專利名稱：使用磁性膠態顆粒檢測分析物的方法
技術領域：
本發明涉及用于檢測液體、生物或合成樣品中至少一種分析物的方法，包括將所述物質與類似凝集劑的試劑偶聯。
背景技術：
迄今，已提出了許多“凝集”方法。它們主要用于檢測抗原和/或抗體以進行診斷。這些方法尤其適用于生物分析鑒定(驗孕、凝固試驗)或者診斷傳染病。然而，這些方法通常具有有限的靈敏度。事實上，這些試驗的一般原理在于檢測有分析物的情況下膠態顆粒凝膠的形成。在這類試驗中，分析物必須能夠附著兩種膠態顆粒，這些顆粒的表面覆蓋有識別待檢測分析物(廣義上說)的分子。
更具體地，本發明基于使用磁性顆粒作為膠體凝集劑。
磁性顆粒已用于生物分離技術或診斷檢測技術(WO 94/09368；EP180 384；WO 98/51435)。磁性分離速度快并且易于實施，需要的設備簡單。使用覆蓋有識別待捕獲分析物的分子的磁性顆粒，可以在磁力作用下將分析物從復雜混合物中分離。例如，使用該方法有益于“ELISA”測定(酶聯免疫測定)。所用的磁性顆粒將磁性材料(例如磁鐵礦、鐵氧體、氧化鉻或氧化鎳)加入基質(通常為有機基質)中。使用抗原、半抗原或抗體類型的反應基團對它們的表面進行官能化，以使其與待分離的反應物反應。
為了避免與剩磁有關的問題，通常超順磁材料比傳統鐵磁性材料優選。鐵磁流體，具有高的磁化度和飽和度(大于100mT)并且在沒有外來磁場的情況下不顯示任何剩磁，它們是用于超順磁膠體方法的良好候選物。
本發明旨在在磁場的作用下利用這些磁性膠體所示的能力形成特定的結構組織。
在這種情況下，磁場誘導的凝集作用(根據膠體的體積份)產生單獨“鏈”或稱作“簇”的鏈組。本文后面將鏈或簇無差別地稱作鏈。關于這些結構及其形成的詳細文獻在許多出版物中都可以找到。
換句話說，在沒有磁場的情況下，這些顆粒呈分散態。在有磁場的情況下，它們在水溶液中組裝成顆粒鏈。當然，這些鏈是可逆的，并且當除去磁場之后，在熱攪拌的作用下它們快速解開。有利地，如果這些顆粒足夠小，并因此作布朗運動和可極化的話，這些鏈將沿施加其上的磁場的軸快速形成，并且它們對重力不敏感。這種現象圖示于
圖1A。圖1B顯示了這些顆粒在磁場中形成的鏈的顯微照片。
本發明人已出人意料地證實，可以利用磁性膠態顆粒在磁場的作用下快速組裝成顆粒鏈的能力來檢測和/或定量液體介質中的特定物質，。
在這種情況下，當這些磁性膠態顆粒的表面上覆蓋有特異性配體，并且它們分散于其中的連續相含有能夠與至少兩個特異性配體反應的物質時，所述物質將在磁場的催化作用下附著到所述磁場誘導鏈內的兩個相鄰的不同顆粒上。磁場除去之后，附著有所述物質的顆粒被牢固地組裝在永久鏈內，并由此指示在所分析的介質中存在目標物質。
更具體地說，本發明首先涉及一種檢測和/或定量液體介質中的至少一種分析物的方法，其特征在于使用磁性膠態顆粒，所述磁性膠態顆粒的表面用所述待檢測和/或測定的分析物的至少一種特異性配體進行官能化，并且其特征還在于它包括1、將所述顆粒與所述介質接觸，2、對所述介質施加一磁場，其強度足夠使所述磁性顆粒組裝成鏈狀，3、將所述磁場保持足夠時間，以使所述分析物與至少兩個分別存在于鏈的兩個相鄰顆粒上的特異性配體偶聯或結合，4、去除磁場，和5、檢測所述分析物是否存在，并根據情況，通過所述液體介質中是否存在所述恒定的磁性膠態顆粒鏈來檢測其濃度。
應注意的是，所列的這些步驟的順序相當于本發明的優選實施方式，但是在本發明的上下文中，也可以不同順序實施它們，例如在加入待分析的介質之前激活磁場。
在本發明的上下文中，也可以收集由待檢測、測定和替換的分析物連接的磁性膠態顆粒。
