專利名稱：表達巢蛋白的毛囊干細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及毛囊干細胞及其用途。明確地說，本發明涉及表達巢蛋白(nestin)的毛囊干細胞、分離該干細胞的方法以及使用該干細胞治療疾病或障礙的方法。
背景技術：
盡管干細胞治療的重要性已得到公認，但由于使用胚胎干細胞做這樣的治療，對干細胞治療法一直存有爭議。另外，來源于諸如骨髓的干細胞較難獲得。如果有一種易于獲得的成年干細胞，其能夠提供與那些更有爭議的以及更不易獲得的干細胞同樣的好處，對這個領域將是很有益的。本發明通過發現來自哺乳動物毛囊的干細胞，討論了這一需求。涉及毛發的一個簡要背景為本發明中的毛囊干細胞提供了基礎。
毛發生長是一種獨特的循環再生現象。在哺乳動物的整個一生中，毛囊不斷重復著生長(毛發生長期)、衰退(過渡期)以及休眠(毛發生長終期)的循環。毛囊干細胞的位置和功能是理解毛發生長的生物學和病理學的關鍵(Oshima，H.等，Cell(2001)104233-245)。標記滯留細胞是干細胞的特征之一，有人發現這種細胞位于毛囊的永久性上部(permanent upper portion)，即所謂毛囊膨出區(bulge area)(Cotsarelis，G.等，Cell(1990)611329-1337)。
Taylor，G.等(Cell(2000)102451-461)最近報道，毛囊膨出區干細胞很可能是雙能性的(bipotent)，因為它們不僅可以使毛囊發生，還可以使表皮發生。其它實驗(Oshima等，(前述))也提供新證據證明，成年小鼠觸須囊的外根鞘上部包含多能干細胞，它們可分化成毛囊基質細胞、脂肪腺基底細胞和表皮。最近，Toma，J.G.等(Nature Cell Biology(2001)3778-784)報道，從哺乳動物真皮分離到的，稱作皮膚衍生的前體(SKP)的成年多能干細胞，能夠在培養中增殖并分化，產生神經元、神經膠質、平滑肌細胞和脂肪細胞。但是，這些干細胞在皮膚中的精確定位及其功能尚不清楚。
從毛發中分離到與神經干細胞相關的干細胞，對本領域將是很有用的。本發明確立了毛囊干細胞和神經干細胞的相關性。
發明內容
本發明涉及分離的毛囊干細胞以及從所述細胞分化得到的細胞。優選，所述細胞是基于標記(如巢蛋白)而分離得到的，更優選，巢蛋白連接于綠色熒光蛋白。
本發明的另一方面涉及一種分離毛囊干細胞的方法，包括提供來自哺乳動物的含有毛囊的皮膚，以及從中分離毛囊干細胞。優選，該皮膚是毛發生長終期的皮膚。
本發明的另一方面，分離到的毛囊干細胞在培養基中進一步培養以產生分化的細胞。在優選的實施方案中，該培養基包括FBS、BDNF、PDGF或CNTF。在更優選的實施方案中，分化的細胞是神經元、星形膠質細胞、平滑肌細胞或脂肪細胞。
本發明的另一方面涉及一種治療疾病的方法，優選神經性疾病或退化性疾病，包括將干細胞或由其分化來的細胞移植入表現該疾病的哺乳動物。所述細胞既可以是自體固有的也可以是異源的。在一個實施方案中，所述細胞是通過系統注射方式移植到哺乳動物中的，在另一個方案中是通過直接將所述細胞注射進哺乳動物的器官。優選的器官或組織是腦、肝或心血管組織。優選疾病為阿爾茨海默氏病(Alzheimer′s)、帕金森氏病(Parkinson′s)、與年齡相關的記憶力減退、毛發脫落、燒傷、皮膚老化以及皮膚置換(skin replacement)。
圖1a-d在巢蛋白-GFP轉基因小鼠皮膚的毛發生長終期的毛囊巢蛋白-GFP表達細胞。皮膚樣品是從巢蛋白-GFP轉基因小鼠背部皮膚切下來后，馬上新鮮制備的。皮膚樣品從皮下組織切出后使真皮側朝上，用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡直接觀察。(a、b和c)是熒光顯微鏡圖像。(d)是共聚焦顯微鏡圖像。注意獨特的鐘型結構以及毛囊巢蛋白-GFP表達細胞(白箭頭)在每一個毛囊中的位置。毛囊巢蛋白-GFP表達細胞嚴格定位在緊靠脂肪腺(圖1a，白色虛線畫出)的下方，與已定位的毛囊干細胞相同，該區域被稱作毛囊膨出區。注意在毛囊中的巢蛋白-GFP表達細胞，互相之間是通過表達巢蛋白-GFP的神經樣細胞網絡(灰箭頭)相連。放大倍數a 100×、b和c200×、d 400×。
圖2毛囊干細胞形成新生毛囊。在毛發生長終期的GFP表達型毛囊干細胞(白箭頭)。GFP毛囊干細胞形成毛發生長期早期的新毛囊(灰箭頭)。原物放大400×。
