的多核苷酸，探針被標(biāo)記，例如用放射性元素如32P。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的可商業(yè)購買的非放射性標(biāo)記也能使用。
因此本發(fā)明也包括的多核苷酸能選擇性地與一種編碼序列標(biāo)識符SEQ IDNO3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸或其片段雜交。要理解的是如果這些多核苷酸編碼的肌醇六磷酸酶相當(dāng)于序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示，多核苷酸僅是本發(fā)明一部分。因此根據(jù)發(fā)明，表達(dá)“能選擇性雜交的多核苷酸”指通過一種常規(guī)分子雜交方法(Sambrook等，1989，《分子克隆實驗室手冊》，第2版，Nolan C.編，NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press)與標(biāo)記探針雜交的多核苷酸，探針由一種編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸或其片段組成，雜交水平高于所述探針與其它相對非同源多核苷酸的非特異雜交，如果多核苷酸探針獲得自cDNA文庫則特定為其它cDNAs。雜交水平通過標(biāo)記探針產(chǎn)生的信號來測量。能選擇性雜交的多核苷酸和探針間相互作用產(chǎn)生的信號水平一般是10倍，優(yōu)選100倍，比探針與其它產(chǎn)生“背景嘈音”的多核苷酸間相互作用強。選擇性雜交一般用正常雜交和沖洗條件獲得(雜交所用緩沖液在約50-60℃含至少5×SSC和1％SDS，用0.1％SDS連續(xù)洗，SSC濃度從2×SSC逐步下降到0.4×SSC且溫度從20℃上升到50℃)，優(yōu)選嚴(yán)格或非常嚴(yán)格的雜交和沖洗條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能調(diào)節(jié)雜交條件，即本質(zhì)上是用于雜交和沖洗步驟的溫度和緩沖液鹽濃度。這些條件應(yīng)特定調(diào)節(jié)為所用探針長度和用此探針篩選的文庫中所存在多核苷酸同一性程度的函數(shù)。需要調(diào)節(jié)雜交條件以最優(yōu)化雜交的同源序列產(chǎn)生的信號，而同時最小化背景嘈音。
能與根據(jù)發(fā)明的多核苷酸選擇性雜交的多核苷酸可分離自產(chǎn)生的基因組文庫或cDNA文庫，例如來自真菌菌株，尤其是青霉屬菌株如繩狀青霉IMI 134756菌株。分離這種多核苷酸可通過標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)完成(Sambrook等，1989，《分子克隆實驗室手冊》，第2版，Nolan C.編，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press)，使用的探針是編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸、這些多核苷酸片段或其互補多核苷酸。當(dāng)多核苷酸通過這些技術(shù)分離時，需要確定其序列和鑒定此多核苷酸編碼蛋白質(zhì)的性質(zhì)，特定用于證明此蛋白質(zhì)相當(dāng)于序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示的肌醇六磷酸酶。
因此上述雜交技術(shù)能分離的多核苷酸與編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸同源。這些多核苷酸和它們編碼的肌醇六磷酸酶容易由生物技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員鑒定，他們掌握標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)。因此發(fā)明包括的多核苷酸與編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸同源。有利的是，同源多核苷酸相對編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸的同一性程度至少為45％，優(yōu)選至少50％、至少70％、至少80％，更優(yōu)選至少90％，優(yōu)選至少95％。測量和鑒定序列間同一性程度的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。可使用例如程序PILEUP、BLAST(尤其是Altschul等，1993，J.Mol.Evol.36290-300；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-10)或BestFit(Wisconsin序列分析包，Unix版本8，Genetics Computer Group，University Research Park，575 ScienceDrive，Madison，WI 5371l，用《應(yīng)用數(shù)學(xué)》(Applied Mathematics)，1981，2號，482-489所述Smith和Waterman算法)。
這些同源多核苷酸也可通過常規(guī)突變技術(shù)人工獲得。
編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的優(yōu)選多核苷酸選自序列標(biāo)識符SEQ ID NOl和SEQ ID NO2所示序列。
作為同源多核苷酸的例子，提到序列標(biāo)識符SEQ ID NO4所示多核苷酸。
根據(jù)發(fā)明的特定實施方案，上述編碼肌醇六磷酸酶的多核苷酸來源自青霉屬真菌。根據(jù)特定實施方案，它們源自青霉屬CBS 109899菌株或來自繩狀青霉IMI134756菌株。
根據(jù)發(fā)明的特定實施方案，依照發(fā)明的多核苷酸所編碼的肌醇六磷酸酶具有下列性質(zhì)(a)最適溫度＝50℃(b)最適pH＝4-5(c)Km＝550μm本發(fā)明也涉及上述多核苷酸片段。術(shù)語“片段”特定指至少20個核苷酸的片段，特定至少50個核苷酸，優(yōu)選至少100個核苷酸。這些片段一般命名為寡核苷酸。它們可用作雜交探針以鑒定同源多核苷酸，或作為引物通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)鑒定和擴(kuò)增這些同源多核苷酸，PCR描述于Ausubel等，(1987)《分子生物的當(dāng)前操作》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley&Sons編，6.3-6.4節(jié)。
術(shù)語“片段”也指根據(jù)發(fā)明的多核苷酸片段，它編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶片段或與序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶同源或相當(dāng)?shù)募〈剂姿崦钙巍?br>
本發(fā)明也涉及的多核苷酸包含至少一種上述多核苷酸。
所有上述多核苷酸編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶或同源肌醇六磷酸酶或者這些肌醇六磷酸酶的活性片段。因此，發(fā)明延伸到所有這些多核苷酸編碼的全部肌醇六磷酸酶。此定義因而包括序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶、與此肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶和這些肌醇六磷酸酶的活性片段。
根據(jù)發(fā)明的優(yōu)選實施方案，肌醇六磷酸酶是一種蛋白質(zhì)，包括至少序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肽序列。
因此發(fā)明也包括與序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶。根據(jù)發(fā)明，術(shù)語“同源肌醇六磷酸酶”指肌醇六磷酸酶的序列相對序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶有修飾。像同源多核苷酸，同源肌醇六磷酸酶的肽序列表現(xiàn)出一定程度同一性，同一性程度一般由相同氨基酸百分比表示。因此發(fā)明涵蓋的肌醇六磷酸酶相對序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶具有一個或多個序列修飾，其性質(zhì)相當(dāng)于序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的性質(zhì)。這些修飾可以是加入、缺失或取代天然或常規(guī)突變技術(shù)獲得的氨基酸。有利的是，同源肌醇六磷酸酶相對序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的同一性程度至少為35％，優(yōu)選至少50％、至少70％、至少80％，更優(yōu)選至少90％，優(yōu)選至少95％。測量和鑒定序列間同一性程度的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的?？墒褂美绯绦騊ILEUP、BLAST(尤其是Altschul等，1993，J.Mol.Evol.36290-300；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-10)或BestFit(Wisconsin序列分析包，Unix版本8，Genetics Computer Group，University Research Park，575 ScienceDrive，Madison，WI 53711，用《應(yīng)用數(shù)學(xué)》，1981，2號，482-489所述Smith和Waterman算法)。
作為與序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶同源的多核苷酸例子，提到序列標(biāo)識符SEQ ID NO4所示多核苷酸編碼的肌醇六磷酸酶。
根據(jù)發(fā)明的特定實施方案，依照發(fā)明的肌醇六磷酸酶來源自青霉屬真菌。
根據(jù)發(fā)明的特定實施方案，肌醇六磷酸酶具有下列性質(zhì)(a)適溫度＝50℃(b)最適pH＝4-5(c)Km＝550μm發(fā)明也延伸到序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的片段和同源肌醇六磷酸酶的片段。術(shù)語“片段”本質(zhì)上指生物活性片段，即片段具有的肌醇六磷酸酶活性相當(dāng)于完全肌醇六磷酸酶，用實施例2所述測定或類似測定測量。
本發(fā)明也涉及的嵌合基因包括至少一個在宿主生物中有功能的啟動子、根據(jù)發(fā)明編碼肌醇六磷酸酶的多核苷酸、在相同宿主生物中有功能的終止元件，它們彼此功能相聯(lián)。一般基因可包含的多種元件首選是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)成熟的元件，如啟動子、編碼信號肽或轉(zhuǎn)運肽的序列、或構(gòu)成聚腺苷酸信號的終止元件，其次是編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸。表達(dá)“彼此功能相聯(lián)”指所述嵌合基因的元件彼此相聯(lián)從而這些元件中一個的功能受另一個影響。作為例子，當(dāng)啟動子能影響所述編碼序列表達(dá)時，啟動子與編碼序列功能相聯(lián)。根據(jù)發(fā)明的嵌合基因構(gòu)建和其多種元件集合可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)完成，特定描述于Sambrook等(1989，《分子克隆實驗室手冊》，第2版，Nolan C.編，New YorkCold Spring HarborLaboratory Press)。選擇構(gòu)成嵌合基因的調(diào)節(jié)元件本質(zhì)上取決于它們在其中必須發(fā)揮功能的宿主生物，本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇在特定宿主生物中有功能的調(diào)節(jié)元件。術(shù)語“有功能”指能在特定宿主生物中發(fā)揮功能。
嵌合基因根據(jù)發(fā)明可包含的啟動子是組成型或可誘導(dǎo)的。作為例子，用于在細(xì)菌中表達(dá)的啟動子可選擇自下述啟動子。為在大腸桿菌中表達(dá)，提到lac、trp、lpp、phoA、recA、araBAD、proU、cst-1、tetA、cadA、nar、tac、trc、lpp-lac、Psyn、cspA、PL、PL-9G-50、PR-PL、T7、λPL-PT7、T3-lac、T5-lac、T4基因32、nprM-lac、VHb和蛋白A啟動子(Makrides，1996，《生物技術(shù)的當(dāng)前觀點》(Current Opinionsin Biotechnology 7494-499)或其它Ptrp啟動子(WO 99/64607)。為在革蘭氏陽性細(xì)菌如棒狀桿菌或鏈霉菌中表達(dá)，提到PtipA(Holmes等，1993，EMBO J.123183-3191)或PS1和PS2(FR91/09870)啟動子或?qū)＠暾圗P0629699A2所述啟動子。為在酵母和真菌中表達(dá)，提到K.lactis PLAC4啟動子(Van den Berg等，1990，Bio/Technology8135-139)或K.lactis Ppgk啟動子(專利申請F(tuán)R91/05294)、木霉菌(Trichoderma)tef1或cbh1啟動子(WO 94/04673)、青霉菌his、csl或apf啟動子(WO 00/68401)以及曲霉菌gla啟動子(Gwynne等，1987，Bio/Technology 5713-719)。
嵌合基因也包括編碼信號肽或轉(zhuǎn)運肽的亞細(xì)胞定位序列。這種序列位于編碼肌醇六磷酸酶的多核苷酸上游或下游，能指導(dǎo)所述肌醇六磷酸酶特異進(jìn)入宿主生物的細(xì)胞區(qū)室，或指導(dǎo)它分泌入胞外空間。例如，嵌合基因可包括編碼信號肽或轉(zhuǎn)運肽的序列，用于指導(dǎo)肌醇六磷酸酶趨向特定細(xì)胞質(zhì)區(qū)室，如線粒體、體(plasts)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或液泡。定位序列優(yōu)選編碼的信號肽使肌醇六磷酸酶定位到非原質(zhì)體或胞外基質(zhì)。
根據(jù)實施方案，轉(zhuǎn)運肽可以是葉綠體、液泡或線粒體定位信號，信號隨后在葉綠體、液泡或線粒體中裂解。這些肽廣泛描述于文獻(xiàn)中Neuhaus和Rodgers，1998，Plant Molecular Biology 38127-144；專利USP 5188642所述EPSPS轉(zhuǎn)運肽；核酮糖-二羧化酶/氧化酶小亞基轉(zhuǎn)運肽(EP 189707)。
根據(jù)另一個實施方案，轉(zhuǎn)運肽可由信號肽組成，用于定位到細(xì)菌周質(zhì)如pac(Schumacher等，1986，Nucl.Acids.Res.145713-5727)、ompA(Bowden和Georgiou，1990，J.Biol.Chem.26516761-16766)和phoA(Chang等，1986，Gene 44121-124)基因，或由細(xì)菌表面錨定肽組成，如PS1和PS2基因(FR91/09870)。
轉(zhuǎn)運肽可以是單或雙肽。雙轉(zhuǎn)運肽任選由中間序列分開。作為葉綠體轉(zhuǎn)運肽的例子，提到的雙轉(zhuǎn)運肽在轉(zhuǎn)錄方向包括編碼植物基因轉(zhuǎn)運肽的序列，植物基因編碼定位于質(zhì)體的酶、來自植物基因成熟N-末端部分的序列部分，植物基因編碼定位于質(zhì)體的酶、以及編碼植物基因第2個轉(zhuǎn)運肽的序列，植物基因編碼定位于質(zhì)體的酶。例如，適當(dāng)雙葉綠體轉(zhuǎn)運肽描述于專利申請EP 0 508 909。
根據(jù)實施方案，轉(zhuǎn)運肽可包括多種元件，用于增加感興趣蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基的量。因此提到載體蛋白結(jié)合與感興趣蛋白質(zhì)融合的蛋白裂解位點(USP 6130063)。
根據(jù)發(fā)明，嵌合基因也包括其它調(diào)節(jié)序列，序列位于啟動子和編碼序列間，如轉(zhuǎn)錄活化子(增強子)。