在本發明的上下文中，可以使用各種不同的磁場和磁場梯度幾何形狀，也可以使用各種不同幾何形狀的“凝集池”。根據情況，這些不同的幾何形狀易于使配體-受體締合的速度以及恒定鏈的檢測最佳化，所述恒定鏈可以隨條件的不同在長度和粗細方面有很大的不同。具體地說，本發明包括微流體設備，它使得通道的寬度或高度小于100μm。可以使用與通道軸垂直和平行取向的磁場。
有利地，該方法可用于診斷工具中，例如分析設備中。特別優選自動化分析設備。
至于這些恒定鏈的具體表征，可以有利地通過對待分析介質的簡單顯微測定來進行。然而，尤其是當使用自動化分析設備時，優選對這些鏈的存在進行光學檢測。因此通過測定光散射(例如通過光度測定法和濁度測定法)可以檢測鏈的存在。另一種方法是處理捕獲的圖像，例如通過CCD照相機。這種方法的優點在于能夠對這些鏈的大小作細微分析。任何適宜的光源(優選激光)都可用于這些檢測方法。
當然，與傳統凝集物相似，鏈的形成首先取決于待分析的介質中分析物的濃度，其次取決于顆粒的濃度。可以直觀地認為，所述介質中存在的分析物越多，鏈越長，并且顆粒濃度越高，鏈越粗，并且與聚集物更相似。因此本發明證實可以通過對組裝成恒定鏈狀的磁性顆粒的密度的定量來確定分析物的濃度。這種密度測定可以通過常規技術進行。因此對給定的分析物可以預先建立參照校準。
所述方法在靈敏度方面特別有益。因此證實其對檢測液體介質中低濃度的分析物是有益的。
正如下面實施例中所示，使用相同的配體-受體偶聯對(生物素-抗生蛋白鏈菌素)進行，以抗原分析物為例，當分析物的濃度數量級是10-9mol/l時，本發明鏈狀物持久存在，而傳統凝集測定的檢測限則為10-5mol/l。有利地，當使用相同的抗原-抗體偶聯對，并在沒有磁場的情況下，這一濃度閾值低于傳統凝集測定中聚集物持久存在和形成凝膠所需的濃度閾值。
因此所述方法有利地替代了傳統凝集測定，并且大大增加了測定的靈敏度。
為了本發明的目的，術語“膠體”是指顆粒大小在5-10000nm之間，更優選在100-500nm之間。然而，特別有利地是優選使用盡可能小的顆粒，與此同時還要保證它們具有足夠的磁化率，使它們能夠在磁性偶極力和布朗運動的結合作用下立即凝集。通常，當磁性材料(通常是包封的氧化鐵)的量最大時，粒徑不大于幾微米，優選約0.1-0.5微米就達到這種平衡。
為了上述原因，優選使用超順磁的膠態顆粒。
有幾種不同方法可以生產具有本發明所需質量的超順磁膠態顆粒。例如用含水鐵氧流體與天然或合成的聚合物共沉淀，或者在有機相中用鐵氧流體乳化。
以控制方式獲得這類膠體材料的優選工藝是基于乳化然后聚合并枝接的原理。這些乳液尤其可以通過將由有機鐵氧流體和冨含表面活性劑的水相組成的混合物剪切制得。選擇鐵氧流體，以便其有機相微溶于水相中。在這種情況下，每一液滴轉變成包含磁性材料(優選磁性氧化鐵(磁赤鐵礦))的納米顆粒的球狀聚集體，其中在每一液滴中約有60體積％的氧化鐵。通過加入疏水單體(例如苯乙烯)將由此獲得的顆粒聚合，這樣在這些液滴內發生反應。在聚合作用結束時加入水溶性功能單體使得表面官能化。通過乳化和聚合這兩個操作獲得冨含氧化鐵并且涂布有經過聚合和官能化的層的球形顆粒。就該乳液的制備而言，尤其可以參考J.Bibette在J.Magn.and Magn.Mat.V.122，p.37(1993)和T.Mason和J.Bibette在Phys.Rev.Lett.77，3481(1996)以及WO 97/38787和FR 2800836中公開的方法。
