重組人紅細胞生成素的層析純化的制作方法

專利名稱：重組人紅細胞生成素的層析純化的制作方法
技術領域：
本發明涉及以高度純化形式，即具有低量宿主細胞蛋白質的形式生產具有確定糖基形式組成的重組人紅細胞生成素(Epo)的方法。通過特定順序的純化步驟并且結合用于定量所分離的同種型(isoform)的分析工具可以達到該目的。
背景技術：
紅細胞生成素是調節紅細胞祖細胞增殖和分化及循環紅細胞生理水平維持的主要激素。在胎兒中，主要在肝臟中產生紅細胞生成素(Epo)，出生后，其約90％產物轉移到腎臟中生產。當由于慢性或急性腎衰竭使紅細胞生成素(Epo)下降時，必須外部給予紅細胞生成素(Epo)以防止正在發展的貧血的發生。因為紅細胞生成素(Epo)基因的發現和它在嚙齒動物細胞中的表達，已經可以獲得治療活性的人紅細胞生成素。
人紅細胞生成素(Epo)基因編碼27個氨基酸的信號肽和具有18396道爾頓的計算分子量的166個氨基酸的蛋白質。成熟的蛋白質通常有一個氨基酸的N-末端缺失，是165個氨基酸長度。信號序列將肽引導到參與正確糖基化的細胞區室，產生了具有三個N-和一個O-糖基化位點的成熟蛋白質。占總分子量約40％的糖部分對于紅細胞生成素(Epo)的全部生物學活性是必要的。幾項研究表明盡管體外活性，即與受體的結合在非或部分糖基化形式中最高，但是末端唾液酸殘基的數量對體內半衰期具有積極的作用(Takeuchi和Kobata，1991，Glycobiology 1(4)337-346).。唾液酸化的程度直接與半衰期成比例，其中具有較少唾液酸的同種型會快得多地從生物體清除，因此顯示出較小的活性。
產生高活性重組紅細胞生成素的目的在于通過良好的優化發酵策略和利用選擇性純化方法產生具有大量末端唾液酸殘基的產物。
存在關于不同來源紅細胞生成素(Epo)的純化的大量出版物。在紅細胞生成素克隆和重組DNA技術應用以前，大多數描述的純化利用人尿作為天然來源。下面所有的人紅細胞生成素(Epo)純化方案都以純的產物告終，而沒有強調確定同種型的積累。T.Miyake等，1977，J.Biol.Chem252(15)5558-5564描述了通過七個步驟方法的尿紅細胞生成素(Epo)的純化，包括離子交換層析，乙醇沉淀，凝膠過濾和吸附層析。N.Inoue等，1994，Biol.Pharm.Bull.，17(2)180-184描述了利用陰離子交換層析，凝膠過濾，凝集素層析和反相層析純化來源于人尿的紅細胞生成素(Epo)的不同方法。尿也是G.Krystal等，1986，Blood，67(1)71-79描述的用于Affi-Blue，層析聚焦，凝集素層析，反相層析和制備型SDS-PAGE五步純化的來源。H.Yianagi等，1987，J.Chromatogr.417178-182公開了上述純化步驟的不同聯合。他們的下游處理(DSP)方法開始于尿，并通過乙醇沉淀、兩個凝集素層析步驟、羥基磷灰石和反相層析純化。
V.Broudy等，1988，Arch.Biochem.Biophys.265(2)329-336通過Affi-Gel blue層析、陰離子層析和反相層析，利用轉染的BHK細胞系純化紅細胞生成素(Epo)。純化的紅細胞生成素(Epo)未針對特定同種型進行富集。
A.B.Ghanem，1994，Prep.Biochem.24(2)127-142和A.Gokana等，1997.J.Chromatogr.791109-118利用DEAE-Sephacel在親和層析步驟后分離B-類淋巴母細胞系中產生的紅細胞生成素的同種型。他們通過等電聚焦分析了純化產物，但是沒有合并具有確定同種型的級分。
J.Burg等，WO99/28346對紅細胞生成素(Epo)，就碳水化合物結構中的N-乙酰基-乳糖胺單元和/或四天線分枝(tetra-antenna branch)，進行了高度純化。DSP順序開始于細胞培養物上清液，通過親和層析捕獲，通過疏水相互作用層析、羥基磷灰石和反相層析純化。這種方法的缺點是Blue-sepharose捕獲基質的Cibacron Blue 3G染料-配體可能泄漏，通過HIC步驟對宿主細胞蛋白質的分離相當弱，和硅基RPC樹脂對于NaOH消毒處理不穩定。
發明概述本發明提供了從包含宿主細胞的細胞培養基回收和純化重組人紅細胞生成素(rhEpo)的方法，該方法包括步驟(a)通過選自(i)離心后深度過濾(depth filtration)步驟，(ii)深度過濾步驟，和(iii)離心步驟的方法，從細胞培養基除去宿主細胞、細胞成分和碎片以獲得澄清的培養基上清液；(b)調節上清液的電導率到5mS/cm或以下，及調節pH至約7.0到8.0之間；(c)將步驟(b)得到的上清液施加到包含陰離子交換層析介質的柱上，洗柱子，從柱上洗脫重組人紅細胞生成素(rhEpo)，收集含有重組人紅細胞生成素(rhEpo)的峰級分；(d)利用樹脂，將步驟(c)得到的合并峰級分進行反相層析步驟，該樹脂可以在中等壓力(＜10bar)下運行并且可以抵抗高濃度的NaOH，利用有機溶劑的線性梯度洗脫重組人紅細胞生成素(rhEpo)；(e)將步驟(d)中洗脫的一個或多個含有重組人紅細胞生成素(rhEpo)的級分加到包含陰離子交換層析介質的柱上，洗柱子，利用線性鹽梯度洗脫重組人紅細胞生成素(rhEpo)；(f)根據重組人紅細胞生成素(rhEpo)的唾液酸化程度，選擇步驟(e)中洗脫的含有重組人紅細胞生成素(rhEpo)的一個或多個級分；和(g)利用凝膠過濾介質，將步驟(f)中洗脫的含有重組人紅細胞生成素(rhEpo)的一個或多個級分進行一個或多個大小排阻層析步驟以除去潛在的二聚體和更大的聚集體；收集含有重組人紅細胞生成素(rhEpo)的洗脫物。
發明的詳細描述已經開發出利用現代聚合樹脂的新的純化方法，該樹脂為剛性的(rigid)并且耐受原位苛刻清洗過程，包括1M NaOH或醋酸。而且，對于生產規模的有效方法，這些樹脂有高結合容量并允許高的流率。不使用具有潛在可泄漏配體(如凝集素或染料)由此可能對患者造成問題的樹脂。
所實施的純化步驟有不同的選擇性，從而產生具有低量來源于宿主細胞的蛋白質或DNA的非常純產物。而且，在根據這里概述的本發明純化方法中，幾個、優選至少3個層析步驟有分離單獨的同種型的潛力。特別地，在合并第二陰離子交換層析步驟(即，步驟(e)，參見下文)的級分及通過最后凝膠過濾層析進一步處理前可以通過CZE(毛細管區帶電泳)進行分析。此外，或者備選地，可以通過CZE(毛細管區帶電泳)分析反相層析步驟(即步驟(d)，參見下文)的級分，并且相應地處理該級分。另一種可能性是用第一次陰離子交換層析(即步驟(c)，參見下文)獲得的級分進行(備選地或額外地)CZE(毛細管區帶電泳)。利用CZE(毛細管區帶電泳)，可以將在所分析級分中含有的同種型混合物或組合物形式的糖基化蛋白質或多肽分離為特定的同種型。通過和已知同種型標準比較，特別是比較糖基化模式，例如唾液酸化模式，可以確定通過CZE(毛細管區帶電泳)分離的每個同種型的特定結構。在本發明上下文中，這導致具有確定的高糖基化同種型組成的合并級分，而不依賴于來源的質量。更一般而言，在本發明的過程中，確立了CZE(毛細管區帶電泳)是獨立于蛋白質或多肽本身的屬性而生產包含蛋白質或多肽的糖基化同種型的蛋白質性組合物時的有價值工具。因此，本發明提供了CZE(毛細管區帶電泳)作為分析工具在具有確定的同種型組成的糖基化蛋白質或多肽的生產中的用途。特別地，該用途可以有利地應用在具有確定同種型組成的重組人紅細胞生成素的生產中。因此，本發明包括具有確定同種型組成的糖基化蛋白質或多肽，特別是重組人紅細胞生成素的生產方法，所述方法包括利用CZE(毛細管區帶電泳)分析包含糖基化蛋白質或多肽的一種或多種同種型的樣品(其可以是層析純化步驟的級分)，并且，當期望時合并含有該糖基化蛋白質或多肽的期望同種型的樣品，特別地，其中所述糖基化蛋白質或多肽的同種型是重組人紅細胞生成素的同種型。
而且，可以設計本方法，通過降低剪切應力和細胞裂解在最初分離期間僅僅釋放非常低量的細胞蛋白酶，并且利用殘余蛋白酶沒有活性和對產物無害的條件。這可以通過如下方式達到首先，通過密閉設計的盤疊式離心機(disc stack centrifage)進行細胞分離以保持細胞完整，其次，利用在中性pH工作的陰離子交換層析實施捕獲步驟。低于6的pH將引起內源低pH活性蛋白酶的切割作用。
最后，此下游處理(DSP)順序中的幾個步驟在病毒除去和/或病毒失活方面是有力的。對于哺乳動物細胞來源的治療劑而言，因為不能排除病毒污染，這是重要的要求。實施的納米過濾(nanofiltration)特別有助于除去甚至非常小的無包膜病毒，如細小病毒。反相層析期間和/或之后的溶劑暴露是另一個引起包膜病毒失活的有效步驟。
因此，本發明提供了從包含宿主細胞的細胞培養基回收和純化重組人紅細胞生成素(rhEpo)的方法，該方法包括步驟(a)通過選自(i)離心后深度過濾步驟，(ii)深度過濾步驟，和(iii)離心步驟的方法，從細胞培養基除去宿主細胞、細胞成分和碎片以獲得澄清的培養基上清液；(b)調節上清液的電導率到5mS/cm或以下，并調節pH至約7.0到8.0之間；(c)將步驟(b)得到的上清液施加到包含陰離子交換層析介質的柱上，洗柱子，從柱上洗脫重組人紅細胞生成素(rhEpo)，收集含有重組人紅細胞生成素(rhEpo)的峰級分；(d)利用樹脂，將合并的步驟(c)得到的峰級分進行反相層析步驟，該樹脂可以在中等壓力(＜10bar)下運行并且可以抵抗高濃度的NaOH，利用有機溶劑的線性梯度洗脫重組人紅細胞生成素(rhEpo)；(e)將步驟(d)中洗脫的一個或多個含有重組人紅細胞生成素(rhEpo)的級分施加到包含陰離子交換層析介質的柱上，洗柱子，利用線性鹽梯度洗脫重組人紅細胞生成素(rhEpo)；(f)根據重組人紅細胞生成素(rhEpo)的唾液酸化程度，選擇步驟(e)中洗脫的一個或多個含有重組人紅細胞生成素(rhEpo)的級分；和(g)利用凝膠過濾介質，將步驟(f)中一個或多個洗脫的含有重組人紅細胞生成素(rhEpo)的級分進行一個或多個大小排阻層析步驟以除去潛在的二聚體和更大的聚集體；收集含有重組人紅細胞生成素(rhEpo)的洗脫物。
優選地，利用盤疊式分離器進行步驟(a)中的離心。
在優選實施方式中，在步驟(b)中將電導率調節到2至5mS/cm之間，優選達到約3mS/cm。
有利地，用在步驟(c)中的陰離子交換介質是基于陶瓷的離子交換介質Q-HyperD FTM，可從BioSepra獲得。有利地，用在步驟(d)中的樹脂是可以抗約0.5M NaOH濃度的樹脂；優選地其是聚苯乙烯樹脂，有利地其是Source 30RPCTM(可從Amersham Biosciences獲得)，而用在步驟(e)中的陰離子交換介質優選瓊脂糖凝膠(Sepharose)陰離子交換層析介質，有利地它是Q Sepharose High PerformanceTM(可從AmershamBiosciences獲得)。用在步驟(g)中的凝膠過濾介質優選Superdex 75 prepgradeTM(可從Amersham Biosciences獲得)。
在優選實施方式中，在步驟(d)前，步驟(c)的峰級分(優選地，可以合并)進行硫酸銨沉淀步驟以沉淀污染的宿主細胞蛋白質，然后將上清液的硫酸銨濃度調到與步驟(d)相容的濃度。在向步驟(d)的反相柱上樣前，優選地，該濃度小于0.24M硫酸銨。
通常，在步驟(b)中調節pH到約pH7.5。優選地，用適合的含有鹽，如NaCl的含水緩沖液，例如Tris緩沖液進行步驟(c)中的洗滌。在優選實施方式中，利用20mM pH7.5含有50mM NaCl的Tris緩沖液。類似地，用適合的含有鹽，如NaCl的含水緩沖液，例如Tris緩沖液進行洗脫。通常利用有100mM至1M，特別是大于125mM，優選150mM鹽濃度的緩沖液進行步驟(c)中的洗脫步驟。在優選實施方式中，在該洗脫步驟中利用20mM pH7.5含有150mM NaCl的Tris緩沖液。優選地，步驟(d)中的有機溶劑選自乙腈、乙醇和己二醇(即，2-甲基-2，4-戊二醇)，最優選是乙腈。優選地，在將包含紅細胞生成素的級分施行反相層析前，用含有有機溶劑，優選乙腈的含水緩沖液，如20mM Tris/HCl，pH7.0，稀釋級分。在將稀釋的級分加到反相柱上后，優選地，用含有有機溶劑，優選乙腈的含水緩沖液，如20mM Tris/HCl，pH7.0，洗滌柱子。優選地，利用約10％到約100％的有機溶劑線性梯度在步驟(d)中洗脫紅細胞生成素(Epo)多肽。在其特別優選的實施方式中，在步驟(d)中，通常利用約25％到50％的乙腈線性梯度進行洗脫。步驟(e)中線性鹽梯度通常為0到300mM。優選地，步驟(c)和(e)中的鹽是NaCl。
