專利名稱：：氨基葡萄糖苷抗性基因的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物技術的蛋白質表達領域。特別涉及氨基葡萄糖苷抗性基因，尤指新霉素抗性基因，在實現動物細胞的高密度生長中的應用，以及蛋白質生產方法及高密度細胞培養物。生物技術上以動物細胞培養方式生產治療用蛋白質是一項非常費力且昂貴的工作。包括下游加工之生產效率主要系受到最初細胞培養步驟之空間-時間產率支配。自當希望同時使培養物肉湯中之產物蛋白達到高產率及高濃度。結果，在進入工業規模細胞培養之生產穩定期前使最大細胞密度達到較少量增加，將可希望使總產量增加，此僅因為于此方式中加入大量細胞總數。強硬地視細胞種類及培養方法而定，習知適用于高密度生長之補料-分批培養系統例如氣升式反應器并無法使生長中不含血清的細胞培養物達到或甚至高于107細胞/毫升的密度。有可能于補充血清之補料-分批培養系統或于最近之灌輸反應器系統中達到較高密度。但是，該二種選擇皆留下嚴重的缺點。經補充以胎牛血清的培養基包含所有天然生長促進物質，其強烈依賴血清來源品質且(最重要的)具有無心地將動物病毒導入生產供醫療應用之治療性蛋白質的培養物中的永久性危機。因此基于調節性理由，須避免血清補充。然而，灌輸反應器系統較習知補料分批培養系統更為復雜，并需要在操作期間加以控制且在操作上更昂貴。此系由于必須永久灌輸新鮮培養基，其需要最新式微過濾系統以供自該反應器平行釋出培養基。若過濾單元受細胞碎片或蛋白質阻塞，則易使操作過程發生提早停滯的危險。比較上，補料分批培養在制程經濟學及耐用性方面具有顯著優勢。而且，產生可制造所興趣蛋白質之穩定重組細胞株，需要導入至少一種通常被固有表達的抗性標記基因。此類標記基因之表達可能對細胞造成最好不會沖擊其生長行為的額外負擔，其或甚至在富含血清補充的細胞培養基中亦可能有害地影響生長速率及最大存活細胞密度(Gaigle等，1999，氨基葡萄糖苷抗生素磷酸轉移酶亦為絲氨酸蛋白質激酶Aminoglycosideantibioticphosphotransferasesarealsoserineproteinkinases，ChemistryandBiology6，11-18；Maio等，1991，人類巨噬細胞及表達氨基葡萄糖苷抗生素磷酸轉移酶活性之畸胎癌細胞系中由蛋白質激酶C所介導的基因活化GeneactivationmediatedbyproteinkinaseCinhumanmacrophageandteratocarcinomacellsexpressingaminoglycosidephosphotransferaseactivity，J.Cell.Physiology149，548-559；Southern等，1982，哺乳細胞于SV40早期區域啟動子調控下經細菌基因轉化成具抗生素抗性TransformationofmammaliancellstoantibioticresistancewithabacterialgeneundercontroloftheSV40earlyregionpromoter，J.Mol.Appl.Genet.1，327-341)。本發明的目的在于避免先前技術所產生之缺點，并提供一種使細胞于不含血清的培養系統中生長達高細胞密度的方法。此目的系通過于動物細胞中表達氨基葡萄糖苷抗性基因，其后將該等細胞培養于適當培養基及如權利要求1、2、8等獨立所述的適宜培養系統中而實現。意外地，視習用于該項技術的培養方法及培養基而定，經根據本發明處理的細胞可于不含血清的細胞培養基中生長達到較其未經處理的親本細胞系高出甚多之密度。此外，亦觀察到穩定期生長有些許延長。以此方法，可于不含血清的培養基中達到最大存活細胞密度，其在本發明的前所無法理解的。本發明的可能實施方案顯示于圖示中。其中圖1Neo-轉化的NSO細胞在101補料分批氣升式反應器系統中生長期間之存活細胞密度，與親本及bcl-2轉化細胞系的比較。圖2Neo-轉化的NSO細胞在101補料分批氣升式反應器系統中生長期間所表達呈累加細胞時間之分泌抗體的產量，與bcl-2轉化細胞系的比較。圖3質粒圖譜pEF-bcl-2圖4質粒圖譜pEF-Neo圖5以NSO細胞系適應非致死劑量G418之比較性生長實驗。圖6Neo-轉化的NSO細胞系之搖瓶分批培養及產量，與親本及bcl-2轉化細胞系的比較。根據本發明，氨基葡萄糖苷抗性基因產物系用于增進動物細胞的高密度生長。該項根據本發明的應用包含于細胞中表達該抗性基因產物，以其氨基葡萄糖苷會被該相對應抗性基因產物分解之氨基葡萄糖苷抗生素(優選以抗生素新霉素)檢選出表達此類抗性基因產物的細胞，及最后于生物反應器例如氣升式或攪拌型生物反應器中，于適宜不含血清的細胞培養基中將此類細胞活化以達高密度生長。根據本發明的抗性基因產物為任意氨基葡萄糖苷抗性標記，例如已知對慶大霉素、新霉素、潮霉素(且尤其是新霉素)的抗性基因，其可用做真核細胞之基因標記。