lgE結合減少,但T細胞抗原性未減弱的重組變應原的制作方法

專利名稱：lgE結合減少,但T細胞抗原性未減弱的重組變應原的制作方法
技術領域：
本發明廣泛地涉及用于免疫治療或免疫預防治療變應性疾病的試劑。更具體地說，本發明提供一種修飾的變應原，該變應原表現出IgE相互作用性的減弱，包括刺激產生IgE的活性的降低，而保留T細胞抗原性，它可用于I型變應性疾病狀況的免疫調節。本發明還考慮了一種對變應性疾病，例如I型變應性疾病狀況進行免疫調節的方法，該方法包括對患者施用表現出IgE相互作用性減弱，而保留T細胞抗原性的修飾的變應原。
背景技術：
本說明書提供的參考文獻目錄的詳情列于該說明書的最后。
本申請中對任何現有技術的參考不是，也不應看作是承認或以任何形式提示該現有技術形成了任何國家中公知常識的一部分。
I型變應性疾病，例如季節性過敏性鼻炎(花粉癥)、結膜炎、過敏性哮喘和過敏性皮炎代表了工業化國家中的主要健康問題(Wuthrich，Int.Arch.Allergy Immunol.903-10，1989)。目前估計，在發達國家中，有15-20％的人群受到某些形式的變態反應的侵害(Mtyamoto，Advances in Allergology and Clinical Immunology.Godard P，Bousquet J，Michel FB(eds)pp，343-347.The ParthfnopnPublishing Group，Cornforth，UK，1992)。因此，這些疾病的診斷和治療就成了科學研究關心的焦點。
I型變應性反應的主要免疫學和生物化學基礎是變應性物質(變應原)與IgE抗體的相互作用，該抗體結合在肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的高親和性Fc受體上。該相互作用導致了變應原特異的IgE抗體的交聯，而其又刺激產生過敏癥狀的炎癥遞質的直接釋放和級聯產生。變應原存在于空氣傳播的顆粒中，例如房屋塵土，禾本科植物、雜草、樹木的花粉，霉菌的孢子和動物的頭皮屑。
目前，變應性疾病(例如鼻炎、結膜炎和過敏感性哮喘)治療干預的一種方式包括注射假定為引起變態反應的變應原。這種方式稱為脫敏治療。目前用于該步驟中的提取物是由天然來源的物質制備的，其中除了變應原以外，例如，還含有患者對其不過敏的蛋白組分。
重組技術的發展提供了生產用于診斷和治療目的的高水平純化變應原的方法。但是，這種高純度的重組變應原制劑即使在非常低的劑量下，也會產生高的過敏指數。因此，將其施用于患者時，要非常小心。所以需要開發一種降低過敏休克風險的重組變應原。
季節花粉癥和過敏性哮喘的主要戶外原因是空氣傳播的禾本科植物花粉(Smart，Int.Arch.Allergy Immunol.7243-248，1983)。花粉日程表說明，在春天和初夏，禾本科植物的花粉最多，這時禾本科植物開花，而且是過敏性哮喘發病的高峰。禾本科植物花粉的最重要來源是常見的農業牧草，該牧草已廣泛地引入全世界不同溫度和熱帶氣侯的地區。在其溫度使人感覺涼爽的地區，例如黑麥草、草地早熟禾、和梯牧草(都屬于Pooideae亞科)等禾本科植物是有重要臨床意義的，而在暖溫和亞熱帶環境，狗牙根(屬于Chloridoideae亞科)即成為變應原最重要的來源。對黑麥草花粉的蛋白進行了最全面的研究，而對草地早熟禾和梯牧草研究得較少。
對來源于一種禾本科植物的變應原敏感的個體往往對很多其他禾本科植物的變應原也敏感。尤其是對Pooideae亞科的禾本科植物花粉敏感(Smith等，“Analysis of rye-grass pollen allergens using twodimensional electrophoresis and immunoblotting.”In Kraft D(ed)，Molecular Biology and Immunology of Allergens，CRC Press，Boca Raton，FL，1994)，其中的免疫交叉反應性已在采用IgE-結合測定的抑制試驗，即放射變應原吸附測定(RAST)中證實。在這些實驗中，來源于一種禾本科植物的花粉提取物能夠抑制IgE與其他禾本科植物提取物的結合。
禾本科植物花粉的變應原組分可根據其物理化學和免疫學特性分為不同的組。按照應答的過敏性患者人數和相關的與變應原結合的IgE的量為標準來判斷(Singh等，1991，同上)，大多數引起對Pooid禾本科植物花粉的變態反應的變應原為第1組和第5組變應原。在多年生黑麥草Lolium perenne的場合，花粉提取物含有17種以上能結合禾本科植物花粉過敏患者血清中的IgE的蛋白(Singh等，1991，同上)。但是，現已表明，第1組和第5組變應原在一起能夠抑制大部分IgE與粗的花粉提取物結合(Bond等，J.Allergy Clin.Immunol.91339，1993)。
一種28-33kDa的蛋白Lol p5是第二位最普遍的黑麥草變應原，它引起85-90％的禾本科植物花粉過敏個體的變態反應。編碼該第5組變應原的cDNA的分子克隆(Singh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA881384-1388，1991；Ong等，Gene134235-240，1993)表明，Lol p5以同源的家族，但不同的同種型的形式存在，即使在變性的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡分離后，它仍保留其IgE的反應性(Singh等，1991，同上)。
因此，需要開發一種用于變應性疾病狀況的免疫治療和免疫預防的修飾形式的重組變應原。
發明概述在本說明書的自始至終，除非上下文的需要，否則，單詞“包括”，是指包含所述要素或整數，或一組要素或整數；而不排除任何其他要素或整數，或一組要素或整數。
核苷酸和氨基酸序列用序列編號(SEQ ID NO)表示。SEQ ID NOs數字上相應于序列符號<400>1(SEQ ID NO1)、<400>2(SEQ ID NO2)等。序列符號概括在表1中。序列表提供在權利要求書之后。
本發明提供了一種修飾的重組變應原，當該變應原處于天然存在的形式時，與敏感對象的變應性疾病狀況有關。方便地，該修飾的重組變應原含有由天然存在的氨基酸序列修飾的氨基酸序列，使得該變應原缺乏或含有數量減少的IgE表位，和/或呈現出IgE結合能力的減弱，和/或呈現出刺激產生IgE的活性的降低，而保留T細胞抗原性。
優選該變應性疾病狀況為I型變應性疾病狀況。
優選該重組的變應原為禾本科植物花粉變應原。
最優選該禾本科植物變應原為黑麥草花粉變應原，例如，但不限于，Lol p5或免疫學上或植物學上相關的變應原，例如Phl p5和Poa p5。
在特別優選的實施方案中，本發明提供了一種修飾的Lol p5變應原，該變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或呈現出IgE結合能力的減弱，和/或呈現出刺激產生IgE的活性的降低，而保留T細胞抗原性，其中所述Lol p5變體選自具有SEQ ID NO8-12所示的氨基酸序列(參見表1)的分子，或相應于免疫學上或植物學上相關變應原的修飾的變應原。
本發明還涉及含有修飾的變應原，例如禾本科植物變應原(例如，黑麥草花粉變應原)的組合物，該變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或呈現出IgE結合能力的減弱，和/或呈現出刺激產生IgE的活性的降低，而保留T細胞抗原性。該組合物還包括一種或多種藥用載體和/或稀釋劑。
本發明還提出一種對治療對象的變應性疾病狀況進行預防或治療的方法，該方法包括對治療對象施用有效量的修飾的變應原，該變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或呈現出IgE結合能力的減弱，和/或呈現出刺激產生IgE的活性的降低，而保留T細胞抗原性。
本說明書自始至終所用的序列符號概括在表1中。
表1序列符號的概括
附圖簡述

圖1表示推測的第5組變應原的氨基酸序列的比較。虛線表示引入以給出最大的序列對比的空位。與Lol p5A相同的殘基用星號表示。
圖2表示Lol p5A的氨基酸序列，表明在變應原中引入以得到D1、D2、D3、D4和D5突變體的突變。Lol p5A中改變的氨基酸用方框表示，而新的序列用黑體表示。
圖3突變的Lol p5變體的示意圖；例如，mut1含有D1突變。
圖4表示在Lol p5A中產生突變所用的引物的序列。
圖5表示Lol p5(未突變的)，以及9個突變的變體(mut1-mut9)的純化蛋白與多克隆(p)、單克隆(m)抗體和7個黑麥草花粉過敏患者血清的反應性的狹線印跡分析。
圖6表示Lol p5(未突變的)，以及9個突變的變體(mut1-mut9)的純化蛋白與多克隆(p)、單克隆(m)抗體和黑麥草花粉過敏患者(患者2)血清的反應性的免疫印跡分析。
圖7A、B和C是采用純化的未突變的Lol p5和4種突變的蛋白(mut3、mut4、mut6、mut9)的ELISA測定的圖示，表明了突變體與單克隆(mAbA7)和與兩個患者(患者4和患者27)的IgE的反應性的減弱。
優選實施方案的詳述根據本發明，提供了用于免疫治療和免疫預防的基本上低變應原性的基因工程變應原變體，該變應原變體不能與IgE相互作用，或減弱了與IgE相互作用的能力。確定氨基酸序列的某種修飾類型，以造成IgE表位的缺乏或數量的減少、降低IgE表位的活性、減弱與IgE相互作用的能力和/或降低刺激產生IgE的活性。
因此，本發明的一個方面提供一種修飾的重組變應原，其中處于天然存在形式的所述變應原與敏感的對象的變應性疾病狀況有關，其中所述修飾的重組變應原含有由天然存在的氨基酸序列經修飾得到的氨基酸序列，從而使該變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或表現出與IgE結合能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低，而保留T細胞抗原性。
術語“敏感的”對象是按其最廣泛的含義使用，以便包括表現出變應性疾病狀況的個體，尤其是對變應原應答或與變應原有關的I型變應性疾病的癥狀的個體。“個體”優選的是人，但也可擴大至非人靈長目動物、家畜動物(例如綿羊、牛、豬、馬、驢、山羊)、實驗室試驗動物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)和寵物(例如狗、貓)。
本發明特別涉及禾本科植物花粉變應原。