有利地，加入的磁性材料選自氧化鐵、氧化鈷或者最終分開并穩定的金屬，并且優選磁赤鐵礦。以40體積％，并優選60％的比例將磁性材料加入到這些顆粒內。根據本發明的一個優選方案，基本磁性材料是鐵氧流體。
根據傳統工業方法，由于由此獲得的磁性膠態顆粒可以兼容固定在其表面的大量配體，因此它們是特別有益的。
有益地，它們可以與各種特異性配體混合以將它們轉化成特別適用于本發明所述的免疫測定和凝集測定的試劑。
所述配體分子可以通過吸附相互作用、共價相互作用和/或高親合力相互作用固定到磁性膠態顆粒的表面上。
例如，可以使用顆粒表面上存在的化學反應基團進行共價偶聯。更具體地說，這些基團可以是羧基、氨基、醛和環氧基團。當將要表征的分析物是一反應活性化學物質時，這些基團本身能夠起到目標分析物的特異性配體的作用。
至于通過高親合力相互作用獲得的固定，通常是借助如下高親合力鍵合偶聯的兩個成對物(聚)碳水化合物/electin；生物素或生物素化的化合物/抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素、蛋白受體及其特異性配體；和半抗原/抗體等。
最后，配體與顆粒表面的附著可以直接進行，或者可以使用間隔單元來進行，也稱之為使用術語“連接物”和“間隔物”。
借助這些共價或高親合力相互作用可以固定天然或合成的配體，例如肽；包括糖蛋白、脂蛋白和其它類似或衍生結構的自由或絡合形式的蛋白質；免疫球蛋白；核酸，如DNA或RNA及其同源物；糖類如單糖或二糖、低聚糖和多糖；脂類；激素；受體；代謝物和其它生物物質。
可以通過所述方法檢測和/或測定的分析物優選為可以高親合力特異性地與本發明的官能化顆粒相互作用的物質。因此它們可以是可通過免疫反應檢測到的抗原和抗體，或者可以通過雜交反應檢測的核酸，并且更一般地是所有類型的蛋白質。
優選，這些分析物在待分析的介質中的擴散系數至少等于所述顆粒的擴散系數。
待鑒定的分析物可以天然形式以相同方式與兩個不同配體(例如抗原和抗體，它們通常具有幾個締合位點)反應。
在相反情況下，在采用所述方法之前對待分析的介質進行預處理，以便使分析物對其特異性配體之一的至少兩個分子具有反應活性。這種預處理尤其可以是用上面討論的“高親合力”偶聯成對物之一的至少一個分子官能化該分析物。這種預處理的實施在本領域技術人員的能力的范圍內。
本發明的第一個實施方式涉及檢測和/或定量液體樣品內抗體型的分析物諸如針對病毒、細菌或原生動物和其它感染劑的病原體的抗體；腫瘤抗體；針對變應原的抗體或者自身抗體。
本發明的第二個實施方式涉及檢測和/或定量抗原，如自由抗原，例如血蛋白和諸如凝血因子的因子、代謝物、激素或介體；或者與載體相連的抗原，例如微生物的表面抗原、膜結合的受體；血型抗原和主要組織相容性系統的抗原等。
所述方法還可用于檢測和/或定量非生物分子，例如任意天然或人造藥物，應理解為所討論的藥物對一配體可以直接具有雙重親合力。如果不是這種情況，必須通過締合預處理使這類分析物相對設計的配體為二價。本發明在分析和微量分析化學中尤其有用。
根據本發明的一個具體實施方式
，幾種不同的磁性膠態顆粒可以在同一測試中用作凝集劑。當分析物易于與兩種配體發生反應時這可能是有益的。而且，本發明所用的膠態顆粒可以帶有第二標記。
由于這種標記能夠將第二模式的檢測與顯微觀察檢測結合起來，或者能夠簡單地改善顯微觀察檢測，因此它是有益的。這種附加的標記尤其可以通過肉眼、光學、機械和/或電方法表征。根據本發明的這一實施方式，鏈的表征可以通過顯微觀察直接進行，或者根據所選標記的性質通過光學、機械和/或電方法間接進行。適用于本發明的標記，尤其可以提到的有彩色顏料、熒光劑或磷光劑。