在本發明一個實施方式中，用適合的含水緩沖液稀釋步驟(d)中洗脫的含有有機溶劑，優選乙腈的級分，該緩沖液與下面的陰離子交換層析步驟相容。為了失活病毒污染物，在步驟(e)前，放置稀釋的級分一段適合的時間，該段時間將足以達到這種期望的病毒污染物失活效果。例如，可以用0.5倍體積的含水緩沖液(特別是20mM Tris/HCl，pH7.0)稀釋該級分，溫育至少約20分鐘到約40分鐘，或者甚至更長，然后用級分原始體積的3.5倍體積的含水緩沖液進一步稀釋。
在本發明優選實施方式中，在步驟(a)中方法(i)，(ii)和(iii)之任一后是無菌過濾步驟。通常地，通過利用0.2μm過濾裝置進行該無菌過濾步驟。
在本發明進一步實施方式中，在本發明方法中，來源于層析柱的級分可以進行超濾步驟，特別是用于濃縮。因此，在優選實施方式中，在步驟(g)中，在大小排阻層析步驟前對級分進行超濾步驟。在另一個優選實施方式中，在步驟(d)中，在反相層析前，對級分進行超濾步驟。在類似的優選實施方式中，如果本發明的方法包括如上所述的硫酸銨沉淀步驟，那么在該硫酸銨沉淀步驟前，對來自步驟(c)的單個或合并的峰級分進行超濾步驟。優選地，本發明方法利用這里提到的所有三個超濾步驟。例如，具有5kDa至10kDa截斷值，例如10kDa，優選5kDa截斷值的膜可以用在該超濾方法中。
在優選的實施方式中，在步驟(g)前或優選地在步驟(g)后，包括死端(dead-end)納米過濾步驟以除去病毒。裝置的例子包括Planova 15N(Asahi)，PALL Ultipor VF Grade DV20或Millipore Viresolve NFP柱體或囊。
如上所述，可能期望在純化步驟期間能篩選優選的同種型，而利用本發明的純化方法可以達到該目的。具體地，因為不同的同種型會在反相層析步驟和第二個陰離子交換層析步驟期間解析，所以能達到該目的。通過毛細管區帶電泳作為生產過程中的控制手段可以測定不同級分的內容物，并在適合時合并或棄去選定級分。在本發明優選的實施方式中，如上所概述，利用毛細管區帶電泳進行如上所述步驟(f)中的一個或多個篩選或步驟(d)和步驟(e)間的一個或多個篩選。
在本發明上下文中，這里所述優選或特定的實施方式可以彼此組合，由此產生其進一步的優選的實施方式。
因此，在優選的實施方式中，本發明提供了從收獲的細胞培養物回收和純化重組人紅細胞生成素(rhEpo)的方法，該方法包括步驟(a)收獲細胞培養物，通過進行選自(i)利用盤疊式分離器的離心及隨后的深度過濾步驟，(ii)深度過濾步驟，和(iii)離心步驟的方法，接著通過0.2μm過濾步驟，從培養基除去宿主細胞、細胞成分和碎片，以獲得澄清的培養基上清液；和(b)調節上清液的電導率到5mS/cm或以下，并調節pH至約7.0到8.0之間；(c)將步驟(b)得到的上清液施加到用Q-HyperD F填裝的陰離子交換柱上，洗柱子，從柱上洗脫重組人紅細胞生成素(rhEpo)，收集含有重組人紅細胞生成素(rhEpo)的峰級分；(d)利用聚苯乙烯樹脂，將步驟(c)得到的合并峰級分進行反相層析步驟，該樹脂可以在中等壓力(＜10bar)下運行并且可以抵抗NaOH CIP條件，如Source 30RPC，利用乙腈線性梯度洗脫重組人紅細胞生成素(rhEpo)；和(e)根據重組人紅細胞生成素(rhEpo)的唾液酸化程度，選擇步驟(d)中洗脫的一個或多個含有重組人紅細胞生成素(rhEpo)的級分，將所述級分施加到用Q-Sepharose HP填裝的高效陰離子交換柱上，洗柱子，利用線性鹽梯度洗脫重組人紅細胞生成素(rhEpo)；(f)根據重組人紅細胞生成素(rhEpo)的唾液酸化程度，選擇步驟(e)中洗脫的一個或多個含有重組人紅細胞生成素(rhEpo)的級分，利用Superdex 75 prep grade對所述級分進行大小排阻層析以除去潛在的二聚體和更大的聚集體；收集含有重組人紅細胞生成素(rhEpo)的洗脫物。
優選地，通過毛細管區帶電泳確定分別在步驟(d)和步驟(e)中獲得的哪一個或多個級分可以被選擇分別在步驟(e)和/或步驟(f)中用于進一步層析純化。作為指導，已證實RPC步驟中重組人紅細胞生成素(rhEpo)較高的糖基化形式存在于洗脫峰的前半部分中，而在Q-Sepharose HP步驟中，高度糖基化和唾液酸化同種型存在于洗脫峰的后半部分中。如上所述，在優選實施方式中，在步驟(d)前，對來自步驟(c)的合并峰級分進行硫酸銨沉淀步驟以沉淀污染的宿主細胞蛋白質，然后調整上清液的硫酸銨濃度以和步驟(d)相容。優選地，所述濃度小于0.24M硫酸銨。在本發明上下文中同樣優選地，本發明優選的方法進一步包括在步驟(f)前，優選在步驟(f)后進行死端納米過濾步驟以除去病毒。
關于用于純化方法的來源材料，優選在無血清培養基中培養宿主細胞。也優選利用不連續補料分批發酵方法培養宿主細胞。特別地，宿主細胞具有表達重組人紅細胞生成素和將紅細胞生成素分泌到培養基中的能力。通常宿主細胞是哺乳動物細胞。優選的宿主細胞是CHO細胞。
本發明也提供了包含本發明方法產生的純化重組人紅細胞生成素的組合物。本發明進一步提供了可以通過本發明方法獲得的純化重組人紅細胞生成素和包含所述純化紅細胞生成素的組合物，特別是藥物組合物。
優選地，組合物有確定含量的重組人紅細胞生成素(rhEpo)糖基化/唾液酸化同種型。因為不同的同種型會在反相層析步驟和第二個陰離子交換層析步驟期間解析，所以可以達到該目的。通過毛細管區帶電泳作為生產過程的控制手段可以測定不同級分的內容物，并在適合時合并或棄去選定的級分。特別地，從RPC步驟合并第一半洗脫峰，因為該處是較高糖基化形式存在的地方。相反地，Q Sepharose HP步驟中的第二半洗脫峰通常含有高度糖基化和唾液酸化的同種型。
優選地，在包含利用本發明方法表達和純化的重組多肽，特別是紅細胞生成素(Epo)的組合物中，重組多肽基本是純的，如至少90％，95％，99％或99.5％的純度。
可以體外和/或體內測定純化的蛋白質的生物學活性。在Hammering等，1996，J Pharm Biomed Anal 14(11)1455-69中描述了適宜的體外測定法，該方法包括測定類紅細胞系的增殖刺激。在Ghanem等，1994，同上引文中描述了合適的體內測定法，該方法包括測定紅細胞增多癥小鼠的紅細胞中摻入的59Fe。
在一個優選方面，可以聯合核酸載體和宿主細胞進行本發明，其中，(a)第一多核苷酸載體包含(i)編碼重組目的多肽的第一核苷酸序列；和(ii)編碼選擇標記的第二核苷酸序列，當宿主細胞與選擇試劑接觸時第二核苷酸序列擴增，和(b)第二多核苷酸載體，除了用編碼不同選擇標記的第三核苷酸序列置換第二核苷酸序列外，第二多核苷酸載體有與第一多核苷酸載體基本相同的核苷酸序列；第一多核苷酸載體和第二多核苷酸載體整合進入宿主細胞的基因組中。
優選地，宿主細胞是哺乳動物細胞，更優選中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
優選地，第二核苷酸序列編碼二氫葉酸還原酶多肽，該選擇試劑是氨甲蝶呤。優選地，重組目的多肽是人紅細胞生成素。在本文件的實施例部分描述了此類系統。
有利地，通過(a)提供包含編碼重組目的多肽并可指導重組目的多肽在宿主細胞中表達的核苷酸序列的宿主細胞；和(b)提供(i)包含水、植物來源的胨、摩爾滲透壓濃度調節劑、緩沖液、能源、氨基酸、脂源或前體、鐵源、非鐵的金屬離子和一種或多種維生素和輔因子；和(ii)不含有任何全長的多肽的無血清培養基；和(c)在使得重組目的多肽能夠表達的條件下，在此培養基中培養宿主細胞，以進行細胞培養。
優選地，重組目的多肽是人紅細胞生成素。宿主細胞可以是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在本文件的實施例部分描述了該技術。
除非另外定義，這里所用的所有技術和科學術語有與本領域(例如細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術和生物化學)普通技術人員通常理解的相同意義。標準技術用于分子、遺傳和生物化學方法(通常參見Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第四版，JohnWiley & Sons，Inc.-和名稱為Current Protocols in Molecular Biology的完全版本，這里將其并入作為參考文獻)和化學方法。
參考如下實施例進一步描述本發明，實施例僅僅是示例性的而非限制性的。特別地，實施例涉及本發明優選的實施方式。
實施例材料宿主細胞系二氫葉酸還原酶缺陷型的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(ATCCCRL-9096)。它們根據布達佩斯條約在2001年8月29日保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，(Rockville，Md.20852，USA)，保藏號ATCCPTA-3672。
細胞培養基培養基補加了4mM L-谷氨酰胺，10％FCS，1x HT(次黃嘌呤，胸苷)的DMEM，選擇培養基補加了4mM L-谷氨酰胺，10％透析的FCS，和0.5mg/mlG418的DMEM，擴增培養基補加了4mM L-谷氨酰胺，10％透析的FCS，0.5mg/mlG418和4.8×10-8M-1.54×10-6M的MTX(氨甲喋呤)的DMEM，冷凍培養基補加了4mM L-谷氨酰胺，10％FCS和10％DMSO的DMEM，用于重組細胞系的無血清適應培養基補加了6mM L-谷氨酰胺，0.25％大豆胨/UF，1x雜交瘤補料，0.1％Pluronic-F68，0.5mg/ml G418，1.54×10-6M的MTX的1∶1 DMEM/Ham’s F12，無血清的生產培養基補加了0.25％大豆胨/UF，1x雜交瘤補料，0.1％Lutrol，1.54×10-6M的MTX，1g/l葡萄糖，2.5g/l NaHCO3的1∶1DMEM/Ham’s F12，用于重組細胞系的無血清冷凍培養基PBS，20％ PVP-10，5％DMSO，100x雜交瘤補料，2.5×10-3M乙醇胺，2.5×10-2M檸檬酸鐵，2.0×10-3M L-抗壞血酸，5.0×10-6M亞硒酸鈉。
質粒構建體pEpo/neo該質粒編碼紅細胞生成素(Epo)的編碼區和新霉素抗性基因作為兩個不同表達盒子，每個表達盒子受SV40早期啟動子/終止序列控制。在實施例1中提供了構建細節。
pEpo/dhfr該質粒編碼紅細胞生成素(Epo)的編碼區和dhfr作為兩個不同表達盒子，每個表達盒子受SV40早期啟動子/終止序列控制。在實施例2中提供了構建細節。
細胞培養中的方法CHO-dhfr-的生長在DMEM培養基中以一周兩次1∶10傳代率培養二氫葉酸還原酶缺陷的CHO細胞(Urlaub等，1980，PNAS 77(7)4216-4220)(稱為CHOdhfr-)。
CHO細胞的轉染在進行脂質轉染前一天，在25cm3T-燒瓶或96孔板中接種1-5×104細胞/cm2。以適合的比率混合相應的質粒，根據制造商的程序向脂質轉染試劑(GIBCO/BRL)中加入該質粒(0.5-1μl/cm2)。然后，用轉染混合物在無血清的DMEM中覆蓋細胞4到16小時，之后用培養基取代含有DNA的培養基。在含有血清的培養基中培養24到48小時后，將細胞轉換到選擇培養基中。在通過ELISA針對紅細胞生成素(Epo)的產生篩選細胞培養物上清液前，首先在選擇培養基中培養轉染的細胞池(pool)至鋪滿，然后在擴增培養基(4.8×10-8M的MTX)中培養。確定最高的生產者，MTX濃度增加了兩倍，最好的生產者用于進一步培養。