本發(fā)明也涉及克隆、表達(dá)和/或轉(zhuǎn)化載體，載體包括根據(jù)發(fā)明的嵌合基因。根據(jù)發(fā)明的載體用于轉(zhuǎn)化的宿主生物和在此生物體中表達(dá)肌醇六磷酸酶。載體可以是質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒。根據(jù)發(fā)明的轉(zhuǎn)化載體優(yōu)選是質(zhì)粒。一般，此載體的主要性質(zhì)應(yīng)該是在宿主生物細(xì)胞中維持本身和自我復(fù)制的能力，特定通過存在復(fù)制起點以表達(dá)肌醇六磷酸酶。為穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主生物，載體也可整合到基因組。載體組成隨后限制到在宿主中合成肌醇六磷酸酶所需的元件。選擇這種載體以及根據(jù)發(fā)明將嵌合基因插入此載體的技術(shù)充分描述于Sambrook等(1989，《分子克隆實驗室手冊》，第2版，Nolan C.編，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press)且是本領(lǐng)域技術(shù)人員常識的一部分。有利的是，除了根據(jù)發(fā)明的嵌合基因，本發(fā)明所用載體也包含編碼可選擇標(biāo)記的嵌合基因。此可選擇標(biāo)記能選擇有效轉(zhuǎn)化的宿主生物，即接納載體的生物體。在能使用的可選擇標(biāo)記中，提到的標(biāo)記含抗生素或殺真菌劑抗性的基因，例如潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Gritz等，1983，Gene25179-188；Punt等，1987；Gene 56117-24)、編碼賦予腐草霉素抗性的多肽的鏈絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶、賦予苯菌靈抗性的突變β-微管蛋白(Gold等，1994，Gene142225-30)或bialaphos乙酰轉(zhuǎn)移酶(Avalos等，1989，Curr.Genet，16369-72)。其它標(biāo)記可以是與營養(yǎng)缺陷型互補的基因，如pyrA、pyrB、pyrG、pyr4(Buxton和Radford，1983，Mol.Gen.Genet.190403-405)、arg4、arg B(Berse等，1983，Gene25109-117)和trpC(Goosen等，1989，Mol.Gen.Genet.219282-88)基因、molybdopterin合酶基因(Appleyard等，1998，J Biol Chem 27314869-76；Unkles等，1999；J BiolChem 27419286-93)或乙酰胺酶(Beri和Turner，1987，Curt Genet 11639-41)。另一類可選擇標(biāo)記由耐受除草劑的基因組成，如bar基因(White等，NAR 181062，1990)用于bialaphos耐性、EPSPS基因(US 5,188,642)用于草甘膦耐性、HPPD基因(WO 96/38567)用于異唑耐性或草甘膦氧化還原酶基因(US5463175)。也提到的基因編碼易鑒定酶如GUS酶，或者基因編碼色素或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中色素生成的酶。這種可選擇標(biāo)記基因特定描述于專利申請WO 91/02071、WO 95/06128、WO96/38567和WO 97/04103。
本發(fā)明也涉及根據(jù)發(fā)明含至少一種嵌合基因的轉(zhuǎn)化的宿主生物，嵌合基因整合到宿主基因組或在染色體外遺傳元件上，如質(zhì)粒。術(shù)語“宿主生物”指任何較低或較高的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體，其中導(dǎo)入根據(jù)發(fā)明的嵌合基因以制造依照發(fā)明的肌醇六磷酸酶。宿主生物優(yōu)選微生物，尤其是真菌，例如青霉屬、曲霉屬、金孢霉菌屬(Chrysosporium)或木霉菌屬，細(xì)菌例如埃希氏菌屬，尤其是大腸桿菌、棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬或鏈霉菌屬，酵母，尤其是酵母、克魯維酵母(Kluyveromyces)或畢赤酵母屬，桿狀病毒或植物細(xì)胞。宿主生物也可以是植物或植物的一部分。
表達(dá)“轉(zhuǎn)化的宿主生物”所指宿主生物將至少一個根據(jù)發(fā)明的嵌合基因摻入其基因組或在染色體外遺傳元件中，例如質(zhì)粒，從而在其組織或培養(yǎng)基中制造肌醇六磷酸酶。為獲得根據(jù)發(fā)明的宿主生物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用許多已知的轉(zhuǎn)化方法。
這些方法之一是使待轉(zhuǎn)化的宿主生物的細(xì)胞或組織接觸聚乙二醇(PEG)和根據(jù)發(fā)明的載體(Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168(1)，111-115；Mercenier和Chassy，1988，Biochimie 70(4)，503-517)。電穿孔是另一種方法，使待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織以及發(fā)明的載體接觸電場(Andreason和Evans，1988，Aust.J.Biotechnol.3(1)，56-62)。另外一種方法是通過微注射將載體直接注入細(xì)胞或組織(Gordon和Ruddle，1985，Gene 33(2)，121-136)。有利的是，可使用“生物射彈(biolistic)”法。它用粒子轟擊細(xì)胞或組織，粒子上吸收有發(fā)明的載體(Bruce等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(24)，9692-9696；Klein等，1992，Biotechnology10(3)，286-291；美國專利號4,945,050)。
一些轉(zhuǎn)化細(xì)菌的方法描述于大腸桿菌和其它革蘭氏陰性細(xì)菌的文獻(xiàn)中(Ausubel等，1995，《分子生物的當(dāng)前操作》，John Wiley和Sons，New York；Inoue等，1990，Gene 9623-28；Chung等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862172-2175)。也可使用接合(Cameron等，1989，J.Bacteriol.，171547-557)。對于革蘭氏陽性細(xì)菌，可使用電穿孔以及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，特定用于鏈霉菌屬細(xì)菌(Bonamy等，1990，F(xiàn)EMSMicrobio.Lett 66263-270；Hopwood等，1985，《鏈霉菌的遺傳操作實驗室手冊》(Genetic Manipulation of StreptomycesA Laboratory Manual)，John Innes Foundation，Norwich)。
一些轉(zhuǎn)化真菌的方法也描述于文獻(xiàn)中(Talbot，2001，《絲狀真菌的分子和細(xì)胞生物》(Molecular and cellular biology of filamentous fungi)，Oxford University Press，New York)。用PEG轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體描述于EP 0260762，它用于曲霉菌，適于繩狀青霉的此方法描述于WO 00/36120。同樣已知的轉(zhuǎn)化是通過調(diào)節(jié)整合的限制性酶或REMI(Sanchez等，1998，Mol.Gen.Genet.25889-94)，也已知用農(nóng)桿菌(Agrobacterium)屬細(xì)菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(de Groot等，1998，Nature Biotechnology16839-842)。轉(zhuǎn)化酵母的技術(shù)也描述于文獻(xiàn)中，尤其是Ausubel等(1995，《分子生物的當(dāng)前操作》，John Wiley和Sons，New York)和Van den Berg等(1990，Bio/Technolgy 8135-139)。
在特定情況中，當(dāng)待轉(zhuǎn)化的宿主生物是植物來源時，植物細(xì)胞或組織優(yōu)選用農(nóng)桿菌屬細(xì)菌轉(zhuǎn)化，優(yōu)選用根瘤農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)(Knopf，1979，Subcell.Biochem.6，143-173；Shaw等，1983，Gene 23(3)315-330)或毛根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)(Bevan和Chilton，1982，Annu.Rev.Genet.16357-384；Tepfer和Casse-Delbart，1987，Microbiol.Sci.4(1)，24-28)感染所述植物的細(xì)胞或組織。優(yōu)選的是，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織是根據(jù)Ishida等(1996，Nat.Biotechnol.14(6)，745-750)所述操作完成。本領(lǐng)域技術(shù)人員會選擇適當(dāng)方法，這取決于待轉(zhuǎn)化的宿主生物性質(zhì)。
本發(fā)明也涉及制造具肌醇六磷酸酶活性的提取物的方法。根據(jù)發(fā)明的一個實施方案，此方法包括步驟(a)在可表達(dá)所述肌醇六磷酸酶的條件下培養(yǎng)一種生物體，所述生物體基因組中天然具有根據(jù)發(fā)明的多核苷酸(b)濃縮步驟(a)中培養(yǎng)的生物體(c)破裂步驟(b)中分離的生物體細(xì)胞(d)離心步驟(c)中獲得的破裂細(xì)胞提取物(e)回收從步驟(d)獲得的具肌醇六磷酸酶活性的上清。
步驟(c)可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)完成，如機(jī)械碾磨(通過壓力差異、超聲波作用、研碎)、酶裂解或滲壓震擾，所述技術(shù)能單獨或組合使用。
本方法也可用于制造根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶，這是通過加入另一個純化的步驟(f)。用于制造根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶的步驟(f)方法是從步驟(e)回收的上清中純化肌醇六磷酸酶。純化肌醇六磷酸酶可通過任何濃縮或分離蛋白質(zhì)的技術(shù)完成，尤其是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的微濾、超濾、電泳或?qū)游黾夹g(shù)。為獲得純化肌醇六磷酸酶，本領(lǐng)域技術(shù)人員能使用上述方法測量肌醇六磷酸酶活性以鑒定含所述肌醇六磷酸酶的純化部分。根據(jù)此方法，制造的肌醇六磷酸酶可具有的純度優(yōu)選為50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或有利的100％。
根據(jù)依照發(fā)明的方法的另一個實施方案，尤其是當(dāng)根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶分泌到培養(yǎng)基時，所述方法包括以下步驟(a)在可表達(dá)所述肌醇六磷酸酶的條件下培養(yǎng)一種生物體，所述生物體具有根據(jù)發(fā)明的多核苷酸(b)通過去除所述生物體來回收培養(yǎng)基。
表達(dá)“基因組中天然具有根據(jù)發(fā)明的多核苷酸的生物體”指任何生物體，其基因組在天然狀態(tài)具有編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸或同源多核苷酸。
根據(jù)上述方法的另一個實施方案，所述生物體是微生物。根據(jù)一個特定實施方案，所述微生物是真菌，尤其是青霉屬真菌，特別是青霉屬CBS 109899菌株。
根據(jù)這些方法，生物體在適于產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。所述生物體尤其是微生物時，特別是真菌，可培養(yǎng)于Erlenmeyer搖瓶、實驗室規(guī)模的發(fā)酵罐或工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵罐(成批發(fā)酵、補料分批發(fā)酵或在固體培養(yǎng)基下發(fā)酵)。所用培養(yǎng)基應(yīng)包含碳和氮源以及無機(jī)鹽。在發(fā)明的特定實施方案中，使用青霉屬CBS 109899菌株作為生物體，存在或缺乏肌醇六磷酸鹽時獲得肌醇六磷酸酶的表達(dá)(作為例子，肌醇六磷酸鹽可以是Na+鹽、Ca++鹽或Ca++和Mg++鹽的組合)。pH可被控制(優(yōu)選pH3或4)或不控制。
根據(jù)此方法，通過去除所述生物體來回收培養(yǎng)基的步驟可用任何分離液體部分中所含固體部分的方法完成。特定的是，過濾和離心是完成此步驟的適當(dāng)方法。
本方法也可用于產(chǎn)生根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶，這是通過加入另一個純化的步驟(c)。用于產(chǎn)生根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶的步驟(c)方法是從步驟(b)回收的上清中純化肌醇六磷酸酶。純化肌醇六磷酸酶可用任何濃縮或分離蛋白質(zhì)的技術(shù)，尤其是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的微濾、超濾、電泳或?qū)游黾夹g(shù)。為獲得純化肌醇六磷酸酶，本領(lǐng)域技術(shù)人員能使用上述方法測量肌醇六磷酸酶活性以鑒定含所述肌醇六磷酸酶的純化部分。根據(jù)此方法，產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶可具有的純度優(yōu)選為50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或有利的100％。
根據(jù)發(fā)明的另一個實施方案，制造具肌醇六磷酸酶活性的提取物的方法使用根據(jù)發(fā)明的宿主生物，包括步驟(a)培養(yǎng)根據(jù)發(fā)明的轉(zhuǎn)化的宿主生物(b)濃縮步驟(a)中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化的宿主生物(c)破裂步驟(b)中分離的生物體細(xì)胞(d)離心步驟(c)中獲得的破裂細(xì)胞提取物(e)回收從步驟(d)獲得的具肌醇六磷酸酶活性的上清。
步驟(c)可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)完成，如機(jī)械碾磨(通過壓力差異、超聲波作用、研碎)、酶裂解或滲壓震擾，所述技術(shù)能單獨或組合使用。
本方法也可用于產(chǎn)生根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶，這是通過加入另一個純化的步驟(f)。用于產(chǎn)生根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶的步驟(f)方法是從步驟(e)回收的上清中純化肌醇六磷酸酶。純化肌醇六磷酸酶可通過任何濃縮或分離蛋白質(zhì)的技術(shù)完成，尤其是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的微濾、超濾、電泳或?qū)游黾夹g(shù)。為獲得純化肌醇六磷酸酶，本領(lǐng)域技術(shù)人員能使用上述方法測量肌醇六磷酸酶活性以鑒定含所述肌醇六磷酸酶的純化部分。根據(jù)此方法，產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶可具有的純度優(yōu)選為50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或有利的100％。
此方法所用轉(zhuǎn)化的宿主生物優(yōu)選是微生物。特定的是，所述微生物可以是真菌，例如青霉屬、曲霉屬、金孢霉菌屬或木霉菌屬，細(xì)菌例如埃希氏菌屬，尤其是大腸桿菌、棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬或鏈霉菌屬，酵母，尤其是酵母、克魯維酵母或畢赤酵母屬，桿狀病毒或植物細(xì)胞。
