因子ⅷc2結構域變體的制作方法

專利名稱：因子ⅷc2結構域變體的制作方法
技術領域：
本發明一般涉及包含氨基酸取代的修飾的哺乳動物因子VIII，與獲得它們的蛋白質或其它因子VIII制品，如人因子VIII相比，所述氨基酸取代降低了其免疫原性和/或抗原性。
背景技術：
當血小板附于損傷位置的受損血管切口時，血液凝固開始。隨后，在酶調節的級聯反應中，可溶纖維蛋白原分子被凝血酶轉化成纖維蛋白的不溶鏈，使血小板在血栓中保持一起。在級聯反應各步，蛋白質前體轉化成蛋白酶，裂解此系列中的下一個蛋白質。大部分步驟需要輔因子。
因子VIII作為血液中失活前體循環，緊密且非共價結合馮維勒因子。因子VIII由凝血酶或因子Xa蛋白分解活化，使它與馮維勒因子分離并活化它在級聯中的促凝血功能。活性形式的蛋白因子VIII是一種輔因子，使因子IXa對因子X活化的催化效率增加幾個數量級。
因子VIII或抗因子VIII抗體有缺陷的人不用因子VIII治療不能控制內出血，內出血會引起多種嚴重癥狀，從關節炎癥反應到早期死亡。美國約有10,000個嚴重血友病患者，他們可通過灌輸人因子VIII來治療，如果以足夠頻率和濃度施用人因子VIII能恢復血液正常的凝固能力。因子VIII的經典定義是正常血漿中存在的物質，修正血友病A個體血漿中的凝固缺陷。
抑制因子VIII活性的抗體(“抑制劑”或“抑制抗體”)的發展是治療血友病患者中的一個嚴重并發癥。約20％血友病A患者中自身抗體應答因子VIII的治療灌輸而發生。在前面發展抗體的未治療血友病A患者中，抑制劑通常在治療一年內發生。此外，使因子VIII失活的自身抗體偶爾在前面具正常因子VIII水平的個體中發展。因子VIII(fVIII)的抑制抗體(抑制劑)可在接受因子VIII灌輸的血友病A患者中作為同種抗體發展，或在非血友病患者中作為自身抗體發展[Hoyer，L.W.和D.Scandella(1994)Semin.Hematol.311-5]。A1-A2-B-ap-A3-C1-C2 fVIII分子中的A2、ap-A3和C2結構域抗原表位的抗體在大部分抑制劑血漿中產生抗凝血作用[Prescott，R.等，(1997)Blood 893633-3671；Barrow，R.T.等，(2000)Blood 95557-561]。18-kDa C2結構域定義為單鏈人因子VIII中的絲氨酸2173-酪氨酸2332殘基，包含因子VIII正常促凝血功能必需的磷脂膜結合位點。特異于C2結構域的人抗因子VIII抗體抑制此相互作用[Arai，M.等，(1989)J.Clin.Invest.831978-1984]。與此一致的是，磷脂保護因子VIII不被因子VIII抑制劑失活[Arai，M.等，同上；Barrowcliffe，T.W.等，(1983)J.Lab.Clin.Med.10134-43]。C2結構域也包含部分馮維勒因子(vWf)結合位點[Saenko，E.L.等，(1994)J.Biol.Chem.26911601-11605；Saenko，E.L.和Scandella，D.(1997)J.Biol.Chem.27218007-18014]。一些抑制劑可通過干擾此相互作用來見效[Shima，M.等，(1995)Br.J.Haematol.91714-721；Saenko，E.L.等，(1994)J.Biol.Chem.27127424-27431；Gilles，J.G.等，(1999)Thromb.Haemost.8240-45]。
倘若抑制劑效價足夠低，治療血友病A患者可通過增加因子VIII的劑量。然而，通常抑制劑效價高到不能通過施用因子VIII克服。另一種策略是繞過正常止血中對因子VIII的需要，使用因子IX復合制品(例如KONYNE，Proplex)或重組人因子VIIIa。此外，由于豬因子VIII與抑制劑的反應性通常顯著低于人因子VIII，使用部分純化的豬因子VIII制品(HYATEC)。許多發展人因子VIII抑制抗體的病人成功地用豬因子VIII治療且長時間耐受這種治療。然而，施用豬因子VIII還不是完善的方法，因為一次或多次灌輸后抑制劑可對豬因子VIII發展。
一些獲自人血漿的因子VIII不同純度制品可商業購買用于治療血友病A。這些包括獲自許多供體收集血液的部分純化因子VIII，用熱和去垢劑處理病毒但含顯著水平的抗原性蛋白質；單克隆抗體-純化因子VIII，具較低水平的抗原性雜質和病毒感染；以及正在進行臨床試驗的重組人因子VIII。不幸的是，人因子VIII在生理濃度和pH不穩定，在血液中存在濃度非常低(0.2μg/ml血漿)，特異凝固活性低。
血友病患者需要每天更新因子VIII以防止出血和導致變形性血友病關節病。然而，供給不足和治療使用中出現的問題是由于分離和純化中的困難、免疫原性和被病毒(如HIV、肝炎病毒等)感染的風險造成的。使用重組人因子VIII或部分純化的豬因子VIII不能解決所有問題。
與普遍使用、商業購買、獲自血漿的因子VIII相關的問題引起發展更好因子VIII產品的巨大興趣。需要具更特異活性的因子VIII分子從而適當凝固活性可以較小劑量傳送；在所選pH和生理濃度穩定的因子VIII分子；免疫原性較小的因子VIII分子；在已發展出人因子VIII抗體的病人中不被抑制的因子VIII分子。
Lollar的美國專利6,180,371描述了人因子VIII A2結構域中的氨基酸取代，取代改變所得因子VIII分子的抗原性。Lollar的美國專利5,859,204揭示了人因子VIII 484-509區域中的氨基酸位點特異取代。更具體的是，所述’204專利教授了修飾因子VIII相對人蛋白質在位置485、487、488、489、492、501或508發生氨基酸取代。Lollar等的美國專利5,888,974揭示了雜合促凝血因子VIII，通過分離和重組人與其它非人因子VIII亞基或結構域來產生。Lollar等的美國專利5,663,060描述了雜合因子VIII，具有非人和人的重及輕鏈亞基的組合。美國專利5,583,209描述了編碼’060專利中雜合因子VIII分子的核酸。美國專利5,364,771描述了純化的雜合因子VIII，由人和豬的重及輕鏈亞基組合形成。同樣揭示了人因子VIII，其中豬A2結構域取代人A2結構域。
美國專利6,180,371；5,888,974；5,859,204；5,744,446；5,663,060；5,583,209和5,364,771(所有納入本文供參考)沒有揭示因子VIII C2結構域中的取代或提出特異氨基酸取代，取代會導致抗原性或免疫原性低于野生型因子VIII或相應重組因子VIII。
因此，本發明的一個目的是提供修正患者血友病的修飾因子VIII，患者缺乏因子VIII或具有因子VIII C2結構域的抑制抗體。
本發明的進一步目的是提供治療血友病的方法。
本發明的另一個目的是提供在所選pH和生理濃度穩定的因子VIII。
本發明的又一個目的是提供凝血活性高于人因子VIII的因子VIII。
發明概述本發明一般涉及重組修飾因子VIII。本發明的組合物提供分離、純化的重組修飾因子VIII分子，分子具凝血活性，其中重組因子VIII在C2結構域有氨基酸取代使抗原性低于正常人因子VIII或其它具正常人因子VIII C2結構域的因子VIII。以提供編碼本發明的組合物的DNA序列以及產生修飾因子VIII的方法。治療需要因子VIII處理的病人的方法也在本發明范圍內。
發明的第一個實施方案提供的組合物含C2結構域有氨基酸取代的哺乳動物因子VIII。修飾重組因子VIII C2結構域中的氨基酸取代使抑制抗體抗凝血活性低于正常人因子VIII或其它具正常人因子VIII C2結構域的因子VIII。此實施方案的組合物有凝血活性且減少與定向抗C2結構域的抑制抗體的結合。