圖3a-f共聚焦圖像顯示，新毛囊從膨出區的巢蛋白-GFP表達細胞長出，并在毛發循環發育。毛發生長期毛囊通過脫發作用引入，脫發是通過在6-7周齡C57B16巢蛋白-GFP轉基因小鼠背部皮膚上用熱蠟造成，該小鼠的毛發循環通過粉紅色皮膚顏色判定在毛發生長終期。(a)是即將脫發前的樣品，顯示僅有膨出區巢蛋白-GFP細胞定位于該膨出區。(b)是脫發后第2天的樣品。注意具有巢蛋白-GFP表達的新毛囊芽剛剛直接從膨出區巢蛋白-GFP干細胞形成。(c和d)是脫發后第4和第5天的樣品，顯示出毛發生長期早期的毛囊。注意新毛囊持續生長和發育，伴隨著巢蛋白-GFP的表達。(e)是脫發后第8天的樣品，顯示出毛發生長期中期的毛囊。注意在外根鞘上部完全形成毛囊并有巢蛋白-GFP表達，在毛囊球部(bulb)無巢蛋白-GFP表達。(f和g)是脫發后第19-20天的樣品，顯示過渡期的毛囊。注意毛囊已經退化并回復至毛發膨出狀態。共聚焦顯微鏡。放大倍數(a，b，c和d)400×，(e和f)100×，(g)200×。
圖4通過免疫組化染色確定的，GFP、巢蛋白和角蛋白5/8和15在毛囊膨出區干細胞以及外根鞘細胞中的共定位。(a)是活組織的共聚焦圖像，顯示出表達巢蛋白-GFPd的毛囊膨出區干細胞(灰箭頭)，其形成了新毛囊(白箭頭)。(b)是石蠟包埋的組織切片，用巢蛋白抗體(1∶100)進行免疫組化染色，其展現了巢蛋白表達的準確模式，如同(a)中的巢蛋白-GFP表達。灰箭頭指示巢蛋白陽性毛囊膨出區干細胞。白箭頭指示新形成的巢蛋白陽性毛囊。(c)和(d)是巢蛋白-GFP轉基因小鼠皮膚毛囊的兩個系列縱向石蠟切片，用GFP mAb(1∶100)和角蛋白-15mAb(1∶100)進行雙免疫組化染色。GFP用色素原固紅檢測，角蛋白-15用色素原DAB檢測。注意巢蛋白-GFP和角蛋白-15在膨出區毛囊干細胞中的定位。(e，f和g)是巢蛋白-GFP轉基因小鼠皮膚毛囊的系列橫向石蠟切片，分別用GFP mAb(e，1∶100)、角蛋白5/8mAb(f，1∶100)和巢蛋白mAb(g，1∶100)進行免疫組化染色。注意GFP、角蛋白5/8和巢蛋白在毛囊外根鞘細胞中的共定位。放大倍數400×。
圖5毛囊中表達巢蛋白-GFP的干細胞和毛囊間的神經樣細胞網絡。來自巢蛋白-GFP轉基因小鼠皮膚的毛發生長終期毛囊，顯示表達GFP的干細胞。注意毛囊膨出區中正處在脂肪腺下方的干細胞的獨特結構(白箭頭)。這些囊與表達GFP的神經樣細胞網絡(灰箭頭)相連。原物放大100×。
圖6從毛囊分離的巢蛋白-GFP表達細胞在體外產生多種細胞類型。(a)從毛囊的表達巢蛋白-GFP的細胞中生長出來的神經球。(b)在包被的板子上鋪板兩天后，神經球附著于表面；細胞開始遷移并失去其GFP熒光。(c)鋪板一周后，細胞開始表達神經元的標記β-微管蛋白(纖維樣結構)；有些細胞仍表達低水平的GFP(相對圓的亮點)。(d)鋪板兩周后，GABA陽性神經元細胞很明顯。(e)鋪板一周后，細胞開始表達星形膠質細胞的標記GFAP；一些細胞仍表達低水平的GFP。
實施本發明的模式 在一個方面，本發明涉及分離的毛囊干細胞。已發現毛囊細胞表達中樞神經祖細胞(progenitor)的一種標記，如巢蛋白。因此，在本發明的一個方面，這些毛囊細胞是基于該標記(巢蛋白)的表達來分離的。
巢蛋白是一種中間絲(intermediate filament)，它是中樞神經系統祖細胞的標記。具體地，帶有在巢蛋白調控序列控制下的綠色熒光蛋白(GFP)的轉基因小鼠已經產生，且已用于觀察CNS干細胞的自我更新和多能性。雖然在一個優選實施方案中，巢蛋白可以與一種檢測劑如綠色熒光蛋白相結合以便促進分離過程，但仍預期有這些細胞的其它標記以及任何其它可檢測的試劑，可用于分離毛囊干細胞。例如，細胞可以在體外或在原位進行測定，并測試帶有標記的結合配對物、抗體或結合核酸。在毛囊干細胞附著于固相支持物的實施方案中，測定可以使用其它類型的信號分子，其中非結合的信號分子可以與結合于所述細胞的信號分子分離開來。舉例來說，信號分子可以用放射性同位素(例如121I131I35S32P14C或3H)、光散射標記(Genicon Sciences Corporation，San Diego，CA；美國專利6,214,560)、酶或蛋白標記(如GFP或過氧化物酶)、或另外的發色標記或染料(例如德克薩斯紅)來進行標記。另外，FACS或其它細胞分揀機制也可用于分離細胞。
毛囊干細胞的位置根據毛發循環而變化。在巢蛋白-GFP轉基因小鼠的毛發生長期早期，表達巢蛋白的細胞位于毛囊的永久性上部，在毛囊膨出區中緊靠脂肪腺的下方，即毛囊干細胞所在之處。毛囊膨出區的巢蛋白表達細胞相對較小、為橢圓形，并圍繞在毛發桿周圍，利用短樹突使它們彼此相連。圖3顯示巢蛋白表達細胞在毛囊中的定位是依賴毛發循環的。在毛發生長終期(實施例1和圖1)和毛發生長期早期，GFP陽性細胞即巢蛋白-表達細胞主要位于毛囊膨出區。在圖2中，表達GFP的毛囊干細胞可見于毛發生長終期和毛發生長期早期。由于來自毛發生長終期的毛囊干細胞看起來是最初級并且是局部化的，它們優選用于收獲，但可以從毛發循環的任何時期收獲細胞。