因此，本發明的另一個方面涉及修飾的重組禾本科植物花粉變應原，其中處于天然存在形式的所述禾本科植物花粉變應原與I型變應性疾病狀況有關，其中所述修飾的重組禾本科植物花粉變應原含有由天然存在的氨基酸序列經修飾得到的氨基酸序列，從而使該變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，或表現出與IgE結合能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低，而保留T細胞的抗原性。
在一個特別優選的實施方案中，禾本科植物花粉變應原是黑麥草或免疫學上相關的禾本科植物花粉變應原，例如，但不限于Lol p5、Phl p5。涉及的“禾本科植物花粉變應原”包括所有的黑麥草或免學上相關的禾本科植物花粉變應原，或其他禾本科植物變應原。
因此，本發明的這個方面，考慮一種修飾的重組黑麥草花粉變應原，它含有由天然存在的氨基酸序列經修飾得到的氨基酸序列，從而使該變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或表現出與IgE結合能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低，而保留T細胞抗原性。
T細胞抗原性的保留包括有關T細胞表位的保留，換句話說，保留與T細胞相互作用的能力，以誘導T細胞應答。
在下文，進行有關Lol p5的描述。因為，迄今為止，Lol p5代表一種實踐本發明的特別有用的變應原；但仍然在下述理解下進行本發明擴大至任何一種變應原，尤其是與I型變應性疾病有關的變應原，例如，但不限于第5組禾本科植物花粉變應原。本發明的方法尤其可應用于除Lol p5之外的任何一種黑麥草，或免疫學上相關的禾本科植物花粉變應原，如Phl p5和Poa p5。
在得到本發明的工作中，發明人使重組Lol p5在大腸桿菌中以非融合蛋白的形式表達，并發現，將cDNA的N-末端信號肽除去，然后克隆到細菌表達載體中，產生了可溶的重組形式的該變應原。該方法可避免從細菌細胞分離變應原時的苛刻變性條件。通過抑制ELISA試驗，測定重組Lol p5與天然對應物的抗原相似性，發明人表明，該重組形式完全抑制了其分離形式的天然花粉對應物與IgE的結合。單個重組的同種型能夠抑制IgE與天然變應原結合的事實進一步指明，不同的變應原同種型是相似的。發明人將重組的變應原用于免疫印跡抑制的研究，該研究中，使用重組Lol p5再溫育的變應性血清對黑麥草可溶蛋白的雙向免疫印跡進行探測。根據本發明，發現用一種形式預溫育，完全消除了與所有由不同基因編碼的不同形式的結合。這說明即使序列有輕微的不均一性，不同的變應原同種型在抗原學上是非常類似的。
完成本發明的下一步是確定變應原蛋白中可改變的關鍵氨基酸殘基，它可經改變而消除或減弱IgE的相互作用，同時保持T細胞表位通常的結構和功能。
發明人確定了Lol p5的同種型A和B上的哪些氨基酸殘基是保守的。理所當然，這種保守的氨基酸殘基對IgE結合是重要的，因為在很多不同禾本科植物的變應原之間存在交叉反應性。通過選擇性地使這些保守的氨基酸殘基突變，可鑒定出缺乏IgE相互作用性，或IgE相互作用性減弱，而保留T細胞抗原性的突變體。
因此，本發明的另一個方面包括修飾的第5組禾本科植物花粉變應原，其中所述第5組禾本科植物花粉變應原含有一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加，這些氨基酸殘基至少在兩種免疫交叉反應性的第5組禾本科植物花粉變應原中是保守的；與相應的天然形式相比，其中所述修飾的第5組禾本科植物花粉變應原缺乏或含有數量減少的IgE表位，和/或表現出結合IgE能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低。
按照本發明的這個方面，一種合適的參考氨基酸序列為SEQ IDNO1，該序列是Lol p5，同種型A的氨基酸序列。例如圖1所示，氨基酸序列的比較指出了在Lol p5和Phl p5的同種型A和B中，以及在Poa p5的同種型中保守的氨基酸殘基。圖1中，保守的殘基用星號表示。然后很容易導入改變了一個或多個這些保守的殘基的突變體。
本發明的另一個方面提供一種修飾的第5組禾本科植物花粉變應原，該變應原在相應于圖3所描述的Lol p5的突變體1-9中的一個或多個突變體，或免疫學上相關變應原的相應突變體的位置上含有氨基酸截短或取代、缺失和/或添加。
在特別優選的實施方案中，本發明提供一種修飾的Lol p5變應原，該變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或表現出與IgE結合能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低，而保留T細胞的抗原性，其中所述Lol p5變體選自具有SEQ ID NO8-12所示的氨基酸序列的分子，或提供相應于免疫學相關變應原的修飾的變應原。
由SEQ ID NO8-12所表示的Lol p5變體在此分別稱為突變體D1-D5。
本發明還提供一種核酸分子，它含有編碼修飾的重組變應原的核苷酸序列，或含有與編碼修飾的重組變應原的序列互補的核苷酸序列，其中處于天然存在形式的所述變應原與過敏對象的變應性疾病狀況有關，其中所述修飾的重組變應原含有由天然存在的氨基酸序列經修飾得到的氨基酸序列，從而使該變應原缺乏或含有減數量的IgE表位，和/或表現出與IgE結合能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低，而保留T細胞抗原性。
本發明的另一方面提供一種核酸分子，它含有編碼修飾的重組變應原的核苷酸序列，或含有與編碼修飾的重組變應原的序列互補的核苷酸序列，其中處于天然存在形式的所述變應原與過敏對象的I型變應性疾病狀況有關，其中所述修飾的重組變應原含有由天然存在的氨基酸序列經修飾得到的氨基酸序列，從而使該變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或表現出與IgE結合能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低，而保留T細胞的抗原性。
本發明還有另一個方面涉及一種核酸分子，它含有編碼修飾的重組禾本科植物花粉變應原的核苷酸序列，或含有與編碼修飾的重組禾本科植物花粉變應原的序列互補的核苷酸序列，其中處于天然存在形式的所述禾本科植物花粉變應原與過敏對象的I型變應性疾病狀況有關，其中所述修飾的重組禾本科植物花粉變應原含有由天然存在的氨基酸序列經修飾得到的氨基酸序列，從而使該變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或表現出與IgE結合能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低，而保留T細胞的抗原性。
本發明還又有一個方面涉及一種核酸分子，它含有編碼修飾的重組黑麥草花粉變應原的核苷酸序列，或含有與編碼修飾的重組黑麥草花粉變應原的序列互補的核苷酸序列，重組黑麥草屬花粉變應原含有由天然存在的氨基酸序列經修飾得到的氨基酸序列，從而使該變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或表現出與IgE結合能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低，而保留T細胞抗原性。
因此，本發明特別優選的方面是提供編碼修飾的禾本科植物花粉變應原的純化核酸分子，更具體的是修飾的第5組禾本科植物花粉變應原，或其抗原片段，或其衍生物或同源物，或者這樣的核酸分子的功能等同物，其中修飾的禾本科植物花粉變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或表現出與IgE結合能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低，而保留T細胞的抗原性。優選編碼第5組變應原的家族成員，如Lol p5、Poa p5和Phl p5的核酸序列。一種特別有用的核酸分子編碼Lol p5的突變體D1-D5。
本發明的核酸分子可以是基因組或cDNA分子，或相應的mRNA分子，也可以指一種基因。關于“基因”，就本發明而言，是指任何一種鄰接的核苷酸序列，它的轉錄產生mRNA分子，或它的序列是mRNA分子，這種mRNA分子能夠翻譯產生蛋白。編碼第5組禾本科植物花粉變應原家族成員的基因是指編碼該蛋白，或該蛋白的衍生物或同源物的核苷酸序列，與相應天然存在的分子比較，該蛋白可含有單個或多個氨基酸取代、缺失和/或添加。修飾的Lol p5基因亦指與mRNA互補的cDNA，該mRNA與Lol p5蛋白的全長或部分長度相對應，與天然存在的分子比較，至少有一處截短或氨基酸取代、添加和/或缺失。
本發明進一步考慮到融合分子。例如，對于本發明的某些方面，要求產生一種融合蛋白，它含有修飾的禾本科植物花粉變應原或其片段，或其衍生物，還含有另一種肽或蛋白的氨基酸序列，后者的例子是酶，例如β-半乳糖苷酶、磷酸酶、脲酶等。大多數融合蛋白是通過重組基因的表達而生成，該重組基因中，兩個編碼序列按其讀框協調的方式連接在一起。或者，蛋白或肽可以通過化學方法在體外連接。所有這樣的禾本科植物花粉變應原的融合蛋白，或雜合基因衍生物，或它的編碼核酸序列都包括在本發明內。此外，禾本科植物花粉變應原的同源物和衍生物意味著包括其合成的衍生物。這里提出的核苷酸序列可以用來通過化學法合成完整的蛋白，或利用眾所周知的方法(例如固相合成)，通過化學合成產生任意數量的片段(肽)。所有這樣的化學合成肽都包括在本法明內。因此，本發明擴大至通過重組方法或化學合成制備的，分離的修飾的禾本科植物花粉變應原的家族成員、其片段及其衍生物、同源物和免疫學上的相關物。
術語“分離的”和“純化的”在本發明中可以互換使用，在用重組DNA技術生產時，是指基本上不含細胞物質或培養基的肽、蛋白、蛋白片段和核酸序列；或在化學合成時，是指化學前體或其它化學物質。這里所用的術語“天然存在的”是指由禾本科植物花粉或其他植物部分純化的蛋白或其片段，也包括由cDNA序列確定的有關的氨基酸序列，但該氨基酸序列與變應性狀況相關的方式與禾本科植物花粉純化的變應原的方式類似。
本發明范圍內的核酸分子片段包括編碼部分禾本科植物花粉變應原的核酸分子片段，它們在哺乳動物，優選在人類中，表現出T細胞抗原性，但缺乏與IgE的相互作用，或表現出與IgE相互作用的減弱。
理想的重組或合成產生的修飾的禾本科植物花粉變應原的片段和突變體不與IgE結合，和/或具有最小的與IgE相互作用能力，和/或具有最小的刺激產生IgE的能力。優選不會導致組胺釋放的最小IgE相互作用活性。例如，優選修飾的變應原不引起IgE在肥大細胞或嗜堿細胞上的交聯。最小的IgE相互作用活性是指小于由重組或合成產生的“天然存在的”禾本科植物花粉變應原，或完整的純化天然禾本科植物花粉變應原的IgE相互作用量的IgE相互作用活性。IgE相互作用也可以測定為刺激產生IgE的活性。優選的片段還包括抗原片段，該片段施用于禾本科植物花粉敏感的個體，或對與禾本科植物花粉變應原交叉反應的變應原過敏的個體時，能夠改善該個體對禾本科植物花粉變應原的變態反應。