在此實施方案的一個方面，組合物涉及C2結構域有至少一個氨基酸取代的重組哺乳動物因子VIII，取代位置對應于人因子VIII的R2215、W2313、R2220、R2320、Y2195、F2196和F2290。此實施方案的組合物可以是單突變、雙突變、三突變或其它多突變。發明的氨基酸取代例子包括但不限于R2215A、R2215K、W2313A、W2313F、R2220A、R2220K、R2320A、R2320K、Y2195H、Y2195A、F2196L、F2196A、F2290S和F2290A，它們都涉及人因子VIII編號系統，其中氨基酸1號是成熟因子VIII的氨基末端丙氨酸。優選重組豬或人因子VIII中的取代。優選的氨基酸取代包括降低免疫反應性的取代。優選在位置2220、2196和2215取代。
發明的第二個實施方案提供新的雜合因子VIII組合物，含C2結構域有氨基酸取代的重組因子VIII。此實施方案的新組合物通過制備C2結構域有氨基酸取代的雜合因子VIII來構建。因子VIII的其它結構域可獲自多種哺乳動物如人、小鼠、豬、大鼠和犬等。此實施方案的新組合物有凝血活性且減少與抑制抗體的結合。發明的氨基酸取代例子包括但不限于R2215A、R2215K、W2313A、W2313F、R2220A、R2220K、R2320A、R2320K、Y2195H、Y2195A、F2196L、F2196A、F2290S和F2290A，它們都涉及人因子VIII編號系統，其中氨基酸1號是成熟因子VIII的氨基末端丙氨酸。優選重組豬或人因子VIII中的取代。優選的氨基酸取代包括降低免疫反應性的取代。優選在位置2220、2196和2215取代。
發明的另一個實施方案提供DNA序列，包括本發明新組合物的編碼序列。發明的又一個實施方案提供產生發明新組合物的方法。
發明也提供降低因子VIII分子免疫原性的方法以及通過此方法生成的免疫原性減少的重組因子VIII。具體的是，描述了修飾重組因子VIII分子和產生這些免疫原性減少的分子的方法，免疫原性減少的分子在C2結構域有取代。
還提供了了治療因子VIII缺陷病人的藥物組合物和方法，包括施用重組修飾因子VIII和其雜合物。
附圖簡述

圖1A-1H一起提供了人、豬和小鼠因子VIII氨基酸序列的序列比對。
發明詳述本發明一般涉及重組修飾因子VIII。本發明的組合物提供了具有凝血活性的分離、純化的重組修飾因子VIII分子。發現因子VIII C2結構域中的突變使突變體抑制抗體的結合低于正常人因子VIII或具有正常人因子VIII C2結構域的因子VIII，突變已用最近獲得的x-射線結構鑒定。因此，本發明的組合物提供了在C2結構域有氨基酸取代的重組因子VIII，這種取代使其抗原性低于正常人因子VIII或具正常人因子VIII C2結構域的因子VIII。此外，本發明還提供了在C2結構域有氨基酸取代的重組因子VIII，這種取代使其抗原性低于其它可獲得的因子VIII制品。本發明還提供了在C2結構域有降低免疫原性的氨基酸取代的重組因子VIII。發明的相關實施方案提供了治療需要因子VIII處理的病人的方法、制造本發明的新重組因子VIII組合物的方法、編碼新重組因子VIII蛋白質的DNA序列、以及包含新因子VIII蛋白質的藥物組合物。
本發明進一步提供活性重組雜合因子VIII分子或其片斷、編碼這些雜合物的核酸序列、制備和分離它們的方法以及確定它們特征的方法。這些雜合物可以是人/動物、動物/動物、豬/人或其它這類雜合因子VIII分子，且進一步具有至少一個C2結構域的特異氨基酸序列，包括一類因子VIII的一個或多個獨特氨基酸用于取代其它類因子VIII的對應氨基酸序列(或氨基酸)；或具有至少一種C2結構域的序列，包括與因子VIII沒有已知序列同一性的一個或多個氨基酸，因子VIII取代人、動物、豬或雜合因子VIII中的特異氨基酸序列。所得重組雜合因子VIII與獲得該因子的蛋白質相比，對因子VIII抑制抗體的免疫反應性降低或消失。
如本文所用，“對應的”核酸或氨基酸或兩者的序列存在于因子VIII分子或其片斷的位點中，結構和/或功能與其它種類因子VIII分子的位點相同，盡管核酸或氨基酸數量可能不同。“對應于”另一種類因子VIII序列的DNA序列完全對應此序列并在嚴緊條件下與指定的SEQ ID NO.序列雜合。“對應于”另一種因子VIII序列的DNA序列也包括一種序列，此序列使VIII或其片斷表達，且如果不是因為遺傳密碼的簡并性會與指定的SEQ ID NO.序列雜合。
“獨特”氨基酸殘基或序列在這里指一個種類因子VIII分子中的氨基酸序列或殘基，它與另一種類因子VIII序列分子中的同源殘基或序列不同。
“特異活性”在這里是指會修正人因子VIII缺乏血漿的凝固缺陷的活性。特異活性在標準測定中以凝固活性單位每毫克總因子VIII蛋白質測量，其中人因子VIII缺乏血漿的凝固時間與正常人血漿相比較。一個單位的因子VIII活性是一毫升正常人血漿中存在的活性。在測定中，凝固形成時間越短，所測因子VIII活性活性越高。豬因子VIII在人因子VIII測定中具有凝固活性。
“表達”指使用遺傳信息生成產物時發生的一系列過程。編碼豬因子VIII氨基酸序列的DNA可在哺乳動物宿主細胞中“表達”以產生豬因子VIII蛋白質。物質、遺傳結構、宿主細胞和可表達特定DNA序列的條件在本領域熟知且可操作用于影響表達的時間和量以及表達蛋白質的胞內或胞外位置。例如，通過在編碼豬因子VIII的DNA 5’末端(5’末端習慣指編碼蛋白質NH2末端的終端)包含編碼信號肽的DNA，表達蛋白質從宿主細胞內部運輸到培養基中。信號肽編碼DNA結合豬因子VIII編碼DNA具有優勢，因為表達因子VIII輸出到培養基中使純化過程簡化。優選信號肽是哺乳動物因子VIII信號肽。
因子VIII作為約300kDa的單鏈肽合成，內部序列同源定義“結構域”序列NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH。如本文所用，因子VIII分子中的“結構域”是連續氨基酸序列，由內部氨基酸序列同一性和凝血酶蛋白裂解位點定義。除非另有說明，當序列與人氨基酸殘基序列排列時，因子VIII結構域包括下列氨基酸殘基序列A1，殘基Ala1-Arg372；A2，殘基Ser373-Arg740；B，殘基Ser741-Arg1648；A3，殘基Ser1690-Ile2032；C1，殘基Arg2033-Asn2172；C2，殘基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括殘基Ser1690-Tyr2332。剩余部分是殘基谷氨酸1649-精氨酸1689，通常稱為因子VIII輕鏈活化肽。因子VIII被凝血酶或因子Xa蛋白裂解活化，使它與馮維勒因子分離并形成具促凝血功能的因子VIIIa。因子VIIIa的生物功能是使因子IXa對因子X活化的催化效率增加幾個數量級。凝血酶活化的因子VIIIa是160kDa A1/A2/A3-C1-C2異三聚物，在血小板或單核細胞表面與因子IXa和因子X形成復合體。如本文所用，“部分結構域”是形成部分結構域的連續氨基酸序列。
如本文所用，人或動物因子VIII的“亞基”是蛋白質的重和輕鏈。因子VIII的重鏈包含三個結構域A1、A2和B。因子VIII的輕鏈也包含三個結構域A3、C1和C2。
術語“抗原表位”、“抗原位置”和“抗原決定簇”在這里可同義使用，并定義為被抗體特異識別的人或動物因子VIII部分或其片斷。它可由任意數量氨基酸殘基組成，它可取決于蛋白質一級、二級或三級結構。
術語“免疫原性位置”在這里定義為人或動物因子VIII區域或其片斷，特異引起人或動物中因子VIII或片斷的生成，通過常規操作測量例如免疫測定，如本文所述的ELISA或Bethesda測定。它可由任意數量氨基酸殘基組成，它可取決于蛋白質一級、二級或三級結構。在一些實施方案中，雜合或雜合等價的因子VIII或其片斷在動物或人中沒有免疫原性或免疫原性低于人或豬因子VIII。