氨基葡萄糖苷抗性基因一般用于真核細胞分子生物學中且經描述在許多標準教科書及實驗手冊中(例如，Shaw等，1993，氨基葡萄糖苷抗性基因之分子遺傳學及氨基葡萄糖苷-修飾酵素之家族關系Moleculargeneticsofaminoglycosideresistancegenesandfamilialrelationshipsoftheaminoglycoside-modifyingenzymes，Microbiol.Rev.57138-163；WO82/03087；Southern等，1982，哺乳細胞于SV40早期區域啟動子調控下經細菌基因轉化成具抗生素抗性TransformationofmammaliancellstoantibioticresistancewithabacterialgeneundercontroloftheSV40earlyregionpromoter，J.Mol.Appl.Genet.1，327-341)。如上所推論得，氨基葡萄糖苷抗性基因產物以其根據本發明的氨基葡萄糖苷分解活性的觀點而言，系一種功能性之基因產物。因此依上述概念，亦可將已知氨基葡萄糖苷抗性基因產物之經遺傳工程改造所得的有義功能性變體用于本發明。此類變體可例如通過分別對胺基酸及其編碼DNA序列進行取代、缺失、插入或截斷而產生。此等方法為該項技術所熟知且通常包含定點突變或經由其隨機突變產生多樣性，然后再以功能分析之方式篩選得所希望的變體。用于產生突變之例行方法可為例如暴露至烷化劑或UV照射、進行易錯PCR或相關之基因改組PCR技術，且通常在微生物中完成(Miller，J.，分子遺傳學實驗ExperimentsinMolecularGenetics，冷泉港實驗室1972；Ling等，1997，DNA致變方法ApproachestoDNAMutagenesis，分析生物化學254，157-178；Cadwell等，1992，通過PCR致變作用之基因隨機化于PCR方法RandomizationofgenesbyPCRmutagenesisinPCRMethods，冷泉港實驗室出版1992；Moore等，1997，蛋白質功能活體外演化之策略Strategiesfortheinvitroevolutionofproteinfunction，J.Mol.Biol.272，336-347)。方便上，系從適用于真核細胞表達且經已知技術轉染入細胞中的DNA表達構體表達該抗性基因產物；可固有表達該抗性基因產物或可誘發其表達或壓制，亦即可以其中任一種方式調控表達。至少于以氨基葡萄糖苷抗生素進行篩選期間，及于高密度細胞培養系統中達到最大細胞密度之對數增長期間，應根據本發明表達該抗性基因。優選在例如胸苷激酶(TK)或猴病毒(SV40)晚期啟動子調控下固有表達，最優選在在真核細胞中恒定具活性之強病毒增強子-啟動子，例如Rous肉瘤病毒(RSV)-長末端重復序列(LTR)-啟動子或巨細胞病毒(CMV)-啟動子調控下表達。亦可利用由強病毒啟動子之增強子部份與另一啟動子，例如提供必要如轉錄起始區、TATA區框及CAAT區框之α-肌動蛋白啟動子之核心啟動子部份所構成的嵌合型啟動子。根據本發明的氨基葡萄糖苷為一般已知的氨基葡萄糖苷類抗生素(Mingeot-Leclercq，M.等，氨基葡萄糖苷活性與抗性Aminoglycosidesacitvityandresistance，1999，Antimicrob.AgentsChemother.43(4)727-737)，它包含至少一個通過葡萄糖苷鍵與該分子之另半部結合的胺基-吡喃糖或胺基-呋喃糖。它們的抗生素作用系基于抑制蛋白質合成。例子有卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、妥布拉霉素、G418(遺傳霉素)、新霉素B(法拉霉素)、紫蘇霉素、阿米卡星、異帕米星等。在本發明文中，其他由于抑制細菌蛋白質合成而具有抗生素活性之化合物例如奇放線菌素、茴香霉素與尤其普羅霉素，及具有與非還原性胺基-糖部份相關之化學結構的化合物，亦被認為系根據本發明的“氨基葡萄糖苷抗生素”，誠如該項技術所常為之。須注意，氨基葡萄糖苷類化合物對真核細胞培養物亦具有毒性，部份是因為粒線體的蛋白質轉譯元件系由原核生物演化而來(粒線體演化之內共生學說)，而亦可能具有其他毒性作用且先前已有描述。根據本發明，為篩選可表達該抗性基因產物的細胞，遂在轉染該抗性基因后至少實施以氨基葡萄糖苷抗生素進行之抗性篩選，其一般須達48小時至數星期。結果，該氨基葡萄糖苷抗性基因被穩定轉染至所述細胞系中。穩定的轉染株一般在其基因組插入至少一個該氨基葡萄糖苷抗性基因的經表達或可表達拷貝，而產生具功能之基因產物。最近在遺傳工程方面可想出的策略，例如于細胞中產生人造、穩定之微型染色體亦包括于目前所提“穩定轉染株”的概念中。