根據(jù)發(fā)明的另一個實施方案，尤其是當(dāng)根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶分泌到培養(yǎng)基時，此方法包括步驟(a)培養(yǎng)根據(jù)發(fā)明的轉(zhuǎn)化的宿主生物。
(b)通過去除所述轉(zhuǎn)化的宿主生物來回收培養(yǎng)基。
根據(jù)這些方法，生物體在適于產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。所述生物體尤其是微生物時，特別是真菌，可培養(yǎng)于Erlenmeyer搖瓶、實驗室規(guī)模的發(fā)酵罐或工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵罐(成批發(fā)酵、補料分批發(fā)酵或在固體培養(yǎng)基上發(fā)酵)。所用培養(yǎng)基應(yīng)包含碳和氮源以及無機(jī)鹽。
根據(jù)此方法，通過去除轉(zhuǎn)化的宿主生物來回收培養(yǎng)基的步驟可用任何分離液體部分中所含固體部分的方法完成。特定的是，過濾和離心是完成此步驟的適當(dāng)方法。
本方法也可用于產(chǎn)生根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶，這是通過加入另一個純化的步驟(c)。用于產(chǎn)生根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶的步驟(c)方法是從步驟(b)回收的上清中純化肌醇六磷酸酶。純化肌醇六磷酸酶可用任何濃縮或分離蛋白質(zhì)的技術(shù)，尤其是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的微濾、超濾、電泳或?qū)游黾夹g(shù)。為獲得純化肌醇六磷酸酶，本領(lǐng)域技術(shù)人員能使用上述方法測量肌醇六磷酸酶活性以鑒定含所述肌醇六磷酸酶的純化部分。根據(jù)此方法，產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶可具有的純度優(yōu)選為50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或有利的100％。
本發(fā)明也涉及酶組合物，包括至少一種根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶。
術(shù)語“酶組合物”所指組合物包含至少一種根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶，肌醇六磷酸酶可以不同的比例，這取決于它是否結(jié)合促進(jìn)其穩(wěn)定性和保守性的不同佐劑。作為根據(jù)發(fā)明的酶組合物中所用佐劑例子，提到山梨糖醇、甘露醇、安息香酸鹽、無機(jī)鹽或植物油。根據(jù)發(fā)明的酶組合物可以是液體形式，所述組合物和它所含肌醇六磷酸酶隨后在水溶液中或以固體形式，所述組合物和它所含肌醇六磷酸酶之后以粉末形式被凍干。
根據(jù)發(fā)明的一個特定實施方案，除了根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶，酶組合物包含至少一種另外的酶。此另外的酶可具有肌醇六磷酸酶活性或除了肌醇六磷酸酶活性的活性。當(dāng)此另外的酶具有肌醇六磷酸酶活性時，所述肌醇六磷酸酶活性優(yōu)選與根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶活性不同且互補。當(dāng)此另外的酶具有除了肌醇六磷酸酶活性的活性時，它可例如具有木聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、昆布多糖酶、阿魏酸酯酶、支鏈淀粉酶、蛋白酶、酰胺酶、磷酸酶或甘露聚糖酶活性。
優(yōu)選的是，所述酶組合物要摻入家畜動物的飼料中，尤其是單胃動物，優(yōu)選豬或家禽。
本發(fā)明也涉及的飼料組合物包含至少一種根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶。
術(shù)語“飼料組合物”本質(zhì)上指用于家畜動物的飼料，尤其是單胃動物，優(yōu)選豬或家禽。根據(jù)發(fā)明的飼料組合物是用于家畜動物的理想飼料，添加有根據(jù)發(fā)明的酶組合物。因此根據(jù)發(fā)明的飼料組合物是家畜動物的飼料，加入至少一種根據(jù)發(fā)明的酶組合物，混合所述飼料和所述酶組合物以獲得所述飼料組合物。
根據(jù)發(fā)明的一個特定實施方案，所述飼料組合物包含至少一種根據(jù)發(fā)明的轉(zhuǎn)化的宿主生物。根據(jù)發(fā)明的另一個特定實施方案，所述飼料組合物包含至少一種具有根據(jù)發(fā)明的多核苷酸的生物體，尤其是至少一種青霉屬的一種真菌，特別是青霉屬CBS 109899菌株的真菌。
有利的是，根據(jù)發(fā)明的飼料組合物用于單胃動物營養(yǎng)物。根據(jù)發(fā)明的一個特定實施方案，所述飼料組合物用于豬營養(yǎng)物。根據(jù)發(fā)明的另一個特定實施方案，所述飼料組合物用于家禽營養(yǎng)物。
本發(fā)明的一個主題也是產(chǎn)生上述飼料組合物的方法。
根據(jù)發(fā)明的一個特定實施方案，所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)發(fā)明的宿主生物或具有根據(jù)發(fā)明的多核苷酸的生物體，尤其是真菌，更確切是青霉屬真菌，特別是青霉屬CBS 109899菌株，用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知濃縮方法來濃縮所述生物體，尤其是過濾或離心，隨后將所述濃縮的生物體摻入飼料組合物。
根據(jù)發(fā)明的另一個特定實施方案，所述方法包括制造具肌醇六磷酸酶活性的提取物或根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶，通過上述產(chǎn)生所述提取物或所述肌醇六磷酸酶的方法之一，隨后將生成的所述提取物或所述肌醇六磷酸酶摻入飼料組合物。
本發(fā)明也涉及的方法用于增加單胃動物吸收以植物為基礎(chǔ)飼料的肌醇六磷酸中所含無機(jī)磷酸鹽，其中肌醇六磷酸酶或根據(jù)發(fā)明的酶組合物摻入所述動物營養(yǎng)物中。在所述方法中，所述單胃動物優(yōu)選用根據(jù)發(fā)明的飼料組合物喂養(yǎng)。
本發(fā)明也涉及的方法用于減少單胃動物營養(yǎng)物中磷的加入，其中所述動物用根據(jù)發(fā)明的飼料組合物喂養(yǎng)。
本發(fā)明也涉及的方法用于減少來自單胃動物營養(yǎng)物的磷釋放，其中所述動物用根據(jù)發(fā)明的飼料組合物喂養(yǎng)。
本發(fā)明也涉及青霉屬的絲狀真菌，保藏號CBS 109899。
下面的例子能闡述本發(fā)明，然而不限制其范圍。
實施例1青霉屬CBS 109899菌株的特征和培養(yǎng)1.1特征在PDA瓊脂培養(yǎng)基上(24g/l馬鈴薯右旋糖肉湯，16g/l瓊脂-瓊脂)，CBS 109899菌株的菌絲體在30℃生長，老化時顏色變黃。在柱外圍觀察到氣生菌絲體，沒有青霉菌的結(jié)構(gòu)特征。真菌在28℃培養(yǎng)于MN-Uri液體培養(yǎng)基后(P.J.Punt和C.A.M.J.J.van den Hondel，(1992)《酶學(xué)中的方法》(Methods in Enzymology)216，447-457)，振蕩2天，菌絲體通過過濾和在液氮中碾磨來回收?；蚪MDNA提取通過本領(lǐng)域技術(shù)員人員熟知的酚-氯仿方法完成，1g碾磨物質(zhì)在5ml裂解緩沖液中(1％SDS、2％Triton X-100、100mM NaCl、lmM EDTA、10mM Tris，pH8.0)。純化后，基因組DNA通過加入2體積乙醇來沉淀。用高保真聚合酶和引物PN3(SEQ ID NO5)及PN4(SEQ ID NO6)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能獲得1175bp片段，此片段被測序(SEQ IDNO7)。
PN35’-CCGTTGGTAACCAGCGGAGGGATC-3’PN45’-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3’將此內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列與數(shù)據(jù)庫中可用的ITS序列排列顯示與鑒定為青霉菌aculeatum的ITS序列有96％的同一性且與繩狀青霉IMI 134756的ITS序列有96％的同一性。因此CBS 109899菌株被命名為青霉屬。
1.2培養(yǎng)條件確定培養(yǎng)CBS 109899菌株的合成培養(yǎng)基。它包括軟化水中的10g/l葡萄糖、0.1M NH4NO3、1.5g/l KH2PO4、0.5g/l KCl、0.5g/l MgSO4、10mg/l MnCl2、10mg/lZnSO4和10mg/l FeSO4。為表達(dá)肌醇六磷酸酶，取自PDA培養(yǎng)基上生長集落的1cm2菌絲體樣品在30ml MSP3培養(yǎng)基(10g/l葡萄糖、NaNO3、20g/l肌醇六磷酸鈣、0.5g/l KCl、0.5g/l MgSO4、2.2mg/l ZnSO4、1.1mg/l H3BO3、0.5mg/l MnCl2、0.5mg/lFeSO4、0.17mg/l CaCl2、0.16mg/l CuSO4、0.15mg/l Na2MoO4和5mg/l Na2EDTA)中30℃振蕩培養(yǎng)7天。培養(yǎng)物以5000rpm離心10分鐘且上清如實施例2所述分析。
實施例2測量肌醇六磷酸酶活性測量肌醇六磷酸酶活性以Shimizu方法為基礎(chǔ)(1992，Biosci.Biotech.Biochem.56(8)，1266-1269)。此方法的原理包括在肌醇六磷酸酶與其底物的酶反應(yīng)中測量釋放的無機(jī)磷酸鹽量(肌醇六磷酸鈉溶液在250nM醋酸緩沖液中以10g/l制備，緩沖液含1mM CaCl2，pH5.5)。釋放的無機(jī)磷酸鹽量通過此磷酸鹽與顯色試劑反應(yīng)來測量(1體積10.8％的硫酸鐵與4體積在0.012M H2SO4的鉬酸銨當(dāng)場混合)。此反應(yīng)在高酸性介質(zhì)中導(dǎo)致有色磷鉬酸鹽復(fù)合體的形成(在Fe2+存在時)，通過在分光光度計上測量產(chǎn)生的有色溶液在700nm的吸光率來定量所形成復(fù)合體的量。
三種反應(yīng)平行進(jìn)行以在37℃產(chǎn)生10、20和30分鐘的酶動力學(xué)。酶反應(yīng)通過加入2.5ml 20％三氯乙酸來終止。確定樣品干擾通過加入20％三氯乙酸和隨后的肌醇六磷酸到粗提取物，粗提取物可以稀釋或不稀釋。酶反應(yīng)的空白用250mM醋酸緩沖液制備，緩沖液含1mM CaCl2，pH5.5。反應(yīng)終止后，釋放的磷酸鹽量通過加入相同體積有色試劑來顯示[1體積FeSO4·7H2O+4體積鉬酸銨溶液]。藍(lán)色強度通過分光光度計在700nm測量。它涉及磷酸鹽濃度，使用的KH2PO4范圍在0和1mM間。酶活性用酶動力學(xué)進(jìn)程中磷酸鹽的出現(xiàn)速度來確定。
實施例3分離含肌醇六磷酸酶活性的真菌提取物CBS 109899菌株以錐形燒瓶規(guī)模培養(yǎng)，在3-200升的發(fā)酵罐中30℃ 6-8天。生成培養(yǎng)基包括10g/l葡萄糖、40g/l淀粉、25g/l米糠、20g/l Ca2+肌醇六磷酸、15g/l氯化銨、0.5g/l硫酸銨和0.9g/l防沫劑。pH調(diào)節(jié)到5.5，但它在發(fā)酵中不受控制。4％的接種體用于起始發(fā)酵。此接種體對應(yīng)于30℃ 3-4天的培養(yǎng)物，包括10g/l葡萄糖、10g/l蛋白胨、5g/l Na-CMC、0.5g/l硫酸鎂、0.5g/l氯化鈣、0.01g/lFeSO4·7H2O和0.01g/l MnSO4·4H2O。接種體直接用上面培養(yǎng)真菌的孢子或瓊脂塊(PDA培養(yǎng)基，30℃ 10天)接種。它也可自身用相同條件下制備的3-到4-天培養(yǎng)物接種。
發(fā)酵結(jié)束后，過濾全部的培養(yǎng)物且過濾物通過超濾經(jīng)有機(jī)或無機(jī)膜濃縮，膜的截止為10kDa?；钚栽诔瑸V滯留物樣品上確定且涉及起始發(fā)酵體積。
表1發(fā)酵結(jié)束后獲得的活性作為發(fā)酵體積的函數(shù)
實施例4根據(jù)發(fā)明的分離肌醇六磷酸酶的特征確定所提供粗真菌提取物的最適pH和最適溫度、對pH和溫度的穩(wěn)定性以及米氏常數(shù)，使用實施例2所述方法。
4.1米氏常數(shù)Michaelis-Menten常數(shù)(Kmapp)和最大反應(yīng)速度(Vmapp)通過修改底物濃度和孵育時間來獲得。確定真菌提取物中所含肌醇六磷酸酶的特征是通過550μM Kmapp和1.425μmol Vmapp的每分鐘和每mg樣品所釋放磷酸鹽。
4.2肌醇六磷酸酶活性作為pH的函數(shù)最適pH通過修改反應(yīng)緩沖液的pH和/或性質(zhì)(在pH 2KCl-HCl緩沖液；在pH3甘氨酸-HCl緩沖液；在pH 4、5、5.5和6乙酸鈉緩沖液；在pH 7Tris-HCl緩沖液)。圖1給出的結(jié)果顯示關(guān)于所得最大酶活性計算的相對活性。在37℃測量時，真菌提取物中所含肌醇六磷酸酶的最適pH在pH4和pH5間。
4.3肌醇六磷酸酶活性作為溫度的函數(shù)最適溫度通過修改酶反應(yīng)的孵育時間來獲得。圖2給出的所得數(shù)據(jù)顯示關(guān)于確定最大酶活性計算的相對活性。在pH5.5時，真菌提取物中所含肌醇六磷酸酶的最適溫度在50℃區(qū)域。
4.4肌醇六磷酸酶的穩(wěn)定性作為pH的函數(shù)評估肌醇六磷酸酶活性對酸性pHs的抗性。提取物在41℃暴露于pH2和pH6.5間的pHs 0到180分鐘后，溶液的pH通過稀釋穩(wěn)定在pH5.5?；钚噪S后用實施例2所述方法確定。結(jié)果顯示提取物的肌醇六磷酸酶活性在下降到pH3.5時相對穩(wěn)定。然而，它在更酸的pHs中迅速變性，尤其是pH2。
4.5肌醇六磷酸酶的穩(wěn)定性作為溫度的函數(shù)評估溫度大于或等于60℃時肌醇六磷酸酶活性的穩(wěn)定性。提取物的稀釋溶液(終濃度1IU/ml)接受特定時間段(不超過30分鐘)的測試溫度?；氐街車鷾囟群?，各熱處理的溶液根據(jù)實施例1A中所述方法分析。60℃ 5分鐘間，肌醇六磷酸酶活性降低約80％，直到它在80℃ 1分鐘后成為零，所在條件用于完成實驗。
實施例5純化根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶實施例3所得真菌酶提取物通過超濾用10kDa截止的膜來濃縮。提取物的離子強度和pH通過20mM甘氨酸緩沖液，pH3洗幾次來調(diào)節(jié)。
陽離子交換層析通過將所得濃縮物應(yīng)用至固定pH為3的SP10柱(PerSeptiveBiosystems)來完成。附著蛋白質(zhì)用甘氨酸緩沖液中0到1M NaCl梯度以3ml/分鐘的流速洗脫。肌醇六磷酸酶活性峰值在約30％的1M NaCl時獲得。肌醇六磷酸酶與活性峰值的其它成分分離是通過HR200柱(Pharmacia)上的膠滲透，以0.7ml/分鐘的流速在50mM乙酸鈉緩沖液中，pH5.5。收集部分的純度通過銀染色非變性聚丙烯酰胺膠電泳來估計。膠上存在單條蛋白質(zhì)帶，估計分子量為130kDa。然而，純化肌醇六磷酸酶進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，觀察到2條多肽帶，一條是相對遷移距離為70kDa的主帶，另一條是相對遷移距離為90kDa的小帶。
實施例6純化肌醇六磷酸酶的微量測序6.1 N-末端序列的確定與SDS-PAGE電泳所得70和90kDa多肽帶相應(yīng)的多肽在4℃轉(zhuǎn)15小時到PVDF膜上(ProBlott，Applied Biosystems)。檢測多肽通過酰胺黑10B(Sigma)染色并接受測序(Institut Pasteur，Laboratoire de Microsequencage de Proteines[Protein Micro-sequencing Laboratory]，Paris)。兩條多肽帶獲得相同的N-末端序列(SEQ ID NO8)。
此結(jié)果得出結(jié)論SDS-PAGE上鑒定的兩條多肽帶可能對應(yīng)于相同多肽，遷移速度的差異可能產(chǎn)生自純化步驟中多肽組分的部分降解。