如本文所用，“因子VIII缺乏”包括凝固活性缺乏，由缺陷因子VIII生成、不適當或沒有生成因子VIII、抑制劑部分或完全抑制因子VIII來引起。血友病A是因子VIII缺乏類型，來自X-相連基因缺陷和其編碼的因子VIII蛋白質缺失或不足。
“診斷測定”在這里包括以一些方式使用抗原-抗體相互作用來檢測和/或定量測試樣品中存在的具體分子量以選擇醫學治療。本領域技術人員已知許多這類的測定。如本文所用，人、豬或修飾豬因子VIII DNA或其片斷和其表達蛋白質可全部或部分取代其它已知測定中的相應試劑，其中修飾測定可用于檢測和/或定量因子VIII抗體。使用這些試劑即因子VIII DNA或其片斷和其表達蛋白質可修改已知測定用于檢測人或動物因子VIII的抗體。這些測定包括但不限于ELISA、免疫擴散測定和免疫印跡。本領域技術人員已知使用這些測定的適當方法。如本文所用，包括至少一個蛋白質抗原表位的因子VIII或其片斷可用作診斷試劑。其它可使用人、豬或修飾豬因子VIII或其片斷的測定例子包括Bethesda測定和抗凝血測定。
術語“編碼蛋白質如豬因子VIII的DNA”指一種聚脫氧核糖核酸，其核苷序列包含宿主細胞編碼信息，根據已知遺傳密碼關系用于蛋白質氨基酸如豬因子VIII。
編碼人或動物因子VIII或修飾因子VIII的DNA的“表達產物”獲自適當宿主細胞中參考蛋白質的表達，包含特征如參考DNA編碼蛋白質的翻譯前或后修飾，包括但不限于糖基化、蛋白裂解等。在本領域中已知這些修飾可發生且取決于宿主細胞類型和其它因素而有所不同，可產生保持促凝血活性的產物分子同工型。參見例如Lind，P.等，Eur.J.Biochem，2321927(1995)，納入本文供參考。
“表達載體”是一種DNA元件，通常為環狀結構，能在所需宿主細胞中自動復制或整合到宿主細胞基因組，且也具有一些熟知的特征可表達在適當位點和以適當方向插入載體序列的編碼DNA。這些特征可包括但不限于一個或多個啟動子序列，用于指導編碼DNA和其它DNA元件的轉錄起始，如增強子、多腺苷酸位點等，所有這些在本領域熟知。因此，例如缺乏啟動子的載體可通過插入結合編碼DNA的啟動子成為表達載體。
“免疫原性降低”在本文定義為促進抗體-抗原對結合能量的氨基酸。已知免疫原性降低的一些氨基酸非限制性例子包括丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、絲氨酸和甘氨酸。要理解的是通過特定抗體-抗原對中特定取代獲得的免疫原性降低也可由除了上述所列之外的氨基酸取代產生，只要它們影響蛋白質構象、抗原表位可達性等。
減少抑制抗體結合的因子VIII突變的發現因子VIII C2結構域由氨基酸殘基2173-2332組成，包含血友病A或獲得性血友病患者中主要的抗原位點或用于大部分抑制抗體的位點。這些抗體的抑制作用主要由于對因子VIII結合促凝血磷脂膜的抑制。人因子VIII C2結構域的X-射線結構顯示一個假定的疏水性磷脂膜-結合位點，由含M2199/F2200和L2251/L2252的環組成[Barrow，R.T.等，(2000)Blood 97169-174]。當這些環被同源豬、鼠或犬殘基取代時觀察到抗原性降低，由此判斷它們參與結合抑制性抗C2抗體。鑒定另外的抗原殘基是通過突變膜結合位點周圍的7個表面暴露位點來產生下列構建Y2195H、Y2195A、F2196L、F2196A、R2215K、R2215A、R2220K、R2220A、F2290S、F2290A、W2313F、W2313A、R2320K和R2320A。突變體在幼倉鼠腎細胞中表達。W2313A和R2320K產生低水平表達且沒有進一步評估。為促進篩選這些突變體，用重組人/豬因子VIII分子HP20測試44種患者抑制劑血漿的C2特異性，HP20包含取代相應人結構域的豬C2結構域。11種血漿對HP20的交叉反應性與或幾乎與無重組B結構域的豬因子VIII一樣低，說明它們是C2-特異的。這些血漿中的8種關于C2突變體評估，使用Bethesda測定。對于2種抑制劑血漿(DR和JF)，R2215、R2220和F2196的突變產生的抗原性低于野生型因子VIII，但W2313、R2320、F2290或Y2195不是。剩余6種抑制劑血漿沒有證明Bethesda滴讀對任何突變體降低，表明它們不識別氨基酸R2215、R2220、F2196、W2313、R2320、F2290或Y2195。
總之，殘基R2215、R2220和F2196有助于因子VIII結合抑制抗體。數據證明膜結合環外的氨基酸殘基可促進抗體結合。本文所示數據說明通過特異于因子VIII C2結構域的抑制抗體，在這些殘基中的免疫原性降低氨基酸取代可減少抑制。膜結合環外的免疫原性降低氨基酸取代如位置2199、2220、2251和2252可預期進一步減少抑制一些與C2結構域反應的抑制抗體，膜結合環中具有類似的取代。
通過上述剪接-重疊延伸突變[Lubin，I.M.，等(1997)J.Bio.chem.27230191-30195]突變在名為HSQ的人因子VIII無B結構域形式中進行[Lind，P.K.等(1995)，Eur.J.Biochem，23219-27]。進行下列具對應核苷變化的突變R2215AAGG到GCCR2215KAGG到AAGW2313ATGG到GCCW2313FTGG到TTCR2220AAGA到GCCR2220KAGA到AAGR2320AAGG到GCCR2320KAGG到AAGY2195HTAC到CACY2195ATAC到GCCF2196LTTT到CTGF2196ATTT到GCCF2290STTC到TCTF2290ATTC到GCT方法的概述美國專利5,364,771描述了發現具凝血活性的雜合人/豬因子VIII分子，其中人或豬的因子VIII分子元件取代其它種類因子VIII分子的相應元件。美國專利5,663,060描述了促凝血雜合人/動物和雜合等價因子VIII分子，其中一個種類的因子VIII分子元件取代其它種類因子VIII分子的相應元件。
盡管目前的信息表明B結構域沒有抑制抗原表位且對因子VIII功能沒有已知效果，在一些實施方案中，B結構域在活性雜合或雜合等價因子VIII分子或其片斷(“B(-)因子VIII”)中全部或部分缺失，VIII分子或其片段用本文所述的任何方法制備。
人因子VIII基因在哺乳動物細胞中分離和表達，如報導于Toole，J.J.等，(1984)Nature 312342-347(Genetics Institute)；Gischier，J.等，(1984)Nature312326-330(Genetech)；Wood，W.I.等，(1984)Nature 312330-337(Genetech)；Vehar，G.A.等，(1984)Nature 312337-342(Genetech)；WO 87/04187；WO 88/08035；WO 88/03558；美國專利號4,757,006，氨基酸序列推斷自cDNA。Capon等的美國專利號4,965,199揭示了重組DNA方法，用于在哺乳動物細胞中生成因子VIII并純化人因子VIII。報導了CHO(中國倉鼠卵巢)細胞和BHKC(幼倉鼠腎細胞)中表達的人因子VIII。人因子VIII被修飾以缺失部分或所有B結構域(美國專利號4,868,112)，并嘗試用人因子V的B結構域取代人因子VIII的B結構域(美國專利號5,004,803)。