本發明的抗原片段具有T細胞刺激活性，即T細胞抗原性，因而含有至少一個T細胞表位，是特別理想的。可以認為，T細胞表位參與對引起變態反應臨床癥狀的蛋白變應原的免疫應答的發生和維持。這些T細胞表位被認為通過與抗原呈遞細胞表面上的適當HLA分子結合，并刺激相關的T細胞亞群，而觸發T輔助細胞的水平上的早期事件。這些事件導致T細胞的增殖、淋巴因子分泌、局部炎癥反應、其它免疫細胞募集至該部位、并使B細胞級聯激活而導致抗體的產生。這些抗體中的一種同種型，IgE，對過敏癥狀的發生是十分重要的，在早期的事件級聯中，它的產生，根據所分泌的淋巴因子的性質，在T輔助細胞的水平上受到影響。T細胞表位是被T細胞受體識別的基本元件或最小的單位，該表位包含受體識別所必須的氨基酸。模擬T細胞表位和改善對蛋白變應原的變態反應的氨基酸序列都在本發明的范圍內。
使患者暴露于本發明純化的修飾的蛋白變應原之下，或暴露于含有至少一個T細胞表位、并來源于蛋白變應原的本發明抗原片段，可以使患者忍受適當的T細胞亞群，或對其無反應，從而使這些患者變得對該蛋白變應原無反應，并且不參與刺激因暴露而引起的免疫應答。此外，施用本發明的蛋白變應原或含有至少一個T細胞表位的本發明抗原片段，與暴露于天然存在的蛋白變應原或其部分相比，可以改善淋巴因子分泌的圖形(例如引起IL-4的減少或IL-2的增加)。而且，暴露于這樣的抗原片段或蛋白抗原，可對在正常情況下參與對該抗原應答的T細胞亞群產生影響，這樣，這些T細胞就離開通常暴露于該抗原的部位(例如鼻粘膜、皮膚和肺)而靠近該片段或蛋白抗原的治療施用部位。這種T細胞亞群的重新分布可以改善或減弱個體的免疫系統刺激在正常暴露于該變應原的部位的通常的免疫應答能力，導致過敏癥狀的減少。
本發明提供用于轉化以表達本發明的核酸序列的表達載體和宿主細胞。本發明的表達載體包含編碼修飾的禾本科植物花粉變應原、或其抗原片段、或其衍生物或同源物的核酸序列，或該核酸序列的功能等同物。上述的核酸序列可以在原核或真核宿主細胞中表達。合適的宿主細胞包括細菌細胞，例如大腸桿菌、昆蟲細胞、酵母、或哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)。合適的表達載體、啟動子、增強子，和其他表達調控元件可在Sambrook等，分子克隆實驗室指南，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，中查到。合適的在酵母中表達的載體包括YepSecl(Baldari等，EMBOJ.6229-234，1987)；pMF(Kurjan和Herkowti，Cell 30933-943，1982)；和JRY88(Schultz箏，Gene 54113-123，1987)。
宿主細胞可用常規技術，例如磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染或電穿孔進行轉化，以表達本發明的核酸序列。轉化宿主細胞的合適方法可在Sambrook等(1989，同上)和其他實驗室教科書中查到。本發明的核酸序列也可以用標準的技術合成。
因此，本發明的另一個方面是提供一種生產重組的修飾的禾本科植物花粉變應原或其片段，或其衍生物或同源物，或其免疫相關物的方法，該方法包括在足以使重組DNA分子能穩定地保持的條件下和時間中培養含有可復制的重組DNA分子的生物，并指導修飾的禾本科植物花粉變應原或其片段，或衍生物、同源物或免疫相關物的合成，然后任選對其進行分離，所述重組DNA分子包含能夠在所述生物中表達的啟動子；位于所述啟動子下游并從該啟動子轉錄的編碼修飾的禾本科植物花粉變應原或其家族成員、片段或同源物或衍生物、或其免疫相關物的基因；可選擇標記和含有原核或真核復制起點的DNA載體。
禾本科植物花粉變應原及其片段(肽)可以采用本領域中純化肽和蛋白的已知技術，由細胞培養基、宿主細胞或兩者進行純化，這些已知技術包括離子交換層析、凝膠過濾層析、超濾、電泳，以及利用對修飾的禾本科植物花粉變應原特異的抗體的免疫純化。術語“分離的”和“純化的”在此可互換使用，在用重組DNA技術生產時，是指基本上不含細胞物質或培養基的肽、蛋白、蛋白片段和核酸序列，或化學合成時，是指化學前體或其它化學物質。
本發明的另一個方面提供了包含Lol p5D1、D2、D3、D4和D5或其功能等同物或免疫等同物、同源物或衍生物的蛋白制劑。
由此，本發明提供了修飾的禾本科植物花粉變應原或其衍生物，將其施用于禾本科植物花粉敏感的個體時，減弱了該個體對禾本科植物花粉，例如黑麥草花粉或免疫相關的禾本科植物的花粉的變態反應。優選的修飾的禾本科植物花粉變應原包括修飾的Lol p5蛋白或其衍生物或同源物。其它優選的變應原是Phl p5和Poa p5。
除了誘導氨基酸的取代、添加和/或缺失或截短以外，蛋白或肽的修飾的另一個例子是優選用丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或谷氨酸取代半胱氨酸殘基，使通過二硫鍵進行的二聚化作用減到最小。本發明的蛋白和肽的修飾的另一個例子是氨基酸側鏈的化學修飾，或該肽的環化。
為了提高穩定性和/或反應性，本發明的蛋白或肽也可以進行修飾，以便在天然等位變異所產生的蛋白變應原的氨基酸序列中摻入一個或多個多態性。另外，D-氨基酸、非天然的氨基酸或非氨基酸類似物可以用于取代或添加，以產生在本發明范圍內的修飾的蛋白或肽。
本發明的另一個方面涉及含有編碼一種蛋白的DNA序列的重組載體，該蛋白表現出改進的禾本科植物種花粉變應原活性。更具體地說，該禾本科植物的種屬于禾本科，再更具體是屬于黑麥草屬，還再更具體的說，該變應性蛋白具有與多年黑麥草花粉Lol pIb蛋白的抗體免疫交叉反應的特性，即Pooid(festucoid)禾本科植物，第1組Triticanea無芒雀麥；偃麥草；冰草；黑麥，普通小麥。第2組Poanae鴨茅；多年黑麥草；多花黑麥草；草地早熟禾；加拿大早熟禾；燕麥；絨毛草；黃花茅；燕麥草；小糠草；梯牧草；絲帶草。Panicoid grass，Paspalum notatum，須芒草屬石茅高粱。
可以構建出很多表達載體用于生產修飾的禾本科植物花粉變應原或其片段或衍生物。
本發明擴大到修飾的禾本科植物花粉變應原或其片段、衍生物或同源物的單克隆和多克隆抗體。
上述單克隆抗體可用于篩選cDNA庫，或純化重組生產的蛋白，或甚至用于治療中，以降低導入的蛋白的活性。在以下的討論中，涉及的禾本科植物花粉變應原包括其衍生物、同源物和免疫相關物，及其化學合成的衍生物。以下的討論還包括對純化的修飾Lol p5及其片段、衍生物和同源物特異的抗體。考慮這種抗體可用于建立對修飾的禾本科植物花粉變應原的檢測分析方法(免疫測定法)中，尤其是在監測治療或診斷方案期間，以及用于重組或合成生產的禾本科植物花粉家族成員，特別是第5組的禾本科植物花粉變應原的純化中。上述的抗體可以是單克隆的或多克隆的。此外，針對上述討論的第一抗體的任何第二抗體(單克隆或多克隆)也包括在本發明的范圍內。本發明還考慮將這些第一或第二抗體用于檢測分析中，例如用于監測診斷或施用的藥物制劑的效果中。還有，任何與修飾的禾本科植物花粉變應原復合的分子的抗體也包括在本發明的范圍內。因此，禾本科植物花粉蛋白變應原的抗體包括這種蛋白變應原、或其抗原部分、以及任何有關的分子(例如脂質區、載體分子、融合蛋白等)的抗體。
這里所研究的禾本科植物花粉家族成員或其片段可經純化后用于抗體的生產。通過用重組或合成的修飾的禾本科植物花粉蛋白家族成員免疫，可得到多克隆和單克隆抗體，這兩種類型的抗體都可用于免疫測定。獲得該兩種類型的血清的方法在本領域是眾所周知的。多克隆血清較不優選，但相對容易通過下述方法制備對合適的實驗室動物注射有效量純化的修飾的禾本科植物花粉變應原或其抗原部分，收集動物的血清，然后用任何已知的免疫吸附劑技術分離特異的血清。雖然這種方法生產的抗體最終可用于任何類型的免疫測定，但由于該產品潛在的異質性，一般較少被選用。
由于大量生產的能力和產品的均一性，單克隆抗體在免疫測定中特別優選。采用本領域技術人員所熟知的技術(例如，參見Kohler和Milstein，Nature 256495-499，1975；Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6511-519，1976)，可以通過永生化細胞系與對免疫原性的制劑增敏淋巴細胞融合，獲得生產單克隆抗體的雜交瘤細胞系制品。
與多克隆血清制劑不同，動物的選擇取決于能夠與淋巴細胞融合的合適的永生化細胞系的可得性。小鼠和大鼠是被選擇用于雜交瘤技術中的動物，而且是優選使用的動物。如果可得到合適的永生化人(或非人的)細胞系，人類也可以用作增敏的淋巴細胞的來源。對于本發明目的，可以對選擇的動物注射約0.1mg-約20mg純化的修飾的禾本科植物花粉變應原或其一部分。通常，將注射的物質在福氏完全佐劑中乳化。也可能需要加強注射。采用適當標記的抗原，通過測定抗血清可以對抗體生產進行檢測。淋巴細胞可在無菌的狀態下，通過取出敏化動物的脾臟或淋巴結而得到，然后進行融合。或者，可以在體外刺激或免疫淋巴細胞。
在患者的血清、植物或哺乳動物的組織或組織提取物中存在的修飾的禾本科植物花粉變應原，或其特異的抗體，可以用上述制備的單克隆或多克隆抗體，基本用任何類型的免疫測定法進行檢測。參考美國專利No.4,015,043、4,424,279和4,018,653可見，有很多免疫測定技術可供使用。這些技術包括非競爭型的單位點和雙位點測定法，或“夾心”測定法；以及傳統的競爭性結合測定法。夾心測定法是其中最有用，而且是最常用的方法，適合于本發明中使用。夾心測定技術有很多變化，所有這些變化也包括在本發明內。簡單地說，在通常的正向測定中，將未標記的抗體固定在固體基質上，并使被測樣品與結合的分子接觸。經過足以形成抗體-抗原第二復合物的一段適當時間的溫育后，加入標記了能產生可檢測信號的報道分子的第二抗體，并溫育足夠的時間，使抗體-抗原-標記的抗體的第三復合物(例如，抗體-修飾的禾本科植物花粉變應原蛋白-抗體)形成。洗去任何未反應的物質，然后通過觀察報道分子產生的信號來確定該抗原的存在。該結果可以是定性的，即通過簡單地觀察可見的信號；或者也可以是定量的，即通過與含有已知量半抗原的對照樣品比較。正向測定的變化包括同步測定，或反向測定，前者是將樣品和標記的抗體同時加到結合的抗體上；后者是將標記的抗體先和被測樣品結合、溫育，然后同時加到結合的抗體上。顯而易見，這些技術，包括任何細小的改變，是本領域的技術人員所熟知的。
雖然以下的討論是有關檢測修飾的禾本科植物花粉變應原，但它同樣可用于檢測該變應原的抗體，而且看成是對該檢測的充分描述。