當然，已知的轉染方法例如脂質轉染法、DEAE-葡聚糖、Ca-磷酸鹽或電穿透都是根據本發明的可用轉染方法，應首先將剛經轉染的細胞培養于未補充氨基葡萄糖苷的培養基中，然后再于進行篩選時添加此類補料。此未篩選之間隔期系為有效表達該抗性標記基因產物所需，且視細胞種類而定期范圍大約從12小時至1-2天。優選地，抗性篩選在轉染后進行至少2周，更優選在轉染后進行至少5周，最優選在轉染后進行至少8周。亦可能于生物反應器中進行發酵期間，在由已添加至該培養基的氨基葡萄糖苷抗生素所產生之壓力下延長生長期以進一步培養細胞。亦可在轉染株之最初篩選后，在進一步培養期間通過重復添加單一劑量氨基葡萄糖苷，然后將該培養基再以未補充氨基葡萄糖苷的培養基沖凈，而間隔地施予短暫篩選壓力。優選地，在生物反應器培養期間，該根據本發明的可表達或經表達抗性基因系穩定地整合入基因組中，且該培養在無篩選壓力存在下進行。亦即，例如于根據本發明另一優選實施方案之補料-分批生物反應器中進行的細胞培養，在無補充至所述細胞培養基(發酵開始或發酵期間)的氨基葡萄糖苷存在下完成。優選地，氨基葡萄糖苷的使用濃度為至少0.1毫克/毫升，優選濃度為至少1毫克/毫升，最優選濃度為至少4毫克/毫升。通常，在經用以表達相對應抗性基因產物之表達構體轉染后，將此量根據本發明的氨基葡萄糖苷如該項技術所熟知且如標準實驗操作手冊所述加至細胞培養基中。在另一尤其優選實施方案中，在轉染后連續細胞培養期間，使用氨基葡萄糖苷濃度為1至4毫克/毫升達至少2周，更優選達至少5周，最優選達至少8周。優選地，根據本發明的抗性基因產物為如WO82/03087中所述的新霉素-磷酸轉移酶(該抗性基因通常命名為Neor)。此類磷酸轉移酶之各種天然同工型為已知，且亦包含在本發明范圍中。可使用以G418(遺傳霉素，定義于化學摘要注冊編號49863-47-0)或新霉素進行之篩選，以挑選出表達該新霉素基因產物的細胞。于一項更優選的實施方案中，系使用G418篩選具抗性的細胞。根據本發明的動物細胞或細胞系可為任何用于生產重組蛋白質之習知細胞系，例如Sf9昆蟲細胞、CHO細胞、Hela細胞、COS-7細胞、VERO-96細胞、HepG2細胞、BHK細胞、成纖維細胞、融合瘤、EBV無限增殖化淋巴母細胞、或“骨髓瘤”細胞例如NSO細胞系。骨髓瘤細胞例如NSO細胞實際上為B-淋巴樣細胞，而其于該項技術中慣常被歸于“骨髓瘤”(Barnes等，Cytotechnology32109-123，2000)。優選地，根據本發明的動物細胞或細胞系為不依賴貼壁的細胞。此類細胞毋需仰賴基質接觸而得以適當生長，且可自由懸浮于培養基中。在更優選的實施方案中，該生產細胞系為淋巴樣細胞系例如融合瘤、EBV無限增殖化淋巴母細胞或骨髓瘤細胞，最優選所述細胞系為骨髓瘤細胞且尤其是骨髓瘤NSO細胞，例如細胞系ECACCNo.85110503及其衍生物，可免費索取自歐洲細胞培養物保藏所(ECACC)，應用微生物學與研究中心，薩里布利，威斯海爾SP40JG，英國。已發現NSO可提升相當高的產量，尤其在用于制造重組抗體方面。最標準的NSO細胞系為膽固醇依賴性，使膽固醇成為培養基的必須組成份。在另一優選實施方案中，根據本發明攜帶氨基葡萄糖苷抗性基因的細胞為能夠進一步表達重組谷胺酰胺合成酶(GS)的細胞系，更優選為NSO骨髓瘤重組型GS細胞系。NSO細胞若與谷胺酰胺合成酶(GS)表達系統使用時則特別有利(Bebbington等，1992，自使用谷胺酰胺合成酶基因做為可擴增可選擇標記之骨髓瘤細胞高度表達重組型抗體High-levelexpressionofarecombinantantibodyfrommyelomacellsusingaglutaminesynthetasegeneasanamplifiableselctablemarker，Bio/Technology10169-175；Cockett等，1990，于使用谷胺酰胺合成酶基因擴增作用之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中高度表達金屬蛋白酶之組織抑制劑HighlevelexpressionoftissueinhibitorofmetalloproteinasesinChineseHamsterOvary(CHO)cellsusingGlutaminesynthetasegeneamplification，Bio/Technology8662-667)。優選地，所述產物蛋白基因序列及GS基因序列系攜帶于供產生該經轉染NSO細胞系之單一GS質粒載體上，且該等基因系從不同或相同使用(例如)內部核糖體進入位置之啟動子表達。GS系統為現今僅兩種供制造治療性蛋白質之特別重要系統其中之一。