在毛發生長期的中期和晚期，GFP表達細胞位于外根鞘上部及毛囊膨出區，不在毛發基質球中。這些觀察結果表明巢蛋白表達細胞形成外根鞘，這與觀察到的毛囊干細胞行為一致。免疫組化染色結果顯示，巢蛋白、GFP、角蛋白5/8和角蛋白15共定位在毛囊膨出區細胞、外根鞘細胞和脂肪腺的基底細胞，如實施例3和圖4所示。這些數據進一步說明，毛囊膨出區的巢蛋白-GFP表達細胞是毛囊干細胞。受巢蛋白驅動的GFP還發現在囊間神經樣網絡中高表達，如圖5所示。巢蛋白在神經干細胞、毛囊干細胞和毛囊間神經樣網絡中的共同表達，表明了它們的共同來源。實施例6展示了巢蛋白-GFP干細胞向神經球的轉變，如本領域內已知，后者在適宜條件下可分化成神經細胞、星形膠質細胞及可能的其它細胞類型。
在另一方面，本發明涉及一種分離毛囊干細胞的方法，包括從哺乳動物提供或切取皮膚以及分離毛囊干細胞。優選從皮膚分離巢蛋白表達細胞，從而分離毛囊干細胞。皮膚樣品可從毛發循環的任何時期獲得。優選皮膚樣品從毛發生長終期獲得，因為據信毛囊干細胞優選定位在這一階段，因此容易收獲。盡管與這一理論無關，在毛發生長終期階段收獲細胞還能使獲得的細胞處于其最原始狀態。但如上面所討論的，巢蛋白表達細胞還發現存在于毛發生長期、毛發生長期中期和毛發生長期后期。這些細胞可以利用切取的皮膚以及如優選實施方案中的分離方法來分離，但其它分離方法也可以考慮。例如，細胞可以從受試對象原位獲得。
已發現這些分離的毛囊干細胞是多能性的或具有多潛能。因此，本發明的再一個方面涉及一種分化毛囊干細胞的方法，毛囊干細胞可在各種引導分化的選定條件下培養，并產生分化的細胞如神經元、星形膠質細胞、平滑肌細胞或角質細胞及脂肪細胞，還有其它細胞。產生神經元的培養基可包括PDGF或CNTF。用于星形膠質細胞的培養基包括如GFAP。另外，用于平滑肌組織的培養基包括如FBS。下面參考中所述的分化細胞的條件及本領域所教授的那些條件，也可用于本發明分化細胞的方法中。
移植可按本領域內所知的任何方式來完成。在一個實施方案中，毛囊干細胞或由其分化所得的細胞經系統注射方式進入受試對象體內。在另一方面，毛囊干細胞或由其分化所得的細胞，直接注入受試對象的器官或組織中。優選該器官或組織是腦、肝或與心血管系統相關的器官或肌肉，如心臟。另外，在將被移植的合成支持物上附著或生長的細胞或組織也要予以考慮。毛囊干細胞或由其分化的細胞可以異源移植入與獲得所述細胞的對象不同的受試對象中。然而，由于毛囊干細胞的易用性(accessibility)，在一個優選實施方案中，所述細胞可以從將要治療的受試對象獲得，而且如果需要，可以使其生長以提供分化細胞，然后將這些干細胞或經分化的細胞用于自體移植。也可以考慮使用毛囊干細胞庫，因為本發明中的干細胞是非常原始的(primitive)，因此在移植時宿主將不太可能排斥這些細胞。
很多報道(Mezey，E.等，Science(2000)2901779-1782；Brazelton，T. R.等，Science(2000)2901775-1779；Jiang，Y等，Nature(2002)41841-49；Krause，D.S.等，Cell(2001)105369-377；Lagasse，E.等，Nat.Med.(2000)61229-1234；Petersen，B.E.等，Science(1999)2841168-1170；Sata，M.等，Nat.Med.(2002)8403-409；Shimizu，K.等，Nat.Med.(2001)7738-741；Jackson，K.A.等，J.Clin.Invest.(2001)1071395-1402；和Orlic.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001)9810344-10349)已顯示了來源于各種組織包括骨髓、皮膚和腦等的成年干細胞的可塑性。Mezey等(前述)顯示了移植的成年骨髓細胞遷移進小鼠的腦并分化成為可表達神經元特異性抗原的細胞。Brazelton等(前述)，將標記的成年小鼠骨髓細胞注射到經過致死性輻射處理的正常成年小鼠體內，接下來觀察到了來自供體的細胞在腦中表達神經元蛋白。Jiang等(前述)報道，與稱為成年多能祖細胞或MAPC的間質干細胞共純化的細胞，其注入早期胚囊后可生成即使不是全部，也是大多數的體細胞，當其注入小鼠后，可分化成為造血譜系以及肝、肺和腸的上皮組織。Krause等(前述)顯示成年骨髓細胞可分化成肝、肺、胃腸道、以及皮膚的上皮細胞。Lagasse等(前述)報道成熟骨髓細胞注入FAH(-/-)小鼠，即一種I型酪氨酸血癥模型動物以后，恢復了該小鼠肝的生化功能。