待分析的液體介質可以是合成或天然的，例如生物流體。它們尤其可以是體液，例如血液(全血或部分血)、血清、血漿、尿或腦脊髓液，它們可以稀釋或未稀釋的形式使用。
至于磁場，可以通過本領域技術人員已知的各種方式產生，例如赫姆霍茲線圈、電磁鐵或永久磁鐵。
所施加的連續磁場通常為1-500mT，優選1-100mT。
施加基本上均勻的磁場通常是有益的。產生這種磁場的簡單方法是在“凝集”區的任一側分別放置永久磁鐵或電磁鐵的兩極(北極和南極)。另一種方式是用電流發生器磁化的赫姆霍茲線圈構建一具有基本上為環狀和同心軸通道。
根據本發明的一個優選實施方式，施加振蕩(交變)磁場。
振蕩磁場能夠增加待檢測的分析物處于分別存在于兩個顆粒的兩個特異性配體附近的可能性。在每一磁場循環中，顆粒可以彼此締合以便形成或延伸鏈，并且不會影響已經形成的鏈。因此這意味著能夠實現官能化磁性膠態顆粒的配體與待檢測分析物之間的反應。
因此可以檢測低濃度的分析物，由此獲得具有較好靈敏度的測定。
然而，應注意的是，本發明的一些用途可能需要非均勻的磁場。具體地說，可以使用能夠對顆粒進行凝集的磁場和能夠在精確位置將鏈濃縮的磁場梯度。該磁場及其梯度都可以同時或單獨操作。因此，可以首先濃縮分析物，然后通過形成足夠大小的聚集體來觀察它們。在為本發明內容的一部分的其它應用中，優選在微流體通道內進行凝集。例如(E.M.Lawrence等人，Int.J.of Modern Phys.B，8，2765-2777，1994)已知冨含磁性顆粒的柱或鏈的直徑和間隔取決于磁場和池的厚度。因此可以選擇最適合所需應用的凝集條件。
加入待分析介質的手段包括-采用一個或多個沉積樣品的凹口或“孔”，如凝膠電泳中的，“Electrophoresistheory，techniques and biochemical and clinicalapplications，A.T.Andrews，Oxford University Press，NY 1986”，-或者采用過壓或減壓系統，如毛細管電泳中的，例如參見“Capillary Electrophoresis”，P.D.Grossman，J.C.Colbum published byAcademic Press，San Diego，CA，USA，1992)，-或者采用一通道，經過它滴流樣品連續溢出，如液體靜脈中的電泳，-或者采用一種用于色譜分析的進樣方法(“Chromatographie enphase liquide et supercritique”[液相色譜和超臨界色譜法]，R.Rosset，M.Caude，A.Jardy，巴黎，Masson出版，1991；“Practical High PerformanceLiquid Chromatography”，V.R.Meyer，John Wiley出版，Chichester，NY，USA；“Chromatography of polymers”，T.Prodver，由華盛頓特區的ACS出版公司出版，1993)，
-或者使用樣品池或其它容器，例如自動化分析設備中常用的。
在其最簡單的實施中，按照以下方案進行試驗，并在此基礎上，容易想到許多其它方案。