相較于二氫葉酸還原酶(DHFR)系統，GS系統(且尤指用于與NSO組合之GS系統)于研發期間提供極大時間優勢，因為常可自原始轉染株群體中產生具高產量的細胞系，而免除需要重復多次漸增篩選劑濃度以達基因擴增之篩選循環(Brown等，1992，供使用谷胺酰胺合成酶(GS)系統制造重組抗體之制程研發Processdevelopmentfortheproductionofrecombinantantibodiesusingtheglutaminesynthetase(GS)system，Cytotechnology9231-236)。NSO骨髓瘤細胞在表型上缺乏谷胺酰胺合成酶。因此衍生自小鼠腫瘤細胞系的NSO細胞系(Galfre，G.與Milstein，C.MethodsinEnzymol.73，3-75，1981)常在工業規模上被選為利用GS系統的細胞系。此類細胞系的例子是6A1-Neo細胞系，其于2002年8月30依據布達佩斯條約以保藏標號為02083031保藏于歐洲細胞培養物保藏所(ECACC)，應用微生物學與研究中心，波特丹，薩里布利/威斯海爾SP40JG，英國。該已保藏的細胞系缺乏重組型bcl-2，且經進一步描述在實驗段落中。此細胞系與任何經工程改造以生產除cB72以外之抗體的親本子代亦為本發明的優選實施方案。此類工程可包含細胞融合及緘默化或剔除特定基因，以及通過致變方法產生重組體及產生變異株之較傳統技術(如前文詳述)或使所給細胞培養基保留或改善親本細胞系生長特性之傳統培養基適應技術。在另一優選實施方案中，根據本發明用以高密度細胞培養的細胞系缺乏經重組表達的bcl-2蛋白質、bcl-x1蛋白質或其他功能性(據了解為防止細胞凋亡)的抑制細胞凋亡-bcl-2家族的天然或經遺傳工程改造的變體(Petros等，2001，抗細胞凋亡蛋白質bcl-2之溶液結構Solutionstructureoftheantiapoptoticproteinbcl-2，Proc.Natl.Acad.ScienceU.S.A.，98，3012-3017)，或bcl-2之種系類似物例如依斯坦巴爾病毒之BHFR-1，或如Petros等(前述)所回顧描述之bcl-2功能類似物。此類優選實施方案可權宜地與另一前述優選實施方案組合，亦即如所了解在發酵期間無篩選壓力實則有氨基葡萄糖苷抗生素存在。意外地，已發現氨基葡萄糖苷抗性標記與bcl-2之共表達對根據本發明氨基葡萄糖苷抗性增進性細胞密度之功效而言是一項難題。無意限定于理論，本發明的生長促進作用似乎并非由于抗-細胞凋亡或以bcl-2為主之影響所致，因為在比較性實驗中確實觀察到，例如bcl-2與Neo之共表達應較欲實現高密度生長之難題更占優勢。適用于哺乳動物細胞系之適宜培養基與培養方法為該項技術所熟知，例如描述在美國專利5633162號。用于實驗室培養瓶或低密度細胞培養且適于特定細胞種類所需之標準細胞培養基實例如羅斯威爾派克紀念協會(RPMI)1640培養基(摩爾，G.，TheJournaloftheAmericanMedicalAssociation，199，p.519f.1967)、L-15培養基(Leibovitz，A.等，Amer.J.ofHygiene，78，1p.173ff，1963)、Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM)、Eagle極限必須培養基(MEM)、漢姆氏F12培養基(Ham，R.等，Proc.Natl.Acad.Sc.53，p288ff.1965)、或缺乏白蛋白、轉鐵蛋白及卵磷脂的Iscoves改進的Eagle培養基(Iscoves等，J.Exp.med.，1，p.923ff.，1978)。已知此等培養基可補充以胎牛血清(FBS，亦稱為FCS)，該后者提供許多激素與生長因子來源。在轉染及以氨基葡萄糖苷進行篩選期間，可使用任何適于使所培養的動物細胞持續生長的培養基。為使動物細胞于根據本發明的補料分批生物反應器中達高密度生長，則必須使用高密度生長培養基。根據本發明，若一種培養基可使動物細胞于習知補料分批生物反應器系統中生長高達或超過存活細胞密度為106細胞/毫升，則該培養基即被定義為高密度生長培養基。在本發明文中，此類培養基再與前述氨基葡萄糖苷篩選組合時甚至可提升較高細胞密度。通常，此類根據本發明的培養基將包含1-10克/升葡萄糖或其他能量來源，于補料-分批培養期間將葡萄糖濃度控制于此濃度。優選地，該培養基將包含至少2克/升葡萄糖，基本上于補料-分批發酵期間被控制于此濃度。該培養基為等張性，亦即范圍介于270-320mOsm/公斤，優選為280-300mOsm/公斤。特定細胞種類(例如淋巴樣細胞)對某種培養基的個別優選性為該項技術所熟知，且復雜地與各營養物之濃度范圍、比例及個別劑量有關。相較于上述標準培養基，一些適用于例如融合瘤的高密度生長培養基的例子描述在GB2251249A中；此類高密度生長培養基一般可補充以諸如所有氨基酸、能量來源如葡萄糖(濃度范圍如上述)、無機鹽類、維生素、微量元素(定義為通常以其最終濃度落于微摩爾體積濃度范圍內存在之無機化合物)、緩沖劑、四種核苷類或其相對應之核苷酸、抗氧化劑如谷胱甘肽(還原型)、維生素C及其他組成如重要的膜脂質例如膽固醇或磷脂酰膽堿或脂質前驅物例如膽堿或肌醇等營養物。