Petersen等(前述)證明注射成年骨髓細胞可轉變為再生的肝細胞。Sata等(前述)證明骨髓細胞衍生出大多數參與小鼠動脈重建(remodeling)的平滑肌細胞(SMC)。Shimizu等(前述)使表達β-半乳糖苷酶的細胞經骨髓移植進入接受了主動脈異體移植(allograft)的個體中，結果證明內膜細胞包括骨髓來源的那些。Jackson等(前述)發現富集的造血干細胞分化成為心肌細胞和內皮細胞，并在小鼠中負責形成功能性組織。
Orlic等(前述)報道，在出現急性心肌梗塞時，細胞因子介導的骨髓細胞移位可導致顯著程度的心肌再生。
然而，Terada，N.等，Nature(2002)416542-545證明小鼠骨髓細胞在含有白細胞介素-3的體外培養中可自發地與胚胎干細胞融合。此外，自發融合的骨髓細胞接下來可以采用受體細胞的表型，這可解釋為分化。另外，最近Wagers，A.J.等，Science，(Sep 5，2002)[印刷出版前已經有電子版的公開]未能證明骨髓干細胞在體內轉化成其它細胞類型。盡管這些結果提出了對成年干細胞可塑性的擔心，但表達巢蛋白的毛囊干細胞顯示出更原始的分化并維持了其多能性。
因此，期望毛囊干細胞能提供與上述文獻中報道的干細胞相似的結果，并因此與本領域就胚胎、骨髓、腦和皮膚等其它來源的干細胞所知的一樣，可用于治療各種疾病和情況。如此，本發明的一個實施方案涉及一種治療疾病的方法，優選神經性疾病或退化性疾病，該方法包括將分離到的毛囊干細胞移植入表現該疾病的哺乳動物中。
預計，經注射或移植的本發明毛囊干細胞，在適當的條件下能分化成在腦中表達神經元蛋白的細胞，或與上述文獻中描述的體細胞類型，造血組織，心肌細胞，內皮組織，心肌組織，肝、肺、腸、胃腸管道的上皮組織，平滑肌組織，皮膚，肝組織，動脈和心血管組織相關的細胞。在一個優選實施方案中，毛囊干細胞或由其分化來的細胞，用于治療與這些器官和/或組織相關的疾病或障礙的方法中。
預計，毛囊干細胞一旦移植后，能在體內分化并修復或再生諸如肝組織、腦組織、心血管組織等組織。另一方面，毛囊干細胞在體外分化，且分化的細胞同樣可用于治療疾病如神經疾病或退化疾病。在一個更優選實施方案中，毛囊干細胞或由其分化的細胞用于治療選自下組的疾病阿爾茨海默氏病，帕金森氏病和與年齡相關的記憶力減退。另外，毛囊干細胞或由其分化的細胞可用于治療脫發或皮膚替換，或治療諸如燒傷或皮膚老化等與表皮相關的情況。此外，可用毛囊干細胞或由其分化的細胞治療的疾病或障礙還涉及心血管疾病或肝病。對其它疾病的治療如下詳述。
另外，本發明考慮利用表達系統來研究和治療下文詳述的疾病。本發明還考慮利用干細胞在體外測定毛囊干細胞的各種分化潛能。
另外，對于上面所述的具體疾病和障礙來說，可以考慮將本發明的毛囊干細胞或由其分化的細胞用于干細胞治療，以便治療細胞增生和/或分化疾病、與骨代謝相關的疾病、心血管疾病、包括內皮細胞疾病、肝疾病、或腦疾病，優選腦或肝疾病，更詳細的描述如下。
細胞增生和/或分化疾病的實例包括癌癥(cancer)，例如癌(carcinoma)、肉瘤、轉移性疾病或造血性瘤形成疾病、例如白血病。轉移性腫瘤可發生于多種原發性腫瘤類型，包括但不限于前列腺、結腸、肺、乳腺和肝來源的那些。
本文術語“癌癥(cancer)”(可與術語″增生性″和″致瘤性″交換使用)是指有自主生長能力的細胞，即以細胞的迅速增殖為特征的非正常狀態。癌癥的疾病狀況可以是病理性的，即表現或形成疾病狀態，例如，惡性腫瘤生長；或可以是非病理性的，即偏離了正常狀態而又不與疾病狀態相關，例如，與創傷修復相關的細胞增殖。該術語包括所有類型的癌癥生長或致癌過程、轉移性組織或惡性轉化的細胞、組織或器官，而不考慮組織病理學類型或入侵時期。術語“癌癥”包括各種器官系統的惡病質，例如影響肺、乳房、甲狀腺、淋巴、胃腸和泌尿生殖道的那些，還包括惡性腺癌如大多數結腸癌、腎細胞癌、前列腺癌和/或睪丸腫瘤，非小細胞肺癌、小腸癌和食道癌。術語“癌(carcinoma)”為本領域認可，是指上皮或內分泌組織的惡病質，包括呼吸系統癌、胃腸系統癌、泌尿生殖系統癌、睪丸癌、乳房癌、前列腺癌、內分泌系統癌和黑色素瘤。典型的癌包括那些由宮頸、肺、前列腺、乳房、頭部和頸部、結腸和卵巢的組織形成的癌。術語“癌”也包括肉瘤，例如包括由癌組織和肉瘤樣組織組成的惡性腫瘤。“腺癌”是指從腺體組織衍生的癌或其中腫瘤細胞形成可辨認的腺體結構的癌。術語“肉瘤”為本領域認可，是指間葉細胞衍生的惡性腫瘤。