在典型的正向夾心測定中，本發明中考慮的對修飾的禾本科植物花粉變應原或其抗原部分具有特異性的第一抗體，與固體表面共價或被動結合。該固體表面通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固體支持物可以是管狀、珠狀、圓盤狀微孔板，或任何其它適合于進行免疫測定的表面。上述的結合方法在本領域是眾所周知的，通常包括交聯共價結合或物理吸附。在測試樣品制備中，洗滌聚合物-抗體復合物。然后將一份待測樣品加到固相復合物上，并在約室溫-約37℃下溫育一段時間，該時間足以使任何存在于抗體中的亞單位結合。該溫育的時間可以變動，但一般在約2-40分鐘的范圍，或者，如在方便的條件下，可以過夜。在溫育期之后，將抗體亞單位固相洗滌并干燥，然后用半抗原的一部分特異的第二抗體溫育。第二抗體與用來表示第二抗體與半抗原結合的報道分子連接。
本發明中所用的“報道分子”是指一種分子，根據其化學性質，該分子提供了一種通過分析可鑒別的，能夠檢測與抗原結合的抗體的信號。該檢測可以是定性或定量的。在這種測定類型中最常用的報道分子是酶、熒光團或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)。在酶免疫測定的場合，酶與第二抗體偶聯，通常是通過戊二醛或高碘酸鹽偶聯。但是，顯而易見，有很多不同的偶聯技術很容易可提供給熟練的技術人員使用。常用的酶包括辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶，以及其它。一般，選擇通過相應的酶的水解，產生可檢測的顏色變化的底物與特異性酶一起使用。例如，磷酸對硝基苯基酯適合與堿性磷酸酶偶聯物共用；對于過氧化物酶偶聯物，通常使用1，2-苯二胺、5-氨基水楊酸，或甲苯胺。也可以使用產生熒光產物的熒光團底物，而不用上述的生色底物。在所有的場合中，將酶標記的抗體加到第一抗體半抗原復合物上，使其結合，然后洗去過量的試劑。隨后將含有適合底物的溶液加入抗體-抗原-抗體三元復合物中。該底物會與連接在第二抗體上的酶反應，給出定性的可見信號，該信號通常可用分光光度計進一步定量，給出存在于樣品中的半抗原量的指示。“報道分子”也可以擴大到使用細胞凝集或凝集的抑制，例如紅血細胞或乳膠珠等。
或者，熒光化合物，例如熒光素和羅丹明，可以與抗體化學偶聯而不會改變其結合的能力。熒光染料標記的抗體被特定波長的光照射激活時，吸收該光能，在分子內誘導激發狀態，隨后發射出用光學顯微鏡通過視覺可檢測的特有顏色的光。如在EIA中那樣，使熒光素標記的抗體與第一抗體-半抗原復合物結合。洗去未結合的試劑后，將留下的三元復合物暴露于適合波長的光，觀察到的熒光團表明了目的半抗原的存在。免疫熒光和EIA技術在本領域中都已非常成熟，特別優選用于本發明的方法中。但其它報道分子，例如放射性同位素、化學發光或生物發光分子也可以使用。對熟練的技術員來說，如何變化程序以適應于所要求的目的，是顯而易見的。上述的內容可以直接或間接(即通過抗體)用于檢測本發明的禾本科植物花粉變應原蛋白，也是顯而易見的。
因此，本發明的一個方面是提供一種檢測以下物質的方法修飾的花粉變應原或其衍生物或同源物；或與存在于血清、組織提取物、植物提取物、或其它生物體液或組合物中的所述修飾的禾本科植物花粉變應原或其衍生物或同源物發生免疫反應的變應原蛋白，該方法包括下述步驟在規定的條件下，使待測的所述體液或組合物與所述修飾的禾本科植物花粉變應原接觸一段時間，該條件和時間足以使修飾的變應性蛋白-抗體復合物生成，并用某種檢測方法對所述復合物進行檢測。對于純化的方法，天然變應原的抗體對修飾的變應原的純化也有效，這樣的實施方案也包括在本發明內。
本發明也涉及一種試劑盒，它可快速、方便地測定哺乳動物的體液(例如血清、組織提取液、組織液)、體外細胞培養物上清液，以及細胞裂解物中修飾的禾本科植物花粉變應原或其衍生物、同源物或免疫相關物的抗體。該試劑盒分成間隔，以便容納用來裝入其抗原組分的第一容器，和用來裝入該禾本科植物花粉變應原的抗體的第二容器，所述抗體用能夠給出可檢測信號的報道分子標記。如果該報道分子為酶，則還提供用來裝入所述酶的底物的第三容器。在舉例說明的本發明試劑盒的使用中，待測樣品與第一容器的內含物在抗體所要求的條件下，接觸一段時間，如果樣品中存在抗體，則使其可與所述第一容器中的禾本科植物花粉變應原結合。
由于變應原在環境中的存在，盡管在其藥物學和免疫學方面取得進展，花粉癥和季節性的哮喘對西方社區仍然有嚴重的發病率和社會-經濟方面影響。雖然廣范圍的可用藥物，包括抗組胺劑和類固醇，改善了對變應性疾病的治療狀況，但這些藥物存在與長期使用有關的不適宜的副作用。由于這些問題，對變應性疾病的免疫治療的關注又重新出現。免疫治療涉及將可能的變應原提取物注射給脫敏患者而抗變應性反應。遺憾的是用作變應原的花粉制劑是多價的，而且質量差。因此，往往需要使用高的濃度，以誘導IgG應答，但這樣有可能通過引發全身的反應，包括過敏反應而致死。根據變應原的序列克隆的基因產物或合成的肽提供了用于治療的安全介質，因為人們可以控制它的質量、對其鑒定和標準化。
因此，本發明考慮了一種使對禾本科植物花粉過敏的哺乳類動物(例如人)脫敏的方法，該方法包括在足以使哺乳動物(例如人)對禾本科植物花粉有效脫敏的時間和條件下，對所述哺乳類動物施用脫敏有效量的修飾的禾本科植物花粉過敏原，或其片段或衍生物、免疫相關物，這種過敏原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或表現出與IgE結合能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低。
本發明還提供一種對黑麥草花粉，或來源于黑麥草的免疫相關物的花粉敏感的哺乳類動物(例如人)，治療其對該花粉敏感性的方法，該方法包括對所述哺乳類動物施用有效治療量的本發明的治療組合物。本發明還進一步提供一種治療對黑麥草屬花粉變應原，或與黑麥草花粉變應原免疫交叉反應的變應原的敏感性的方法，該方法包括對哺乳類動物施用有效治療量的本發明的蛋白制劑。
通過使用本發明的肽和蛋白，可以制備穩定的、組成確定的、以及有生物活性的制劑，并用于治療(例如，改善黑麥草敏感個體對這種植物花粉的變態反應)。例如，將這樣的肽或蛋白施用對象，可以改善IgE對禾本科植物花粉變應原的應答。純化的肽也可以用于研究治療黑麥草變態反應的機制，以及用于設計可用于免疫治療的修飾的衍生物或類似物。
因此，本發明涉及修飾的變應原在生產變應原敏感個體的治療或預防藥物中的用途。
因此，本發明提供一種藥物組合物，它包括脫敏或治療有效量的修飾的禾本科植物花粉過敏原，特別是第5組禾本科植物花粉過敏原，或其衍生物、同源物或免疫相關物，以及包括一種或多種藥用載體和/或稀釋劑。對包含修飾的禾本科植物花粉變應原的藥物組合物中的活性組分進行考慮，以便在對禾本科植物花粉過敏的人進行脫敏中，按照由具體情況確定的量施用時，使該組合物表現出優良的治療或預防活性。例如，可按每公斤體重每天約0.5Fg-20mg的量施用。劑量方案可以調節，以提供最優的治療反應。例如，可將分成幾次的劑量每天施用，或者按照治療狀況的緊急狀況，將劑量按比例減少。活性化合物可以用方便方式施用，例如通過口服、靜脈內(水可溶時)、肌肉內、皮下、鼻內、皮內或栓劑的途徑或植入(例如，用緩慢釋放分子)。根據施用的途徑，包含于本發明的藥物組合物的活性成分可能需要用材料包裹起來，以防止所述成分受到酶、酸和其它可能使該成分失活的自然條件的作用。例如，修飾的禾本科植物花粉過敏原可以在佐劑中施用；與酶抑制劑或在脂質體中共同施用。佐劑按其最廣的含義使用，并包括任何免疫刺激化合物，例如，干擾素。這里考慮的佐劑包括間苯二酚；非離子型表面活性劑，例如，聚氧乙烯油醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制劑包括胰腺胰蛋白酶。脂質體包括水包油包水CF乳狀液，以及常規使用的脂質體。為了誘導T細胞的無反應性，優選該藥物組合物以非免疫原性的形式(例如，不含佐劑)施用。
該活性化合物也可以胃腸外施用或腹膜內施用。也可以在甘油、液體聚乙二醇和它們的混合物中，以及在油中制備分散體。在普通的儲存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物的生長。
適合于注射用的藥物形式包括無菌水溶液(可溶于水時)或分散體，或用于制備可注射溶液的無菌粉末。在所有的場合，該藥物的形式必需是無菌的并且必需易于保持其注射性能的流體。該藥物在生產和儲存的條件下必需穩定，而且必需保護其能抗微生物，例如細菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、異丙二醇和液體聚乙二醇等)、它們的合適混合物，和植物油的分散介質。通過使用包衣，如卵磷脂包衣；在用分散體的場合，通過維持所要求的顆粒大小；以及通過使用表面活性劑，可以保持適合的流動性。通過使用各種抗細菌劑和抗真菌劑，可以達到防止微生物作用的目的，例如使用對羥苯苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在很多場合，優選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。在組合物中使用延遲吸收的試劑，例如一硬脂酸鋁和明膠，可以達到延遲吸收該可注射組合物的目的。
無菌可注射溶液的制備方法如下將所要求量的活性化合物，以及根據需要選用的以上列舉的各種其它組分一起摻入合適的溶劑中，隨后過濾滅菌。通常，分散體的制備方法是將各種滅菌的活性組分摻入無菌的載體中，該載體含有基本的分散介質，以及選自以上列舉的所需其它組分。在生產用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末時，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術，該方法可產生一種由活性組分加上任何額外的所需組分的粉末，其中額外的所需組分來源于其預先過濾滅菌的溶液。