高密度培養基將富含大多數或所有此等化合物，且它們(除需以其調節實質等張性培養基的重量摩爾滲透濃度的無機鹽類以外)的含量將較前述標準培養基更高(增養化)，例如GB2251249與RPMI1640間之比較。優選地，根據本發明的高密度培養基系以所有氨基酸(除色氨酸外)量高于75毫克/升而均衡地增養化。優選地，結合對一般胺基酸之需求，谷胺酰胺及/或天冬酰胺共同量高于1克/升，更優選為2克/升高密度培養基。無異議地，后述之優選實施方案較不適用于經谷胺酰胺合成酶(GS)載體轉染之重組細胞系個案中。于此類細胞系中，過量例如自外加及內在來源產生之谷胺酰胺將導致氨產生(其應避免)。GS轉染細胞系的培養條件敘述于下列實施例中。權宜地，根據本發明的高密度細胞培養基缺乏胎牛血清(FCS或FBS)，稱之為“不含血清”。根據本發明不僅希望以不含血清的培養基使存活細胞密度高達或高于107細胞/毫升，亦意外地發現補充胎牛血清在至少某些在本發明文中所測試的細胞系難以實現高密度生長，此與習于該項技術人士所接受之一般概念相左。生長于無血清培養基中的細胞需要胰島素與轉鐵蛋白以達最適生長。轉鐵蛋白可至少部份以非肽類鐵載體如WO94/02592中所述之環庚三烯酚酮取代。大多數細胞系需要一或多種合成型生長因子(包含重組型多肽類)，其包括例如上皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子I及II(IGFI、IGFII)等。可能需要其他類因子其可包括前列腺素、轉運和結合蛋白(例如血漿銅藍蛋白、高及低密度脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA))、激素(包括類固醇激素)及脂肪酸。最好以逐步方式進行多肽因子試驗，以測試出該等于其存在下可刺激生長的新穎多肽因子。在動物細胞培養領域中已知有數種可行方法，其中一例即列述于下文中。最初步驟系獲得可使細胞從血清-補充培養基傳代后存活且/或緩慢生長達3-6天之條件。于大多數細胞種類中，此條件至少部份為接種密度之函數。一旦發現最適激素/生長因子/多肽補充物后，即減少存活所需之接種密度。在更優選的實施方案中，所述細胞培養基不含生長因子，亦即其中不含胎牛血清或未添加可分別觸發訊號傳導及細胞周期進行之實質上純的蛋白質生長因子。此類培養基尚可包含其他蛋白質例如胰島素或轉鐵蛋白(可用于自培養基征集鐵)、或供遞送諸如膽固醇等脂質所需之BSA。更優選地，根據本發明是將此類培養基與淋巴樣細胞系結合使用，最優選系與骨髓瘤細胞系(尤其是NSO細胞系)組合。根據本發明的生物反應器為分批生物反應器，例如慣常用于高密度動物細胞培養之氣升式生物反應器或攪拌式生物反應器。方便上，為達高密度細胞培養此類生物反應器將以補料-分批形式操作。此定義亦包括連續型補料操作。優選地，根據本發明的補料-分批生物反應器具有容量氧轉質系數KLa(如Bailey，J.等，生化工程原理BiochemicalEngineeringFundamentals，McGraw-Hill，N.Y.1986中所定義)為至少6h-1，更優選為至少10h-1。最優選地，一種具有該根據本發明優選氧轉質特性之補料-分批生物反應器為氣升式生物反應器。氣升式生物反應器為習于該項技術人士所熟知，且為已知反應器設計之必要參數(其回顧參見，例如Chisti，M.等，1987，氣升式反應器Airliftreactors，Chem.Eng.Commun.60，195-242；Koch，A.等，1987，氣升-循環式反應器之轉質測量及模型制作Measurementandmodelingofmasstransportinairlift-loopreactorsinrelationtothereactordesign，Chem.Ing.Tech.，59，964-965)。雖已自明但仍需在此強調，根據本發明的補料-分批培養并不包含灌輸培養系統。在本發明文中，高密度細胞培養系定義為具有存活細胞密度為至少或高于106細胞/毫升，優選為至少或高于107細胞/毫升，更優選高于1.23×107細胞/毫升，最優選高于1.3×107細胞/毫升的動物細胞群體，且該群體已于細胞培養基中于恒定或漸增培養體積中連續地自單一細胞或接種較低存活細胞密度下生長而得。在另一優選實施方案中，該補料-分批培養為一種其中除通過分別補料以控制葡萄糖濃度外，亦至少將谷胺酰胺(視需要地與一或數種其他氨基酸，優選為甘氨酸)補料至細胞培養物中(如GB2251249所述)以維持它們在培養基中所存之濃度的培養系統。更優選地，是將谷胺酰胺視需要地一或數種其他氨基酸之補料與將一或多種能量來源如葡萄糖添補入所述細胞培養物結合，如歐洲專利EP-229809-A中所述。通常于開始培養后25-60小時進行補料；例如，通常在細胞已達為約106細胞/毫升之密度時開始進行補料。