分析方法在不同基質中以ELISA檢測紅細胞生成素(Epo)抗體多克隆血清生物素化的兔抗紅細胞生成素(Epo)(R&D Systems；Catalog # AB-286-NA)單克隆抗體小鼠抗紅細胞生成素(Epo)(Genezyme；Cat.codeAE7A5)。
ELISA緩沖液包被緩沖液8.4g/l NaHCO3，4.2g/l Na2CO3，pH9.6-9.8洗滌緩沖液0.2g/l KCl，1.15g/l Na2HPO4×2H2O，0.2g/l KH2PO4，8g/l NaCl，0.1％ Tween 20稀釋緩沖液洗滌緩沖液中2％PVP(Sigma Cat.No.PVP-40T)樣品緩沖液稀釋緩沖液中0.5％α-單-硫代-甘油染色緩沖液7.3g/l檸檬酸×2H2O，11.86g/l Na2HPO4×2H2O，pH4.8-5.0染色溶液100μl OPD溶液/10ml染色緩沖液，5μl H2O2/10ml染色緩沖液OPD母液PPL0017方法所用的ELISA方法檢測在ng/ml濃度范圍中的紅細胞生成素(Epo)，特別地具有約10ng/ml范圍的檢測限，其中所述Epo從500ng/ml開始，8次兩倍稀釋。一種抗紅細胞生成素的頭26個氨基酸的單克隆抗體作為包被層，結合紅細胞生成素(Epo)。在下步中，紅細胞生成素(Epo)被捕獲抗體特異地結合。通過生物素化的識別紅細胞生成素(Epo)的兔抗血清進行檢測。在鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶偶聯到板上后，用OPD染色進行可見觀察。
免疫熒光在6孔板中于蓋片上，用5×104細胞/200μl接種表達紅細胞生成素(Epo)的CHO細胞，并且溫育24-72小時。用PBS洗滌附著的細胞2次，用-20℃甲醇固定5分鐘，然后空氣干燥，然后再一次浸在PBS中。通過與20％FCS在PBS中溫育15分鐘飽和非特異性蛋白質，然后，溫育抗紅細胞生成素(Epo)1小時。用綴合FITC的抗小鼠IgG顯色反應。在488nm激發波長，隨后在高于515nm發射波長下通過共聚焦顯微術檢測熒光。
核大小的檢測材料Coulter CounterModel ZM(Coulter Electronics Inc.)Coulter ChannelyzesModel 256溫育溶液0.1M檸檬酸，2％Triton X 100，電解質Isoton II(Kat-No.844 8011；Coulter Euro Diagnostic GmbH)Coulter Counter定量電導液中懸浮的顆粒大小和數量。用真空吸引液體通過兩側帶有電極的毛細管。電阻的改變引起電壓脈沖，CoulterChannelizer可以數字化該電壓脈沖。核的大小與細胞DNA含量相關，因此可能區分出二倍體和多倍體染色體組。
方法在PBS中洗約1×106CHO-細胞一次，在2ml溫育溶液中重懸浮并且放置4-5小時。下面的步驟是特別針對C0ulter Counter的。
SDS聚丙烯酰胺電泳和Western印跡材料SDS凝膠Novex Tris-甘氨酸4-20％樣品緩沖液Tris甘氨酸SDS 2x(Novex LC 2676)電泳緩沖液Tris甘氨酸SDS(Novex LC 2675)印跡緩沖液50mM Na2B4O7×10H2O，0.1％SDS，20％甲醇印跡基質PVDF Immobilon P 0.45μM Millipore；K8JM8238H洗滌緩沖液參見ELISA洗滌緩沖液稀釋緩沖液洗滌緩沖液中1％奶粉檢測緩沖液0.1M NaCl0.1M Tris-HCl，pH9.5方法在lx樣品緩沖液中，用1％α-MTG將含有紅細胞生成素(Epo)的樣品調整到30ng/20ul，加到SDS凝膠上。在電泳結束后，在PVDFImmobilon膜上印跡蛋白質2小時，然后用檢測紅細胞生成素(Epo)頭26個氨基酸的單克隆抗體特異地染色紅細胞生成素(Epo)。用綴合堿性磷酸酶的抗小鼠IgG和NBT/BCIP染色完成顯色。
等電聚焦材料系統Multiphor II，Amersham BiosciencesIPG凝膠pH2.5-7重新溶脹緩沖液9g尿素，0.5g CHAPS，0.04g DTE，0.5ml Resolytes(pH3.5-10)，10μl溴酚藍(0.1％)，用H2O調節到25ml樣品緩沖液625μl H2O中25μl IPG樣品緩沖液，pH3-10
印跡緩沖液2.93g甘氨酸，5.81g Tris，20ml甲醇，0.375g SDS，用H2O調節到1000ml印跡基質PVDF Immobilon P 0.45μM Millipore；K8JM8238H洗滌緩沖液參見ELISA洗滌緩沖液稀釋緩沖液洗滌緩沖液中0.1％奶粉檢測緩沖液0.1M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH9.5方法將含有紅細胞生成素(Epo)的樣品調整到500-1000ng/50μl，脫鹽，1∶1稀釋在樣品緩沖液中，加到重新溶脹的IPG凝膠上。電泳條件是最初1分鐘300V，然后線性增加到3500V，最后1小時3500V。在整個聚焦過程期間，設定10mA和10W的限定。然后，通過過夜擴散或通過電印跡將蛋白質印跡到PVDF Immobilon膜上，然后用檢測紅細胞生成素(Epo)頭26個氨基酸的單克隆抗體特異地染色紅細胞生成素(Epo)。用綴合堿性磷酸酶AP的抗小鼠IgG和NBT/BCIP染色完成顯色。
DNA含量的測定通過FACS分析比較重組細胞系和CHO-dhfr-宿主細胞系的DNA含量。
材料洗滌緩沖液0.1M Tris-HCl，pH7.4，2mM MgCl2，0.1％Triton X 100染色緩沖液洗滌緩沖液中0.3μg/ml DAPI(Hoechst)方法在PBS中洗5×105細胞，并且用冰冷的70％乙醇固定。然后，用洗滌緩沖液洗細胞2次，然后在室溫下在染色緩沖液中溫育30分鐘。用FACSVantage(Becton和Dickinson)在359nm激發波長和450nm發射波長下測定DNA含量。
體外特異性檢測人紅白血病細胞系TF-1(German Collection of Microorganisms andCell Cultures)依賴于IL3或hGM-CSF生長。這些細胞因子顯示了對增殖的協同效應，而紅細胞生成素(Epo)可以維持生存能力一段時間。細胞常規地在含有GM-CSF和紅細胞生成素(Epo)的培養基中生長。
檢測補料培養基補加了4mM Gln，10％FCS，20μg/ml運鐵蛋白，10μM β-巰基乙醇，12ng/ml rhGM-CSF，3U/ml rh Epo的RPMI 1640檢測培養基補加了4mM Gln，100μg/ml運鐵蛋白，2mg/ml BSA的RPMI 1640方法在96孔板中以MTT生存力檢測進行功能性檢測(Hammerling等，1996，J Pharm Biomed Anal 14(11)1455-69)。在檢測培養基中從100ng紅細胞生成素(Epo)/ml開始以1∶2倍稀釋樣品8次。將50μl每個樣品稀釋液、標準稀釋液或空白轉移到96孔檢測板。用冷PBS洗TF-1細胞3次，在檢測培養基中調節到2×105細胞/ml。用50μl細胞懸浮液鋪在96孔檢測板的每個孔中，在CO2培養箱中放置細胞72小時。之后加入10μlMTT溶液(6mg/ml，于PBS中)并37℃溫育4小時。在黑暗中，用100μl SDS/HCl(0.1M HCl中10％SDS)溶解染料另外4小時，在550/690nm光度測定紅細胞生成素依賴性生存力。
實施例1-質粒Epo/neo的構建1.p2-neo的構建1.1從含有SV40早期啟動子的pSV2neo制備載體片段載體構建的基礎是包含在pSV2neo中的pBR322質粒骨架。較小的EcoRI-PvuII限制片段包含該pBR322骨架，并且來自SV40的鄰近PvuII-HindIII片段具有SV40早期啟動子的相關片段。
用限制酶EcoRI和HindIII切割質粒pSV2neo(ATCC 37149)。由此得到的片段大小是3092bp和2637bp。2637bp片段的組成為含有pBR322骨架的EcoRI-PvuII限制片段和含有SV40早期啟動子片段的鄰近PvuII-HindIII片段。通過凝膠電泳制備和純化2637bp片段。
1.2新霉素抗性基因的制備從pSV2neo的轉座子Tn5提取neo基因。以含有僅基因編碼區的片段形式擴增該基因。作為克隆策略的一部分，在兩個末端引入限制性內切核酸酶的識別位點。在上游擴增引物中建立HindIII位點，而EcoRI和SpeI位點建立在下游引物中。擴增區對應于pSV2neo序列中核苷酸第2846到1938位(Genbank記錄號U02434)。設計寡核苷酸如下寡2004-01長度38mer5′-ggg gga agc ttg ttg gga agc cct gca aag taa act gg -3′ SEQ ID No.15′HindIIIaagctt-g(＝pSV2neo中位置2846)ttgggaagccctg....... SEQ ID No.2寡2004-02長度42mer5′-ggg gaa ttcactagtgag tcc cgc tca gaa gaa ctc gtc aag -3′ SEQ ID No.35′EcoRI/SpeIgaa ttcactagt-g(＝pSV2neo中位置1938)agtcccgctcagaa......... SEQ ID No.4利用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制備引物2004-01和2004-02的擴增產物。該方法的參數是在所提供的緩沖液中20ng pSV2neo，每種引物10pmol，10mmol dNTPs，2.5U Pwo聚合酶，總體積50μl；溫度模式95℃，5分鐘，35次(95℃，30秒；65℃，20秒；72℃，90秒)，72℃，3分鐘，在4℃冷卻直到下一步使用。
通過DNA分離柱(Mini，Wizard Promega GmbH)純化由此得到的935bp DNA片段，用EcoRI和HindIII消化，通過瓊脂糖凝膠純化，用SpinColumns(Supelco)洗脫。
1.3 p1-neo的構建利用Ligation Express(Clontech)將擴增的EcoRI-HindIII neo基因片段與來自pSV2-neo的EcoRI-HindIII載體片段連接，并且轉化進入大腸桿菌(E.coli)宿主(E.coli SURE(Stratagene))。通過在補加50mg/l氨芐青霉素的LB培養基上生長篩選轉化體。
從克隆分離質粒DNA，利用EcoRI加NcoI，通過限制分析進行檢查(分別是2527bp，780bp和251bp三個片段)。通過測序構建體的相關部分進一步檢查顯示預期片段的質粒DNA。命名含有證實的SV40早期啟動子和新霉素抗性基因的質粒DNA為p1-neo。
1.4 SV40終止區SV40LTpolyA/IVS的制備設計PCR引物擴增pSV2neo中存在的SV40終止區域片段(核苷酸751到1598位)。上游引物也含有SpeI限制位點。除了BamHI位點已經包含在pSV2-neo位置751處外，將EcoRI位點引入下游引物中距離BamHI位點6個核苷酸間隔區。兩個引物的序列如下寡2004_05長度40mer5′-ggggactagttt gtg aag gaa cct tac ttc tgt ggt gtg a -3′ SEQ ID No.55′ SpeIactag-t(＝pSV2neo中位置1598)ttgtgaagga.............SEQ ID No.6寡2004_06長度46mer5′-ggg ggaattcgg agg gggatccag aca tga taa gat aca ttg atg a-3′ SEQ ID No.75′EcoRI/BamHIgaattc-g(＝pSV2neo中位置751)gatccagacatgataag..... SEQ ID No.8利用上述Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制備引物2004-05和2004-06的擴增產物。利用DNA分離柱純化由此得到的873bp DNA片段，用EcoRI和SpeI消化，凝膠純化。