豬因子VIII從血漿中分離[Fass，D.N.等，(1982)Blood 59594]。Church等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816934描述了豬因子VIII的部分氨基酸序列對應于N-末端輕鏈序列部分，此序列與血漿銅藍蛋白和凝固因子V同源。Toole，J.J.等(1984)Nature 312342-347描述了4個豬因子VIII氨基酸片斷的N-末端部分測序，但沒有確定片斷在因子VIII分子中位置的特征。豬因子VIII的B和部分A2結構域氨基酸序列報導于Ioole，J.J.等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835939-5942。1994年11月15日出版的名為“雜合人/豬因子VIII”的美國專利5,364,771和1993年10月14日出版的WO 93/20093中所述cDNA序列編碼豬因子VIII完整A2結構域和預測的氨基酸序列和雜合人/豬因子VIII，雜合人/豬因子VIII具有全部結構域、全部亞基和特異氨基酸序列的取代。編碼豬因子VIII A2結構域的cDNA序列對應于成熟人因子VIII的殘基373-740。更近的是，1994年5月26日出版的WO 94/11503報導了豬因子VIII部分A1結構域和A2結構域的核苷和對應氨基酸序列，A1結構域缺乏前198個氨基酸。編碼豬因子VIII的完整核苷序列包括完整A1結構域、活化肽、A3、C1和C2結構域，以及編碼的氨基酸序列最終由Lollar獲得，如1999年1月12日出版的美國專利5,859,204和1997年12月31日出版的WO 97/49725所示，兩者都納入本文供參考。
豬和人因子VIII作為兩個亞基蛋白質從血漿中分離。稱為重鏈和輕鏈的亞基通過非共價鍵結合一起，需要鈣或其它二價金屬離子。因子VIII的重鏈包含三個共價連接的結構域A1、A2和B。因子VIII的輕鏈也包含三個結構域，名為A3、C1和C2。B結構域沒有已知的生物功能，可通過蛋白裂解或重組DNA技術方法從分子中去除或部分去除，因子VIII任何可測量參數沒有顯著改變。人重組因子VIII的結構和功能類似來自血漿的因子VIII，盡管它沒有糖基化，除非在哺乳動物中表達。
由于A1和A2結構域間的重鏈裂解，人和豬的活化因子VIII(“因子VIIIa”)具有三個亞基。此結構稱為A1/A2/A3-C1-C2。人因子VIIIa在穩定豬因子VIIIa的條件下不穩定，大概是因為人因子VIIIa A2亞基的弱結合。人和豬因子VIIIa的A2亞基分離與因子VIIIa分子的活性損失相關。Yakhyaev，A.等(1982)Blood90增補本1，摘要#126報導了通過低密度脂蛋白受體-相關蛋白來結合A2結構域，表明這種結合調節的A2細胞吸收用于下調因子VIII活性。
“無B結構域因子VIII”的表達通過包含B結構域部分來增加。包含名為“SQ”[lind，P.等(1995)]的B結構域部分被報導產生良好表達。“SQ”構建缺乏所有人B結構域，除了B結構域N-末端的5個氨基酸和B結構域C-末端的9個氨基酸。POL1212構建指編碼豬因子VIII的cDNA，此豬因子VIII缺乏大部分B結構域但含編碼A2和ap結構域間24個氨基酸接頭的DNA序列，如2000年3月10日提交的USSN 09/523,656所示，它全部納入本文供參考。
純化的修飾因子VIII或其片斷可通過標準分析測定免疫反應性和凝固活性，包括例如無血漿的因子VIII測定、一階段的凝固測定、使用純化重組人因子VIII作為標準的酶聯免疫吸收測定。
其它載體包括質粒和真核病毒載體，可用于在真核細胞中表達重組基因構建，這取決于技術人員的偏向和判斷[參見例如，《分子克隆》(Molecular Cloning)第16章，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，NY，NY]。其它載體和表達系統包括細菌、酵母和昆蟲細胞系統，由于糖基化不同或缺乏，可使用但不優選。
重組因子VIII蛋白質可在多種細胞中表達，這些細胞常用于培養和重組哺乳動物蛋白質的表達。具體的是，發現一些嚙齒動物細胞系是表達大蛋白的特別有用宿主。優選細胞系來自美國模式培養物保藏所，Rockville，MD，包括幼倉鼠腎細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，它們用常規過程和培養基培養。
更高的豬因子VIII凝固活性基礎是人A2亞基與人因子VIIIa的自發分離快于豬A2亞基與豬因子VIIIa的分離。A2亞基解離導致活性損失[Lollar，P.等(1990)J.Bio.Chem.2651688-1692；Lollar，P.等(1992)J.Bio.Chem.26723652-23657；Fay，P.J.等(1992)J.Bio.Chem.26713246-13250]。
免疫反應性降低的因子VIII分子與抑制因子VIII凝固活性的抗體(“抑制劑”或“抑制抗體”)免疫反應的抗原表位在因子VIII的已知結構-功能關系基礎上確定特征。推測抑制劑作用可通過破壞與因子VIII結構域結構相關的任何大分子相互作用或它與馮維勒因子、凝血酶、因子Xa、因子Ixa或因子X的聯合。然而，大部分人因子VIII的抑制抗體作用是通過結合位于因子VIII的40kDa A2結構域或20kDa C2結構域中的抗原表位、破壞與這些結構域相關的特異功能，描述于Fulcher等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 827728-7732和Scandella等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856152-6156。根據Scandella等(1993)Blood 821767-1775，除了A2和C2結構域，可能在因子VIII輕鏈的A3或C1結構域中有第三個抗原表位。此推定的第三個抗原表位意義未知，但它似乎說明了一小部分因子VIII的抗原表位反應性。
抗A2抗體阻礙因子X活化，如Lollar等(1994)J.Clin.Invest.932497-2504所示。前面Ware等(1992)Blood Coagul.Fibrinolysis 3703-716描述通過缺失突變進行圖譜研究，將A2抗原表位定位于40kDa A2結構域N-末端的20 kDa區域。競爭免疫輻射度測定表明A2抑制劑識別普通的抗原表位或精細成簇的抗原表位，描述于Scandella等(1992)Throm.Haemostas.67665-671并證明于美國專利5,859,204。
可測試修飾因子VIII分子在人中的抗原性降低和/或臨床試驗中的免疫原性。一類設計用于確定因子VIII是否與抑制抗體免疫反應的試驗中，施用因子VIII給約25個因子VIII缺乏的病人，優選通過靜脈內灌輸，病人的抗體抑制治療性人因子VIII的凝固活性。動物或修飾動物因子VIII的劑量范圍在每千克體重5-50單位之間，優選每千克體重10-50單位，最優選每千克體重40單位。各施用后約1小時，從血液樣品中回收的因子VIII在一階段凝固測定中測量。灌輸后約5小時再次取樣品，測量回收。來自樣品的因子VIII總回收和消失速度預測抗體效價和抑制活性。如果抗體效價高，通常不能測量因子VIII回收。回收結果與其他病人的回收結果相比較，這些病人用獲自血漿的人因子VIII、重組人因子VIII、獲自血漿的豬因子VIII、其它普遍使用的因子VIII或因子VIII替代物治療形式治療。
鑒定臨床重要的抗原表位后，可表達重組因子VIII分子，當體外測試抗廣泛抑制血漿時，重組因子VIII分子的交叉反應性低于獲自血漿的豬因子VIII或相當。可進行另外的抗原表位區域突變以降低交叉反應性。減少的交叉反應性盡管需要，但對于生成優于現存血漿-獲得豬因子VIII濃縮物的產物不是必需的，由于感染的豬蛋白質或感染傳染劑如病毒或朊病毒，此濃縮物可能產生副作用。重組朊病毒或修飾豬因子VIII分子不包含外源豬蛋白質。