在修飾的禾本科植物花粉變應原或其片段接以上所述被合適地保護起來后，該活性化合物可以通過口服施用，例如，與惰性稀釋劑或與可吸收的可食載體一起服用；或者可以封裝入硬的或軟的明膠膠囊殼內、或可以壓成片劑、或直接摻入飲食的食品內。對于口服治療施用，該活性化合物可以與賦形劑摻合，然后以可食用的片劑、含片、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮劑、糖漿劑、薄膜片等形式使用。這樣的組合物和制劑應含有至少1重量％的活性化合物。當然，可以很方便地使該組合物和制劑在單位劑量中的重量百分率為5-80％。在這種可用于治療的組合物中，活性化合物的量是能達到合適劑量的量。所制備的本發明的優選組合物或制劑中，口服的劑量單位形式含有約10Fg-200mg的活性化合物。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊等也可以含有下列組分粘合劑，例如，黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，例如，磷酸二鈣；崩解劑，例如，玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸等；潤滑劑，例如，硬脂酸鎂；以及甜味劑，例如，可加入蔗糖、乳糖或糖精；或增香劑，例如，薄荷、冬青油、或櫻桃香料。當劑量單位形式是膠囊時，除了上述類型的材料外，它可以含有液體載體。各種其他材料可作為包衣存在，或者，用于修飾該劑量單位的物理形式。例如，片劑、丸劑或膠囊可包被蟲膠、糖或兩者。糖漿或酏劑可含有活性化合物、用作甜味劑的糖、用作防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、染料和香料，例如櫻桃或柑桔香料。當然用于制備任何劑量單位形式的任何材料都應是藥物純的，而且在該用量下，基本上是無毒的。此外，該活性化合物可以摻入持續釋放的制劑和配方中。
這里所用的“藥用載體和/或稀釋劑”包括任一種和所有的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和延遲吸收劑等。將這種介質和試劑用于藥物活性物質中，在本領域是眾所周知的。除了一些常規使用的介質和試劑與該活性組分相容之外，將上述這些介質和試劑用于治療組合物中是經過仔細考慮的。補充的活性組分也可以摻入該組合物中。
通過以下非限定的實施例，對本發明作進一步描述。
實施例1Lol p5突變蛋白的生成為了通過基因工程獲得低變應原性、非IgE反應的變應原變體，必需確定能否可選出蛋白的關鍵殘基，該殘基可以改變，而能保持其一般的結構和T細胞表位的完整。因為在跨Lol p5C末端一半的肽片段處，觀察到頻率最高的IgE結合，所以發明人主要在該變應原的C末端引入突變。為了鑒定Lol p5中可能對該蛋白的IgE相互作用性有影響的氨基酸位置，將Lol p5同種型A和B的蛋白序列與其它禾本科植物的5組變應原比較(圖1)。采用定點誘變，置換第5組變應原中的高度保守的殘基(圖2)。生成了一個或三個結構域發生改變的突變蛋白(圖3)。
用pQE表達載體系統(Qiagen)使非突變的Lol p5和突變的Lol p5變體在大腸桿菌中以可溶的形式表達。使用這種載體進行的蛋白的細菌表達(見下文)中，在該分子的N末端引入了多聚組氨酸標記，這有助于通過一步金屬螯合親和層析進行重組蛋白的純化。然后在狹線印跡(圖5)，蛋白印跡(圖6)和ELISA測定(圖7)中，測定非突變的對照和突變蛋白的IgE反應性，以及與抗Lol p5單克隆抗體A7(Mab A7)和多克隆抗Lol p5抗血清的反應性。結果表明，在幾個突變蛋白的場合(例如，突變體4、突變體6、突變體9)，很大程度上減弱了IgE的結合活性。這樣的基因工程變應原分子可能有助于I型變應性疾病的更安全和更有效的免疫治療，所描述的方法一般可以應用于產生變應原的非IgE反應變體。
實施例2重組Lol P5和突變蛋白的表達和純化將Lol P5和突變蛋白的編碼序列按讀碼框引入表達載體pQE31(QIAGEN)中。該載體可使N末端含有6個組氨酸殘基標記的重組蛋白表達。該蛋白的表達和收集按照概括在QIA表達指南中所述進行。按照概括在TALON金屬親和樹脂用戶指南(Clontech)中所述的批式/重力流動柱純化步驟，用TALON金屬親和樹脂(Clontech)純化組氨酸標記的蛋白。
實施例3SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白印跡為進行SDS-PAGE，將1.3Fg的Lol p5和每種突變蛋白用10×蛋白樣品緩沖液煮沸5分鐘。將樣品在15％w/v的丙烯酰胺微型凝膠上加樣后，在含0.2M甘氨酸，0.025M Tris，0.1％w/v SDS的緩沖液中，200V下電泳40分鐘。
將凝膠在0.1％w/v考馬斯亮蘭R250中振蕩至少1小時，進行染色。使凝膠在20％v/v甲醇，7％v/v冰醋酸，3％v/v甘油中退色過夜，其間更換緩沖液2次。
用BIORAD mini-Protean II細胞蛋白印跡裝置，使凝膠在含0.025MTris，0.2M甘氨酸，20％v/v甲醇的緩沖液中，在0.2Fm的尼龍膜(Schleicher & Schuell)上進行蛋白印跡，印跡條件為100V，4℃下印跡1小時。
實施例4狹線印跡分析將0.7Fg的突變蛋白和Lol P5加入Hybri-Slot多功能狹線印跡裝置(Life Technologies)中的狹線中，并在通過水真空抽吸的條件下，印跡到Nytran 0.2Fm的尼龍膜(Schleicher & Schuell)上，進行狹線印跡分析。
實施例5用抗體及患者血清的溫育印跡將所有的蛋白印跡和狹線印跡在10％w/v的溶于PBS(150mM氯化鈉，36mM磷酸二氫鈉一水合物，7mM磷酸氫二鈉二水合物)的脫脂奶粉中，振蕩下封閉1小時，然后用抗體或血清溫育。用PBS，0.5v/vTween20洗滌一次，用PBS洗滌兩次，然后用單克隆抗體(1∶5稀釋的mAbA7)，多克隆抗體(1∶50稀釋的B1)或患者血清溫育。所有的稀釋物都用PBS，0.5％w/v BSA，0.1％w/v疊氮化鈉制備，然后與印跡在室溫下振蕩過夜。將印跡按以上所述洗滌后，與用PBS，0.5v/vTween20，1％w/v BSA按1∶5000稀釋的堿性磷酸酶偶聯的抗小鼠(mAbA7)或抗兔(B1)第二抗體(Promega)在室溫下振蕩溫育過夜。然后將所有的印跡按以上所述洗滌。通過顏色反應檢測結合的抗小鼠和抗兔抗體-10ml堿性磷酸酶緩沖液(0.1M Tris，pH9.5，0.1M氯化鈉，0.05M氯化鎂)和66F1的BCIP貯液(5％w/v溶于100％二甲基甲酰胺的溴氯吲哚磷酸酯)。用患者血清溫育的印跡物用PBS，0.5v/v Tween20，1％w/v BSA(緩沖液B)按1∶5稀釋的I131標記的抗人抗體(Bioclone)，在室溫下振蕩過夜，進行探測。所有印跡按以上所述洗滌，洗滌后，用Kodak Biomax MS膠片在-70C下曝光，檢測結合的I131標記的抗人IgE。
實施例6直接ELISA用50F1的100、500、1000、5000和10000ng/ml的Lol p5和4種突變蛋白的稀釋物等分物涂布ELISA板(Greiner)的孔，并在4℃下溫育過夜。然后用PBS，0.5v/v Tween20將孔洗滌4次。用緩沖液B在室溫下封閉1小時后，再將孔洗滌，并用50F1用緩沖液B適當稀釋的患者血清在4℃下溫育過夜。按以上所述，洗滌孔，然后用50F1用緩沖液B按1∶2000稀釋的抗人IgE抗體(堿性磷酸酶偶聯的，Sigma)在室溫下溫育1小時。在最后的一系列洗滌后，用Blue Phos微孔磷酸酶底物系統(Kirkegaard & Perry實驗室)檢測結合的抗人IgE。用Spectracount平板讀數器檢測在630nm的顯色(Packard)。
本領域的技術人員會意識到，除具體描述外，這里所描述的發明易于變更和改進。應該懂得，本發明包括所有這樣的變更和改進。本發明也包括本說明書中單獨或集中地涉及或指出的所有步驟、特性、組合物和化合物，以及任意兩個或多個所述步驟或特性的任何和所有組合。
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Lys Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Val100 105 110Thr Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arg Val Ile Ala Gly Ala Leu Glu Val115 120 125His Ala Val Lys Pro Ala Thr Glu Glu Val Pro Ala Ala Lys Ile Pro130 135 140Thr Gly Glu Leu Gln Ile Val Asp Lys Ile Asp Ala Ala Phe Lys Ile145 150 155 160Ala Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro Thr Asn Asp Lys Phe Thr Val165 170 175Phe Glu Ser Ala Phe Asn Lys Ala Leu Asn Glu Cys Thr Gly Gly Ala180 185 190Tyr Glu Thr Tyr Lys Phe Ile Pro Ser Leu Glu Ala Ala Val Lys Gln195 200 205Ala Tyr Ala Ala Thr Val Ala Ala Ala Pro Glu Val Lys Tyr Ala Val210 215 220Phe Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Ile Thr Ala Met Thr Gln Ala Gln225 230 235 240Lys Ala Gly Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Val245 250 255Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala260 265 270Gly Gly Tyr Lys Ala275<210>2<211>138
<212>PRT<213>同種型<400>2Ala Thr Pro Ala Thr Ala Ala Thr Pro Thr Pro Ala Thr Pro Ala Thr1 5 10 15Pro Ala Ala Val Pro Ser Glu Ile Lys Ile Val Val Tyr Thr Val Glu20 25 30Thr Gly Ala Thr Asn Phe Val Glu Gly Leu Ala Ser Gly Tyr Ala Asp35 40 45Gln Ser Lys Asn Gln Thr Ser Ala Leu Lys Leu Glu Gln Tyr Ala Thr50 55 60Ala Lys Val Gly Ala Ala Ala Val Leu Ile Val Arg Thr Ala Asn Thr65 70 75 80Asn Ile Lys Val Ser Leu Ala Asp Ser Thr Leu Val Lys Gln Thr Thr85 90 95Ser Thr Lys Val Ser Glu Glu Glu Ala Thr Thr Ala Thr Pro Thr Pro100 105 110Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Pro Ala Ala Ala Tyr Thr Ala Thr115 120 125Pro Ala Ala Thr Pro Ala Thr Thr Pro Val130 135<210>3<211>112<212>PRT<213>同種型<400>3Leu Gly Thr Pro Gly Tyr Thr Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Gly Ala1 5 10 15