6.2肌醇六磷酸酶內(nèi)部片段氨基酸序列的確定2個70和90kDa的多肽用SDS-PAGE電泳分離且通過酰胺黑染色檢測。70kDa的多肽帶從膠上切下且多肽用內(nèi)溶素-C(Endolysine-C)在37℃原位消化18小時。肽片段用HPLC在C18 DEAE柱上分離。4個內(nèi)部片段的序列通過微量測序獲得(SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11和SEQ ID NO12)。
SEQ ID NO8IPTDPQVPQ/VYFSEQ ID NO9TSGGDAVNEWTALYLQK
SEQ ID NO10AGGAPFLAQXNPIYXQPXYVSEQ ID NO11LYDPASKSEQ ID NO12APGLVR實施例7生成涉及青霉屬CBS 109899菌株肌醇六磷酸酶的分子探針微量測序后，寡核苷酸從肽中推斷以通過PCR擴(kuò)增DNA片段，此片段涉及編碼青霉屬CBS 109899菌株肌醇六磷酸酶的基因。
7.1 PCR引物設(shè)計引物推斷自內(nèi)部序列SEQ ID NO9的N-末端氨基酸序列。N-末端序列推出4組有義簡并引物，內(nèi)部序列SEQ ID NO9推出1組反義簡并引物。各組有義引物分別與反義引物組使用。
7.2擴(kuò)增涉及肌醇六磷酸酶的基因組DNA首先，青霉屬CBS 109899培養(yǎng)于液體MN-Uri培養(yǎng)基中(28℃，180rpm，2天)。菌絲體通過過濾和液氮中碾磨來回收?；蚪MDNA提取在5ml裂解緩沖液中完成(1％SDS、2％Triton X-100、100mM NaCl、1mM EDTA、10mM Tris，pH8.0)且1g碾磨物質(zhì)上有5ml酚。通過酚/氯仿和氯仿抽提純化水相后，加入2體積乙醇來沉淀基因組DNA。
進(jìn)行PCR反應(yīng)，100ng基因組DNA用1單位Taq聚合酶(Q-BIOgene)且使用MJ Research熱循環(huán)儀模型PTC-200。來自各PCR的反應(yīng)產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖膠上分析。獲得的核苷酸片段在850bp區(qū)域中且對應(yīng)于引物對OT ACS 17 P4.4(SEQ IDNO13)和OT ACS 25 P6.1(SEQ ID NO14)，片段直接亞克隆到載體pCR4-TOPO(Invitrogen)并測序(SEQ ID NO15)。
分析序列顯示用于擴(kuò)增的兩個引物存在于擴(kuò)增片段的任一側(cè)，隨后從它們推出的氨基酸序列與微量測序肌醇六磷酸酶所得的相一致。此外，內(nèi)部肽片段SEQ IDNO10和SEQ ID NO11的氨基酸序列出現(xiàn)在從DNA片段推出的氨基酸序列中。這些發(fā)現(xiàn)得出結(jié)論，擴(kuò)增的DNA片段對應(yīng)于微量測序的肌醇六磷酸酶，它被命名為OT ACS 29.1。此DNA片段隨后用作同源分子探針以克隆編碼純化肌醇六磷酸酶的基因。
OT ACS 17 P4.4(SEQ ID NO13) 5’-ACNGAYCCNCARGTCCCOT ACS 25 P6.1(SEQ ID NO14) 5’-GCNGTCCAYTCRTTNAC
實施例8克隆編碼青霉屬CBS 109899肌醇六磷酸酶的基因和確定特征8.1確定涉及肌醇六磷酸酶的cDNA序列根據(jù)5’和3’RACE-PCR技術(shù)通過擴(kuò)增、亞克隆和測序其5’和3’末端來獲得cDNA的完整序列。
首先，青霉屬CBS 109899在誘導(dǎo)肌醇六磷酸酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基包括40g/l淀粉面粉、25g/l米糠、20g/l肌醇六磷酸鈣、10g/l葡萄糖、15g/l NH4Cl和0.5g/l MgSO4·7H2O，pH5.5，添加0.06g/l葡糖淀粉酶AMG 300 L(Novozymes)和0.18g/lα淀粉酶Termamyl 120 L(Novozymes)。培養(yǎng)繼續(xù)直到獲得10U/ml培養(yǎng)基的肌醇六磷酸酶活性?；厥站z體是通過經(jīng)濾紙(Whatman)過濾培養(yǎng)物，隨后在液氮中碾磨。總RNA提取自碾磨物質(zhì)，通過50mM乙酸鈉緩沖液，pH5.3中的酚抽提，緩沖液含10mM EDTA。隨后mRNAs用GeneRacer試劑盒(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄。合成的cDNAs在它們的5’和3’末端有特定核苷酸序列，用于之后的PCR擴(kuò)增。為特異擴(kuò)增感興趣cDNA末端，2個引物推斷自涉及肽序列SEQ ID NO10的區(qū)域中的分子探針，一個引物趨向5’末端，名為OT ACS 37 P1(SEQ ID NO20)，另一個趨向3’末端，名為OT ACS 37 P3(SEQ ID NO21)。
進(jìn)行PCR反應(yīng)，1μl cDNA合成產(chǎn)物用1單位Taq聚合酶(Q-BIOgene)，使用MJ Research熱循環(huán)儀模型PTC-200。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖膠上分析。涉及5’末端的0.3kb區(qū)域中的片段和另一個涉及3’末端的1.7kb區(qū)域中的片段直接亞克隆到載體pCR4-TOPO(Invitrogen)，隨后測序。然后重構(gòu)完整cDNA序列(SEQ IDNO2)。
OT ACS 37 P1(SEQ ID NO20) 5’-GGCGCTCCGTTCCTTGCGCAAAC-3’OT ACS 37 P3(SEQ ID NO21) 5’-GTAGGTCGGCTGGGAATAGATCG-3’8.2亞克隆含基因的EcoRV基因組DNA片段基因組DNA片段用基因組步移技術(shù)克隆。首先，連接物連到EcoRV限制性片段末端。為此，青霉屬CBS 109899基因組DNA的EcoRV消化產(chǎn)物用50mMTris-HCl緩沖液，pH7.5中的T4 DNA連接酶連入GenomeWalker連接物(CLONTECH Laboratory，Inc)，緩沖液含10mM MgCl2、10mM二硫蘇糖醇、1mMATP和0.25μg/ml牛血清白蛋白，16℃作用15小時。反應(yīng)通過70℃的熱處理終止且反應(yīng)混合物吸收在200μl的超純水中。
為通過PCR擴(kuò)增EcoRV限制性片段的5’和3’末端，兩個有義引物從分子探針推出，一個引物趨向5’末端，名為OT ACS 32 P5(SEQ ID NO16)，另一個趨向3’末端，名為OT ACS 32 P3(SEQ ID NO17)。名為連接引物(CLONTECH Laboratory，Inc)的反義引物用于PCR反應(yīng)，對應(yīng)于連接物的5’末端序列。
進(jìn)行PCR反應(yīng)，1μl連接產(chǎn)物用1單位優(yōu)勢基因組聚合酶混合物(CLONTECHLaboratory，Inc)，使用MJ Research熱循環(huán)儀模型PTC-200。來自各PCR的反應(yīng)產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖膠上分析。
兩個片段，一個在涉及5’末端的1.8kb區(qū)域中且另一個在涉及3’末端的1.3kb區(qū)域中，片段被亞克隆并通過測序分析。一旦有EcoRV片段的5’和3’核苷酸序列，設(shè)計特異于末端的引物并命名為OT ACS 38 P1(SEQ ID NO18)和OT ACS 38P2(SEQ ID NO19)。用高保真聚合酶擴(kuò)增全部片段。進(jìn)行PCR反應(yīng)，100ng青霉屬CBS 109899基因組DNA用1單位PLATINUM pfx DNA聚合酶(Life Technology，Inc.)，使用MJ Research熱循環(huán)儀模型PTC-200。擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖膠上分析。3.8kb片段直接亞克隆到載體pCR4-TOPO(Invitrogen)、測序(SEQ ID NO1)并命名為OT ACS 38.1。
8.3分析cDNA和基因的序列氨基酸序列推自cDNA并分析(SEQ ID NO3)。微量測序所得肌醇六磷酸酶的所有內(nèi)部肽序列在此氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)，證明測序的cDNA對應(yīng)于感興趣的肌醇六磷酸酶。此外，推出的氨基酸序列包含結(jié)合(RHGXRXP)和親核攻擊(HD)磷酸鹽的特異位點，這是屬于組氨酸磷酸酶的肌醇六磷酸酶特征。cDNA序列與OT ACS38.1基因組DNA片段的排列能確定感興趣基因的確切界限并定位它包含的內(nèi)含子。
實施例9同源序列搜索9.1構(gòu)建繩狀青霉IMI 134756菌株的粘粒文庫繩狀青霉IMI 134756培養(yǎng)于液體MN-Uri培養(yǎng)基中(28℃，180rpm，2天)。菌絲體通過過濾和液氮中碾磨來回收?；蚪MDNA提取在5ml裂解緩沖液中完成(1％SDS、2％Triton X-100、100mM NaCl、1mM EDTA、10mM Tris，pH8.0)且1g碾磨物質(zhì)上有5ml酚。通過酚/氯仿和氯仿抽提純化水相后，加入2體積乙醇來沉淀基因組DNA。
用SalI限制性酶部分消化的20μg基因組DNA產(chǎn)物上樣到瓊脂糖(低熔點)膠上以在0.5×TBE中進(jìn)行脈沖電場電泳(18小時，5V/cm)。用溴化乙錠染色后，30到40kb長度的DNA片段通過β-瓊脂糖酶(GIBCO-BRL)消化和乙醇沉淀從膠中釋放。此基因組DNA的等分樣品連入載體pMOCosX[Orbach(1994)，GENE 150，159-162頁]，載體用XhoI消化并預(yù)先用小牛腸磷酸酶去磷酸化。連接產(chǎn)物與λ噬菌體元件接觸(包裝操作-STRATAGENE；Gigapack Gold-11)，能轉(zhuǎn)染大腸桿菌菌株Q358(Maniatis等，1982)。在添加50μg/ml氨卡青霉素的Luria和Bertani(LB)瓊脂培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)后，集落吸入50個96孔微量滴定板中且在添加50μg/ml氨卡青霉素的150μl LB中過夜培養(yǎng)。在添加終濃度50％的甘油和-80℃保存前，培養(yǎng)物影印到Hybond N+膜(AMERSHAM)。
9.2篩選探針OT ACS 29.1的粘粒文庫對繩狀青霉IMI 134756菌株基因組DNA的DNA印跡分析用探針OT ACS29.1進(jìn)行?；蚪MDNA用一些限制性內(nèi)切酶消化并預(yù)先通過電泳分離，基因組DNA轉(zhuǎn)移的膜在雜交緩沖液(7％SDS；0.5M磷酸鈉，pH7.0)中65℃預(yù)雜交10分鐘。探針用α-32P dCTP標(biāo)記，使用DNA標(biāo)記試劑盒(Amersham)。使用前，標(biāo)記探針加入雜交緩沖液且混合物在100℃加熱5分鐘。雜交在65℃進(jìn)行6小時。雜交后，膜在漂洗緩沖液(1％SDS；0.5M磷酸鈉，pH7.0)中65℃洗3次15分鐘，隨后曝光。此分析僅顯示一個信號。因此繩狀青霉IMI基因組僅包含一個感興趣基因的拷貝。然后粘粒文庫在相同嚴(yán)格條件下用探針OT ACS 29.1篩選，在15、19和48號膜上顯示一些信號。因此，涉及15號膜的粘粒15F10被鑒定為含與探針OT ACS 29.1雜交的DNA序列。在此粘粒的DNA上進(jìn)行限制性分析以確定相應(yīng)基因的位置。基因被命名為phyF?？寺『蜏y序粘粒15F10的1.3kb NcoI片段顯示與序列OT ACS 29.1的強同源性。完整phyF基因位于2.7kb EcoRV-EcoRI片段，此片段被克隆和測序(SEQ ID NO4)。
序列分析指示790bp的啟動子區(qū)域和在ATG 791編碼phyF的序列起始。phyF基因有1536bp(位置791-2527)，包括兩個35bp和61bp長度的推定內(nèi)含子。
實施例10OT ACS 38.1(SEQ ID NOI)所含基因的重組表達(dá)10.1將基因的多個拷貝導(dǎo)入繩狀青霉IMI 134756為確認(rèn)克隆基因(OT ACS 38.1)，將多個拷貝導(dǎo)入產(chǎn)生少量肌醇六磷酸酶的繩狀青霉IMI 134756菌株基因組中，以觀察轉(zhuǎn)化克隆是否表現(xiàn)出產(chǎn)率上升。
為此，根據(jù)專利WO 00/68401所述技術(shù)用含片段OT ACS 38.1的質(zhì)粒和可用潮霉素選擇的質(zhì)粒pAN7-1(Punt等，1987；Gene，56117-24)共轉(zhuǎn)化繩狀青霉IMI134756。轉(zhuǎn)化后，整合感興趣基因的多個拷貝通過Southern分析用分子探針OTACS 29.1驗證。Southern分析根據(jù)實施例9所述條件進(jìn)行，候選基因組DNA用EcoRI限制性內(nèi)切酶消化。
陽性候選在誘導(dǎo)肌醇六磷酸酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)于50ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)基包括40g/[空斑]肌醇六磷酸鈣、10g/l葡萄糖、8g/l NH4NO3、5g/l KCl和5g/lMgSO4·7H2O，添加1ml/l痕量元素溶液(2.2％ZnSO4·7H2O、1.1％H3BO3、0.5％MnCl2·4H2O、0.5％FeSO4·7H2O、0.17％CoCl2·6H2O、0.16％CuSO4·5H2O、0.15％Na2MoO4·2H2O和5.0％Na2EDTA，pH6.5)。隨著時間測量培養(yǎng)基中肌醇六磷酸酶活性。
所得結(jié)果用于分析2個候選，非轉(zhuǎn)化的繩狀青霉IMI 134756用作對照，結(jié)果示于表2。
表2監(jiān)控2個候選培養(yǎng)物中的肌醇六磷酸酶活性(U/ml)，候選由用片段OT ACS38.1轉(zhuǎn)化的繩狀青霉IMI 134756和野生型繩狀青霉IMI 134756組成
監(jiān)控培養(yǎng)基中肌醇六磷酸酶活性顯示對于多拷貝OT ACS 38.1整合到其基因組的2個測試候選，肌醇六磷酸酶活性增加2-2.5倍。此結(jié)果趨向確認(rèn)片段OT ACS38.1所含感興趣基因編碼肌醇六磷酸酶且青霉菌菌株的肌醇六磷酸酶活性可通過增加其基因組中該基因拷貝數(shù)來提高。
10.2基因在異源啟動子控制下的表達(dá)專利WO 00/68401所述表達(dá)盒包含cs131啟動子和終止子，用于表達(dá)編碼感興趣肌醇六磷酸酶的基因組DNA片段OT ACS 38.1區(qū)域。為此，在SwaI位點引入啟動子末端后，表達(dá)盒用SwaI/SpeI限制性內(nèi)切酶消化。基因組DNA片段OT ACS38.1中所含編碼肌醇六磷酸酶的區(qū)域用下列引物擴(kuò)增phyGoamp4 5’TAGATATCACGATGCTCAAGCTATATGTAGCTGC 3’(SEQ IDNO22)phyGoamp5 5’ATACTAGTTTAGGACGTAGCATTCTTCGGAATAG 3’(SEQID NO23)PCR反應(yīng)用MJ Research熱循環(huán)儀模型PTC-200進(jìn)行，100pmol的各引物和1單位PLATINUM pfx DNA聚合酶(Life Technology，Inc.)在50μl涉及此聚合酶的緩沖液中(Life Technology，Inc.)。PCR產(chǎn)物用EcoRV和SpeI限制性內(nèi)切酶消化并連入載體pBCMT。因此所得質(zhì)粒命名為pCP。
根據(jù)專利WO 00/68401所述技術(shù)用含片段OT ACS 38.1的質(zhì)粒和能用潮霉素選擇的質(zhì)粒pAN7-1(Punt等，1987；Gene，56117-24)共轉(zhuǎn)化繩狀青霉IMI 134756。pCP盒整合到候選基因組通過Southern分析用分子探針OT ACS 29.1驗證，8個候選的基因組DNA用EcoRI限制性內(nèi)切酶消化。分析后，選擇4個共轉(zhuǎn)化子并在誘導(dǎo)cs131啟動子的條件下培養(yǎng)。分析基因表達(dá)并測量肌醇六磷酸酶活性。
選擇的4個候選在125ml錐形燒瓶中培養(yǎng)于添加1％玉米漿的50ml基本培養(yǎng)基。菌絲體在28℃，180rpm培養(yǎng)48小時和72小時后收集，用探針OT ACS 29.1對20μg總RNA進(jìn)行各樣品Northern分析(Sambrook等，1989，《分子克隆實驗室手冊》)。沖洗膜后，信號用STORM磷成像儀(phosphoimager)(Molecular Dynamics)顯現(xiàn)。
結(jié)果顯示信號全在用pCP轉(zhuǎn)化的候選中，非轉(zhuǎn)化對照沒有信號，證明該基因在csl31啟動子控制下表達(dá)。
肌醇六磷酸酶活性在各培養(yǎng)物上清中平行測量。結(jié)果示于表3。