診斷測定因子VIII cDNA和/或其表達蛋白質可全部或部分用作測定的診斷試劑以檢測底物中人或動物因子VIII或修飾動物因子VIII的抑制抗體，包括例如血清樣品和因子VIII缺乏的人類患者的體液。這些抗體測定包括如ELISA測定、免疫印跡、放射性免疫測定、免疫擴散測定和因子VIII生物活性測定(如通過凝固測定)。制備這些試劑的技術和其使用方法對于本領域技術人員是已知的。例如，檢測病人血清樣品中抑制抗體的免疫測定可包括使測試樣品與足夠量因子VIII反應，從而在樣品中與抑制抗體形成可檢測復合體。
核酸和氨基酸探針可在修飾因子VIII cDNA或蛋白質分子或其片斷基礎上制備。在一些實施方案中，標記這些可用染料或酶、熒光、化學發光或可商業購買的放射性標記。氨基酸探針可用于例如篩選血清或其它體液，其中懷疑存在人、動物或雜合人/動物因子VIII的抑制劑。可定量病人的抑制劑水平并與健康對照相比，例如可用于確定因子VIII缺乏的病人是否能用動物或修飾動物因子VIII治療。cDNA可用于例如篩選DNA文庫的研究目的。
制備重組因子VIII重組因子VIII可通過使用真核蛋白質表達系統來產生。通常，缺乏所需基因的真核細胞系用載體轉化，該載體含有其缺乏的基因和希望表達的重組DNA。轉化可通過電穿孔或病毒傳遞等技術來完成。所選生成蛋白質的細胞系與感興趣蛋白質相容，能連續表達感興趣蛋白質，能在培養基上生長，該培養基可促進感興趣蛋白質以及精通此領域的技術人員已知的其它因子的純化。這些技術的例子描述于歐洲專利申請0 302 968 A2和美國專利號5,149,637，全部納入本文供參考。
測試重組因子VIII公子可測試重組因子VIII分子在人中的抗原性降低和/或至少兩類臨床試驗中的免疫原性。一類設計用于確定重組或重組雜合因子VIII是否與抑制抗體免疫反應的試驗中，施用重組或重組雜合因子VIII給約25個因子VIII缺乏的病人，優選通過靜脈內灌輸，病人的抗體抑制治療性人或豬因子VIII的凝固活性。重組或重組雜合因子VIII的劑量范圍在5和50單位/kg體重間，優選10-50單位/kg體重，最優選40單位/kg體重。各施用后約1小時，從血液樣品中回收的因子VIII在一階段凝固測定中測量。灌輸后約5小時再次取樣品，測量回收。來自樣品的因子VIII總回收和消失速度預測抗體效價和抑制活性。如果抗體效價高，通常不能測量因子VIII回收。回收結果與其他病人的回收結果相比較，這些病人用獲自血漿的人因子VIII、重組人因子VIII、豬因子VIII、其它普遍使用的因子VIII或因子VIII替代物治療形式治療。
第二類臨床試驗設計用于確定重組或重組雜合因子VIII是否是免疫原性即病人是否發展抗體，其中重組或重組雜合因子VIII如前面段落所述施用給約100個以前未治療的血友病患者，他們沒有發展出因子VIII抗體。在6個月到1年的時間段中，大約每2周進行治療。在此階段中，以1到3個月間隔取血液樣品并進行Bethesda測定或其它抗體測定以確定抑制抗體的存在。也可如上所述在各灌輸后進行回收測定。結果與其他血友病患者比較，這些血友病患者用獲自血漿的人因子VIII、重組人因子VIII、豬因子VIII、或其它普遍使用的因子VIII或因子VIII替代物治療形式治療。
藥物組合物藥物組合物包括重組或重組雜合(或修飾)因子VIII，單獨或結合適當藥物穩定化合物、傳遞載體和/或運載體(carrier vehicle)，組合物根據已知方法制備，如E.W.Martin的《Remington藥物科學》(Remington’s Pharmaceutical Science)中所述的方法。
在一個優選的實施方案中，用于靜脈內灌輸的優選攜帶或傳遞載體是生理鹽水或磷酸緩沖鹽水。
在另一個優選的實施方案中，適當的穩定化合物、傳遞載體和運載體包括但不限于其它人或動物蛋白質如清蛋白。
磷脂泡或脂質體懸浮液也優選作為藥學上可接受的攜帶或傳遞載體。這些可根據本領域技術人員已知方法制備，可包含例如磷脂酰絲氨酸/磷脂酰膽堿或其它磷脂或去垢劑組合物，它們賦予表面負電荷，因為因子VIII結合帶負電的磷脂膜。制備脂質體可通過在無機溶液中溶解適當脂類(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰膽堿、花生酰磷脂酰膽堿(arachidoyl phosphatidyl choline)和膽固醇)，隨后蒸發無機溶液，在容器表面留下干燥脂類的薄膜。然后將雜合因子VIII的水溶液導入容器。接著容器用手旋轉以使脂類物質從容器側面游離且分散脂類聚集物，從而形成脂質體懸浮液。
重組或重組雜合(修飾)因子VIII可結合適當藥物穩定化合物、傳遞載體和/或運載體，包括依賴維生素K的凝固因子、組織因子、馮維勒因子(vWf)或含因子VIII結合位點的vWf片斷、多糖如蔗糖。
重組或重組雜合(修飾)因子VIII也可通過基因治療傳遞，與傳遞人因子VIII的方式相同，使用傳遞載體如逆轉錄病毒載體。此方法包括將因子VIII cDNA納入人細胞中，人細胞直接移植到因子VIII缺乏的病人中或置于因子VIII能滲透但細胞不能滲透的可移植裝置中，隨后移植裝置。優選方法是逆轉錄病毒-調節的基因轉移。在此方法中，外源基因(如因子VIII cDNA)克隆到修飾逆轉錄病毒的基因組中。基因通過病毒機制插入宿主細胞基因組，在其中它被細胞表達。修飾逆轉錄病毒載體使它不產生病毒，防治病毒感染宿主。此類治療的一般原則對本領域技術人員已知且在文獻中綜述[如Kohn，D.B.等，(1989)Transfusion 29812-820]。
重組或重組雜合(修飾)因子VIII可結合vWf保存以提高雜合分子的半衰期和自身壽命。另外，vWf存在時凍干因子VIII能改進活性分子產量。目前商業供應商用于保存人和動物因子VIII的方法可用于保存雜合或修飾因子VIII。這些方法包括(1)凍干部分純化狀態的因子VIII(作為沒有進一步純化灌輸的因子VIII的“濃縮物”)；(2)通過Zimmerman方法免疫親和純化因子VIII且在清蛋白存在時凍干，清蛋白穩定因子VIII；(3)在清蛋白存在時凍干重組因子VIII。
此外，雜合因子VIII在4℃的0.6M NaCl、20mM MES、5mM CaCl2，pH6.0中不一定穩定，它也可在這些緩沖液中冷凍保存并以最小活性損失來解凍。
治療方法重組或重組雜合(修飾)因子VIII用于治療因子VIII缺乏引起的不受控出血(如關節內、頭蓋內或胃腸出血)，用于有和沒有抑制抗體的血友病患者以及由于抑制抗體發展產生獲得性因子VIII缺乏的病人。活性物質優選靜脈內施用。
另外，如上所述，施用重組或重組雜合(修飾)因子VIII可通過移植遺傳改造產生雜合物的細胞或移植含這些細胞的裝置。
在一個優選的實施方案中，重組或重組雜合(修飾)因子VIII的藥物組合物單獨或結合穩定劑、傳遞載體和/或運載體，根據人或動物因子VIII灌輸所用相同過程靜脈灌輸給病人。
必須施用給需要這些治療的病人的重組或重組雜合(修飾)因子VIII組合物治療劑量取決于因子VIII缺乏的嚴重性而變化。一般，調節劑量水平的頻率、持續時間和單位與各病人出血事件的嚴重性和持續時間一致。因此，雜合因子VIII以足夠量包括在藥學上可接受運載體、傳遞載體或穩定劑中，用于將治療有效量的雜合物傳遞給病人以停止出血，這通過標準凝固測定來測量。
因子VIII的經典定義是正常血漿中存在的物質，它修正來自血友病A個體血漿中的凝固缺陷。純化或部分純化形式的因子VIII的體外凝固活性用于計算灌輸人類患者的因子VIII劑量且可靠指示回收自患者血漿的活性和體內出血缺陷的修正。根據Lusher，J.M.等，328 New Engl.J.Med.328453-459；Pittman，D.D.等，(1992)Blood 79389-397；Brinkhous等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.828752-8755，新因子VIII分子的體外標準測定和它們在狗灌輸模型或人類患者中的特性間沒有報導差異。