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65<210>5<211>121<212>PRT<213>同種型<400>5Val Gly Ala Pro Thr Leu Thr Pro Pro Ala Ala Gly Tyr Thr Pro Ala1 5 10 15Ala Pro Ala Gly Ala Ala Pro Ile Lys Ile Gly Val Ala Val Tyr Thr20 25 30Val Thr Gly Ala Ser Asn Phe Ala Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro Lys35 40 45Gly Ala Ala Ala Ala Ser Ser Asn Ala Val Thr Ser Ala Lys Leu Ser50 55 60Tyr Val Ala Thr Leu Ser Ile Thr Gly Lys Ala Ala Val Ile Val Val65 70 75 80Ala Ala Asp Ile Lys Ala Ser Gln Ser Ala Ser Thr Ala Thr Lys Ser85 90 95Ala Val Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ala Val Gly Ala Val Gly Ala Gly100 105 110Tyr Lys Thr Gly Ala Ala Pro Thr Val115 120<210>6<211>98<212>PRT<213>同種型<400>6Leu Ser Gly Ala Pro Thr Pro Ala Ala Gly Tyr Thr Pro Ala Ala Pro
1 5 10 15Ala Gly Ala Ala Pro Met Ile Lys Ile Val Gly Gly Val Ala Asn Tyr20 25 30Thr Val Thr Gly Ala Ala Ser Asn Phe Ala Glu Ala Leu Ser Thr Glu35 40 45Pro Lys Gly Ala Ala Ala Asp Ser Ser Lys Ala Ala Thr Ser Ala Lys50 55 60Leu Ser Asp Tyr Ala Thr Ser Ile Thr Gly Ala Lys Ala Thr Ala Val65 70 75 80Ile Val Val Ala Ala Asp Ile Lys Ala Ser Gln Ser Ala Ser Thr Ala85 90 95Ala Val<210>7<211>305<212>PRT<213>Lol p5<400>7Met Ala Val Gln Lys Tyr Thr Val Ala Leu Phe Leu Ala Val Ala Leu1 5 10 15Val Ala Gly Pro Ala Ala Ser Tyr Ala Ala Asp Ala Gly Tyr Thr Pro20 25 30Ala Ala Ala Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala35 40 45Gly Gly Lys Ala Thr Thr Asp Glu Gln Lys Leu Leu Glu Asp Val Asn50 55 60
Ala Gly Phe Lys Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala65 70 75 80Asp Lys Phe Lys Ile Phe Glu Ala Ala Phe Ser Glu Ser Ser Lys Gly85 90 95Leu Leu Ala Thr Ser Ala Ala Lys Ala Pro Gly Leu Ile Pro Lys Leu100 105 110Asp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Tyr Lys Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro115 120 125Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Val Thr Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arg130 135 140Val Asn Leu Ala Ala Ile Ala Gly Ala Leu Glu Val His Ala Val Lys145 150 155 160Pro Ala Thr Glu Glu Val Pro Ala Ala Lys Ile Pro Thr Gly Glu Leu165 170 175Gln Ile Val Asp Lys Ile Asp Ala Ala Phe Lys Ile Ala Ala Thr Ala180 185 190Ala Asn Ala Ala Pro Thr Asn Asp Lys Phe Thr Val Phe Glu Ser Ala195 200 205Phe Asn Lys Ala Leu Asn Glu Cys Thr Gly Gly Ala Tyr Glu Thr Tyr210 215 220Lys Phe Ile Pro Ser Leu Glu Ala Ala Val Lys Asp Ala Tyr Ala Ala225 230 235 240Thr Val Ala Ala Ala Pro Glu Val Lys Tyr Ala Val Phe Glu Ala Ala245 250 255Leu Thr Lys Ala Ile Thr Ala Met Thr Gln Ala Gln Lys Ala Gly Lys260 265 270
Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Thr Gly Ala275 280 285Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Lys290 295 300Ala305<210>8<211>276<212>PRT<213>Lol p5變體D1<400>8Ala Asp Ala Gly Tyr Thr Pro Ala Ala Ala Ala Thr Pro Ala Thr Pro1 5 10 15Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Gly Lys Ala Thr Thr Asp Glu Gln20 25 30Lys Leu Leu Glu Asp Val Asn Ala Gly Phe Lys Ala Ala Val Ala Ala35 40 45Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala Asp Ala Phe Lys Ile Phe Glu Ala Ala50 55 60Phe Ser Glu Ser Ser Lys Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ala Ala Lys Ala65 70 75 80Pro Gly Leu Ile Pro Lys Leu Asp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Tyr Lys85 90 95Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Val Thr100 105 110Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arg Val Ile Ala Gly Ala Leu Glu Val His
115 120 125Ala Val Lys Pro Ala Thr Glu Glu Val Pro Ala Ala Lys Ile Pro Thr130 135 140Gly Glu Leu Gln Ile Val Asp Lys Ile Asp Ala Ala Phe Lys Ile Ala145 150 155 160Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro Thr Asn Asp Lys Phe Thr Val Phe165 170 175Glu Ser Ala Phe Asn Lys Ala Leu Asn Glu Cys Thr Gly Gly Ala Tyr180 185 190Glu Thr Tyr Lys Phe Ile Pro Ser Leu Glu Ala Ala Val Lys Asp Ala195 200 205Tyr Ala Ala Thr Val Ala Ala Ala Pro Glu Val Lys Tyr Ala Val Phe210 215 220Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Ile Thr Ala Met Thr Gln Ala Gln Lys225 230 235 240Ala Gly Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala245 250 255Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly260 265 270Gly Tyr Lys Ala275<210>9<211>276<212>PRT<213>Lol p5變體D2<400>9