1.5 p2-neo的制備用EcoRI+Spel消化p1-neo質粒DNA。純化所得線性化片段，與含有SV40LTpolyA/IVS的擴增片段連接，并且轉化進入大腸桿菌(E.coli)宿主細胞。通過在補加50mg/l氨芐青霉素的LB培養基上生長篩選轉化體。從克隆分離質粒DNA，利用EcoRI(1個4411bp片段)和NcoI(3631bp和780bp大小2個片段)和SphI(3499bp，840bp和72bp大小3個片段)，通過限制分析檢查該質粒DNA。通過測序構建體的相關部分進一步檢查顯示預期片段的質粒DNAs。命名含有證實的SV40LTpolyA/IVS的質粒DNA為p2-neo。
2.質粒p3的構建2.1 SV40早期啟動子片段的制備質粒pSV2neo用作SV40早期啟動子片段的來源。片段大小幾乎與用于構建p2質粒的片段相同。然而，對片段的末端進行了修飾以引入BamHI和NotI識別位點。用于擴增啟動子的寡核苷酸引物設計如下寡2004-07長度38mer5′-ggg gggatcctg tgg aat gtg tgt cag tta ggg tgt gg -3′ SEQ ID No.95′BamHIggatcc-t(＝pSV2neo中位置3435)gtggaat.............SEQ ID No.10寡2004-08長度46mer5′-ggg ggcggccgcagc ttt ttg caa aag cct agg cct cca aaa aag c-3′SEQ ID No.115′NotIgcggccgc-a(＝pSV2neo中位置3093)gctttttgcaaaag...............SEQ ID No.12利用上述Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制備引物2004-07和2004-08的擴增產物。利用DNA分離柱純化由此得到的365bp DNA片段，用BamHI和NotI消化，凝膠純化。
2.2 pBluescript載體部分的制備分別利用BamHI和NotI相繼限制切割pBluescript II SK+DNA。利用堿性磷酸酶將DNA去磷酸化。在連接前通過瓊脂糖凝膠電泳從小片段純化BamHI/NotI片段。
2.3質粒p3的制備和驗證利用T4 DNA連接酶(Promega GmbH)將含有SV40早期啟動子的擴增BamHI/NotI片段連接到制備的pBluescript II SK+載體中。從補加100mg/l氨芐青霉素的LB培養基上的菌落分離和純化大腸桿菌SURE(Stratagene)轉化體的質粒DNA。
利用EcoRI加NcoI，通過限制分析檢查由此得到的DNA(2個3039bp和253bp大小的片段)。
通過測序進一步檢查顯示預期片段的兩個質粒DNA。測序SV40早期啟動子的雙鏈以證實每個位置。命名該質粒為p3。
3.人紅細胞生成素(Epo)cDNA的分離3.1 TRIZol試劑分離總RNA
用于從人腎組織(從Laizner Krankenhaus醫院獲得)分離紅細胞生成素(Epo)RNA的TRIZol試劑是苯酚和異硫氰酸胍的單相溶液。在細胞裂解期間，當細胞破壞時，異硫氰酸胍與RNA形成水溶性復合物。添加氯仿后離心，將溶液分成含有RNA的水相和有機相。水相分離后，用異丙醇沉淀RNA，用乙醇洗，空氣中干燥并在無RNAse的水中重懸浮。
將人腎組織塊切成小片，施力使其通過100μm細胞濾器，離心(179xg/10分鐘)，用PBS洗由此產生的沉淀3次。然后在PBS中重懸浮沉淀，等份置于無菌試管中，冷凍到-196℃，在使用前貯藏在-80℃。
通過添加1ml TRIZol試劑裂解冷凍組織，勻漿并在15-30℃溫育5分鐘確保完全解離。加入200μl氯仿后，震蕩試管并在15-30℃溫育2-3分鐘，以12000xg離心試管10分鐘。離心后，將上層水相小心地轉移到新試管中與500μl異丙醇混合，在15-30℃溫育10分鐘。離心(12000xg，10分鐘)沉淀的RNA，用乙醇洗沉淀，再次離心，空氣干燥并在無RNAse的DEPC水中溶解。在260nm光度地測定總RNA含量。
1OD260nm＝40μg RNA/ml通過計算OD260nm和OD280nm(蛋白質最大吸收)的比率，人們可以估計出RNA分離物的純度。范圍應該在1.6和1.8之間。
3.2用Dynabeads寡(dT)25分離mRNADynabeads寡(dT)25mRNA DIRECT試劑盒利用真核生物mRNA的聚腺苷尾RNA和超磁性聚苯乙烯顆粒雜交，該顆粒含有與其表面共價連接的25個核苷酸長的脫氧胸苷酸鏈。利用Dynal磁性顆粒濃縮器(DynalMPC)分離與磁珠結合的mRNA。
洗滌緩沖液 Tris-HCl 10mM，pH8.0；LiCl 0.15mM；EDTA 1mM2x結合緩沖液 Tris-HCl 20mM，pH7.5；LiCl 1mM；EDTA 2mM對于10μg總RNA，在Dynal MPC中分離100μl Dynabeads寡(dT)25，并且用2x洗滌緩沖液洗2次。同時用1x洗滌緩沖液將總RNA調整到200μl的體積，并且通過在65℃溫育4分鐘變性。然后，將RNA與磁珠混合，在室溫溫育5分鐘，在Dynal MPC中分離。用1x洗滌緩沖液洗磁珠2次。通過在65℃與洗脫緩沖液(2×10μl)溫育4分鐘從Dynabeads寡(dT)25洗脫聚腺苷酸化RNA。在Dynal MPC中分離Dynabeads，立即將上清液轉移到新的無RNAse的微量離心管中。洗脫物直接用于反轉錄。
3.3 反轉錄通過在80℃溫育4分鐘變性紅細胞生成素(Epo)的特異引物，通過在65℃溫育5分鐘變性mRNA。在冰上，將下面的成分加到1.5ml無菌微量離心管中試劑 終濃度mRNA 10μlMMLV(200U/μl)0.25μlBoehringer PCR緩沖液(10×)2μldNTPs(10mM) 2μlMgCl2(50mM) 1μlEpo正向引物(100pmol/μl) 1μlDTT(0.1M) 0.25μlRNAse抑制劑(40U/μl) 0.25μlH2O 3.25μl37℃溫育60分鐘，100℃失活5分鐘。
3.4 聚合酶鏈式反應在4℃，將下列成分加入到無菌1.5ml微量離心管中。PCR條件如下試劑 Epo模板 cDNA Epo 5μl聚合酶Vent 1U(0.5μl)聚合酶緩沖液(10×)Vent緩沖液1×(10μl)dNTPs(10mM) 200μM(2μl)MgCl2(50mM) /正向引物(10pM)30pM(3μl)反向引物(10pM)30pM(3μl)DMSO /H2O 76.5μl
PCR循環1變性 95℃2分鐘2變性 94℃45秒3引物退火 58℃30秒4延伸 72℃1分鐘5最后延伸 72℃10分鐘6循環 30個通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產物。
3.5 瓊脂糖凝膠電泳6×BX緩沖液 溴酚藍0.25％；二甲苯腈藍0.25％；甘油30％TAE緩沖液Tris堿242g；冰醋酸57.1ml；EDTA(0.5M，pH8.0)100ml；水調整到1000mlλ標記III10μg野生型λ噬菌體Dann(2.5μl HindIII+2.5μl EcoRI+20μl緩沖液R(Fermentas)，用水補充到200μl；在37℃消化1小時，在65℃失活20分鐘；用40μl BX-上樣緩沖液補充)在微波爐中溶化1g瓊脂糖和99g 1×TAE緩沖液，冷卻到約60℃，補加3μl溴乙錠母液(10mg/ml)。根據待分離DNA片段的長度，在1×TAE緩沖液中，在100-300V進行凝膠電泳約30分鐘。每泳道含有10μl與2μl 6×BX緩沖液混合的樣品。根據與λ/HindIII消化分子量標準比較鑒定DNA片段。
3.6用于連接的載體和PCR產物的制備3.6.1載體DNA和用于粘性末端克隆的插入片段的限制消化根據制造商的說明書，10u限制酶和適合的限制緩沖液與1μg載體DNA和插入片段混合。根據所用的酶、載體和插入片段，在37℃(對于Smal是30℃)溫育混合物30至60分鐘。然后通過加熱到65℃，10分鐘失活酶，通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應混合物。
3.6.2連接pIRESneoSV40載體pIRESneo載體(Clontech Laboratories)含有腦心肌炎病毒(ECMV)的內部核糖體進入位點(IRES)，其允許從一個信使RNA翻譯兩個開放讀框。pIRESneo表達盒子含有人巨細胞病毒(CMV)主要立即早期啟動子/增強子，其后是多克隆位點(MCS)、ECMV IRES，之后是新霉素磷酸轉移酶基因和牛生長激素的聚腺苷酸化信號。在該載體中，用SV40早期啟動子置換CMV啟動子。
用T4 DNA連接酶連接載體和PCR產物。對于最佳的連接，以約1∶10的摩爾比率利用約20ng載體和200ng插入片段(根據長度)，在總體積10μl的水中與下面試劑混合。15℃過夜并在室溫進行溫育3小時。然后通過在65℃溫育10分鐘熱失活連接酶。

3.6.3細菌和培養基JM109(Promega，USA)LB培養基 酪蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g，用水調整到1000ml，用5M NaOH將pH調到7.0。
LB瓊脂1000ml LB培養基中15g瓊脂LB-Amp1000ml LB培養基中100μl氨芐青霉素(100mg/ml)SOC培養基 細菌培養用胰蛋白胨20g；酵母提取物5g；NaCl 10mM；KCl 3mM；MgCl210mM；葡萄糖20mM，MgSO410mM3.6.4利用CaCl2轉化感受態細菌(JM109)的制備用大腸桿菌(JM109)接種10ml LB培養基，在37℃過夜生長。在LB培養基中以1∶100稀釋4ml細菌培養物，生長到OD260nm達到0.8。在4℃，4500rpm離心細菌10分鐘，以10ml 0.1M CaCl2(4℃)/50ml所用細菌懸浮液重懸浮細胞沉淀。離心細胞，在2ml 0.1M CaCl2中重懸浮沉淀，等份為100μl的總體積，液氮中冷凍，在-80℃貯藏。
轉化在預冷卻的17×100mm聚丙烯培養管中將5-10ng質粒DNA加入到JM109感受態細菌中，輕輕混合，在冰上放置30分鐘。然后在精確地42℃，不要振蕩，水浴熱激細胞45秒，之后立即置冰上2分鐘。向試管中加入900μl SOC培養基，并且在37℃溫育30分鐘，之后在LB-Amp平板上涂100μl細菌懸浮液。
3.6.5篩選和確立甘油培養物通過PCR技術篩選具有插入DNA片段的氨芐青霉素抗性菌落。將氨芐青霉素抗性菌落的一部分和PCR反應混合物及特異于克隆的DNA片段的引物(參見下文)混合。在瓊脂糖凝膠電泳中陽性菌落顯示PCR擴增的DNA帶。然后，在LB-Amp培養基中增殖這些菌落用于進一步分析和質粒純化。為了進一步使用和貯藏，1ml期望的細菌培養物與500μl甘油(87％)混合，并在-80℃貯藏。