通常，所需血漿因子VIII水平在正常的30-100％范圍中，此水平通過施用重組或重組雜合因子VIII在病人中獲得。在施用重組或重組雜合因子VIII的一個優選模式中，靜脈內給予的組合物優選劑量范圍是每千克體重約5-50單位，更優選每千克體重10-50單位，最優選每千克體重20-40單位；間隔頻率范圍從約8到24小時(在一些嚴重受影響的血友病患者中)；治療持續時間的天數范圍從1到10天或直到解決短暫出血。參見例如Roberts，H.R.和M.R.Jones《血友病和相關癥狀-先天性凝血素缺陷(因子II、因子V和因子VII-XII)(Hemophilia andRelated Conditions-Congenital Deficiencies of Prothrommbin(FactorII，Factor V，and Factors VII to XII))，第153章，1453-1474，1460，《血液學》(Hematology)，Williams，W.J.等編(1990)。有抑制劑的病人可能需要更多重組或重組雜合因子VIII，或由于其特異活性高于人因子VIII或者抗體反應性或免疫原性減少，病人可能需要更少的重組或重組雜合因子VIII。用人或豬因子VIII治療，灌輸的重組或重組雜合因子VIII的量通過一階段因子VIII凝固測定確定，在一些選擇情況中，體內回收通過測量灌輸后病人血漿中的因子VIII來確定。要理解的是對于任何具體試驗者，特異劑量方案應隨著時間調節，調節是根據個體需要和施用或監控組合物施用的人的專業判斷，本文所列濃度范圍僅作為范例，不想限制權利要求的組合物的范圍或實踐。
根據需要，治療可采用形式是單次靜脈內施用組合物或定期或連續施用一段延長的時間。另外，重組或重組雜合因子VIII可皮下或用脂質體在不同時間間隔以一個或幾個劑量施用。
因子VIII也可用于治療血友病患者中因子VIII缺乏引起的不受控出血。在此情況中，高于單獨人或動物因子VIII的凝固活性不是必需的。如果活性不被患者血漿中的抗體中和，低于人因子VIII的凝固活性(即小于3,000單位/mg)有用。
上面綜述的重組或重組雜合(或修飾)因子VIII分子和其分離、特征確定、產生和使用方法通過參考下列非限制例子可進一步理解。
實施例材料一檸檬酸化的血友病A血漿和正常收集的人血漿(FACT)購自George KingBiomedical公司(Overland Park，KS)。肝素-瓊脂糖購自Sigma Chemical公司(St.Louis，MO)。胎牛血清、遺傳霉素、青霉素、鏈霉素、DMEM/F12培養基和AIM-V培養基購自Life Technologies公司(Gaithersburg，MD)。HP20如上所述制備[Healey，J.F.，(1998)同上]，它是無B結構域的雜合人/豬因子VIII分子，含人A1、A2、ap-A3、C1結構域和豬C2結構域。
質粒DNA用Qiagen Plasmid Maxi試劑盒純化(Qiagen公司，Valencia，CA)。PCR反應用Hybrid OmniGene熱循環儀進行，使用pfu DNA聚合酶。PCR產物用膠純化，乙醇沉淀并用T4 DNA連接酶連入質粒DNA(DNA快速連接試劑盒(Rapid DNALigation kit)，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。含插入的質粒用于轉化大腸桿菌Epicurean XL1-Blue細胞。所有PCR產生的新因子VIII DNA序列通過雙脫氧測序用Applied Biosystems(Foster City，CA)的373a自動DNA測序儀和PRISM終止子染色試劑盒(PRISM dye terminator kit)來確定。
實施例1因子VIII突變cDNA的構建轉染細胞系維持于Dulbecco改進的Eagle培養基-F12，其中含有10％胎牛血清、50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素。胎牛血清使用前在56℃熱失活1小時。ReNeo中的突變cDNA穩定轉染到BHK細胞中，選擇遺傳霉素抗性，轉入無血清的AIM V培養基用于表達，通過上述肝素-瓊脂糖層析部分純化[Healey，J.F.等，(1998)同上]。
實施例2因子VIII和因子VIII抑制劑測定重組因子VIII蛋白質的活性通過一階段(one-stage)凝固測定來測量[Bowie，E.J.W.和Owen，C.A.(1984)，《止血紊亂》(Disorders of Hemostasis)，O.D.Ratnoff和C.D.Forbes編，Grune&Stratton公司，Orlando，FL 43-72]。1單位的因子VIII定義為1ml正常檸檬酸化人血漿中的活性。因子VIII抑制劑效價通過改進的Bethesda測定來測量[Kasper，C.K.等，(1975)Thromb.Diath.Haemorrh.34869-872]。重組因子VIII加入血友病A血漿至最終濃度為每毫升0.8-1.2單位，并用不同濃度的抑制劑在37℃孵育2小時。為確定定義Bethesda單位的50％抑制點，稀釋抑制劑以產生橫跨至少35％-65％范圍的剩余活性。在一些情況中，進行反復稀釋，使用平均值。平均稀釋10次以確定各Bethesda效價。數據通過非線性回歸用Marquardt算法(SigmaPlot 5.0，SPSS公司)產生等式剩余活性％＝m(logx-logx50)+50其中擬合參數(fitted parameter)x50是產生50％抑制的對應稀釋，合適參數m是半-log線斜率且獨立變量x是抑制劑樣品的對應稀釋。
Bethesda效價相當于x50-1。Bethesda效價的標準誤差(SD)估計通過Bethesda效價乘以變量x50的系數來計算。因子VIII分子的Bethesda效價用Student t檢驗來比較。部分純化制品中的因子VIII質量濃度通過三明治ELISA確定，如上所述使用ESH4作為捕捉抗體和生物素化的ESH8作為檢測抗體[Lubin，I.M.等，(1994)2698639-8641]。樣品測定四次。
實施例3抗C2突變體的C2特異性血漿的Bethesda效價因子VIII抑制劑血漿稱為DR、EE、EEE、JF、LK、NF、JM和WC，它們抗C2突變體Y2195H、Y2195A、F2196L、F2196A、R2215K、R2215A、R2220K、R2220A、F2290S、F2290A、W2313F、W2313A、R2320K和R2320A。測試并與HSQ相比較，參見表1。DR和JF血漿中發現抗原性降低，但其它6種血漿中沒有發現。DR強烈識別R2215、R2220和F2196，而JF強烈識別R2215。
表1患者C2特異血漿抗人無B結構域的fVIII C2突變體的Bethesda效價(HSQ效價％)DR EE EEE JF LK NF JM WCHSQ 100 100 100 100 100 100 100 100R2215A8 140 62 770 81 91 68R2215K91 152 68 102 68 95 85 112R2220A4 119 58 41 85 129 123 121R2220K4 130 54 107 79 75 113 78W2313F41 138 99 133 50 80 93 89R2320A87 117 80 90 89 185 139 118F2290S74 130 129 70 118 162 123 159F2290A64 131 103 73 57 97 99 119Y2195H69 93 60 63 65 71 86 105Y2195A37 131 116 112 74 113 125 92F2196L14 74 99 72 89 155 89 99F2196A8 143 84 172 68 99 122 69