本發明的毛囊干細胞或由其衍生的分化細胞可用于治療各種增生性疾病。這些疾病包括造血性瘤形成疾病。本文術語“造血性瘤形成疾病”包括與造血來源的增生性/瘤形成性細胞，例如從髓細胞、淋巴或紅細胞譜系、或其前體細胞生成的細胞相關的疾病。優選所述疾病起因于低分化急性白血病、如幼紅細胞白血病和急性原始巨核細胞白血病。骨髓疾病的其它實例包括，但不限于急性前髓細胞白血病(APML)、急性骨髓性白血病(AML)以及慢性骨髓性白血病(CML)(綜述于Vaickus，L.(1991)Crit Rev.inOncol.lHemotol.11267-297)；淋巴惡病質包括，但不限于急性淋巴母細胞白血病(ALL)，其中包括B-譜系ALL和T-譜系ALL，慢性淋巴細胞白血病(CLL)、前淋巴細胞白血病(PLL)、毛細胞(hairy cell)白血病(HLL)以及Waldenstrom′s巨球蛋白血癥(WM)。其它形式的淋巴惡病質包括，但不限于非-Hodgkin淋巴瘤及其變體、外周T細胞淋巴瘤、成熟T細胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)、大顆粒淋巴細胞白血病(LGF)、Hodgkin′s疾病和Reed-Sternberg疾病。
本發明的毛囊干細胞或由其分化所得細胞，可用于治療與骨代謝相關的疾病。“骨代謝”是指骨骼結構的形成或退化中的直接或間接作用，如骨形成、骨吸收等，它們能最終影響血清中鈣和磷酸鹽的濃度。該術語還包括骨骼細胞如破骨細胞和成骨細胞的活動，其導致骨骼形成和退化。例如，本發明中的毛囊干細胞或由其分化所得細胞，可用于治療骨吸收性破骨細胞的不同活性，如刺激單核細胞和單核吞噬細胞分化成為破骨細胞。因此，本發明中的毛囊干細胞或由其分化所得細胞，可以用于產生可影響骨骼形成和退化的骨骼細胞，并因此可用于治療骨骼疾病。此類疾病的實例包括，但不限于，骨質疏松、骨營養不良、骨軟化癥、佝僂病、囊性纖維性骨炎、腎性骨營養不良、骨硬化、抗驚厥治療、骨質減少、骨纖維不全發生、次級甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能減退、甲狀腺功能亢進、硬化、阻塞性黃疸、藥物誘導性新陳代謝、骨髓癌、慢性腎病、佝僂病、肉狀瘤病、糖皮質激素拮抗、吸收障礙綜合癥、脂肪瀉、熱帶口炎性腹瀉、先天血鈣過多以及牛奶熱。
本文中，與心臟有關的疾病或“心血管疾病”包括，影響心血管系統，例如心臟、血管、和/或血液的疾病或障礙。心血管疾病可由動脈壓力不平衡、心臟功能不良、或血管閉塞(如血栓引起)造成。心血管疾病包括，但不限于諸如動脈硬化、缺血再灌注損傷、再狹窄、動脈炎、脈管壁重塑、心室重塑、快速心室起博、冠狀微栓、心動過速、心搏徐緩、壓力過載、大動脈彎曲、冠狀動脈結扎、脈管心臟病、閥門疾病、心房纖維性顫動、長-QT綜合征、充血性心力衰竭、竇結官能疾病、心絞痛、心衰、高血壓、心房纖維性顫動、心房撲動、心肌病、例如擴張性心肌病或特發性心肌病、心肌梗塞、冠狀動脈疾病、冠狀動脈痙攣、缺血性疾病、心律不齊、以及心血管發育疾病(例如動脈畸形、動靜脈漏管、雷諾綜合癥、神經源性胸廓出口綜合癥、灼痛/反射交感神經營養失調、血管瘤、動脈瘤、海綿狀血管瘤、大動脈閥狹窄、房間隔缺損、房室管、大動脈收縮、埃布施泰因異常、左心發育不全綜合癥、大動脈弓斷裂、二尖瓣脫垂、動脈導管、開放性卵圓孔、局部異常肺靜脈回流、肺動脈瓣閉鎖伴隨心室隔膜缺陷、肺動脈瓣閉鎖不伴隨心室隔膜缺陷、持續性胎循環、肺部閥門狹窄、單心室、全部異常肺靜脈回流、大血管變換、三尖瓣閉鎖、動脈干、心室隔膜缺陷)。心血管疾病或障礙也包括內皮細胞疾病。
本文中，“內皮細胞疾病”包括以異常的、失控的、或不必要的內皮細胞活性為特征的疾病，例如增生、遷移、血管發生、或血管形成；或細胞表面粘附分子或血管發生相關基因，例如TIE-2，FLT和FLK的異常表達。內皮細胞疾病包括腫瘤發生、腫瘤轉移、牛皮癬、糖尿病性視網膜病、子宮內膜異位、格雷夫斯病、缺血性疾病(例如，動脈粥樣硬化)，以及慢性炎癥(例如，類風濕性關節炎)。
可以用這里描述的方法治療的疾病包括，但不限于此，與肝部纖維化組織累積相關的疾病，例如因細胞外基質的生成和降解失衡并伴隨著現有纖維的萎縮和濃縮而產生的疾病。這里描述的方法可以用于治療由多種因素引起的肝細胞壞死或損傷，所述因素包括擾亂內環境穩態的過程，如炎癥過程，由毒性損傷或變化了的肝血流量引起的組織損傷，以及感染(例如，細菌性的、病毒性的和寄生性的)。例如，所述方法可用于治療肝臟損傷，如門靜脈高壓或肝纖維化。