3.6.6 WizardPlus SV小量制備DNA純化系統細胞重懸浮溶液 Tris-HCl 50mM，pH7.5；EDTA 10mM，RNase A 100μg/ml細胞裂解溶液NaOH 0.2M，SDS 1％中和溶液鹽酸胍4.09M，醋酸鉀0.759M，冰醋酸2.12M，pH4.2柱洗滌溶液 醋酸鉀60mM，Tris-HCl 10mM，pH7.5；乙醇60％用單菌落接種2-3ml LB-Amp培養基，在37℃過夜溫育。離心(12000xg，5分鐘)溶液，以250μl重懸浮溶液及隨后以250μl細胞裂解液完全重懸浮由此得到的沉淀，通過顛倒試管4次混合，在室溫溫育1-5分鐘。此后加入10μl堿性蛋白酶溶液(在室溫溫育5分鐘)和350μl中性溶液。通過顛倒試管4次立即混合試管，室溫，12000xg離心細菌裂解液10分鐘。將澄清的裂解液轉移到Spin Columns，離心(12000xg，5分鐘)，用洗滌溶液(750μl/250μl)洗柱2次。用100μl無核酸酶的水洗脫DNA。
3.6.7質粒的測序通過IBL(Gerasdorf，Austria)和通過GenXpress(Maria Wrth，Austria)，用特異性引物測序插入的序列。下面列出了用于紅細胞生成素(Epo)和SV40早期啟動子擴增和序列分析的寡核苷酸引物。
寡核苷酸引物序列SV40早期啟動子SV40早期ClaI正向 5’-aga tcg atc aag ctt ttt gca aaa gcc tag-3 SEQ ID No.13SV40早期NruI反向 5′-agt cgc gag cgc agc acc atg gcc tg-3′ SEQ ID No.14SV40早期281反向 5′-gcc cag ttc cgc cca ttc-3′ SEQ ID No.15EpoEpo BamHI正向 5′-tag gat cct cat ctg tcc cct gtc ctg c-3′ SEQ ID No.16Epo EcoRI反向 5′-tag aat tcc gcc atg ggg gtg cac gaa tgt cc-3′ SEQ ID No.17Epo221正向5′-taa ctt tgg tgt ctg gga-3′ SEQ ID No.18Epo204反向5′-tcc cag aca cca aag tt-3′ SEQ ID No.19PIRESneopIRESneo 181反向 5′-tta ggg tta ggc gtt ttg cg-3′ SEQ ID No.20pIRESneo 1016正向 5′-act cac ccc aac agc cg-3′ SEQ ID No.21pIRESneo 2786正向 5′-ggcc aaa caa cag atg gct-3′SEQ ID No.22pIRES-20000反向 5′-tgg aaa gag tca aat ggc-3′ SEQ ID No.234.質粒p5的構建4.1 Epo基因片段的制備利用pSVGPIRNEO作為模板DNA，通過PCR擴增Epo(人紅細胞生成素)的結構基因。在GenBank記錄號M11319.1中給出了Epo序列。分別將限制位點NotI和KspI引入上游和下游引物中。設計引物如下寡2004-09長度45mer
5′-ggg ggcggccgcatg ggg gtg cac gaa tgt cct gcc tgg ctg tgg -3′ SEQ ID No.245′NotIgcggccgca(＝PSVGPIRNEO中位置665)tgggggtg.............. SEQ ID No.25寡2004-10長度44mer5′ggg gccgcggtc atc tgt ccc ctg tcc tgc agg cct ccc ctg tg-3′ SEQ ID No.265′KspIccgcgg-t(＝PSVGPIRNEO中的位置1246)catctgtcccct............... SEQ ID No.27利用上述Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制備引物2004-09和2004-10的擴增產物。利用DNA分離柱純化由此得到的604bp DNA片段，用KspI和NotI消化，凝膠純化。由此得到的592bp KspI/NotI片段用在下述的三重連接中。
4.2終止區SV40LTpolyA/IVS的制備除了將引物設計為具有不同限制核酸內切酶識別位點外，用與上述1.4部分中p2-neo構建方法相似的方法，通過PCR，從pSV2neo再次克隆終止區SV40LTpolyA/IVS上游引物包含KspI(＝SacII)位點，下游引物包含SacI和EcoRI位點。
寡2004-11長度42mer5′ggg gccgcggtt tgt gaa gga acc tta ctt ctg tgg tgt gac-3′SEQ ID No.285′KspIccgcgg-t(＝pSV2neo中位置1598)ttgtgaaggaa.............SEQ ID No.29寡2004-12長度46mer5′-ggg ggagctcgaattcga tcc aga cat gat aag ata cat tga g-3′ SEQ ID No.305′SacI/EcoRIgagctcgaattc-g(＝pSV2neo中位置752)atccagacatg.....SEQ ID No.31利用上述Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制備引物2004-11和2004-12的擴增產物。利用DNA分離柱純化由此得到的873bp DNA片段，用KspI和SacI消化。凝膠純化由此得到的858bp DNA片段。
4.3 p3載體部分的制備分別利用NotI和SacI相繼消化p3質粒DNA。用堿性磷酸酶處理DNA，凝膠純化載體片段。
4.4質粒p5的三重連接和分離在一個連接反應中連接質粒p3的NotI/SacI載體部分、KspI/NotI Epo基因和KspI/SacI終止區SV40LTpolyA/IVS(Ligation Express，Clontech)。在補加100mg/l氨芐青霉素的LB培養基上篩選轉化體。
利用兩個擴增片段2004-09/2004-10和2004-11/2004-12作為標記探針，通過菌落雜交篩選含有兩個片段的陽性轉化體。選擇使用兩個探針均給出陽性雜交信號的10個克隆用于“中等”規模的質粒制備(Qiagen)。
利用酶BamHI(1個4723bp片段)，EcoRI(2913，1810bp的2個片段)和PvuII(2513，1204，903，103bp的4個片段)進行限制分析。選擇顯示正確限制片段的兩個克隆，通過測序進行檢查。測序克隆進入pBluescript IISK+中的整個盒子，并且與預期的核苷酸序列比較。可以成功地證實每個單獨的核苷酸。命名質粒為p5。
5.pEpo/neo的構建5.1 pEpo/neo 12-1的構建用BamHI和EcoRI消化p5質粒DNA，凝膠純化由此產生的代表SV40啟動子-Epo基因-SV40終止子的1792bp片段。
也用BamHI和EcoRI消化質粒p2-neo，凝膠純化線性化載體。此外，用堿性磷酸酶去磷酸化DNA，用Amicon Micropure酶去除器純化。
連接4411bp p2-neo載體和來源于p5的1792bp盒子此兩個片段(Ligation Express，Clontech)，轉化進入大腸桿菌SURE。從生長在補加70mg/l氨芐青霉素的LB培養基上的各種轉化體分離質粒DNA，通過利用限制內切核酸酶PvuII，EcoRI和NcoI消化分析該質粒DNA。
選擇顯示期望片段(EcoRI6191bp，NcoI4085，1326和780bp，PvuII3273，2130，685和103bp)的克隆，命名為pEpo/neo-12。
為了進一步純化，將DNA重新轉化進入大腸桿菌SURE(參見上文)并利用“Midi-prep”方法(Qiagen)從單菌落接種的培養物制備質粒DNA(pEpo/neo 12-1)，利用酶BamHI，HindIII，EcoRI，NcoI，NotI，PstI，SpeI，SphI，PvuII，NarI進行限制分析。可以發現預期的片段和大小，證實克隆為正確的pEpo/neo克隆。
5.2 pEpo/neo的最后構建在從起始ATG起的-3位置改變pEpo/neo-12-1中Epo基因的上游區。將另外核苷酸A引入以在從起始ATG起的-3位置產生嘌呤堿基G。在該位置的嘌呤可以改進基因的表達水平。為了該目的，利用修改的上游引物2004-09-a再次擴增Epo基因。
寡2004-09-a長度46mer5′-gggggcggccgcaatgggggtgcacgaatgtcctgcctggctgtgg-3′SEQ ID No.32如上所述，利用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制備引物2004-09-a和2004-10的擴增產物。利用DNA分離柱純化由此得到的605bp DNA片段，用KspI和NotI消化。然后凝膠純化由此得到的593bp DNA片段。
分別用KspI和NotI消化pEpo/neo-12-1質粒DNA以除去Epo基因。然后凝膠純化5599bp片段。連接兩個制備的DNA(Ligation Express，Clontech)。從補加70mg/l氨芐青霉素的LB培養基上的菌落分離和純化轉化體的質粒DNA。在第一次篩選中，利用NcoI限制分析DNA。
選擇陽性克隆利用“Midi-prep”方法(Qiagen)分離DNA。利用BamHI，HindIII，EcoRI，NcoI，NotI，PstI，SpeI，SphI，PvuII，NarI進行深入的限制分析。可以發現預期的片段和大小，證實正確的pEpo/neo克隆。也通過測序證實插入在pBR322載體部分中的整個盒子的每一個核苷酸(SV40早期啟動子-neo基因-SV40LTpolyA/IVS-SV40早期啟動子-Epo基因-SV40LTpolyA/IVS)。
實施例2-質粒Epo/dhfr的構建1.p2-dhfr-CDS的構建1.1 dhfr基因的制備從存在于質粒pLTRdhfr26(ATCC 37295)中的小鼠cDNA獲取用于載體構建的dhfr基因。可以以GenBank記錄號L26316.得到小鼠dhfrcDNA核苷酸序列(MUSDHFR)。
利用設計的引物從pLTRdhfr26擴增dhfr，該設計的引物產生含有從位置56起始ATG到位置619終止密碼子TAA的編碼區的片段。考慮到上述新霉素抗性基因的擴增，在上游和下游擴增引物中分別引入HindIII和SpeI位點。在反向引物中除了SpeI位點外也引入了EcoRI位點。寡核苷酸的序列如下寡2004-13長度39mer5′-ggg gaagcttat ggt tcg acc att gaa ctg cat cgt cgc-3′ SEQ ID No.335′HindIIIaagctt-A(＝MUSDHFR中位置56)TGgttcgaccattg.............SEQ ID No.34寡2004-14長度42mer5′ggggaa ttcactagttag tct ttc ttc tcg tag act tca aac-3′SEQ ID No.355′EcoRI/SpeIgaattcactag-t(＝MUSDHFR中位置619)tagtctttcttctcgtagacttcaaact..... SEQ ID No.36如上所述，利用Pwo聚合酶(Roche Diagnostics)制備引物2004-13+2004-14的擴增產物。利用DNA分離柱純化由此得到的588bp DNA片段，用HindIII和EcoRI消化，凝膠純化。
1.2 p1-dhfr-CDS的制備利用Ligation Express(Clotech)，連接擴增的EcoRI-HindIII dhfr基因片段和來源于pSV2-neo的EcoRI-HindIII載體片段，轉化進入大腸桿菌宿主。通過在補加50mg/l氨芐青霉素的LB培養基上生長篩選轉化體。從補加50mg/l氨芐青霉素的LB培養基上的菌落分離和純化轉化體的質粒DNA。
從克隆分離質粒DNA，并且利用EcoRI加ScaI，通過限制分析檢查質粒DNA(2225bp，514bp和473bp大小的3個片段)。