谷胺酰胺及/或天冬酰胺補料(以天冬酰胺替代谷胺酰胺，參見Kurano，N.等，1990，J.Biotechnology15，113-128)通常系介于0.5至3克(優選為1至2克)每1培養體積之范圍內；其他可存在補料中之氨基酸優選為10至300毫克總補料每升培養物，尤其甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸及亮氨酸通常較其他胺基以為至少150至200毫克之較高量進行補料。補料可以噴丸-添加或以連續泵送補料之形式添加，優選為將補料以幾近連續地泵送至該生物反應器中。當然在生物反應器中進行補料分批培養期間，須通過添加堿或緩沖劑將pH值控制于所指定最適細胞系生長之近似生理pH值下。當使用葡萄糖作為能量來源時，總葡萄糖補料通常為1至10(優選為3至6)克每升培養物。除包含氨基酸外，該補料優選尚包含范圍為5至20克每升培養物之低量膽固醇。優選地，根據本發明的動物細胞或細胞系為一種(例如)于誘導時制造第二產物蛋白，或能夠表達第二產物蛋白之生產細胞系。根據本發明，該第二產物蛋白系為能以高產量制造并獲得的蛋白質。其可為任何有興趣的蛋白質，例如治療性蛋白質如介白質或酵素，例如酵素抑制劑或抗體或其片段(如fab片段)。其可為重組蛋白質(攜帶于質粒或另一類包括經遺傳工程改造之病毒的載體上)或其可經由任何技術穩定地整合入所述細胞之基因組中。其亦可為天然表達構體例如由血漿或融合瘤細胞所分泌之抗體。所述產物蛋白可包括令多肽自宿主生產者細胞分泌出之訊號序列。其可經固有表達或可經誘導表達。優選地，所述產物蛋白為重組型蛋白質，最優選為一種自組成啟動子表達之重組蛋白質。根據本發明“重組型”意指于細胞系中從原先已通過任意遺傳工程技術導入所述細胞系之該相對應基因的至少一個外源拷貝所表達得的蛋白質，而不考慮該蛋白質是否以其至少一個天然存在之拷貝生成于該生產細胞系中。此等重組基因之額外拷貝可例如整合入基因組內或可攜帶于游離型元件上。可使用穩定或暫時性表達。根據本發明可使用任意表達載體技術，包括經遺傳工程改造之病毒。更優選地，該重組型蛋白質為經穩定地整合至染色體的蛋白質。在本發明另一優選實施方案中，所述產物蛋白為分泌蛋白。更優選地，所述產物蛋白為抗體或經工程改造之抗體或其片段，最優選其為免疫球蛋白G(IgG)抗體。蛋白質表達之個別方法及進一步基于使用氨基葡萄糖苷抗性基因與前述對應的高密度細胞培養亦為本發明的標的。前文中對于可能及優選實施方案之敘述同樣應用于此目的的。實施例1.細胞系及質粒的產生NSO6A1(100)3細胞系(6A1簡稱；LonzaBiologics有限責任公司，史羅夫/UK)由經穩定整合之重組谷胺酰胺合成酶(GS)表達構體分泌人-鼠嵌合型IgG抗體(cB72.3)。攜帶新霉素抗性之重組細胞系系通過將該6A1細胞系以雙順反子表達bcl-2及Neor或僅自單一質粒構體表達Neor的質粒載體轉染而得。為產生pEF-Neor，是將得自pMC1neopa(Stratagene)的MC1Neo多聚A彈夾插入具有填充片段的pEFBOS(Mizushima等，1990，pEFBOS，一種有力的哺乳動物表達載體Apowerfulmammalianexpressionvector，NucleicAcidsResearch18，5322)而制得pEFMC1neo多聚A(Visvader等，Mol.CellBiol.1995Feb；15(2)643-41)。圖4顯示該質粒的圖譜。為產生pEFbcl-2-Neor，是將人類bcl-2cDNA(長抗-細胞凋亡轉錄物，Cleary等，Cell4719-28(1986))的EcoRI/TaqI片段亞克隆入經EcoRI/ClaI開環之pIC194(Gene32482，1984)中，再切出呈SalI(鈍端)/EcoRV片段進一步克隆入pEF-MC1neopA多克隆位點(MCS)的鈍端XbaI位置中。因此bcl-2由延伸因子(EF)l-a啟動子表達(質粒圖譜，圖3)。該Neor-表達彈夾(MC1neopA)為pEF-載體之整合部份，雖然在最終所使用之Neo載體構體中EF1-a啟動子下的MCS在XhoI位置開環，鈍端化且為達適當調控而插入一段得自非-編碼序列之300bp隨機填充片段(質粒圖譜，圖4)。根據制造商之操作程序進行由脂質轉染試劑(Gibco，派斯利，蘇格蘭)介導的轉染作用。質粒轉染株系以1毫克/毫升G418存于補充以5％胎牛血清及其他如泰等(Tey，B.等，于骨髓瘤NSO培養物中由Bcl-2所介導的細胞凋亡抑制作用Bcl-2mediatedsuppressionofapoptosisinmyelomaNSOcultures，J.Biotechnology，79(2000)，147-159)所述之補料的GMEM培養基(Gibco)中進行篩選。然后將穩定的轉染株適應于不含血清的高密度生長培養基EX-CELL302。