此外，所述方法可以應用于治療由先天性新陳代謝錯誤導致的肝臟纖維化，例如，由貯積病如戈謝病(脂質異常)或肝糖元貯積病、AI-抗胰蛋白酶缺乏引起的纖維化；調控外源物質積聚(如貯存)的疾病，如，血色素沉著病(鐵超載綜合征)和銅貯積病(威爾遜病)；由毒性代謝物(如，酪氨酸血癥、果糖血癥和半乳糖血癥)積聚和過氧化物體疾病(如，澤爾韋格綜合征)引起的疾病。此外，這里描述的方法可用于與多種化學品或藥物服用有關的肝臟損傷的治療，如氨甲蝶呤、異煙肼、酚丁、甲基多巴、氯丙嗪、甲苯磺丁脲或酒精，或表現肝臟顯性的血管疾病，如或者肝內或者肝外的膽汁流阻塞或由例如慢性心力衰竭、靜脈閉塞病、門靜脈血栓癥或巴-吉綜合征引起的肝循環改變。
涉及腦的疾病包括但不僅限于涉及神經元的疾病以及涉及神經膠質的疾病，諸如星形膠質細胞、少突膠質細胞、室管膜細胞以及小膠質細胞；腦水腫、顱內壓升高和形成氙、以及腦積水；畸形和發育疾病如神經管缺陷、前腦異常、后窩異常、以及脊髓空洞癥和脊髓積水；圍產期腦損傷；腦血管疾病如那些涉及缺氧、局部缺血、以及梗塞、包括血壓過低、低灌注和低流速狀態-球形腦局部缺血和焦點腦局部缺血-來自局部供血疾病的梗塞、顱內出血、包括腦內(實質內)出血、蛛網膜下出血和漿果樣動脈瘤破裂、以及脈管畸形、高血壓腦血管疾病、包括腔隙梗塞、裂隙出血、以及高血壓腦病；感染如急性腦膜炎、包括急性化膿性(細菌)腦膜炎和急性無菌性(病毒)腦膜炎、急性焦點化膿性感染、包括腦膿腫、硬膜下積膿癥、以及硬膜外膿腫、慢性細菌腦膜腦炎、包括肺結核和分支桿菌、神經梅毒、以及神經疏螺旋體病(萊姆病)、病毒性腦膜腦炎、包括節肢動物來源(Arbo)的病毒腦炎、I型單純皰疹病毒、II型單純皰疹病毒、帶狀水痘病毒(帶狀皰疹)、巨細胞病毒、脊髓灰質炎、狂犬病、以及人類免疫缺陷病毒1、包括HIV-1腦膜腦炎(亞急性腦炎)、空泡脊髓病、AIDS-有關的肌病、外周神經病、以及小孩中的AIDS、進行性多病灶腦白質炎、亞急性硬化全腦炎、真菌性腦膜腦炎、其它神經系統的傳染性疾病；可遺傳的海綿狀腦病(朊病毒疾病)；脫髓鞘疾病、包括多發性硬化癥、多發性硬化癥變體、急性彌散型腦脊髓炎以及急性壞死性出血腦脊髓炎、以及其它有脫髓鞘現象的疾病；退化性疾病、如影響腦皮質的退化性疾病、包括阿耳茨海默氏病和Pick疾病、基本神經中樞和腦干的退化性疾病、包括帕金森病、先天帕金森疾病(agitans麻痹)、進行性核上癱瘓、皮質基層的退化、多重系統萎縮、包括紋狀體黑質變性、ShyDrager綜合癥、以及橄欖體腦橋小腦萎縮癥、和Huntington疾病；脊髓小腦退化、包括脊髓小腦共濟失調、包括Friedreich共濟失調、以及毛細管擴增共濟失調、影響運動神經元的退化性疾病、包括肌萎縮側面硬化癥(運動神經元疾病)、脊柱球萎縮(Kennedy綜合癥)、以及脊柱肌肉萎縮；先天性新陳代謝偏差、如腦白質營養不良、包括Krabbe疾病、異染性腦白質營養不良、腎上腺白質營養不良、佩-梅病疾病、以及Canavan疾病、線粒體腦脊髓疾病、包括Leigh疾病和其它線粒體腦脊髓疾病；中毒和獲得性新陳代謝疾病、包括維生素缺陷如硫胺素(維生素B1)缺陷和維生素B12缺陷、新陳代謝疾病造成的神經后遺癥、包括低血糖癥、高血糖癥、以及肝腦病、中毒性疾病、包括一氧化碳、甲醇、乙醇、以及輻射、包括混合的氨甲蝶呤和輻射誘導傷害；腫瘤、如神經膠質瘤、包括星細胞瘤、包括原纖維(擴散)星細胞瘤和多形性成膠質細胞瘤、纖維狀細胞星細胞瘤、多行性黃色星細胞瘤、以及腦干神經膠質瘤、少突神經膠質瘤、以及室鼓膜瘤和有關的心室旁大面積損傷、神經元瘤、缺乏分化瘤、包括成神經管細胞瘤、其它實質瘤、包括初級腦淋巴瘤、病菌細胞瘤、以及松果腺實質瘤、腦膜瘤、轉移性腫瘤、伴瘤形成綜合癥、外周神經鞘腫瘤、包括神經鞘及纖維神經瘤、以及惡性外周神經鞘瘤(惡性神經鞘)、以及神經皮膚綜合癥(斑痣性錯構瘤病)、包括神經纖維瘤病、包括I型神經纖維瘤病(NF1)和2型神經纖維瘤病(NF2)、結節硬化癥、以及Von Hippel-Lindau病。
下面的實施例目的在于說明而不是限制本發明。
實施例1對毛發生長終期巢蛋白-表達細胞的觀察 巢蛋白是一種中間絲(IF)基因，是中樞神經系統(CNS)組細胞和神經上皮干細胞的標記(Lendahl，U.等，Cell(1990)60585-596)。攜帶受巢蛋白第二內含子增強子控制的強化綠色熒光蛋白(EGFP)的巢蛋白-EGFP轉基因小鼠，可用于研究和觀察CNS干細胞的自我更新和多能性(Lendahl等，(supra)；Zimmerman，L.等，Neuron(1994)1211-24；and Kawaguchi，A.，Molecular and Cellular Neuroscience(2001)259-273)。我們在巢蛋白-EGFP小鼠中觀察到，巢蛋白在毛囊干細胞以及毛囊間神經樣網絡中強表達。