通過測序構建體的相關部分進一步檢查顯示預期片段的質粒DNA。命名含有證實的SV40早期啟動子和二氫葉酸還原酶基因的質粒DNA為p1-dhfr-CDS。序列的分析揭示了dhfr基因內不同于MUSDHFR公開序列的一個差異，具體是在MUSDHFR序列位置451從T到C的改變。隨后的測序表明該變化也存在于源質粒中。因為CTT和CTG都編碼亮氨酸，所以由此得到的改變沒有引起核苷酸序列編碼的氨基酸序列的改變。
1.3 p2-dhfr-CDS的制備用EcoRI+SpeI消化p1-dhfr-CDS質粒DNA。純化由此得到的線性片段，并且與含有SV40LTpolyA/IVS的擴增片段連接(見上述)。接著轉化和篩選，利用AccI，通過限制分析(2994，855和216bp的3個片段)由此得到的質粒。選擇幾個質粒，利用HincII(分別是3466bp和599bp的2個片段)，A f IIII(分別是2872bp和1193bp的2個片段)和BgII(分別是2371bp和1694bp 2個片段)進一步分析。
通過測序進一步檢查顯示所有預期正確大小片段的質粒DNA。命名證實的質粒為p2-dhfr-CDS。
2.pEpo/dhfr的構建2.1 pEpo/dhfr 21的制備用BamHI和EcoRI消化p5質粒DNA，凝膠純化由此得到的1792bp片段，其為SV40啟動子-Epo基因-SV40終止子盒子。
也用BamHI和EcoRI消化質粒p2-dhfr-CDS，凝膠純化線性化載體，用Supelco spin柱洗脫。此外，用堿性磷酸酶去磷酸化DNA，用AmiconMicropure酶去除器純化。
連接4053bp p2-dhfr-CDS載體和來源于p5的1792bp盒子此兩個片段(Ligation Express，Clontech)，轉化進入大腸桿菌SURE。利用Epo基因(PCR產物)作為探針，雜交生長在補加70mg/l氨芐青霉素的LB培養基上的轉化體菌落，從各種陽性克隆分離質粒DNA，通過利用限制內切核酸酶NcoI消化分析該質粒DNA。
選擇顯示預期片段(NcoI4085bp和1760bp)的克隆，命名為pEpo/dhfr-21。
為了進一步純化，將DNA重新轉化進入大腸桿菌SURE(參見上文)，利用“Midi-prep”方法(Qiagen)從單菌落接種的培養物制備質粒DNA(pEpo/dhfr-21-1)。
利用酶BamHI，HindIII，EcoRI，NcoI，NotI，PstI，SpeI，SphI，PvuII，NarI進行限制分析。可以發現所有預期的片段和大小，證實克隆為正確pEpo/dhfr-21。
2.2 pEpo/dhfr的最后構建用與pEpo/neo相同的方法，在相對于起始ATG的-3位置改變Epo/dhfr-21中Epo基因上游區。將另一個核苷酸A引入以在從起始ATG起-3位置產生嘌呤堿基G。如實施例1之4.2部分所述再次擴增Epo基因。
用KspI和NotI消化Epo/dhfr-21質粒DNA以除去Epo基因。然后凝膠純化5259bp片段。
連接兩個制備的DNA(Ligation Express，Clontech)。從補加70mg/l氨芐青霉素的LB培養基上的菌落分離和純化轉化體的質粒DNA。利用NcoI在第一篩選中限制分析DNA。
選擇陽性克隆，利用“Midi-prep”方法(Qiagen)分離DNA。利用BamHI，HindIII，EcoRI，NcoI，NotI，PstI，SpeI，SphI，PvuII，NarI進行深入的限制分析。可以發現預期的片段和大小，證實克隆為正確的pEpo/dhfr。
也通過測序證實插入在pBR322載體部分中的整個盒子的每一個核苷酸(SV40早期啟動子-dhfr基因-SV40LTpolyA/IVS-SV40早期啟動子-Epo基因-SV40LTpolyA/IVS)。
實施例3-從pEpo/neo和pEpo/dhfr產生重組CHO細胞在進行脂質轉染前一天，在25cm3T-燒瓶或96孔板中接種1-5×104細胞/cm2。以50∶1＝Epo/neo∶Epo/dhfr的比率混合兩種質粒，根據制造商的程序，使該質粒吸附到脂質轉染試劑(GIBCO/BRL)上。
簡而言之，我們利用0.25μg DNA/cm2和1.5μl脂質轉染試劑/cm2，并且調整該DNA/脂質混合物到200μl/cm2細胞層。在無血清的DMEM中用轉染混合物鋪在細胞上4小時，然后用培養基置換含有DNA的培養基。在含有血清的培養基中培養24小時后，將細胞轉到選擇培養基。開始在選擇培養基中培養轉染的細胞池至鋪滿，然后在擴增培養基中(4.8×10-8MMTX)培養，之后通過針對Epo產生的ELISA篩選細胞培養上清液。確定最高的生產細胞株，MTX濃度增加2倍，最好的生產細胞株用于進一步培養。選擇7個重組細胞池，并且比較生長特性、Epo生產力、蛋白質帶型(通過Western印跡分析)，Epo功能性和染色體穩定性。
在T25燒瓶中，用每個T25燒瓶中2.5μg pEpo/neo、0.05μg pEpo/dhfr和15μl脂質轉染試劑(09/T25/1和09/T25/2)及每個T25燒瓶中2μgpEpo/neo、0.4μg pEpo/dhfr和15μl脂質轉染試劑(09/T25/3和09/T25/4)進行轉染。
此外，用每平板10μg pEpo/neo、0.2μg pEpo/dhfr和60μl脂質轉染試劑轉染5個平板(09/96/1-09/96/5)，用每平板8μg pEpo/neo、1.6μgpEpo/dhfr和60μl脂質轉染試劑轉染5個平板(09/96/6-09/96/10)。用6.25μg pEpo/neo、0.08μg pEpo/dhfr和35.5μl脂質轉染試劑轉染平板11和12。
簡而言之，利用了0.25μg DNA/cm2和1.5μl脂質轉染試劑/cm2，并且將該DNA/脂質混合物調整到200μl/cm2細胞層。
因為以前的試驗表明一個培養單元中克隆數最大是3到5，所以主要是在微量滴定板上進行一系列轉染。這意味著單克隆轉染體的分離比從T燒瓶中數百個克隆的分離更容易。表1描述了每個96孔板的克隆數及有擴增壓力和無擴增壓力下的ELISA效價。開始在選擇培養基中培養轉染的細胞池至鋪滿，然后在擴增培養基中(4.8×10-8M MTX)培養轉染的細胞集合，之后通過針對Epo產生的ELISA篩選細胞培養上清液。篩選了大約1000個生長孔，用增加的MTX濃度檢測50個這種培養物的Epo比生產力。確定最高的生產細胞株，MTX濃度增加2倍，最好的生產細胞株用于進一步培養。
在96孔板中進行篩選和最初的擴增步驟，篩選所有克隆后，在4.8×10-8M MTX中生長，選擇7個克隆，命名為09/96/1F5，09/96/3D5，09/96/3H5，09/96/5D4，09/96/5H1，09/96/6C5和09/96/7E6，比較它們的生長特性、Epo生產力、Western印跡分析中的蛋白質帶型，Epo功能性檢測和染色體穩定性。
細胞倍增的時間看來對所有克隆是相同的，它們可以一周兩次以1∶2到1∶5比率傳代。從9.6×10-8M到1.9×10-7M增加MTX濃度也改進生產力，但是進一步倍增MTX濃度不影響ELISA值。因此在3.8×10-7MMTX下進行亞克隆。在1.9×10-7M MTX時分析免疫熒光，各單個培養物沒有顯著性不同。
通過光學顯微術和Coulter Counter核DNA分析比較細胞形態學。克隆09/96/7E9，09/96/6C5，09/96/5H1，09/96/5D4和09/96/3D5特征是與宿主細胞系CHO-DHFR-有相同的核大小分布。與此相比，細胞系09/96/1F5和09/96/3H5有較大的核。從以前的試驗得知，這是增加染色體數量的結果。因此，為了進一步穩定化，決定利用克隆09/96/3D5。
與重組藥物產品比較，所有7個培養上清液在Epo對TF-1細胞的功能性檢測中產生了相同的斜率。
在每個MTX濃度通過SDS PAGE和western印跡檢測重組蛋白質，并且在所有重組培養上清液中發現僅僅微小的改變。這些克隆產生Epo。
總結和討論在此描述了表達Epo的重組CHO細胞系的選擇，從真核生物表達載體構建到哺乳動物細胞轉染和多克隆Epo表達細胞池的分離。主要用ELISA、免疫熒光、Western印跡和體外功能性檢測設定分析的基礎。所有這些方法均建立在能夠篩選僅僅ng/ml量的低生產細胞池培養上清液和更穩定的重組細胞的濃度范圍內。
產生重組CHO池，其中用高達3.8×10-7M的MTX逐步地擴增基因拷貝數。這些細胞一周兩次以1∶3到1∶4的比率傳代，并且每次在ELISA中檢測升高的Epo水平。
實施例4-重組細胞系的進一步篩選重組細胞池09/96/3D5用于進一步穩定化。MTX濃度逐步增加到0.38μM MTX。在該擴增水平，用每孔10和20個細胞亞克隆重組3D5細胞。通過ELISA進行具有單克隆的孔的培養上清液篩選。表2顯示在0.38μMMTX存在的情況下，重組細胞池3D5的亞克隆條件和效率。檢測300個單克隆的上清液。用0.77μM MTX，在24孔板中選擇傳代后4天有升高Epo效價的克隆。
在液氮中保藏這些克隆中的7個克隆，通過增加MTX濃度到1.54μM，通過基因拷貝數的進一步擴增進行克隆選擇。
表3匯編了第二輪穩定化的鋪板條件和效率，這里，最后一次用1.54μM MTX亞克隆克隆09/96/3D5/1H9和09/96/3D5/18E5。每孔細胞數降低到4個細胞。篩選260個單克隆，將其中每個亞培養的20個以上克隆轉移到T燒瓶，并且篩選比生產力。通過標準如比表達速率、生長條件和核大小分布，確定最終生產克隆。棄掉顯示4倍性的克隆，因為經驗中這種細胞在生物反應器中傾向于顯示復雜的生長模式。篩選后，選定下面的6個亞克隆(4個1H9和2個18E5亞克隆)，在液氮中將其冷凍。
09/96/3D5/1H9/4C2 09/96/3D5/1H9/6C2 09/96/3D5/1H9/6D409/96/3D5/1H9/15B4 09/96/3D5/18E5/7A6 09/96/3D5/18E5/15C3實施例5-適應無血清的培養基在最后的亞克隆步驟后，選定實施例4的最后6個重組細胞系用于適應無血清的培養條件。用約5×104細胞/cm2將亞克隆后第7-12代中的細胞接種到T25燒瓶中，培養3-4天至鋪滿。在該時間點，用無血清的適應培養基完全取代培養基，以后每天更新80％的培養基。將所有懸浮細胞返回到培養物中。適應時間后，當幾乎所有的細胞都在懸浮液中生長時，一周傳代克隆2次，并且作為懸浮培養物培養。
在深低溫保藏前，在無血清的適應培養基中培養克隆11-13代。用無血清冷凍培養基在液氮中冷凍每個細胞系，共6個安瓿，每個安瓿5×106個細胞。融化后，在無血清的生產培養基中培養克隆。在融化后于第二或第三代中用上清液進行分析性表征以篩選生產克隆。
分析檢測包括比生長速率[μ]-(μ＝ln(×2/×1)/天數)比生產力[qp]-(Qp＝產生的產物×106/(細胞數×天數))Western印跡等電聚焦
DNA含量和穩定性克隆穩定性所有6個細胞系均可以在無血清生長培養基中生長，一周2次傳代。在沒有血清時也進行深低溫保藏，融化后，將培養基轉換為無血清的生產培養基。此制劑富含葡萄糖和氨基酸。
5代后測定不同的蛋白質和細胞參數，選定一個生產克隆(09/96/3D5/1H9/6C2；縮寫6C2)和一個備用克隆(09/96/3D5/1H9/4C2；縮寫4C2)。
實施例6-重組細胞系的比較經幾周，通過測定培養物中的細胞數和傳代期間的傳代比率(splittingratio)，計算來自實施例4和5的6個細胞系的生長特性。通過ELISA檢測Epo生產力。從該數據計算上述比生產力和比生長速率。
表4概括了在1∶3傳代比率下標準培養條件下3天培養后得到的數據。
示出了傳代后和再3天后細胞數(通過Coulter Counter測定)。
還原條件下的SDS-PAGE通過SDS-PAGE分離6個細胞系的上清液，比較分子量的差異。6個上清液顯示了相同SDS帶型，具有在這種高度糖基化蛋白質中通常可觀察到的成片條帶(未示出數據)。
類似的商購產品遷移為較為清楚的條帶，這可能是在下游處理期間不同條帶分離的結果。