2.高密度補料分批細胞培養對于高密度細胞培養，是將NSO6A1親本細胞系、6A1Neo-細胞系及6A1bcl-2/Neo對照組細胞系適應于補充以1毫升/50毫升GSEM(GS表達培養基補料，產品編號G9785，Sigma，Poole，UK)的無血清培養基EX-CELL302(JRHBiosciences股份有限公司，KS/U.S.A.)。在進行傳代同時，將25μMMSX及0.7克/升G418補充至該培養基中，但于接種及生物反應器培養基則省略。針對各細胞在生物反應器細胞培養期間之存活細胞密度系顯示于圖1中。各細胞系之補料分批培養設定如下骨髓瘤細胞系生長于含無血清EX-CELL302培養基的10升氣升式發酵槽中。起始細胞群體密度為大約105細胞/毫升取自新鮮之中-指數生長其培養物。待連續生長至密度達約106細胞/毫升后，進行補料之噴丸添加并開始泵送補料(表1)。補料連續進行歷時100小時。pH值控制于約pH7。大約每25小時通過計數經錐蟲藍排除法決定的細胞存活度測定培養物密度。為計算總體及存活細胞濃度，遂將經適度稀釋之樣本以錐蟲藍(Sigma，Poole，UK)稀釋，隨后使用改進之Fuchs-Rosental血球計數器以顯微鏡進行檢視。使用CASY計數器(基于細胞大小)測量總體及存活細胞濃度以進行復核。表1而bcl-2/Neo重組細胞系僅生長至最大存活細胞密度為約107細胞/毫升，相對于泰等所述于血清-補充之補料分批培養中所獲得最大細胞密度為＜106細胞/毫升，該Neo重組細胞系可生長至最大密度為1.4×107細胞/毫升(圖1)。所計算得的細胞存活度系依上述之錐蟲藍排除法進行測定。重組抗體之空間時間產率支持該重組型Neo細胞系(圖2)。此顯示于以生物反應器中之產物力價對培養細胞時間(CCT；單位109細胞小時/升)所繪制之圖中。CCT系經由細胞生長曲線之積分計算得，基本上如Renard等(1988，生物技術簡報1091-96)所述。如圖2所示，bcl-2/Neo重組細胞系之平均單一細胞產量為0.260微微克蛋白質/細胞·小時，而Neo細胞系計量為0.210微微克蛋白質/細胞。單一細胞產量(qp)的些微差距顯然在總產量層面上高過于存活細胞密度上的差異。3.基因拷貝數之測定通過定量PCR分析方法對所保藏的6A1-Neo細胞系測定該新霉素抗性基因之基因拷貝數，其使用6A1親本做為比較性標準物。測定得基因拷貝數為3.0拷貝(±0.4)。已給予經穩定轉染基因之多聯體整合，亦即該重組新霉素抗性標記之單一整合作用發生于該6A1細胞系中而未進一步擴增。此與約為25μMMSX之低MSX濃度有關；為可使GS標記基因發生擴增必須施予高出10-20倍高濃度之篩選劑。該分析系由特定合約實驗室(LarkTechnologies股份有限公司，修斯頓，得克薩斯州)完成。除了測試來自轉座子Tn5的新霉素抗性基因外，亦建立以同樣方法測定小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶[GAPDH]基因之陰性對照組。使用經克隆的質粒標準物校正該等分析平板。拷貝數計算成每細胞中標靶物(NEO)的數量(MUSGAPDH)，假設標準雙套哺乳動物細胞的DNA質量為約6.6微微克，且GAPDH系以兩拷貝存在每細胞。如該項技術之例行公事，通過測量260及280nm下之吸光密度以分光光度計定量從細胞萃取出之基因組DNA。為分析新霉素抗性基因拷貝數，遂使用八組由隆薩生物公司所提供之pMC1neopA質粒的稀釋物制作QPCR標準曲線。該系列稀釋代表范圍從5×106拷貝至49拷貝的質粒DNA。將各標準物稀釋于GS-NSO對照組基因組DNA(相當于1000個細胞)中以模擬經粹取細胞系DNA之基質效應。陰性對照組反應不包含模板或其僅含有對照組質粒(5000至50000拷貝)或相當1000GS-NSO細胞(親本細胞系，約6.6毫微克)的DNA同等物。通過測定閥值周期(Ct)以95％置信區間決定拷貝數。該Ct為通過探針裂解所產生之報告物螢光乘以設定于基準線以上之固定閥值的分數。各Ct數值之增加代表標的物呈2×增加，假設PCR效率達100％。制備各測試物件DNA之六組獨立稀釋并重復進行分析。各QPCR反應含有約6.6毫微克之測試樣本DNA。該等QPCR系根據TaqManTMUniversalPCRMasterMix操作程序(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)進行組裝。將反應進行熱循環并通過ABIPrism7700序列測定系統1.6.3版(AppliedBiosystems)收集數據。4.對比例6A1親本細胞在無Neo-抗性基因但有次致死量G418存在下的培養為排除任何因暴露至G418而非由于經表達的新霉素抗性基因所造成對生長的影響，遂使親本細胞系6A1適應于含有G418的細胞培養基中。