對毛發生長終期的巢蛋白-GFP皮膚樣品，使真皮朝上、表皮朝下，在配有熒光鏡片的尼康熒光顯微鏡下直接觀察。另外，使用固定在尼康Optiphot上的MRC-600共聚焦圖像系統(Bio-Rad)，用10XPlanApo物鏡，對這些皮膚樣本進行共聚焦顯微鏡觀察。結果發現，巢蛋白表達細胞僅僅出現在毛囊膨出區中以及毛發生長終期的毛囊的永久性上部、正好位于脂肪腺之下，并且在這些部位為優勢群體(圖1)。這些細胞相對較小、為紡錘形、橢圓形或圓形(圖2)。
實施例2毛發循環中巢蛋白表達細胞的比較 我們觀察到巢蛋白表達細胞的定位是依賴毛發循環的。為了確定這些巢蛋白-GFP-表達細胞是如何與毛囊發育相關聯的，將7-8周齡、處于毛發生長終期的小鼠通過脫毛來誘導毛發生長期。分別在將要脫毛前(毛發生長終期)，以及脫毛后1、2、3、4和5天(毛發生長期早期)、8和10天(毛發生長期中期)、15和16天(毛發生長期晚期)、19和20天(過渡期)，從背部皮膚切取皮膚樣品(5×5mm2)。如上面所提到的，在毛發生長終期，毛囊中的巢蛋白表達細胞僅位于毛囊膨出區的永久性上部。當新的毛發循環被誘導后，毛發生長期毛囊開始生長。在脫毛兩到三天后，表達巢蛋白的新毛囊細胞直接從位于膨出區的巢蛋白-GFP-表達細胞增殖。在毛發循環處于再生期的中期和晚期時，表達巢蛋白的毛囊細胞特異性定位于外根鞘上部三分之二處，而在毛囊或毛發基質球的下部三分之一沒有表達。表達巢蛋白的外根鞘細胞在整個毛發生長期和過渡期期都可觀察到。在過渡期，當毛發球基質細胞經受衰退和退化時，外根鞘巢蛋白-GFP-表達細胞存留下來并隨著毛囊的收縮而減少，最終在新的毛發生長終期到來時發現僅存在于毛囊膨出區(圖3)。
膨出區巢蛋白-GFP-表達細胞在毛發循環中的動力學循環模式強烈提示它們是毛囊干細胞，并首次提供了活干細胞形成新毛囊結構的直接證據。通過在毛發循環期間跟蹤巢蛋白-GFP表達細胞，我們的觀察證實膨出區細胞實際上形成了毛囊結構。我們的結果被其它人的發現有力支持。最近，Oshima等.(上述)報道，成年小鼠觸須囊外根鞘的上部區域含有多能干細胞，它們能夠應答形態信號來產生復毛囊、脂肪腺和表皮。這些發現與我們對根鞘外部巢蛋白-GFP-表達的觀察一致。
實施例3巢蛋白-表達毛囊干細胞的進一步鑒定 為了進一步鑒定這些巢蛋白-GFP-表達型毛囊干細胞，在石蠟包埋的野生型C57B16和巢蛋白-GFP轉基因小鼠皮膚中，通過免疫組化測定巢蛋白(1∶80，Rat401，DSHB，University of Iowa，Iowa City，IA)、GFP(1∶100，Boehringer Mannheim)、角蛋白5/8(1∶250，Chemico International，Temecula，CA)以及作為毛囊干細胞潛在標記之一的角蛋白15(1∶100，ChemicoInternational，Temecula，CA)的共定位。免疫組化染色使用了DAKO ARKanimal research kit或DAKO EnVision Doublestain System以及色素原DAB(3，3-二氨基聯苯胺)或核固紅。免疫組化染色結果(圖4)說明，巢蛋白、GFP、角蛋白5/8和角蛋白15共定位在毛囊膨出區細胞、外根鞘細胞和脂肪腺基底細胞中。這些數據進一步證明毛囊膨出區的巢蛋白-GFP-表達細胞是毛囊干細胞。
我們還觀察到整個皮膚層中巢蛋白-表達細胞的“神經樣”三維網絡，所述皮膚層包括聯系著毛囊的表皮、毛囊、真皮、皮下和肉膜(圖5)。這些細胞的真實特點和功能還需進一步證實。因此，巢蛋白在毛囊干細胞及毛囊間神經樣網絡中的表達，提示與神經干細胞的相關性。
實施例4毛囊干細胞的分離 為了進一步鑒定這些巢蛋白-GFP表達型毛囊干細胞是否多能干細胞，我們分離了毛囊膨出區的巢蛋白-GFP-表達干細胞，并對它們進行了體外培養。將毛發生長終期的巢蛋白-GFP轉基因小鼠皮膚樣品切下并切碎。接著將切碎的組織用胰蛋白酶(0.25％)、膠原酶(0.4％)和分散酶(1.0％)的混合物在37℃消化2小時。在配有熒光鏡片的解剖顯微鏡下，分離出毛囊膨出區中帶有巢蛋白-GFP表達細胞的單個毛囊。然后在熒光解剖顯微鏡下，進一步用精細的注射器分離出毛囊膨出區的巢蛋白-GFP表達細胞。