IEF-Western印跡IEF-Western印跡分析應該反映糖蛋白潛在的微不均一性。根據加載在凝膠上的蛋白質的量，可以觀察到14條帶。在Western印跡上，大約于凝膠中部有一條可以觀察到的特征性雙帶；將該雙帶下面的下一條帶定為條帶1，在該凝膠的酸性部分可以觀察到9至10條帶。類似商購產品產生了相應于此異質產物中的條帶6到9的4條主要條帶。
重組細胞的DNA含量
DNA含量與細胞系的染色體數成比例。重組細胞系的穩定性部分受染色體數的影響，并且通過與宿主細胞系(CHO dhfr-)比較可以證實DNA含量的身份。
總結和討論這里描述了重組Epo表達CHO細胞系的分離。2輪亞克隆后，比較6個細胞系的不同特性作為指定一個最終生產克隆的基礎。分析基礎主要是ELISA，western印跡和IEF檢測及通過FACS分析的DNA測定。
與商購純化蛋白質比較，重組培養物上清液的Western印跡模式顯示了幾條另外的較低分子量條帶。一種解釋是這些另外條帶為在產生用于比較的商購產品的下游處理期間被除去的同種型。另一種可能是由于SDS的不完全攝取檢測到的人為條帶。所有細胞培養上清液的等電聚焦產生了相同同種型分布，而與它們的Qp無關。
最好的生產克隆和最容易處理的克隆是克隆6C2，選定該克隆作為生產克隆。選定4C2作為備份克隆。在滾瓶中增殖兩個克隆。
實施例7-T燒瓶中CHO細胞的培養在無血清條件下，在T燒瓶中，在中國倉鼠卵巢細胞系(CHO)中產生重組人紅細胞生成素。用2.67×105細胞/mL接種這些培養物。3天溫育期后，達到9.35×105細胞/mL的最終細胞密度(＝＞μ＝0.42天-1)。
實施例1到6描述了多種表達Epo的CHO克隆的制備。在實施例4和5中獲得6個克隆，由于克隆CHO 6C2較高的細胞比生產力和高的比生長速率，所以選定該克隆。
實施例8-生物反應器中CHO細胞的培養在150L生物反應器中，在補料分批(T43C6C2)模式中培養CHO細胞系6C2。利用組成為補加了氨基酸的50∶50 DMEM/Hams F12并含有0.25％植物肽、0.1％lutrol、1.54μM氨甲蝶呤(MTX)、4g/L葡萄糖、2.5g/LNaHCO3、乙醇胺、檸檬酸鐵、抗壞血酸和亞硒酸鈉的細胞培養基。培養基不含有任何昂貴的功能性蛋白質(重組或來源于天然來源的)。存在來源于動物來源的成分。在56L培養基中以約5×105細胞/ml接種細胞。pO2設為50％空氣飽和度，溫度37℃及pH7.0，并且在發酵過程中保持恒定。
葡萄糖濃度保持在1g/L以上。4天后，將新鮮培養基加入反應器到150L。9天后，通過添加1875ml含有氨基酸、碳水化合物和植物來源的胨的營養濃縮物延長分批培養。10天后，添加另外的1875mL營養濃縮物。2天后(第12天)收獲含有紅細胞生成素的上清液。
實施例9-沒有氨甲蝶呤時生物反應器中紅細胞生成素的產生在5L生物反應器中，在補料分批(Kamp 4 B5-1和2)模式中培養CHO細胞系6C2。培養基如實施例9所述。第一生物反應器(Kamp 4 B5-1)培養基中提供1.54μm MTX，第二生物反應器(Kamp 4 B5-2)沒有MTX。
葡萄糖濃度保持在1g/L以上。在1250ml培養基中以約5×105細胞/ml接種細胞。pO2設為50％空氣飽和度，溫度37℃和pH7.0，并且在發酵過程中保持恒定。2天后，用新鮮培養基將生物反應器加到5L。第6，7，8，9和10天后，通過添加50到122mL含有氨基酸、碳水化合物和植物來源的胨的營養濃縮物延長分批培養。11天時，收獲含有紅細胞生成素的上清液。
發現由于較好的糖基化模式，沒有氨甲蝶呤的培養更佳。
實施例10-利用豐富培養基在生物反應器中紅細胞生成素的產生在5L生物反應器中，在補料分批(Kamp 11 B5-1和2)模式中培養CHO細胞系6C2。如實施例10(Kamp 4 B5-2)中所述操作生物反應器1。在生物反應器2中，利用組成為豐富的補加了氨基酸的50∶50DMEM/Hams F12并含有0.325％植物肽、0.1％lutrol、6.4g/L葡萄糖、2.5g/LNaHCO3、乙醇胺、檸檬酸鐵、抗壞血酸、亞硒酸鈉和0.6g/L磷酸鹽的細胞培養基。在1250ml培養基中以約5×105細胞/ml接種細胞。pO2設為50％空氣飽和度，溫度37℃。在開始時，將pH設為7.1。在發酵過程中將其逐步降低到6.9。
在培養過程中，保持生物反應器2中的葡萄糖濃度在3到4g/L之間。2.5天后，用新鮮培養基將生物反應器加到5L。6，7，8，9和10天后，通過添加含有氨基酸、碳水化合物和植物來源的胨的豐富營養濃縮物延長此分批培養。11天時，收獲含有紅細胞生成素的上清液。
發現用營養豐富培養基(氨基酸、葡萄糖、植物胨和磷酸鹽)和從7.1到6.9的pH遷移實施的培養具有雙倍以上的最終Epo濃度，而Epo的糖基化模式相當。
實施例11-在缺少來源于動物的成分的生物反應器中紅細胞生成素的產生在5L生物反應器中，在補料分批(Kamp 17 B5-1和3)模式中培養CHO細胞系6C2。如果沒有相反的說明，如實施例10(Kamp 4 B5-2)所述設定所有參數。在生物反應器2中，利用不含有任何來源于動物的成分的細胞培養基。例如，用合成氨基酸取代通常來源于動物(如鮭魚或人發)的氨基酸酪氨酸或半胱氨酸。
2.5天后，用新鮮培養基將生物反應器加到5L。第5，6，7，8和9天后，通過添加含有氨基酸、碳水化合物和植物來源的胨的營養濃縮物延長此分批培養。在9到10天時，收獲含有紅細胞生成素的上清液。
發現不含有任何動物來源的成分的培養基產生了可比的最終Epo濃度。但是培養物生長較慢，并且需要額外添加營養濃縮物。
實施例12-在具有豐富培養基(維生素、微量元素)的生物反應器中紅細胞生成素的產生在10L生物反應器中，在補料分批(Kamp 12 C)模式中培養CHO細胞系6C2。除了下面的例外，如實施例11(Kamp 11 B5-2)所述操作該生物反應器所用細胞培養基之組成為補加氨基酸的豐富的50∶50 DMEM/HamsF12，其中含有0.325％植物肽、0.1％lutrol、6.4g/L葡萄糖、2.5g/L NaHCO3、乙醇胺、檸檬酸鐵、維生素、微量元素、亞硒酸鈉和0.6g/L磷酸鹽。加倍濃縮物中的含量，并且使其富含維生素。
在4500ml培養基中以約5×105細胞/mL接種細胞。pO2設為50％空氣飽和度，溫度37℃。在開始時，將pH設為7.1。在發酵過程中將其逐步降低到6.9。
在培養過程中，保持生物反應器中的葡萄糖濃度在3到4g/L之間。3天后，用新鮮培養基將生物反應器加到10L。第6，7，8，9，10，11和12天后，通過添加豐富營養濃縮物延長分批培養。13天時，收獲含有紅細胞生成素的上清液。
實施例13-Epo的分離細胞分離在無血清條件下，通過不連續的補料分批培養，在中國倉鼠卵巢細胞系(CHO)中產生重組人紅細胞生成素。發酵后(2個不同生物反應器中4x約1+2分批模式擴展階段)，冷卻具有約200-300mg rhEpo/L的收獲肉湯到2-8℃，不經任何間歇的貯藏期，首先通過盤疊式分離器離心，接著通過深度過濾(PP Polygard 0.1μm，Seitz Bio10或Cuno A90M08，通量約300L/m2過濾器面積)和0.2μ過濾(Sartobran P，Sartorius或Duropore 0.22μ，Millipore)澄清該肉湯。為了避免高的細胞裂解和由此造成的HCP(宿主細胞蛋白質)的高產物污染，重要的是首先在最適時間點(在主要培養中大約12天，氧耗停滯)收獲，其次利用專門設計用于易碎真核生物細胞分離的細胞分離設備，例如具有水密封進料口(hydrohermetic feed inlet)的CSC6(6000m2ECA，15500xg，約200L/h Westfalia)或者具有gentledisc進口和porcupine出口的BTPX 250(11000m2ECA，13000xg，300L/h，Alfa Laval)。不同分離技術，包括切向流過濾和離心，的比較揭示了剪切應力引起的細胞裂解的差異(通過細胞內標記酶LDH的釋放來測定)。離心產生了最柔和的分離(＜3U LDH/mg rhEpo)，優選這種離心。
在可替代的實施方式中，如上所述，僅僅通過盤疊式分離器的離心(沒有深度過濾步驟)用于細胞分離步驟。在另一個可替代實施方式中，利用如上所述的深度過濾步驟(沒有離心步驟)。
通過陰離子交換(AEX)層析進行捕獲澄清后，加樣到AEX捕獲樹脂上前，用約3體積的水稀釋粗上清液達到小于或等于5mS/cm的最終電導率，并用Tris堿調節到pH7.5。
所用的AEX-柱有約10-20cm的床高，并且填裝有良好流動特征的QCeramic HyperD F(Biosepra)。用20mM Tris pH7.5和50mM NaCl平衡。然后以4-8cm/分鐘的流速在柱上加載稀釋的細胞上清液(10-15mg rhEpo/每mL樹脂)，用10-15柱體積(cv)的平衡緩沖液洗柱子。通過改變到較高的電導率緩沖液，即，具有150mM NaCl的20mM Tris pH7.5，通過洗脫步驟洗脫產物。合并峰級分，產生了約50-60％的產率。
在可替代實施方式中，通過超濾濃縮合并的級分以減少中間體積并標準化下面的沉淀條件。優選地，利用5到10kDa截斷膜，調節約20mg/ml的靶產物濃度。
硫酸銨沉淀通常，用2.4M(NH4)2SO4，通過污染的宿主細胞蛋白質的沉淀進一步純化前步的捕獲合并物。在該AS-濃度，在沉淀物中幾乎沒有發現產物，留下純的無HCP的上清液，在進行下面的RPC純化前，必須將此上清液稀釋，達到RPC上樣中＜240mM(NH4)2SO4。
通過向1體積的捕獲合并物添加1.5體積的硫酸銨母液(4M(NH4)2SO4，20mM Tris pH7.5)進行沉淀，在10-15℃溫育30分鐘，通過深度過濾(Seitz Bio10或Cuno A90M08)和0.2μ過濾(Sartobran P，Sartorius或Duropore 0.22μ，Millipore)分離沉淀物。在高洗脫體積＝稀釋的rhEpo洗脫合并物(＜5mg rhEpo/ml)的情況下，通過可選的UF-濃縮步驟(10kDa截斷值)可以改進HCP沉淀。
硫酸銨沉淀比疏水相互作用層析更有效。
為了降低來自前面的沉淀步驟的硫酸銨含量，如上所述必須稀釋含有產物的上清液。可替代的方案是超濾/滲濾(diafiltration)步驟。優選地，利用5到10kDa截膜，并調節小于240mM的靶硫酸銨濃度及約30mg/ml的產物濃度。滲濾步驟所用的緩沖液是20mM Tris/HCl pH7.0。
反相層析下一個純化步驟是反相層析，其在幾個方面是有用的a)不同同種型可以根據它們的的糖骨架很好地分離(高度糖基化/唾液酸化形式洗脫在較少糖基化/唾液酸化形式之前)，b)用該高效層析可以除去殘留的宿主細胞蛋白質和c)通過有機溶劑，此層析是除去病毒和失活病毒的有力步驟。Source 30RPC(Amersham Biosciences)是可以a)在中等壓力(＜10bar)下運行和b)用高濃度NaOH消毒處理的聚合樹脂。優選的床高是10至15cm之間，每ml填裝的樹脂的推薦載荷范圍是8-12mg rhEpo。
在RPC步驟前，需要將含有產物的上清液調整到小于0.24M硫酸銨的最終濃度。這種調整可以通過如下方式進行a)在RPC上樣過程中進行隨后的在線式稀釋步驟(1體積rhEpo上清液+4體積20mM Tris/HClpH7.0+5體積20mM Tris/HCl pH7.0中50vv％ACN)，或b)為了節省昂貴的有機溶劑，優選地，在上樣步驟前再次相對于20mM Tris/HCl pH7.0進行滲濾/濃縮(具有10kDa截斷值的UF)。用20mM Tris/HCl pH7.0中25vv％乙腈(ACN)在上樣前平衡該柱子并在上樣后洗柱。用從25％到50％的線性梯度ACN洗脫產物，以小級分(特別是約0.2CV，在可替代方案中約0.3-0.2CV)在預先裝有4體積稀釋緩沖液(50mM Tris/HClpH7.0)的管中收集該產物以立即降低溶劑濃度，該溶劑濃度可以誘導聚集作用并且損害下面的AEX層析。合并洗脫峰的大約最初一半的級分以產生進一步處理的RPC池。該池包含具有有利的較高糖基化程度的同種型。通過該分級分離方法，除去細胞培養物中以高達20％水平存在的、在位置Ser126丟失O-聚糖的脫-O-糖基化rhEpo產物。