表3在誘導(dǎo)cs131啟動子條件下48和72小時測量4個pCP轉(zhuǎn)化的候選培養(yǎng)物上清中肌醇六磷酸酶活性(U/ml)，繩狀青霉IMI 134756用作對照。
分析結(jié)果顯示肌醇六磷酸酶活性僅在對應(yīng)于pCP轉(zhuǎn)化候選的上清中存在。此結(jié)果與基因表達(dá)一致且證明基因組DNA片段包含編碼肌醇六磷酸酶的基因。
實施例11-最優(yōu)化青霉屬CBS 109899菌株的培養(yǎng)條件11.1攪拌對肌醇六磷酸酶生成的影響發(fā)酵在實施例3的條件下進(jìn)行，攪拌速度范圍從400到450rpm(表4)。
表4發(fā)酵結(jié)束所得活性作為攪拌的函數(shù)
這些結(jié)果顯示攪拌增加對天然青霉屬CBS 109899菌株產(chǎn)生肌醇六磷酸酶有負(fù)作用。
11.2氮源對肌醇六磷酸酶生成的影響發(fā)酵在實施例3的條件下進(jìn)行。唯一改變的參數(shù)是氮源(米糠)，它由另一種氮源豆糠取代(表5)。
表5發(fā)酵結(jié)束所得活性作為氮源的函數(shù)
這些結(jié)果顯示氮源對天然青霉屬CBS 109899菌株產(chǎn)生肌醇六磷酸酶有作用；特定的是，豆糠作為氮源促進(jìn)肌醇六磷酸酶生成。
11.3肌醇六磷酸來源對肌醇六磷酸酶生成的影響發(fā)酵在實施例3的條件下進(jìn)行。唯一改變的參數(shù)是Ca++肌醇六磷酸，它由Ca++和Mg++重鹽取代(表6)。
表6發(fā)酵結(jié)束所得活性作為肌醇六磷酸來源的函數(shù)
這些結(jié)果顯示肌醇六磷酸來源對天然青霉屬CBS 109899菌株產(chǎn)生肌醇六磷酸酶有作用；特定的是，鈣和鎂重鹽作為肌醇六磷酸來源相較鈣鹽能改進(jìn)肌醇六磷酸酶生成。
11.4肌醇六磷酸量對肌醇六磷酸酶生成的影響發(fā)酵在實施例3的條件下進(jìn)行。唯一改變的參數(shù)是發(fā)酵介質(zhì)中存在的肌醇六磷酸量(表7)。
表7發(fā)酵結(jié)束所得活性作為肌醇六磷酸量的函數(shù)
這些結(jié)果顯示發(fā)酵介質(zhì)中存在肌醇六磷酸量時，天然青霉屬CBS 109899菌株產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶顯著增加。
實施例12青霉屬CBS 109899菌株產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶的畜牧學(xué)功效12.1添加肌醇六磷酸酶的飲食對雄禽磷消化的作用實驗用20只雄禽進(jìn)行。動物分成2組10只，一組處理動物和一組對照動物，隨后在籠中單獨飼養(yǎng)。然后它們用以玉米和大豆為基礎(chǔ)的飼料喂養(yǎng)，飼料缺乏可消化的磷(P)，對于處理動物組，添加702IU(國際單位＝在37℃ pH5.5的10g/l肌醇六磷酸鈉溶液每分鐘能釋放1μmol磷酸鹽的肌醇六磷酸酶量)肌醇六磷酸酶每kg飼料。
動物排泄物在實驗開始后2和3天收集以分析磷排泄。磷消化對應(yīng)于動物吸收的磷相較攝入量的百分比。此百分比推斷自排泄物中發(fā)現(xiàn)的排泄量(表8)。
表8磷攝入、排泄和消化
表6結(jié)果顯示缺乏可消化磷的基本飼料添加根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶會顯著減少(P＜0.05)磷排泄。此作用反映用添加飼料喂養(yǎng)的動物的磷消化增加。這顯示根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶對于釋放食物攝入中不易消化的磷有效。
12.2添加肌醇六磷酸酶的飲食對小雞生長的作用實驗用210只Ross 308種小雞進(jìn)行。動物分成6組35只，4組不同劑量肌醇六磷酸酶處理的動物、1組未處理的陰性對照動物和1組無機(jī)磷處理的陽性對照。動物以每籠5只動物的比例飼養(yǎng)，喂養(yǎng)13天(從9天大到22天大)。基本飼料由玉米和大豆組成，缺乏可消化的磷(P)，對于4組處理動物，添加4種不同濃度的肌醇六磷酸酶243、433、738和1234IU肌醇六磷酸酶每kg飼料，對于陽性對照，用0.1％單鈣或二鈣磷酸鹽形式的無機(jī)磷。
通過測量實驗開始和結(jié)束時的動物體重估計生長。這些測量能確定體重增加和消耗指數(shù)(CI)。消耗指數(shù)對應(yīng)于消耗飼料量相對體重增加。對于特定飼料量，指數(shù)減少表示動物重量增加，即動物更好的吸收飼料。結(jié)果示于表9。
表9肌醇六磷酸酶對小雞生長的作用
結(jié)果顯示缺乏可消化磷的基本飼料添加243、433、738和1234IU/kg根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶導(dǎo)致重量增加，分別提高1.7、2.0、2.1和2.3倍。甚至最高劑量能獲得的重量增加大于用無機(jī)磷添加飼料。此添加也能使消耗指數(shù)平均增加33％。
12.3添加肌醇六磷酸酶的飲食對小雞骨礦化的作用實驗用210只Ross 308種小雞進(jìn)行。動物分成6組35只，4組不同劑量肌醇六磷酸酶處理的動物、1組未處理的陰性對照動物和1組無機(jī)磷處理的陽性對照。動物以每籠5只動物的比例飼養(yǎng)，喂養(yǎng)13天(從9天大到22天大)。基本飼料由玉米和大豆組成，缺乏可消化的磷(P)，對于4組處理動物，添加4種不同濃度的肌醇六磷酸酶243、433、738和1234IU肌醇六磷酸酶每kg飼料，對于陽性對照，用0.1％單鈣或二鈣磷酸鹽形式的無機(jī)磷。
在14天，從各動物中取出脛骨。各脛骨被稱重并焚化，分析它的灰燼、鈣和磷含量。結(jié)果示于表10。
表10肌醇六磷酸酶對小雞骨礦化的作用
這些結(jié)果清楚顯示對于所有試驗濃度，飼料添加根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶對小雞骨礦化有正作用。特定的是，根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶促進(jìn)骨的鈣和磷礦化以及它們的灰燼質(zhì)量。此外，對于各測量參數(shù)，觀察到劑量作用。
12.4添加肌醇六磷酸酶的飲食對豬的磷和鈣消化的作用實驗用7只平均質(zhì)量約為70kg的豬進(jìn)行。通過手術(shù)對動物進(jìn)行回腸直腸(ileorectal)接合以能定量收集它們的回腸含量。它們被單獨飼養(yǎng)用于實驗需要。
動物用以玉米和大豆為基礎(chǔ)的三種飼料喂養(yǎng)。添加300和600IU每kg飼料。各動物連續(xù)6天適應(yīng)飼料。在第7天收集回腸含量，隨后改變動物飼料。分析回腸含量中鈣和磷的量，然后測量這兩種元素的消化。結(jié)果示于表11。
表11肌醇六磷酸酶對豬的鈣和磷消化的作用
飼料添加根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶會顯著增加鈣和磷消化。對于每kg飼料添加300和600IU的飼料，鈣消化分別增加5.6和9.3％，對于每kg飼料添加300和600IU的飼料，磷消化分別增加8.4和17％。
12.5添加肌醇六磷酸酶的飲食對豬磷消化的作用實驗用12只平均質(zhì)量約為11kg的小豬進(jìn)行。動物分成2組6只，1組處理動物和一組對照動物，隨后在籠中單獨飼養(yǎng)。然后它們用以玉米和大豆為基礎(chǔ)的飼料喂養(yǎng)26天，飼料缺乏可消化的磷(P)，添加418IU肌醇六磷酸酶每kg飼料。
動物的排泄物從實驗第21天收集5天，以分析它們的磷和鈣含量。磷消化對應(yīng)于動物吸收的磷和鈣相較攝入量的百分比。此百分比推斷自排泄物中發(fā)現(xiàn)的排泄量(表12)。
表12肌醇六磷酸酶對豬磷消化的作用攝入(g) 排泄(g) 消化(％)磷對照 1.007±0.127 0.800±0.07820.11±5.79418IU/kg 1.145±0.124 0.573±0.11150.28±6.52對照 1.873±0.237 1.228±0.18034.2±7.73418IU/kg 2.131±0.234 1.102±0.10248.62±8.44這些結(jié)果顯示飼料添加根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶使磷消化增加250％且鈣消化增加42％。
12.6添加肌醇六磷酸酶的飲食對小豬生長的作用實驗用12只平均質(zhì)量約為11kg的小豬進(jìn)行。動物分成2組6只，1組處理動物和一組對照動物，隨后在籠中單獨飼養(yǎng)。然后它們用以玉米和大豆為基礎(chǔ)的飼料喂養(yǎng)26天，飼料缺乏可消化的磷(P)，添加418IU肌醇六磷酸酶每kg飼料。
通過測量實驗開始和結(jié)束時的動物體重估計生長。這些測量能確定體重增加和消耗指數(shù)(CI)。結(jié)果示于表13。
表13肌醇六磷酸酶對小豬生長的作用處理 對照 418IU/kg起始體重(kg) 6.81±0.696.75±0.88最終體重(kg) 13.34±1.58 14.86±1.41體重增加(kg) 6.53±1.728.11±1.66CI 2.31±1.851.63±0.88結(jié)果顯示缺乏可消化磷的基本飼料添加418IU/kg根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶導(dǎo)致重量增加24％。此添加也顯著減少消耗指數(shù)。
12.7添加肌醇六磷酸酶的飲食對小豬骨礦化的作用實驗用12只平均質(zhì)量約為11kg的小豬進(jìn)行。動物分成2組6只，1組處理動物和一組對照動物，隨后在籠中單獨飼養(yǎng)。然后它們用以玉米和大豆為基礎(chǔ)的飼料喂養(yǎng)26天，飼料缺乏可消化的磷(P)，添加418IU肌醇六磷酸酶每kg飼料。
在實驗的第27天，從各動物中取出脛骨。各脛骨被稱重并焚化，分析它的灰燼、鈣和磷含量。結(jié)果示于表14。
表14肌醇六磷酸酶對小豬骨礦化的作用處理 對照 418IU/kg脛骨磷(％)1.66±0.10 2.18±0.09脛骨鈣(％)3.56±0.30 4.69±0.42礦物(％) 10.45±0.6913.12±0.55結(jié)果顯示缺乏可消化磷的基本飼料添加418IU/kg根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶導(dǎo)致小豬骨礦化顯著增加。特定的是，根據(jù)發(fā)明的肌醇六磷酸酶促進(jìn)骨的鈣和磷礦化以及它們的礦物質(zhì)量。
序列表<110>埃迪塞歐法國聯(lián)合股份有限公司(Adisseo)<120>新的肌醇六磷酸酶和制造這些新肌醇六磷酸酶的方法<130>PM01046<140>
<141>
<160>23<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>3753<212>DNA<213>青霉屬CBS 109899<220>
<221>內(nèi)含子<222>(1491)..(1550)<220>
<221>內(nèi)含子<222>(1703)..(1764)<400>1ggctttgctg gtgcggggtg agtccgctgg ttggctcgct tctgctgttg cgatttcagc 60gtcggcttgg gctatgatag ccgccagggt ggctgcgact cggtcatgga gctgtgcgag 120agtctcacca cgtcgcggtg ggatcacaaa tggtttgtag agactttcag ggttttcggc 180aaggcaagtt gagaaatgag ggtacagaac atttgccgaa acgggagcgg gaggttcaaa 240tgtgatgcct ccgaaccatt cgctatgtta aagctgtcaa tcttcttttt cttaatcata 300ccaatggatg actgccctac cctaatccat tttcgactct gacgttgaga tctgtcccag 360cgtcaagatt tatctcggct gactgggatt tcttcgctaa ctgctccacg gttggctgga 420ttgtctgcat gcatcgatag aacggactag aataaatccg aaatggtttt gggatgaagt 480tagggctact aatatgcgat gcgagctcat gggattgttt gacaccgctt ggattcaagg 540ttgggtctgc gccattgccg gttggtgtag gaaattctgg aatgtattct tgtttgtcga 600aatcgatttc ccagttgtta cgattctagc caagaagatt aatacatcca gttctcaaat 660aaagctcaag ggacatgctt actccatggc gaacgagata gattgtgtct agaggcatcg 720cgtcgaaagg ccgtcttggg actcttggct gtattgatag atttgattga acagttgtaa 780gttctcaatt tctctagcct ttatacttct agaggcaaac tctccatcaa agagtttgct 840tcaataccta cacctggaat ccactttccg atagactgca atgcccacta taactagtgc 900ccaactgtgg tccctaagtt ccatctaact tcttgagatc tctcttggac aaacttaaac 960caaagcgagc cgacataatt gcctcatctg gctgatcaga taaagaataa aatcaacaga 1020ggacaacgaa ttaaagcgcc ttgtttcaat caattttcag tacccgacca tgcaccttct 1080tggaccagtt attgtcggca aatgtaaatg cttgggatag gcccaatgaa ctcactatga 1140ggccccaaat catttctagc taccccagat tttcaaaagc cggggtagaa atatggtgct 1200tgctatgttg tctattcggg caggaggtcg tgtgacagag agagttataa ataaccttgg 1260aaccttggaa atcttcgtaa tgtatacttt gtaccggact ttcaaggttt catttaacat 1320tcattgtcct ttggttcata ttctatacag aagaatcaga actgtatttc gattaccacg 1380atgctcaagc tatatgtagc tgcctgtctg gtggtggccg gtgtttctat cccgacagac 1440cctaccgtaa cccaagtccc ggattacttc caaacgagct atgggccata tgcaggtatg 1500gaaatatgcg taccttgtca aaggctatta gggcrcaaca ggctacaggt gctaccaaag 1560ccggaggcgc tccgttcctt gcgcaaacca atccgatcta ttcccagccg acctacgtcg 1620caaacacgcc attggtgaca actcttccca tatctggtga accccatgac ggaaacatat 1680tcggctggat ggggactttg aggtatgtat tatctttcgc tgaagtaccg ttagtacgga 1740tgaaactgat cttagacaaa acagtcctta ccaacccagc cctgatggat ttggcgtgga 1800tgaatatcct ctccctcccg gtgcaaacat tacgcaaatc catatggtgc atcgccatgg 1860ctcgcgctat ccgacgtcaa attccgcaat cagcgattgg gctaagaaaa taatgcagta 1920tcgatccaac ggcacagtgt tctcaggcga acttgagttt ctgaacgctt ggaactatca 1980gctcggacag gcagagctaa cagcacgagg tcggcaagag ttattcgaca gcgggattct 2040acattggttc aattatggaa agctctacga tcctgcatca aaaatcatag ctcgcacaac 2100