序列表<110>J.S.勞拉(LOLLAR，John，S.)埃默里大學(Emory University)<120>因子VIII C2結構域變體<130>130-01 WO<140>待定<141>2002-11-27<150>US 60/334,569<151>2001-11-30<160>7<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>9009<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1cagtgggtaa gttccttaaa tgctctgcaa agaaattggg acttttcatt aaatcagaaa 60ttttactttt ttcccctcct gggagctaaa gatattttag agaagaatta accttttgct 120tctccagttg aacatttgta gcaataagtc atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt 180ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc accagaagat actacctggg tgcagtggaa 240ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct 300cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt 360gtagaattca cggttcacct tttcaacatc gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg 420ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat gatacagtgg tcattacact taagaacatg 480gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga 540gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg gagaaagaag atgataaagt cttccctggt 600ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca 660ctgtgcctta cctactcata tctttctcat gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc 720
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163516401645Gln Glu Ala Thr Asp Tyr Asp Asp Ala Ile Thr Ile Glu Thr Ile Glu165016551660Asp Phe Asp Ile Tyr Ser Glu Asp Ile Lys Gln Gly Pro Arg Ser Phe1665 167016751680Gln Gln Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp168516901695Asp Tyr Gly Met Ser Thr Ser His Val Leu Arg Asn Arg Tyr Gln Ser170017051710Asp Asn Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp171517201725Gly Ser Phe Ser Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu173017351740Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met1745 175017551760Val Thr Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser176517701775Leu Ile Ser Tyr Lys Glu Asp Gln Arg Gly Glu Glu Pro Arg Arg Asn178017851790Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Ile Tyr Phe Trp Lys Val Gln His179518001805His Met Ala Pro Thr Glu Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr181018151820Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Arg Asp Met His Ser Gly Leu Ile Gly1825 183018351840Pro Leu Leu Ile Cys His Ala Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg184518501855Gln Val Ser Val Gln Glu Phe Ala Leu Leu Phe Thr Ile Phe Asp Glu186018651870Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Val Lys Arg Asn Cys Lys Thr187518801885Pro Cys Asn Phe Gln Met Glu Asp Pro Thr Leu Lys Glu Asn Tyr Arg189018951900
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1.一種修飾因子VIII，其特征在于，所述因子包括對應于人因子VIII的C2結構域中一個或多個位置的氨基酸取代，所述位置選自2215、2313、2220、2320、2195、2196和2290。
2.如權利要求1所述的修飾因子VIII，其特征在于，所述因子缺乏B結構域。
3.如權利要求1所述的修飾因子VIII，其特征在于，包括丙氨酸或賴氨酸取代精氨酸2215。
4.如權利要求1所述的修飾因子VIII，其特征在于，包括丙氨酸或賴氨酸取代精氨酸2220。
5.如權利要求1所述的修飾因子VIII，其特征在于，包括苯丙氨酸取代色氨酸2313。
6.如權利要求1所述的修飾因子VIII，其特征在于，包括丙氨酸取代精氨酸2320。
7.如權利要求1所述的修飾因子VIII，其特征在于，包括丙氨酸或絲氨酸取代苯丙氨酸2290。
8.如權利要求1所述的修飾因子VIII，其特征在于，包括組氨酸或丙氨酸取代酪氨酸2195。
9.如權利要求1所述的修飾因子VIII，其特征在于，包括亮氨酸或丙氨酸取代苯丙氨酸2196。
10.一種修飾人因子VIII，其特征在于，所述因子包括C2結構域中對應于一個或多個位置的氨基酸取代，所述位置選自2215、2313、2220、2320、2195、2196和2290。
11.如權利要求10所述的修飾人因子VIII，其特征在于，所述因子缺乏B結構域。