在可替代方案中，為通過暴露于有機溶劑誘導病毒失活，用0.5體積的20mM Tris/HCl pH7.0，而不是4體積的上述相同緩沖液預先加入級分，溫育20到40分鐘或更長。在該溫育步驟后，再加入相對于原始未稀釋級分體積的3.5體積的20mM Tris/HCl pH7.0，由此終止病毒失活。
合并經或未經病毒失活的級分用于進一步純化。通常合并起始于上升位置處最高OD的50-100％，約結束于下降位置處70-80％以上的級分。較早的洗脫級分可能含有宿主細胞蛋白質，而稍后的洗脫級分含有較少的唾液酸化、較少活性的同種型。此外，可以進行CZE分析以支持某些同種型的合并。
陰離子交換層析然后在高效AEX柱上加樣稀釋的RPC-合并物，這又可以有助于篩選特定同種型和除去宿主細胞蛋白質。這時根據等電點，即根據與糖基化程度成比例的唾液酸數目分離同種型。利用高效樹脂Q-Sepharose HP(Amersham Biosciences)，其顯示了優良的分離效率。床高在15和20cm之間。限定所有條件，如加樣、梯度和床高以保持相當低的產物濃度，否則該濃度會導致洗脫過程中因溶劑誘導的產物聚集而造成的后峰。
在用20mM Tris/HCl pH7.0平衡的Q-Sepharose HP上以2-4mgEpo/mL樹脂加樣PRC合并物。在用平衡緩沖液的洗滌步驟后，以平衡緩沖液中含有0到300mM NaCl的10CV線性鹽梯度洗脫產物。以0.1CV或0.25CV級分收集洗脫峰，通過CZE分析分析性合并物以找到含有期望紅細胞生成素同種型的正確級份合并物。通常，AEX合并物由第二半洗脫峰組成，在此處高度糖基化和唾液酸化同種型被洗脫。
通過利用毛細管區帶電泳(CZE)作為生產過程中的控制，即使來源由于不同的發酵條件或宿主系統而含有僅僅少數高度唾液酸化的同種型，也可以產生精確地限定的紅細胞生成素同種型混合物。
CZE是能分離具不同電荷的同種型的高分辨率方法。它給出了每個級份中每個單個同種型的定量結果。該信息使得可以合并特定級分，從而在批和批之間導致一致的同種型分布圖。通常，通過僅僅合并后來的洗脫級份，避免早期洗脫的較少唾液酸化的同種型。
大小排阻層析在最后的層析步驟中，通過大小排阻精處理AEX合并物，其除去潛在二聚體和更高的聚集體，并完成對最后制品的緩沖液更換。用在該步驟中的Superdex 75Prep Grade(Amersham Biosciences)即使在達到15％柱體積的較高加樣體積時也有良好的分辨率。優選的床高是60至80cm。
因為不可能在進行先前步驟的AEX層析時于AEX合并物中獲得高產物濃度，所以在凝膠過濾前不得不濃縮合并物。用5-10kDa UF膜，通過超濾步驟進行該濃縮，該超濾步驟得到具有約10mg紅細胞生成素/mL的約10倍濃縮的UF-保留物。
將約3-7CV％的UF-保留物直接加樣到用pH7.0，20mM磷酸鈉，75mM NaCl預平衡的Superdex 75pg柱上。在約1-1.5CV后，開始從柱上洗脫產物，收集洗脫峰以得到SEC-合并物。
納米過濾為了除去潛在的病毒，另外實施的死端病毒過濾步驟。用設計以除去小至15nm的顆粒的特定膜，如Planova 15N(Asahi)進行該過濾。可選擇的死端納米過濾裝置是PALL Ultipor VF Grade DV20或MilliporeViresolve NFP柱體或囊。特別是對于小的無包膜病毒，如細小病毒，幾乎沒有其它的病毒除去和失活的工具。
使無菌濾過的SEC合并物通過具有適合膜的最終過濾器，濾液為最終的成批藥物物質。可替代地，納米過濾可以插在UF濃縮和大小排阻層析之間。
表1重組CHO細胞用Epo/neo和Epo/dhfr轉染T25轉染

96孔轉染

不同克隆的擴增

表2在0.38μM MTX存在下細胞池3D5的亞克隆條件和鋪板效率

表3在1.54μM MTX存在下亞克隆3D5/1H9和3D5/18E5的亞克隆條件和鋪板效率3D5/1H9

3D5/18E5

表4重組CHO克隆的比生產力和生長特性

這里并入上面說明書中提到的所有出版物為參考文獻。所述本發明方法和系統的各種修改和改變對本領域技術人員將是顯而易見的，且不背離本發明的范圍和精神。盡管本發明結合特定的優選實施方式已作出描述，但應該理解所要求保護的本發明不應該不適當地限制于這些特定的實施方式。實際上，對分子生物學或相關領域技術人員顯而易見的用于實施本發明的所述模式的各種修改均旨在下面權利要求的范圍內。
權利要求
1.一種從包含宿主細胞的細胞培養基回收和純化重組人紅細胞生成素(rhEpo)的方法，該方法包括步驟(a)通過進行選自(i)離心后深度過濾，(ii)深度過濾，和(iii)離心的方法，從細胞培養基除去宿主細胞、細胞成分和碎片以獲得澄清的培養基上清液；(b)調節上清液的電導率到5mS/cm或以下，并調節pH至約7.0到8.0之間；(c)將步驟(b)得到的上清液加到包含陰離子交換層析介質的柱上，洗柱子，從柱上洗脫rhEpo，收集含有rhEpo的峰級分；(d)利用可在中等壓力(＜10bar)下運行并且可以抵抗高濃度NaOH的樹脂，將來自步驟(c)的合并的峰級分進行反相層析步驟，利用有機溶劑的線性梯度洗脫rhEpo；(e)將步驟(d)中洗脫的一個或多個含有rhEpo的級分加到包含陰離子交換層析介質的柱上，洗柱子，利用線性鹽梯度洗脫rhEpo；(f)根據rhEpo的唾液酸化程度，選擇步驟(e)中洗脫的一個或多個含有rhEpo的級分；和(g)利用凝膠過濾介質，將一個或多個步驟(f)中洗脫的含有rhEpo的級分進行一個或多個大小排阻層析步驟以除去潛在的二聚體和更高的聚集體；收集含有rhEpo的洗脫物。
2.如權利要求1所述的方法，其中用盤疊式分離器進行步驟(a)中的離心。
3.如權利要求1所述的方法，其在步驟(d)和步驟(e)之間還包括另一步驟根據重組人紅細胞生成素(rhEpo)的唾液酸化程度，選擇一個或多個在步驟(d)中洗脫的含有rhEpo的級分。
4.如權利要求1所述的方法，其中在步驟(d)之前，將來自步驟(c)的峰級分進行硫酸銨沉淀步驟以沉淀污染的宿主細胞蛋白質，然后將上清液的硫酸銨濃度調節到與步驟(d)相容的濃度。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述的濃度小于0.24M硫酸銨。
6.如權利要求1所述的方法，其中步驟(b)中pH是約pH7.5。
7.如權利要求1所述的方法，其中利用有大于125mM的鹽濃度的緩沖液進行步驟(c)中的洗脫步驟。
8.如權利要求1所述的方法，其中步驟(d)中的有機溶劑選自乙腈、乙醇和己二醇。
9.如權利要求1所述的方法，其中在步驟(d)中利用約10％到約100％的有機溶劑線性梯度洗脫紅細胞生成素(Epo)多肽。
10.如權利要求8所述的方法，其中步驟(d)中的有機溶劑是乙腈，并且利用從約25％到約50％的梯度洗脫紅細胞生成素(Epo)多肽。
11.如權利要求1所述的方法，其中在步驟(e)之前，用適當的含水緩沖液稀釋步驟(d)中洗脫的級分。
12.如權利要求11所述的方法，其中在步驟(e)之前，放置稀釋的級分一段足以失活病毒污染物的適當時間。
13.如權利要求1所述的方法，其中在步驟(g)中，在大小排阻層析步驟前對級分進行超濾步驟。
14.如權利要求1或4所述的方法，其中在步驟(d)中，在反相層析前對級分進行超濾步驟。
15.如權利要求4所述的方法，其中在硫酸銨沉淀步驟之前，對來自步驟(c)的合并的峰級分進行超濾步驟。
16.如權利要求1所述的方法，其在步驟(g)前或后還包括死端納米過濾步驟以除去病毒。
17.如權利要求1所述的方法，其中步驟(a)中在方法(i)，(ii)和(iii)之任一個之后是0.2μm過濾步驟。
18.如權利要求1或3所述的方法，其中利用毛細管區帶電泳在步驟(f)中或在步驟(d)和步驟(e)之間進行一個或多個選擇。
19.一種從包含宿主細胞的細胞培養基回收和純化重組人紅細胞生成素(rhEpo)的方法，該方法包括步驟(a)通過進行選自(i)離心后深度過濾，(ii)深度過濾，和(iii)離心的方法，從細胞培養基除去宿主細胞、細胞成分和碎片以獲得澄清的培養基上清液，其中利用盤疊式分離器進行所述離心；(b)調節上清液的電導率到5mS/cm或以下，并調節pH至約7.0到8.0之間；(c)將步驟(b)得到的上清液加到包含Q-HyperD F(BioSepra)陰離子交換層析介質的柱上，洗柱子，從柱上洗脫rhEpo，收集含有rhEpo的峰級分；(d)利用可以在中等壓力(＜10bar)下運行并且可以抵抗高濃度NaOH的聚苯乙烯樹脂，如Source 30RPC(Amersham Biosciences)，將步驟(c)得到的合并的峰級分進行反相層析步驟，利用乙腈線性梯度洗脫rhEpo；和(e)根據rhEpo的唾液酸化程度，選擇一個或多個在步驟(d)中洗脫的含有rhEpo的級分，將所述級分加到包含Q-Seph HP(AmershamBiosciences)陰離子交換層析介質的柱上，洗柱子，利用線性鹽梯度洗脫rhEpo；和(f)根據rhEpo的唾液酸化程度，選擇一個或多個步驟(e)中洗脫的含有rhEpo的級分，利用Superdex 75 prep grade(AmershamBiosciences)對所述級分進行大小排阻層析以除去潛在的二聚體和更高的聚集體；收集含有rhEpo的洗脫物。
20.如權利要求19所述的方法，其中通過毛細管區帶電泳在步驟(e)和/或步驟(f)中選擇一個或多個級分。
21.如權利要求20所述的方法，其中在步驟(d)之前，將步驟(c)得到的合并的峰級分進行硫酸銨沉淀步驟以沉淀污染的宿主細胞蛋白質，然后將上清液的硫酸銨濃度調節到與步驟(d)相容的濃度。
22.如權利要求21所述的方法，其中所述的濃度小于0.24M硫酸銨。
23.如權利要求19所述的方法，其在步驟(f)前或后還包括死端納米過濾步驟以除去病毒。
24.如權利要求19所述的方法，其中培養基是無血清培養基，且利用不連續補料分批發酵方法培養宿主細胞。
25.一種具有確定同種型組成的糖基化蛋白質或多肽的生產方法，所述方法包括利用CZE分析包含糖基化蛋白質或多肽的一種或多種同種型的樣品。
26.如權利要求25所述的方法，其中所述糖基化蛋白質或多肽的同種型是重組人紅細胞生成素的同種型。
全文摘要
本發明提供了一種從包含宿主細胞的細胞培養基回收和純化重組人紅細胞生成素(rhEpo)的方法，該方法包括步驟(a)通過利用盤疊式分離器離心，接著深度過濾步驟，從細胞培養基除去宿主細胞、細胞成分和碎片以獲得澄清的培養基上清液；(b)調節上清液的電導率到5mS/cm或以下，而調節pH至約7.0到8.0之間；(c)將步驟(b)得到的上清液加到包含陰離子交換層析介質的柱上，洗柱子，從柱上洗脫rhEpo，收集含有rhEpo的峰級分；(d)利用可以在中等壓力(＜10bar)下運行并且可以抵抗高濃度NaOH的聚苯乙烯樹脂，如Source 30 RPC，將步驟(c)得到的合并的峰級分進行反相層析步驟，利用有機溶劑的線性梯度洗脫rhEpo；(e)將步驟(d)中洗脫的一個或多個含有rhEpo的級分加到包含Q－Seph HP陰離子交換層析介質的柱上，洗柱子，利用線性鹽梯度洗脫rhEpo；(f)根據rhEpo的唾液酸化程度，選擇一個或多個步驟(e)中洗脫的含有rhEpo的級分；和(g)利用Superdex 75 prep grade，將一個或多個步驟(f)中洗脫的含有rhEpo的級分進行一個或多個大小排阻層析步驟以除去潛在的二聚體和更高的聚集體；收集含有rhEpo的洗脫物。
文檔編號C12P21/02GK1596268SQ02823601
公開日2005年3月16日 申請日期2002年11月26日 優先權日2001年11月28日
發明者P·埃利格爾, N·帕爾馬 申請人:桑多斯有限公司