aacgatggtg aggatgttgc aatcagcgga gaacttcctc aatggatttt ttggtccaaa 2160ctggactaat aatgcgacgc ttgaagtcat tattgaaagt accgggttca acaactccct 2220cgcagggaat gatatgtgtc gcaacgcaaa aaatacatcg gggggcgacg cagtaaatga 2280atggaccgcg ctatacttgc agaaagcgac aaatcgcttc agaagtgaaa tatctggaag 2340tctgaactgg actgttgacg acacgtacaa tgcacagtcg atgtgcccat acgagactgt 2400tgcacttggt tatagtccgt tttgtacatt gttttcttgg gaggaatggc aagggttcca 2460gtatgttaac gacttgaacc tctatgggaa ctatggcatg ggttctccag ttggccgcgc 2520cattggactt ggatttgtcg aagaattgat tgcacggctg caggggcaaa tcccaaaccc 2580ccctgaagac tcaattgggt tcaatcaatc gctagatgat agtgccgcga ctttccctct 2640caaccaaaca atctacttcg actttagcca cgacaacgag atgttctcga tgttgactgc 2700cctgggcttg acacagtttg gggactacct ctctcccacg aagccctctg cggatcgttc 2760gttgattgga agccatatcg tcccgttctc ggctaccttt gtatttgaga tcatcaaagc 2820acctggtctt gtacgagaga atcgatcaaa gtattgcggt gaaagtgtgt atgaaaatac 2880gagcgaagaa acaacctaca tacatctcgt cattaaccag aggactgttc ctcttggtca 2940aagcatttca gcatgcgggc aacgagatga tggttggtgt gaaatttccg ccttcattca 3000ggcgcagaaa gaaaacatcg tgaaggcaaa ttacgaggaa agctgtttcg gaaattggag 3060catcccggcg tacggcgaga tcagggatgg cgctattccg aagaatgcta cgtcctaact 3120gctatattag acgccctcga aagtttagat tggagatact cggacaaact cgcttcattc 3180aatagctaga agggcaacta tgttcgtttc acttacttcg ataccagata cacgtagtat 3240gatgcaagta ttccgagttc tcacatgaat attcgggcta agtctgctga aagacatcct 3300gattaaatct agttgtcagt tgccggtgcc accgataact gacagctaca gcgagtatat 3360tggtgttatg tatataatta actaactact gttaaggcgt gtgagtaatc gatacataaa 3420tctctcatag gtcaaccgtg gcaagagtta tcaactacct agatctatca cttctgtctc 3480acgaagagga ggaggaggag accatgcttt tccgcagcac tataaaatac attttcggtt 3540atatataagt tgctgaccga cgtcggtgtc gtttccctcg aaatctgcat tttctaaatt 3600ttccatggcc aactaggagg ctgggatttc atcaaagcac gggaaaggct tttgtcaact 3660atatcctgtt attagtatat ccgtaagagt tagggttagt gaggccacga tgtttctggg 3720gtcaagttac aaacaaagtt acgaacccgc agg 3753<210>2<211>1761<212>DNA<213>青霉屬CBS 109899<220>
<221>CDS<222>(89)..(1711)<400>2accggacttt caaggtttca tttaacattc attgtccttt ggttcatatt ctatacagaa 60gaatcagaac tgtatttcga ttaccacg atg ctc aag cta tat gta gct gcc 112Met Leu Lys Let Tyr Val Ala Ala1 5tgt ctg gtg gtg gcc ggt gtt tct atc ccg aca gac cct acc gta acc160cys Leu Val Val Ala Gly Val Ser Ile Pro Thr Asp Pro Thr Val Thr10 15 20caa gtc ccg gat tac ttc caa acg agc tat ggg cca tat gca ggt gct208Gln Val Pro Asp Tyr Phe Gln Thr Ser Tyr Gly Pro Tyr Ala Gly Ala25 30 35 40acc aaa gcc gga ggc gct ccg ttc ctt gcg caa acc aat ccg atc tat256Thr Lys Ala Gly Gly Ala Pro Phe Leu Ala Gln Thr Asn Pro Ile Tyr45 50 55tcc cag ccg acc tac gtc gca aac acg cca ttg gtg aca act ctt ccc304Ser Gln Pro Thr Tyr Val Ala Asn Thr Pro Leu Val Thr Thr Leu Pro60 65 70ata tct ggt gaa ccc cat gac gga aac ata ttc ggc tgg atg ggg act352Ile Ser Gly Glu Pro His Asp Gly Asn Ile Phe Gly Trp Met Gly Thr75 80 85
ttg agt cct tac caa ccc agc cct gat gga ttt ggc gtg gat gaa tat400Leu Ser Pro Tyr Gln Pro Ser Pro Asp Gly Phe Gly Va1 Asp Glu Tyr90 95 100cct ctc cct ccc ggt gca aac att acg caa atc cat atg gtg cat cgc448Pro Leu Pro Pro Gly Ala Asn Ile Thr Gln Ile His Met Val His Arg105 110 115 120cat ggc tcg cgc tat ccg acg tca aat tcc gca atc agc gat tgg gct496His Gly Ser Arg Tyr Pro Thr Ser Asn Ser Ala Ile Ser Asp Trp Ala125 130 135aag aaa ata atg cag tat cga tcc aac ggc aca gtg ttc tca ggc gaa544Lys Lys Ile Met Gln Tyr Arg Ser Asn Gly Thr Val Phe Ser Gly Glu140 145 150ctt gag ttt ctg aac gct tgg aac tat cag ctc gga cag gca gag cta592Leu Glu Phe Leu Asn Ala Trp Asn Tyr Gln Leu Gly Gln Ala Glu Leu155 160 165aca gca cga ggt cgg caa gag tta ttc gac agc ggg att cta cat tgg640Thr Ala Arg Gly Arg Gln Glu Leu Phe Asp Ser Gly Ile Leu His Trp170 175 180ttc aat tat gga aag ctc tac gat cct gca tca aaa atc ata gct cgc688Phe Asn Tyr Gly Lys Leu Tyr Asp Pro Ala Ser Lys Ile tle Ala Arg185 190 195 200aca aca acg atg gtg agg atg ttg caa tca gcg gag aac ttc ctc aat736Thr Thr Thr Met Val Arg Met Leu Gln Ser Ala Glu Asn Phe Leu Asn205 210 215gga ttt ttt ggt cca aac tgg act aat aat gcg acg ctt gaa gtc att784Gly Phe Phe Gly Pro Asn Trp Thr Asn Asn Ala Thr Leu Glu Val Ile220 225 230att gaa agt acc ggg ttc aac aac tcc ctc gca ggg aat gat atg tgt832Ile Glu Ser Thr Gly Phe Asn Asn Ser Leu Ala Gly Asn Asp Met Cys235 240 245cgc aat gca aaa aat aca tcg ggg ggc gac gca gta aat gaa tgg acc880Arg Asn Ala Lys Asn Thr Ser Gly Gly Asp Ala Val Asn Glu Trp Thr250 255 260gcg cta tac ttg cag aaa gcg aca aat cgc ttc aga agt gaa ata tct928Ala Leu Tyr Leu Gln Lys Ala Thr Asn Arg Phe Arg Ser Glu Ile Ser265 270 275 280gga agt ctg aac tgg act gtt gac gac acg tac aat gca cag tcg atg976Gly Ser Leu Asn Trp Thr Val Asp Asp Thr Tyr Asn Ala Gln Ser Met285 290 295tgc cca tac gag act gtt gca ctt ggt tat agt ccg ttt tgt aca ttg1024Cys Pro Tyr Glu Thr Val Ala Leu Gly Tyr Ser Pro Phe Cys Thr Leu300 305 310ttt cct tgg gag gaa tgg caa ggg ttc cag tat gtt aac gac ttg aac1072Phe Ser Trp Glu Glu Trp Gln Gly Phe Gln Tyr Val Asn Asp Lou Asn315 320 325ctc tat ggg aac tat ggc atg ggt tct cca gtt ggc cgc gcc att gga1120Leu Tyr Gly Asn Tyr Gly Met Gly Ser Pro Va1 Gly Arg Ala Ile Gly330 335 340ctt gga ttt gtc gaa gaa ttg att gca cgg ctg cag ggg caa atc cca1168Leu Gly Phe Val Glu Glu Leu Ile Ala Arg Leu Gln Gly Gln Ile Pro
345 350 355 360aac ccc cct gaa gac tca att ggg ttc aat caa tcg cta gat gat agt1216Asn Pro Pro Glu Asp Ser Ile Gly Phe Asn Gln Ser Leu Asp Asp Ser365 370 375gcc gcg act ttc cct ctc aac caa aca atc tac ttc gac ttt agc cac1264Ala Ala Thr Phe Pro Leu Asn Gln Thr Ile Tyr Phe Asp Phe Ser His380 385 390gac aac gag atg ttc tcg atg ttg att gcc ctg ggc ttg aca cag ttt1312Asp Asn Glu Met Phe Ser Met Leu Thr Ala Leu Gly Leu Thr Gln Phe395 400 405ggg gac tac ctc tct ccc acg aag ccc tct gcg gat cgt tcg ttg att1360Gly Asp Tyr Leu Ser Pro Thr Lys Pro Ser Ala Asp Arg Ser Leu Ile410 415 420gga agc cat atc gtc ccg ttc tcg gct acc ttt gta ttt gag atc atc1408Gly Ser His Ile Val Pro Phe Ser Ala Thr Phe Val Phe Glu Ile Ile425 430 435 440aaa gca cct ggt ctt gta cga gag aat cga tca aag tat tgc ggt gaa1456Lys Ala Pro Gly Leu Val Arg Glu Asn Arg Ser Lys Tyr Cys Gly Glu445 450 455agt gtg tat gaa aat acg agc gaa gaa aca acc tac ata cat ctc gtc1504Ser Val Tyr Glu Asn Thr Ser Glu Glu Thr Thr Tyr Ile His Leu Val460 465 470att aac cag agg act gtt cct ctt ggt caa agc att tca gca tgc ggg1552Ile Asn Gln Arg Thr Val Pro Leu Gly Gln Ser Ile Ser Ala Cys Gly475 480 485caa cga gat gat ggt tgg tgt gaa att tcc gcc ttc att cag gcg cag1600Gln Arg Asp Asp Gly Trp Cys Glu Ile Ser Ala Phe Ile Gln Ala Gln490 495 500aaa gaa aac atc gtg aag gca aat tac gag gaa agc tgt ttc gga aat1648Lys Glu Asn Ile Val Lys Ala Asn Tyr Glu Glu Ser Cys Phe Gly Asn505 510 515 520tgg agc atc ccg gcg tac ggc gag atc agg gat ggc gct att ccg aag1696Trp Ser Ile Pro Ala Tyr Gly Glu Ile Arg Asp Gly Ala Ile Pro Lys525 530 535aat gct acg tcc taa ctgctatatt agacgccctc gaaagcttag attggagata1751Asn Ala Thr Ser540ctcggacaaa 1761<210>3<211>540<212>PRT<213>青霉屬CBS 109899<400>3Met Leu Lys Leu Tyr Val Ala Ala Cys Leu Val Val Ala Gly Val Ser1 5 10 15Ile Pro Thr Asp Pro Thr Val Thr Gln Val Pro Asp Tyr Phe Gln Thr20 25 30Ser Tyr Gly Pro Tyr Ala Gly Ala Thr Lys Ala Gly Gly Ala Pro Phe35 40 45Leu Ala Gln Thr Asn Pro Ile Tyr Ser Gln Pro Thr Tyr Val Ala Asn