實施例5干細胞的生長 將來自毛囊膨出區的巢蛋白-GFP-表達細胞轉移至沒有補加生長因子的M21培養基，該培養基是用來培養神經球的典型的神經維持培養基(Uchida，N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)9714720-14725)。12天后出現神經球樣集落。在另一個實驗中，從毛囊膨出區分離的巢蛋白-GFP-表達細胞以10細胞/mm2生長于含有甲基纖維素(1.2％)的神經干細胞培養基中，并每兩天補加表皮生長因子(EGF)(20ng/ml)、成纖維細胞生長因子(FGF)(20ng/ml)和白血病抑制因子(Lif)(10ng/ml)。當球在培養基中出現后，將其轉移至新的無甲基纖維素的培養板中。從初級球產生了次級球。接下來對這些球的分化潛力進行檢測。
實施例6分化培養試驗 將球接種在多鳥氨酸/層粘連蛋白包被的培養板上，在分別存在胎牛血清(FBS)(5％)、腦源神經營養因子(BDNF)(10ng/ml)、血小板衍生生長因子(PDGF)(10ng/ml)和睫狀神經營養因子(CNTF)(10ng/ml)的Dulbecco′s改良型Eagles培養基(DMEM)-F12上培養。然后，這些細胞用針對神經元(β-III微管蛋白，1∶500，Promega)、星形膠質細胞(GFAP，1∶300，Sigma)、平滑肌細胞(SMA，1∶300，Sigma)和角質細胞(Pan-keratin，1∶100，Sigma)的標記進行免疫化學染色來分析。脂肪細胞通過目測觀察來確定(圖6)。
在有BDNF時生長的球對β-III微管蛋白和GABA具有免疫反應性，表明存在神經元。在有PDGF時生長的球主要產生神經元，有時產生GFAP陽性細胞，表明存在星形膠質細胞。在有CNTF時生長的細胞僅產生β-III微管蛋白陽性細胞，表明為神經元。所有在FBS存在下生長的球分化成為平滑肌肌動蛋白(SMA)陽性細胞，少數為角質細胞。
基于我們的觀察和實驗數據，我們得出結論1)巢蛋白-GFP表達證明膨出區細胞是毛囊干細胞。這是首次證明膨出區細胞實際上有干細胞功能。2)毛囊干細胞表達巢蛋白的事實提示它們與神經干細胞有關。3)毛囊通過表達巢蛋白-GFP-的神經樣網絡相聯系。4)毛囊干細胞在適當的條件下可以形成包括神經元細胞在內的多種細胞類型，提示它們在體內有形成腦細胞的潛能。
權利要求
1.分離的毛囊干細胞。
2.權利要求1的分離的毛囊干細胞，其中所述細胞表達巢蛋白。
3.分離權利要求1所述毛囊干細胞的方法，包括從含有毛囊的皮膚分離毛囊干細胞。
4.權利要求3的分離毛囊干細胞的方法，其中的皮膚被切取；且分離步驟進一步包括從毛囊中分離巢蛋白表達細胞，從而分離毛囊干細胞。
5.權利要求3的方法，其中的皮膚是毛發生長終期的皮膚。
6.權利要求3的方法，進一步包括在培養基中培養該毛囊干細胞，以便產生分化的細胞。
7.權利要求3的方法，其中的培養基包含FBS、BDNF、PDGF或CNTF。
8.權利要求6的方法，其中分化的細胞是神經元、星形膠質細胞、平滑肌細胞或脂肪細胞。
9.權利要求4的方法，其中的巢蛋白與綠色熒光蛋白相連。
10.一種治療疾病的方法，包括將權利要求1的干細胞或由其分化所得的細胞移植入表現該疾病的哺乳動物中。
11.權利要求10的方法，其中的疾病是神經性或退化性疾病。
12.權利要求10的方法，其中的移植步驟進一步包括將干細胞通過系統性注射方式注射到哺乳動物中。
13.權利要求10的方法，其中的移植步驟進一步包括直接將細胞注入哺乳動物的器官或組織中。
14.權利要求13的方法，其中的器官或組織是腦、肝或心血管組織。
15.權利要求10的方法，其中的疾病選自阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、與年齡相關的記憶力減退、脫發、燒傷、皮膚老化以及皮膚替換。
16.權利要求10的方法，其中的干細胞是自體細胞。
17.權利要求10的方法，其中的干細胞是異源細胞。
18.分化的細胞，其是從權利要求1的毛囊干細胞分離得到的。
19.權利要求18的分化細胞，它是在體外分化的。
全文摘要
毛囊干細胞是通過分離巢蛋白表達細胞的手段從哺乳動物中分離得到的。這些毛囊干細胞是用于同源或異源干細胞治療的成熟干細胞來源之一。這些干細胞可以系統性地移植入哺乳動物或直接移植入器官。另外，該干細胞可以在體外進一步分化，然后系統性地或直接移植入哺乳動物。
文檔編號C12N15/09GK1589103SQ02823052
公開日2005年3月2日 申請日期2002年9月20日 優先權日2001年9月20日
發明者李伶娜, 楊萌 申請人:抗癌公司