Ala Asp Ala Gly Tyr Thr Pro Ala Ala Ala Ala Thr Pro Ala Thr Pro1 5 10 15Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Gly Lys Ala Thr Thr Asp Glu Gln20 25 30Lys Leu Leu Glu Asp Val Asn Ala Gly Phe Lys Ala Ala Val Ala Ala35 40 45Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala Asp Lys Phe Lys Ile Phe Glu Ala Ala50 55 60Phe Ser Glu Ser Ser Lys Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ala Ala Lys Ala65 70 75 80Pro Gly Leu Ile Pro Lys Leu Asp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Tyr Lys85 90 95Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Val Thr100 105 110Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arg Val Ile Ala Gly Ala Leu Glu Val His115 120 125Ala Val Lys Pro Ala Thr Glu Glu Val Pro Ala Ala Lys Ile Pro Thr130 135 140Gly Glu Leu Gln Ile Val Asp Lys Ile Asp Ala Ala Phe Lys Ile Ala145 150 155 160Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro Thr Asn Asp Lys Phe Thr Val Phe165 170 175Glu Ser Ala Phe Asn Lys Ala Leu Asn Glu Cys Thr Gly Gly Ala Tyr180 185 190Glu Thr Tyr Lys Phe Ile Pro Ser Leu Glu Ala Ala Val Lys Asp Ala195 200 205
Tyr Ala Ala Thr Val Ala Ala Ala Pro Glu Val Lys Tyr Ala Val Phe210 215 220Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Ile Thr Ala Met Thr Gln Ala Gln Lys225 230 235 240Ala Gly Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala245 250 255Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly260 265 270Ala Tyr Ala Ala275<210>10<211>275<212>PRT<213>Lol p5變體D3<400>10Ala Asp Ala Gly Tyr Thr Pro Ala Ala Ala Ala Thr Pro Ala Thr Pro1 5 10 15Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Gly Lys Ala Thr Thr Asp Glu Gln20 25 30Lys Leu Leu Glu Asp Val Asn Ala Gly Phe Lys Ala Ala Val Ala Ala35 40 45Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala Asp Lys Phe Lys Ile Phe Glu Ala Ala50 55 60Phe Ser Glu Ser Ser Lys Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ala Ala Lys Ala65 70 75 80Pro Gly Leu Ile Pro Lys Leu Asp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Tyr Lys
85 90 95Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Val Thr100 105 110Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arg Val Ile Ala Gly Ala Leu Glu Val His115 120 125Ala Val Lys Pro Ala Thr Glu Glu Val Pro Ala Ala Lys Ile Pro Thr130 135 140Gly Glu Leu Gln Ile Val Asp Lys Ile Asp Ala Ala Phe Lys Ile Ala145 150 155 160Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro Thr Asn Asp Lys Phe Thr Val Phe165 170 175Glu Ser Ala Phe Asn Lys Ala Leu Asn Glu Cys Thr Gly Gly Ala Tyr180 185 190Glu Thr Tyr Lys Phe Ile Pro Ser Leu Glu Ala Ala Val Lys Asp Ala195 200 205Tyr Ala Ala Thr Val Ala Ala Ala Pro Glu Val Lys Tyr Ala Val Phe210 215 220Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Ile Thr Ala Met Thr Gln Ala Gln Lys225 230 235 240Ala Gly Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala245 250 255Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly260 265 270Tyr Lys Ala275
<210>11<211>276<212>PRT<213>Lol p5變體D4<400>11Ala Asp Ala Gly Tyr Thr Pro Ala Ala Ala Ala Thr Pro Ala Thr Pro1 5 10 15Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Gly Lys Ala Thr Thr Asp Glu Gln20 25 30Lys Leu Leu Glu Asp Val Asn Ala Gly Phe Lys Ala Ala Val Ala Ala35 40 45Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala Asp Lys Phe Lys Ile Phe Glu Ala Ala50 55 60Phe Ser Glu Ser Ser Lys Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ala Ala Lys Ala65 70 75 80Pro Gly Leu Ile Pro Lys Leu Asp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Tyr Lys85 90 95Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Val Thr100 105 110Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arg Val Ile Ala Gly Ala Leu Glu Val His115 120 125Ala Val Lys Pro Ala Thr Glu Glu Val Pro Ala Ala Lys Ile Pro Thr130 135 140Gly Glu Leu Gln Ile Val Asp Lys Ile Asp Ala Ala Phe Lys Ile Ala145 150 155 160Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro Thr Asn Asp Asn Leu Ala Ala Phe165 170 175
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50 55 60Phe Ser Glu Ser Ser Lys Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ala Ala Lys Ala65 70 75 80Pro Gly Leu Ile Pro Lys Leu Asp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Tyr Lys85 90 95Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Val Thr100 105 110Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arg Val Ile Ala Gly Ala Leu Glu Val His115 120 125Ala Val Lys Pro Ala Thr Glu Glu Val Pro Ala Ala Lys Ile Pro Thr130 135 140Gly Glu Leu Gln Ile Val Asp Lys Ile Asp Ala Ala Phe Lys Ile Ala145 150 155 160Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro Thr Asn Asp Lys Phe Thr Val Phe165 170 175Glu Ser Ala Phe Asn Lys Ala Leu Asn Glu Cys Thr Gly Gly Ala Tyr180 185 190Glu Thr Tyr Lys Phe Ile Pro Ser Leu Glu Ala Gly Ala Ala Asp Ala195 200 205Tyr Ala Ala Thr Val Ala Ala Ala Pro Glu Val Lys Tyr Ala Val Phe210 215 220Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Ile Thr Ala Met Thr Gln Ala Gln Lys225 230 235 240Ala Gly Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala245 250 255
Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly260 265 270Gly Tyr Lys Ala275<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>D1正向引物<400>13cctccggcgg acgcgttcaa gatc 24<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>D1反向引物<400>14gatcttgaac gcgtccgccg gagg 24<210>15<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>D2正向引物<400>15gctgctggtg cctacgcagc ctgatcagc 29<210>16<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>D2反向引物<400>16gctgatcagg ctgcgtaggc accagcagc 29<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>D3正向引物<400>17ccaccgccgc tgcttgaggc tacaaagc 28<210>18<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>D4反向引物<400>18gctttgtagc ctcaagcagc ggcggtgg 28<210>19<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>D5正向引物<400>19ccaccaacga taacttggcc gccttcgaga gtgc34<210>20<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>D5反向引物
<400>20gcactctcga aggcggccaa gttatcgttg gtgg34<210>21<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>D6正向引物<400>21cctcgaggcc ggggccgcgc aggcctac 28<210>22<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>D5反向引物<400>22cgtaggcctg cgcggccccg gcctcgagg 29
權利要求
1.一種修飾的重組變應原，其中處于天然形式的所述變應原與敏感對象的變應性疾病狀況有關，其中所述修飾的重組變應原包含由天然存在的氨基酸序列經修飾的氨基酸序列，從而使該變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或表現出結合IgE能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低，同時保持T細胞抗原性。
2.根據權利要求1所述的修飾的重組變應原，其中所述變應原是一種禾本科植物花粉變應原。
3.根據權利要求2所述的修飾的重組變應原，其中所述禾本科植物花粉變應原含有一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加，所述殘基至少在兩種免疫交叉反應性的第5組禾本科植物花粉變應原中是保守的，與相應的天然存在的形式相比，其中所述修飾的第5組的禾本科植物花粉變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或表現出結合IgE能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低。
4.根據權利要求3所述的修飾的重組變應原，其中所述禾本科植物花粉變應原是黑麥草花粉變應原。
5.根據權利要求2或3或4所述的修飾的重組變應原，其中所述變應原選自Lol p5，Phl p5，Pao p5和免疫相關的變應原。
6.根據權利要求5所述的修飾的重組變應原，其中所述變應原在相應于Lol p5的突變體1-9中的一個或多個突變體，或免疫學上相關變應原的相應突變體的位置上含有氨基酸截短或取代、缺失和/或添加。
7.根據權利要求6所述的修飾的重組變應原，其中所述變應原包括Lol p5變體或相應于免疫相關變應原的修飾的變應原，其中所述Lol p5變體包括具有SEQ ID NO8-SEQ ID NO12中任何一個所示的氨基酸序列的分子。
8.根據權利要求1-7中任何一項所述的修飾的重組變應原，其中的變應性疾病狀況是I型變應性疾病。
9.根據權利要求8所述的修飾的重組變應原，其中的I型變應性疾病是對黑麥草花粉的敏感性。
10.根據權利要求1-9中任何一項所述的修飾的重組變應原，其中所述敏感對象是人、靈長目動物、家畜動物、實驗室試驗動物或寵物。
11.根據權利要求10所述的修飾的重組變應原，其中所述敏感對象是人。
12.一種含有修飾的變應原和一種或多種藥用載體和/或稀釋劑的組合物，其中所述修飾的變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或表現出結合IgE能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低，同時保持T細胞抗原性。
13.根據權利要求12所述的組合物，其中所述修飾的變應原是一種禾本科植物花粉變應原。
14.根據權利要求13所述的組合物，其中所述禾本科植物花粉變應原含有一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加，所述殘基至少在兩種免疫交叉反應性的第5組禾本科植物花粉變應原中是保守的；與相應的天然存在的形式相比，其中所述修飾的第5組的禾本科植物花粉變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或表現出結合IgE能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低。
15.根據權利要求14所述的組合物，其中所述禾本科植物花粉變應原是黑麥草花粉變應原。
16.根據權利要求15所述的組合物，其中所述變應原選自Lol p5，Phl p5，Pao p5和免疫相關的變應原。
17.根據權利要求16所述的組合物，其中所述變應原在相應于Lol p5的突變體1-9中的一個或多個突變體，或免疫學上相關變應原的相應突變體的位置上含有氨基酸截短或取代、缺失和/或添加。
18.根據權利要求17所述的組合物，其中所述變應原包括Lol p5變體或相應于免疫相關變應原的修飾的變應原，其中所述Lol p5變體包括具有SEQ ID NO8-SEQ ID NO12中任何一個所示的氨基酸序列的分子。
19.一種對治療對象的變應性疾病狀況進行預防或治療的方法，該方法包括將有效量的修飾的變應原施用于所述對象，其中修飾的變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或表現出結合IgE能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低，同時保持T細胞抗原性。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述變應原是一種禾本科植物花粉變應原。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述禾本科植物花粉變應原含有一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加，所述殘基至少在兩種免疫交叉反應性的第5組禾本科植物花粉變應原中是保守的；與相應的天然存在的形式相比，其中所述修飾的第5組的禾本科植物花粉變應原缺乏或含有減少數量的IgE表位，和/或表現出結合IgE能力的減弱，和/或表現出刺激產生IgE的活性的降低。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述禾本科植物花粉變應原是黑麥草花粉變應原。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述變應原選自Lol p5，Phlp5，Pao p5和免疫相關的變應原。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述變應原在相應于Lol p5的突變體1-9中的一個或多個突變體，或免疫學上相關變應原的相應突變體的位置上含有氨基酸截短或取代、缺失和/或添加。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述變應原包括Lol p5變體或相應于免疫相關變應原的修飾的變應原，其中所述Lol p5變體包括具有SEQ ID NO8-SEQ ID NO12中任何一個所示的氨基酸序列的分子。
26.根據權利要求19-25中任何一項所述的方法，其中的變應性疾病狀況是I型變應性疾病。
27.根據權利要求26所述的方法，其中的I型變應性疾病是對黑麥草花粉的敏感性。
28.根據權利要求19-27中任何一項所述的方法，其中所述對象是人、靈長目動物、家畜動物、實驗室試驗動物或寵物。
29.根據權利要求21所述的方法，其中所述對象是人。
全文摘要
本發明廣泛地涉及用于免疫治療或免疫預防治療變應性疾病的試劑。更具體地說，本發明提供一種修飾的變應原，該變應原表現出IgE相互作用性的減弱，包括刺激產生IgE的活性的降低，而保留T細胞抗原性，它可用于I型變應性疾病狀況的免疫調節。本發明還考慮了一種對變應性疾病，例如I型變應性疾病狀況進行免疫調節的方法，該方法包括對患者施用表現出IgE相互作用性減弱，而保留T細胞抗原性的修飾的變應原。
文檔編號C12N15/13GK1589278SQ02823080
公開日2005年3月2日 申請日期2002年9月13日 優先權日2001年9月20日
發明者N·德維爾德, M·B·辛, P·L·哈拉, I·斯沃博達 申請人:墨爾本大學