50 55 60Thr Pro Leu Val Thr Thr Leu Pro Ile Ser Gly Glu Pro His Asp Gly65 70 75 80Asn Ile Phe Gly Trp Met Gly Thr Leu Ser Pro Tyr Gln Pro Ser Pro85 90 95Asp Gly Phe Gly Val Asp Glu Tyr Pro Leu Pro Pro Gly Ala Asn Ile100 105 110Thr Gln Ile His Met Va1 His Arg His Gly Ser Arg Tyr Pro Thr Ser115 120 125Asn Ser Ala Ile Ser Asp Trp Ala Lys Lys Ile Met Gln Tyr Arg Ser130 135 140Asn Gly Thr Val Phe Ser Gly Glu Leu Glu Phe Leu Asn Ala Trp Asn145 150 155 160Tyr Gln Leu Gly Gln Ala Glu Leu Thr Ala Arg Gly Arg Gln Glu Leu165 170 175Phe Asp Ser Gly Ile Leu His Trp Phe Asn Tyr Gly Lys Leu Tyr Asp180 185 190Pro Ala Ser Lys Ile Ile Ala Arg Thr Thr Thr Met Val Arg Met Leu195 200 205Gln Ser Ala Glu Asn Phe Leu Asn Gly Phe Phe Gly Pro Asn Trp Thr210 215 220Asn Asn Ala Thr Leu Glu Val Ile Ile Glu Ser Thr Gly Phe Asn Asn225 230 235 240Ser Leu Ala Gly Asn Asp Met Cys Arg Asn Ala Lys Asn Thr Ser Gly245 250 255Gly Asp Ala Val Asn Glu Trp Thr Ala Leu Tyr Leu Gln Lys Ala Thr260 265 270Asn Arg Phe Arg Ser Glu Ile Ser Gly Ser Leu Asn Trp Thr Val Asp275 280 285Asp Thr Tyr Asn Ala Gln Ser Met Cys Pro Tyr Glu Thr Val Ala Leu290 295 300Gly Tyr Ser Pro Phe Cys Thr Leu Phe Ser Trp Glu Glu Trp Gln Gly305 310 315 320Phe Gln Tyr Val Asn Asp Leu Asn Leu Tyr Gly Asn Tyr Gly Met Gly325 330 335Ser Pro Val Gly Arg Ala Ile Gly Leu Gly Phe Val Glu Glu Leu Ile340 345 350Ala Arg Leu Gln Gly Gln Ile Pro Asn Pro Pro Glu Asp Ser Iie Gly355 360 365Phe Asn Gln Ser Leu Asp Asp Ser Ala Ala Thr Phe Pro Leu Asn Gln370 375 380Thr Ile Tyr Phe Asp Phe Ser His Asp Asn Glu Met Phe Ser Met Leu385 390 395 400Thr Ala Leu Gly Leu Thr Gln Phe Gly Asp Tyr Leu Ser Pro Thr Lys405 410 415Pro Ser Ala Asp Arg Ser Leu Ile Gly Ser His Ile Val Pro Phe Ser420 425 430Ala Thr Phe Val Phe Glu Ile Ile Lys Ala Pro Gly Leu Val Arg Glu435 440 445Asn Arg Ser Lys Tyr Cys Gly Glu Ser Val Tyr Glu Asn Thr Ser Glu450 455 460Glu Thr Thr Tyr Ile His Leu Val Ile Asn Gln Arg Thr Val Pro Leu465 470 475 480Gly Gln Ser Ile Ser Ala Cys Gly Gln Arg Asp Asp Gly Trp Cys Glu485 490 495Ile Ser Ala Phe Ile Gln Ala Gln Lys Glu Asn Ile Val Lys Ala Asn500 505 5l0Tyr Glu Glu Ser Cys Phe Gly Asn Trp Ser Ile Pro Ala Tyr Gly Glu515 520 525Ile Arg Asp Gly Ala Ile Pro Lys Asn Ala Thr Ser530 535 540<210>4<211>2757
<212>DNA<213>繩狀青霉(Penicillium funiculosum)<400>4tgtattgttg tttgtcgaag tcgatttccc egttgttacg attctagcaa gaagattaat 60acatgcagtt ctcaaacaaa gctcaaggga catgcttact ccatggcgaa caagatagat 120ggtgtctaga ggcatcgcat cgaaaggccg tcttggctgt attgatagat ttgattgaac 180agttgraagt tctcaatttt tctagccttt atacttctaa aggcaaactc tccatcaaaa 240agtttgcttc gatacctaca cctggaatcc actttccgat agactgcaat gcccactatg 300accagtgccc acttgcagtc gccaagtttc atttaacttc ctgagacctt ttttggataa 360acctaaagca aagcgagccg acataattgc ctcatctgat aaagaatgaa atcaagttta 420gccaacagcg gataaagcaa tatcgcgcct tggttcttaa taggcgttca gtacctgaca 480atgcagcttc ttggaccagt tattatcggc aaatgtaaat gcttaggata ggcccaacga 540actcactaat gaggtcccaa atcggaagtc tccagctacc ccagattgtc aaaagccggg 600gtaggaatat ggcgctcgct atgttgtcta ttcgggcaga aagtcgtgtg acagagagag 660ttataaataa ccttggaaag cttcgtaatg gacactttgt accggacttc caagattctg 720ttaacattca ttgttcttct gttcatttga ttttatacaa aagaatcaac agtgtattct 780cattagcatg atgctcaagc tatgtgtagc tgcctgtttg gtggtggccg gtgtttctat 840cccgacagac cctacagtaa ctcaagtccc ggattacttc caaacaagct atgggccata 900tgcaggtatg gtaatacgtg taacttgtca aagagtccca gggctcacag gctataggtg 960ctactaaagc cggagacgct ccgttccttg cgcaaaccaa cccagtctat tcccagccga 1020cctatgtcgc aaacacgcca ttggtgacta ctcttcccat atctggtgaa ccccatgacg 1080ggaacatatt cggctggatg gggactttga ggtatgtatt ctcttgcgct gaagtgccgt 1140tactacggat ggaactaatt tgatacaaaa cagtccttac cagcccagcc ctgatggatt 1200tggcgtggat gaatatcctc tccctcccgg tgcaaacatt acgcaaatcc atatggtgca 1260tcgccatggc tcgcgctatc cgacagcaaa ctccgccatt agcagttggg caaagaagat 1320aatgcagtat cgatccaacg gcaccgtgtt ctcaggcgaa cttgattttc tgaacacttg 1380gaactaccag cttggacagg cagagctaac agcacgaggt cggcaagagt tattcgatag 1440cggtgttctg cattggttca attatggaaa gctctacgat cctgcgtcga aaatcattgc 1500tcgtacgaca acgatggtgc ggatgttgca atcggctgag aacttcctca acgggttttt 1560tggtccaaac tggaacaata atgcgacact tgaagttatt attgaaagta ccgggttcaa 1620caactccctc gcagggaatg atatgtgtcc caatgcaaaa aatacatcag gaggcgatgc 1680agtagatgaa tggacctcgc tatacttgca gaaagcgaca aatcgcttta gaagtgaaat 1740atcaggaagc ctgaactgga ctgttgacga cacctacaat gcacaatcta tgtgcccata 1800tgagacggtt gcccttggtt atagcccgtt ttgcacsttg ttttcttggg aggaatggca 1860agggttccag tatgctaacg atttgaacct ccatgggaat tatggcatgg gatccccagt 1920aggccgcgcc attgggcttg gattcgtcga agaattaatt gcaaggttgc aaggacaatt 1980tccaacaccc cctgaagact caattgtttt caatcaatcg ctagatcaga gtgcggcaac 2040cttccctctc aaccaaacta tctacttcga tttcagccac gacaacgaga tgttctccat 2100gttaactgcc ctgggctcaa cacaatttgg ggactacctc tctcccacaa agccctctgc 2160cgatcgttcg ttgattggaa gccatatcgt cccgttctcg gctacctttg tgtttgagat 2220catcaaagca cctggccctg tacgagagga tcgatcaaag tattgcggtg aaagtgtgta 2280tgaaaacact agcgaggaga caacctacat acatctcgtc attaaccaga ggactgttcc 2340tcttggtcaa agcatttcag catgcggaca acgagatgat ggttggtgtg agattcccgc 2400cttcattcag gcgcagaaag acaacattga gaaggcaaat tacgagcaaa gctgctttgg 2460aaactggagt atcccggcgt acggccagat tagagatggc gctattccga agaatgccac 2520ttcctaactg ctatattaga tgcccccgaa agtttagaca ggagatagta ctcgtcagga 2580ggcccatatc tcagccagcc acagcactgc ggagcgatga agggttgaat atagcacacc 2640gcggggtgct tgatcccaag tttgggaagc cggatttaga cattttaatt ctctgttagg 2700tatatttatg ctacgtagct gatttttgtc caatcgacca atttcatctc cgatatc2757<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸PN3<400>5ccgttggtaa ccagcggagg gatc24<210>6
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸PN4<400>6ccttggtccg tgtttcaaga cggg24<210>7<211>1175<212>DNA<213>青霉屬CBS 109899<400>7ccgttggcaa ccagcggagg gatcattacc gagtgcgggc cctcgcggcc caacctccca 60cccttgtctc tatacacctg ttgctttggc gggcccaccg gggccacctg gtcgccgggg 120gacgcacgtc cccgggcccg cgcccgccga agcgcgctgt gaaccctgat gaagatgggc 180tgtctgagta ctatgaaaat tgtcaaaact ttcaacaatg gatctcttgg ttccggcatc 240gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattccg tgaatcatcg 300aatcttcgaa cgcacattgc gccccctggc attccggggg gcatgcctgt ccgagcgtca 360tttctgccct caagcacggc tggtgtgttg ggtgtggtcc ccccggggac ctgcccgaaa 420ggcagcggcg acgtccgtct ggtcctcgag cgtatggggc tctgtcactc gctcgggaag 480gacctgcggg ggttggtcac caccacattt taccacggtt gacctcggat caggtaggag 540ttacccgctg aacttaagca tatcaataag cggaggaaaa gaaaccaacc gggattgcct 600cagtaacggc gagtgaagcg gcaagagctc aaatttgaaa tctggcccct ttggggtccg 660agttgtaatt tgcagaggat gcttcgggtg cggtccccgt ctaagtgccc tggaacgggc 720cgtcatagag ggtgagaatc ccgtctggga tgggcggccg cgcccgtgtg aagctccttc 780gacgagtcga gctgtttggg aatgcagctc taagcgggtg gtaaatttca tctaaagcta 840aatactggcc ggagaccgat agcgcacaag tagagtgatc gaaagatgaa aagcactttg 900aaaagagagt caaacagcac gtgaaattgt tgaaagggaa gcgttgtcca ccagactcgc 960ccgggggggt tcagccggca cgtgtgccgg tgtactcctc tccgggcggg ccagcatcgg 1020tttgggcggc tggtgaaagg ccccgggaat gtaacaccct tcggggtgcc ttatagcccg 1080gggtgccata cagccagcct ggaccgaggc ccgcgcttcg gcgaggatgc tggcgcaatg 1140gtggtcaacg gcccgtcttg aaacacggac caagg1175<210>8<211>11<212>PRT<213>青霉屬CBS 109899<220>
<221>待定<222>(9)<223>Xaa＝Gln或Val<400>8Ile Pro Thr Asp Pro Gln Val Pro Xaa Tyr Phe1 5 10<210>9<211>17<212>PRT<213>青霉屬CBS 109899<400>9Thr Ser Gly Gly Asp Ala Val Asn Glu Trp Thr Ala Leu Tyr Leu Gln1 5 10 15Lys
<210>10<211>20<212>PRT<213>青霉屬CBS 109899<400>10Ala Gly Gly Ala Pro Phe Let Ala Gln Xaa Asn Pro Ile Tyr Xaa Gln1 5 10 15Pro Xaa Tyr Val20<210>11<211>7<212>PRT<213>青霉屬CBS 109899<400>11Leu Tyr Asp Pro Ala Ser Lys1 5<210>12<211>6<212>PRT<213>青霉屬CBS 109899<400>12Ala Pro Gly Leu Val Arg1 5<210>13<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸OT ACS 17 P4.4<400>13acngayccnc argtccc17<210>14<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸OT ACS 25 P6.1<400>14gcngtccayt crttnac17<210>15<211>846<212>DNA<213>青霉屬CBS 109899