12.如權利要求10或11所述的修飾人因子VIII，其特征在于，氨基酸取代在位置2215。
13.如權利要求10或11所述的修飾人因子VIII，其特征在于，氨基酸取代在位置2220。
14.如權利要求10或11所述的修飾人因子VIII，其特征在于，氨基酸取代在位置2196。
15.如權利要求12所述的修飾人因子VIII，其特征在于，包括丙氨酸或賴氨酸取代精氨酸2215。
16.如權利要求13所述的修飾人因子VIII，其特征在于，包括丙氨酸或賴氨酸取代精氨酸2220。
17.如權利要求14所述的修飾人因子VIII，其特征在于，包括丙氨酸或亮氨酸取代苯丙氨酸2196。
18.如權利要求1所述的修飾因子VIII，其特征在于，與相應的人蛋白質相比抗原性降低。
19.如權利要求1所述的修飾因子VIII，其特征在于，與相應的人蛋白質相比免疫原性降低。
20.如權利要求1所述的修飾因子VIII，其特征在于，與相應的人蛋白質相比免疫原性和抗原性降低。
21.如權利要求1所述的修飾因子VIII，其特征在于，特異活性大于每毫克約2,000單位。
22.如權利要求21所述的修飾因子VIII，其特征在于，特異活性大于每毫克約3,000單位。
23.如權利要求22所述的修飾因子VIII，其特征在于，特異活性大于每毫克約5,000單位。
24.如權利要求23所述的修飾因子VIII，其特征在于，特異活性大于每毫克約10,000單位。
25.如權利要求1或10所述的修飾因子VIII，其特征在于，它是單突變體。
26.如權利要求1或10所述的修飾因子VIII，其特征在于，它是雙突變體。
27.如權利要求1或10所述的修飾因子VIII，其特征在于，它是三突變體。
28.如權利要求1或10所述的修飾因子VIII，其特征在于，它是四突變體。
29.如權利要求1或10所述的修飾因子VIII，其特征在于，與相應的人因子VIII相比，它對至少一種C2特異性抑制抗體的抗原性降低。
30.如權利要求1或10所述的修飾因子VIII，其特征在于，與相應的人因子VIII或重組人因子VIII相比，對至少一種抑制抗體制品的Bethesda效價增加或減少。
31.一種修飾因子VIII，其特征在于，所述因子包括至少一個非人因子VIII氨基酸取代相應的人因子VIII氨基酸。
32.如權利要求31所述的修飾因子VIII，其特征在于，至少一個非人因子VIII氨基酸取代來自非人的哺乳動物。
33.如權利要求32所述的修飾因子VIII，其特征在于，所述非人的哺乳動物是豬、犬或鼠。
34.如權利要求32所述的修飾因子VIII，其特征在于，與獲得所述修飾因子的因子VIII分子或其它因子VIII制品相比，所述修飾因子VIII具有凝固活性且抗原性降低。
35.如權利要求32所述的修飾因子VIII，其特征在于，所述氨基酸取代不是丙氨酸。
36.如權利要求32所述的修飾因子VIII，其特征在于，與獲得所述修飾因子的因子VIII分子或其它因子VIII分子相比，修飾因子VIII免疫原性降低。
37.一種修飾因子VIII，以使對抑制抗體的反應性降低并保持促凝血活性的方法，其特征在于，所述方法包括用免疫反應性降低的氨基酸在一個或多個位置取代對應于人因子VIII的C2結構域中天然產生的氨基酸，所述位置選自2215、2313、2220、2320、2195、2196和2290。
38.如權利要求37所述的方法，其特征在于，取代發生在氨基酸位置2215。
39.如權利要求37所述的方法，其特征在于，取代發生在氨基酸位置2313。
40.如權利要求37所述的方法，其特征在于，取代發生在氨基酸位置2220。
41.如權利要求37所述的方法，其特征在于，取代發生在氨基酸位置2320。
42.如權利要求37所述的方法，其特征在于，取代發生在氨基酸位置2195。
43.如權利要求37所述的方法，其特征在于，取代發生在氨基酸位置2196。
44.如權利要求37所述的方法，其特征在于，所述修飾因子VIII是單突變體。
45.如權利要求37所述的方法，其特征在于，所述修飾因子VIII是雙突變體。
46.如權利要求37所述的方法，其特征在于，所述修飾因子VIII是三突變體。
47.如權利要求37所述的方法，其特征在于，所述修飾因子VIII是四突變體。
48.一種修飾因子VIII，以使抗原性降低并保持促凝血活性的方法，其特征在于，所述方法包括用免疫反應性降低的氨基酸在一個或多個位置取代對應于人因子VIII的C2結構域中天然產生的氨基酸，所述位置選自2215、2313、2220、2320、2195、2196和2290。
49.如權利要求48所述的方法，其特征在于，取代發生在氨基酸位置2215。
50.如權利要求48所述的方法，其特征在于，取代發生在氨基酸位置2313。
51.如權利要求48所述的方法，其特征在于，取代發生在氨基酸位置2220。
52.如權利要求48所述的方法，其特征在于，取代發生在氨基酸位置2320。
53.如權利要求48所述的方法，其特征在于，取代發生在氨基酸位置2195。
54.如權利要求48所述的方法，其特征在于，取代發生在氨基酸位置2196。
55.如權利要求48所述的方法，其特征在于，取代發生在氨基酸位置2290。
56.如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述修飾因子VIII是單突變體。
57.如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述修飾因子VIII是雙突變體。
58.如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述修飾因子VIII是三突變體。
59.如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述修飾因子VIII是四突變體。
60.一種編碼修飾因子VIII的分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含對應于人因子VIII的C2結構域中一個或多個位置的氨基酸取代，所述位置選自2215、2313、2220、2320、2195、2196和2290。
61.一種編碼修飾人因子VIII的分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含C2結構域中對應于一個或多個位置的氨基酸取代，所述位置選自2215、2313、2220、2320、2195、2196和2290。
62.一種表達載體，其特征在于，所述表達載體包含權利要求60或61所述的核酸分子。
63.如權利要求60或61所述的核酸分子，其特征在于，所述因子VIII缺乏B結構域。
64.如權利要求60或61所述的核酸分子，其特征在于，所述因子VIII包含位置2220的氨基酸取代。
65.如權利要求60或61所述的核酸分子，其特征在于，所述因子VIII包含位置2215的氨基酸取代。
66.如權利要求60或61所述的核酸分子，其特征在于，所述因子VIII包含位置2196的氨基酸取代。
67.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞被權利要求62所述的表達載體轉染。
全文摘要
血友病患者用因子VIII治療后，人因子VIII的特定氨基酸座位與患者的抑制抗體相互作用。揭示的修飾因子VIII中的氨基酸序列通過在一個或多個特定氨基酸座位取代來改變。修飾因子VIII對血友病患者有效，它以避免或防止抑制抗體的作用。
文檔編號C12N15/09GK1630666SQ02823845
公開日2005年6月22日 申請日期2002年11月27日 優先權日2001年11月30日
發明者J·S·勞拉 申請人:埃默里大學