可在未使細胞停止生長之條件下，將G418的含量逐漸增加至濃度為360毫克/毫升G418(Sigma，Poole，UK；注意G418之批次品質會視其來源而有所改變)。生長培養基為補充以6mM谷胺酰胺而不含胎牛血清之最適化NSO細胞專用培養基。相較于bcl-2轉染株或未經轉染之親本細胞系6A1，對于6A1-Neo細胞系而言，此無血清培養基可重復性地達到根據本發明的高細胞密度(＞2×107細胞/毫升)。因此，該培養基適用于選擇在無新霉素標記基因存在下G418適應之可能影響。相較于生長于PM1+6mM谷胺酰胺之未經適應之親本細胞系，生長于G418(-)培養基的已適應細胞對細胞凋亡及壞死性細胞死亡稍較具抗性(數據未示)，但其與親本細胞系相較時具有較低生長速率及較低最大細胞密度(圖5ANSO6A1細胞系分批培養物中的存活細胞密度/未經適應之6A1實心圓形，經適應于360毫克/毫升G418之6A1于有G418存在下(空心圓形)及無G418存在下(實心三角形))。通過將存活細胞數從總體細胞數扣除，而測定得死亡或壞死細胞之數量并以其對總體細胞數之百分比顯示圖5B中。該項實驗結論為，于無新霉素抗性標記存在下暴露至G418可僅視為對細胞凋亡抗性之潛在作用而不能視為增進高密度生長行為的功效。有趣地，經適應細胞系之生物反應器培養物于有360毫克/升G418存在下，甚至使該經適應細胞在無血清PM1培養基中的生長速率及最大細胞密度減至最小。5.6A1、6A1-Neo及6A1-bcl-2分批培養物中的qp值各細胞系已詳述于實施例1及2中；如實施例2所述進行細胞培養，惟系以于搖晃燒瓶中進行單次分批培養取代前述于氣升式發酵槽中進行的補料-分批培養。通過于Elisa測試中分析等量取樣自培養物之cB72.3分泌量而測定單一細胞產量。對各等量計數存活細胞數并懸浮于新鮮培養基中置入96槽平盤達一段預定時間。于約80小時采樣培養物樣本并收取細胞(約240小時)。結果顯示于圖6B中。基于經由錐蟲藍排除法校正所得存活細胞密度繪制的生長曲線顯示于圖6A中(空心圓形6A1-Neo，實心三角形6A1-bcl-2，實心圓形6A1-(100)3)。該6A1-Neo細胞系恒定地顯示具有較該6A1-bcl-2細胞系高的單一細胞產量qp。該親本6A1細胞系具有曾經較高之qp值，而此系由于被其低甚多的生長位勢負平衡所致。權利要求1.一種蛋白質表達法，其特征在于，所述方法包括將經氨基葡萄糖苷抗性基因轉染且能夠表達第二產物蛋白，優選為重組型產物蛋白，的動物細胞在不含血清的高密度生長培養基中生長至存活細胞密度達至少或高于106個細胞/毫升，優選為至少或高于107個細胞/毫升的步驟，并進一步包括將所述產物蛋白自該培養物肉湯單離的步驟。2.氨基葡萄糖苷抗性基因產物在實現動物細胞高密度生長中的應用。3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述動物細胞為淋巴樣細胞，更優選為骨髓瘤細胞，最優選為NSO細胞。4.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述高密度生長為存活細胞密度高于106個細胞/毫升，優選為高于107個細胞/毫升。5.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述抗性基因產物為新霉素抗性基因產物，所述細胞經攜帶可表達新霉素抗性彈夾的DNA轉染，然后通過將其與濃度為至少1毫克/毫升的新霉素或，優選地，G418培育于細胞培養基中而篩選出具有新霉素抗性表型的細胞。6.如權利要求4所述的應用，其特征在于，進行新霉素抗性篩選后，所述細胞進一步于補料-分批生物反應器系統中培養至高密度。7.抗生素氨基葡萄糖苷在實現動物細胞高密度生長中的應用。8.一種高密度細胞培養物，它包含存在于液體培養基、補料-分批生物反應器、高密度生長無血清細胞培養基中的動物細胞，其中，所述細胞培養物的存活細胞密度高于106個細胞每毫升，優選為高于107個細胞每毫升。9.如權利要求8或9所述的細胞培養物，其特征在于，所述培養物已通過將存活骨髓瘤細胞密度低于107個細胞每毫升的細胞接種物進行生長獲得。10.如權利要求8或9所述的細胞培養物，其特征在于，所述細胞攜帶一種氨基葡萄糖苷抗性標記基因。11.如權利要求10所述的細胞培養物，其特征在于，所述細胞已在經可表達氨基葡萄糖苷抗性標記基因轉染后用補充至該培養基的氨基葡萄糖苷抗生素處理。12.如權利要求8所述的細胞培養物，其特征在于，所述細胞缺乏重組型bcl-2或其功能性變體。全文摘要本發明涉及氨基葡萄糖苷抗性基因用于實現動物細胞的高密度生長的應用。文檔編號C12N15/65GK1705749SQ02823428公開日2005年12月7日申請日期2002年9月26日優先權日2001年9月26日發明者默罕穆德·阿爾-盧比爾,A·皮拉尼,A·拉切爾,J·伯奇申請人:英國龍沙生物醫藥股份有限公司,默罕穆德·阿爾-盧比爾