<400>15acagatcccc aggtcccgga ttacttccaa acgagctatg ggccatatgc aggtatggaa 60atatgcgtac cctgacaaag gctattaggg ctcaacaggc tacaggtgct accaaagccg 120gaggcgctcc gttccttgcg caaaccaatc cgatctattc ccagccgacc tacgtcgcaa 180acacgccatt ggtgacaact cttcccatat ctggtgaacc ccatgacgga aacatattcg 240gctggatggg gactttgagg tatgtattat ctttcgctga agtaccgtta gtacggatga 300aactgatctt agacaaaaca gtccttacca acccagccct gatggatttg gcgtggatga 360atatcctctc cctcccggtg caaacattac gcaaatccat atggtgcatc gccatggctc 420gcgctatccg acgtcaaatt ccgcaatcag cgattgggct aagaaaataa tgcagtatcg 480atccaacggc acagtgttct caggcgaact tgagtttctg aacgcttgga actatcagct 540cggacaggca gagccaacag cacgaggtcg gcaagagtta ttcgacagcg ggattctaca 600ttggttcaat tatggaaagc tctacgatcc tgcatcaaaa atcatagctc gcacaacaac 660gatggtgagg atgttgcaat cagcggagaa cttcctcaat ggattttttg gcccaaactg 720gactaataat gcgacgcttg aagtcattat tgaaagtacc gggtttaaca actccctcgc 780agggaatgat aagtgtcgca atgcaaaaaa tacatcgggg ggcgacgcag taaatgaatg 840gaccgc846<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸OT ACS 32 P5<400>16ccatcagggc tgggttggta aggactg 27<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸OT ACS 32 P5<400>17ctggactaat aatgcgacgc ttgaagtc28<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸OT ACS 38 P1<400>18ggctttgctg gtgcggggtg agtc24<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸OT ACS 38 P2
<400>19cctgcgggt cgtaactttg tttgtaactt gac 33<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸OT ACS 37 P1<400>20ggcgctccgt tccttgcgca aac 23<210>21<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸OT ACS 37 P3<400>21gtaggtcggc tgggaataga tcg 23<210>22<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸phyGoamp4<400>22tagatatcac gatgctcaag ctatatgtag ctgc 34<210>23<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸phyGoamp5<400>23atactagttt aggacgtagc attcttcgga atag 3權(quán)利要求
1.一種編碼肌醇六磷酸酶的分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸選自(a)編碼序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示肌醇六磷酸酶的分離的多核苷酸(b)與(a)所述的多核苷酸雜交的分離的多核苷酸(c)與(a)所述的多核苷酸同源的分離的多核苷酸(d)(a)、(b)或(c)所述多核苷酸的片段。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸選自序列標(biāo)識符SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示序列。
3.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸是序列標(biāo)識符SEQID NO4所示序列。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸源自青霉屬真菌。
5.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含權(quán)利要求1-4中任一項所述多核苷酸。
6.一種肌醇六磷酸酶，其特征在于，所述肌醇六磷酸酶由權(quán)利要求1-5中任一項所述多核苷酸編碼。
7.如權(quán)利要求6所述的肌醇六磷酸酶，其特征在于，所述肌醇六磷酸酶選自(a)序列標(biāo)識符SEQ ID NO3所示的肌醇六磷酸酶(b)與(a)所述肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶(c)(a)或(b)所述肌醇六磷酸酶的片段
8.如權(quán)利要求6或7所述的肌醇六磷酸酶，其特征在于，所述肌醇六磷酸酶源自青霉屬真菌。
9.如權(quán)利要求8所述的肌醇六磷酸酶，其特征在于，所述肌醇六磷酸酶源自青霉屬CBS 109899菌株。
10.一種嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因至少包括彼此功能相聯(lián)的(a)一個在宿主生物中有功能的啟動子(b)如權(quán)利要求1-5中任一項所述多核苷酸(c)一個在宿主生物中有功能的終止元件。
11.如權(quán)利要求10所述的嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因還包括在所述宿主生物中有功能的信號肽或轉(zhuǎn)運肽。
12.一種表達(dá)或轉(zhuǎn)化載體，其特征在于，所述載體包括權(quán)利要求10或11所述的嵌合基因。
13.如權(quán)利要求12所述的載體，其特征在于，所述載體是質(zhì)粒、噬菌體或病毒。
14.一種轉(zhuǎn)化的宿主生物，其特征在于，所述宿主生物包含權(quán)利要求10或11所述的嵌合基因。
15.如權(quán)利要求14所述的宿主生物，其特征在于，所述宿主生物是微生物。
16.如權(quán)利要求15所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物選自細(xì)菌、真菌、酵母或病毒。
17.如權(quán)利要求16所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物是選自棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和埃希氏菌屬的細(xì)菌，尤其是大腸桿菌。
18.如權(quán)利要求16所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物是選自青霉屬、曲霉屬、金孢霉菌屬或木霉菌屬的真菌。
19.如權(quán)利要求16所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物是選自酵母、克魯維酵母和畢赤酵母屬的酵母。
20.如權(quán)利要求14所述的宿主生物，其特征在于，所述宿主生物是植物細(xì)胞、植物或植物的一部分。
21.一種制造具肌醇六磷酸酶活性的提取物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)在可表達(dá)所述肌醇六磷酸酶的條件下培養(yǎng)具有權(quán)利要求1-5中任一項所述多核苷酸的生物體(b)濃縮步驟(a)中培養(yǎng)的生物體(c)破裂步驟(b)中分離的生物體細(xì)胞(d)離心步驟(c)中獲得的破裂細(xì)胞提取物(e)回收從步驟(d)獲得的具肌醇六磷酸酶活性的上清。
22.一種制造具肌醇六磷酸酶活性的提取物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)在可表達(dá)所述肌醇六磷酸酶的條件下培養(yǎng)具有權(quán)利要求1-5中任一項所述多核苷酸的生物體(b)通過去除所述生物體來回收培養(yǎng)基。
23.一種制造如權(quán)利要求6-9中任一項所述肌醇六磷酸酶的方法，其特征在于，所述方法包括權(quán)利要求21或22所述方法的所有步驟，其中加入了以下額外步驟(f)在權(quán)利要求21所述方法中加入從步驟(e)回收的上清中純化肌醇六磷酸酶的步驟(c)在權(quán)利要求22所述方法中加入從步驟(b)回收的培養(yǎng)基中純化肌醇六磷酸酶的步驟。
24.如權(quán)利要求21、22或23中任一項所述的產(chǎn)生方法，其特征在于，所述生物體是微生物。
25.如權(quán)利要求24所述的產(chǎn)生方法，其特征在于，所述微生物是真菌。
26.如權(quán)利要求25所述的產(chǎn)生方法，其特征在于，所述真菌是青霉屬真菌。
27.如權(quán)利要求26所述的產(chǎn)生方法，其特征在于，所述青霉屬真菌是青霉屬CBS109899菌株。
28.一種制造具肌醇六磷酸酶活性的提取物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)權(quán)利要求14-20中任一項所述的轉(zhuǎn)化的宿主生物(b)濃縮步驟(a)中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化的宿主生物(c)破裂步驟(b)中分離的生物體細(xì)胞(d)離心步驟(c)中獲得的破裂細(xì)胞提取物(f)回收從步驟(d)獲得的具肌醇六磷酸酶活性的上清。
29.一種制造具肌醇六磷酸酶活性的提取物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)權(quán)利要求14-20中任一項所述的轉(zhuǎn)化的宿主生物(b)通過去除所述轉(zhuǎn)化的生物體來回收培養(yǎng)基。
30.一種制造如權(quán)利要求6-9中任一項所述的肌醇六磷酸酶的方法，其特征在于，所述方法包括權(quán)利要求28和29所述方法的所有步驟，其中加入了以下額外步驟(f)在權(quán)利要求28所述方法中加入從步驟(e)回收的上清中純化肌醇六磷酸酶的步驟(c)在權(quán)利要求29所述方法中加入從步驟(b)回收的培養(yǎng)基中純化肌醇六磷酸酶的步驟。
31.一種酶組合物，其特征在于，所述組合物包含至少一種權(quán)利要求6-9中任一項所述的肌醇六磷酸酶。
32.一種飼料組合物，其特征在于，所述組合物包含至少一種權(quán)利要求14-20中任一項所述的轉(zhuǎn)化的宿主生物。
33.一種飼料組合物，其特征在于，所述組合物包含至少一種生物體，該生物體具有權(quán)利要求1-5中任一項所述的多核苷酸。
34.如權(quán)利要求33所述的飼料組合物，其特征在于，所述生物體是真菌。
35.如權(quán)利要求34所述的飼料組合物，其特征在于，所述真菌是青霉屬真菌。
36.如權(quán)利要求35所述的飼料組合物，其特征在于，所述真菌是青霉屬CBS109899菌株。
37.一種飼料組合物，其特征在于，所述組合物包含至少一種權(quán)利要求6-9中任一項所述肌醇六磷酸酶。
38.如權(quán)利要求32-37中任一項所述的飼料組合物在單胃動物營養(yǎng)物中的應(yīng)用。
39.如權(quán)利要求38所述的飼料組合物的應(yīng)用，其特征在于，用于豬營養(yǎng)物。
40.如權(quán)利要求38所述的飼料組合物的應(yīng)用，其特征在于，用于家禽營養(yǎng)物。
41.一種制造如權(quán)利要求32所述的飼料組合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)權(quán)利要求14-20中任一項所述的宿主生物(b)濃縮步驟(a)中培養(yǎng)的宿主生物(c)將步驟(b)中分離的宿主生物摻入所述飼料組合物。
42.一種制造如權(quán)利要求33-36所述的飼料組合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)在可表達(dá)所述肌醇六磷酸酶的條件下培養(yǎng)具有權(quán)利要求1-5中任一項所述多核苷酸的生物體(b)濃縮步驟(a)中培養(yǎng)的生物體(c)將步驟(b)中分離的生物體摻入所述飼料組合物。
43.一種制造如權(quán)利要求37所述的飼料組合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)在可表達(dá)所述肌醇六磷酸酶的條件下培養(yǎng)具有權(quán)利要求1-5中任一項所述多核苷酸的生物體(b)濃縮步驟(a)中培養(yǎng)的生物體(c)破裂步驟(b)中分離的生物體細(xì)胞(d)離心步驟(c)中獲得的破裂細(xì)胞提取物(e)回收從步驟(d)獲得的具肌醇六磷酸酶活性的上清(f)將步驟(e)中回收的上清摻入所述飼料組合物。
44.一種制造如權(quán)利要求37所述的飼料組合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)在可表達(dá)所述肌醇六磷酸酶的條件下培養(yǎng)具有權(quán)利要求1-5中任一項所述多核苷酸的生物體(b)通過去除所述生物體來回收培養(yǎng)基(c)將步驟(b)中回收的培養(yǎng)基摻入所述飼料組合物。
45.一種制造如權(quán)利要求37所述的飼料組合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)如權(quán)利要求14-20中任一項所述的轉(zhuǎn)化的宿主生物(b)濃縮步驟(a)中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化的宿主生物(c)破裂步驟(b)中分離的生物體細(xì)胞(d)離心步驟(c)中獲得的破裂細(xì)胞提取物(e)回收從步驟(d)獲得的具肌醇六磷酸酶活性的上清(f)將步驟(e)中回收的上清摻入所述飼料組合物。
46.一種制造如權(quán)利要求37所述的飼料組合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)如權(quán)利要求14-20中任一項所述的轉(zhuǎn)化的宿主生物(b)通過去除所述轉(zhuǎn)化的宿主生物來回收培養(yǎng)基(c)將步驟(b)中回收的培養(yǎng)基摻入所述飼料組合物。
47.如權(quán)利要求43或45所述的方法，其特征在于，步驟(f)被以下步驟取代(f)從步驟(e)回收的上清中純化肌醇六磷酸酶(g)將步驟(f)中純化的肌醇六磷酸酶摻入所述飼料組合物。
48.如權(quán)利要求44或46所述的方法，其特征在于，步驟(c)被以下步驟取代(c)從步驟(b)回收的上清中純化肌醇六磷酸酶(d)將步驟(c)中純化的肌醇六磷酸酶摻入所述飼料組合物。
49.一種增加單胃動物吸收無機(jī)磷的方法，所述無機(jī)磷含在以植物為基礎(chǔ)的飼料的肌醇六磷酸中，其特征在于，權(quán)利要求6-9中任一項所述的肌醇六磷酸酶或權(quán)利要求31所述的酶組合物被摻入所述動物營養(yǎng)物。
50.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述單胃動物用權(quán)利要求32-37中任一項所述的飼料組合物喂養(yǎng)。
51.一種減少單胃動物營養(yǎng)物中磷加入的方法，其特征在于，所述單胃動物用權(quán)利要求32-37中任一項所述的飼料組合物喂養(yǎng)。
52.一種減少來自單胃動物營養(yǎng)物的磷釋放的方法，其特征在于，所述單胃動物用權(quán)利要求32-37中任一項所述的飼料組合物喂養(yǎng)。
53.一種青霉屬的絲狀真菌，其特征在于，所述真菌的保藏號為CBS 109899。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的肌醇六磷酸酶，尤其是真菌來源，同時涉及它們各自的產(chǎn)生方法。本發(fā)明更特定涉及獲得自青霉屬真菌的新肌醇六磷酸酶，尤其是青霉屬CBS109899菌株，也涉及編碼這些肌醇六磷酸酶的多核苷酸。發(fā)明同樣涉及含這些多核苷酸的載體、在組織中表達(dá)所述肌醇六磷酸酶的轉(zhuǎn)化的宿主生物。
文檔編號C12N7/00GK1602357SQ02824611
公開日2005年3月30日 申請日期2002年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月10日
發(fā)明者O·泰斯特尼爾, R·寶爾曼, J·皮拉德, D·索尼爾, O·諾爾, F·牟蘇 申請人:埃迪塞歐法國聯(lián)合股份有限公司