將具有上述性能的膠態顆粒上枝接待測抗原的特異性抗體。為了清楚起見，在本說明書中考慮抗生蛋白鏈菌素-生物素配體-受體的偶聯。由于抗生蛋白鏈菌素被枝接在這些顆粒上，因此待檢測的抗原例如是其兩端枝接有生物素分子的小聚乙二醇聚合物。如果足量的該抗原以1％或更大的體積份與所述顆粒混合，那么正如傳統凝集測定所預期的，可以在幾秒鐘，或者甚至幾分鐘內便可看到凝膠形式的凝集。C*是傳統檢測方法的抗原濃度檢測限，低于該值時，在傳統方法中檢測不到凝集。
在本發明的試驗中，將0.1體積％的顆粒與濃度C(計作C*/x)遠低于C*的抗原混合，將該混合物吸入矩形橫截面(厚度為20-50μm)的毛細管內并與毛細管軸平行地施加一磁場。可以通過放置在毛細管兩側的兩個磁鐵施加該磁場。該磁場保持2分鐘，強度例如為至少500高斯。然后用顯微鏡觀察該毛細管，以便檢測鏈或聚集體的存在。
因此通過生物素-抗生蛋白鏈菌素的實例可以發現，在低達C*/1000的抗原濃度下也可以通過磁場凝集檢測聚集體。
所述方法對檢測特別有益，并且在適當情況下，可以定量微流體中的至少一種分析物。在該具體實施方式
中，可以在微流體系統的一個進行磁性凝集，并在另一區域進行檢測。這種實施方式尤其有益地適用于將顆粒的恒定鏈與沒有經過凝集的顆粒分離。
本發明方法的特別有益的應用包括多標準分析，用于在同一測量中同時檢測幾種分析物。
根據該實施方式，同時使用多種官能化磁性膠態顆粒。每一種顆粒用至少一種待測定分析物的特異性配體官能化。
然后施加振蕩磁場，使得逐漸形成由每一分析物的同種特異性顆粒構成的鏈。
為了能夠區分它們，并因此使測定結果能夠讀出，各種磁性膠態顆粒帶有針對每一待測定的分析物的特異性第二標記。
本發明還涉及一種檢測液體介質(優選生物流體)中至少一種分析物的試劑盒，其特征在于它包含至少一種表面用所述至少一種分析物的至少一種特異性配體官能化的磁性膠態顆粒。
下面通過實施例并參照附圖更清楚地描述本發明，這些附圖顯示了圖1在磁場下形成磁性膠態顆粒鏈的原理示意圖和顯微照片。
圖2除去磁場之后含有枝接磁性膠態顆粒和生物素化BSA的溶液的顯微照片。
圖3顯示了在磁場下以及除去磁場之后磁性膠態顆粒鏈的平均長度作為溶液內生物素化BSA的濃度的函數的圖。
圖4A顯示了0％稀釋(對照)的實施例2的溶液的顯微照片；圖4B顯示了0.1％稀釋的實施例2的溶液的顯微照片；圖4C顯示了1％稀釋的實施例2的溶液的顯微照片；圖4D顯示了100％稀釋的實施例2的溶液的顯微照片；實施例1使用磁性膠態顆粒檢測分析物本實施例描述了得自生物素/抗生蛋白鏈菌素高親合力偶聯的模型分析物的檢測并且旨在表征本發明方法對給定分析物的靈敏度域值。分析物為生物素，并將抗生蛋白鏈菌素枝接在膠態顆粒上。
更具體地說，生物素化分析物是由分子量為5000的聚乙二醇聚合物構成，在其兩端枝接有生物素分子。這些產品可商購獲得(Shearwater USA)。
預先獲得枝接抗生蛋白鏈菌素的超順磁膠態顆粒。這些膠態顆粒是按照J.Bibette的J.Magn.and Magn.Mat.V.122，p.37(1993)和F.Leal Calderon、T.Stora、O.Mondain-Monval、P.Poulin和J.Bibette、Phys.Rev.Lett.，72，2959(1994)公開的步驟或者按照T.Mason和JBibette的Phys.Rev.Lett.77，3481(1996)以及WO 97/38787中公開的步驟獲得。這些顆粒的聚合是按照申請FR 2800836中所述的方法獲得的。抗生蛋白鏈菌素在羧基位置的枝接對本領域技術人員來說為公知。可以參考Molday RS、Dreyer WJ、Rembaum A、Yen SP、J CellBiol 1975年1月；64(1)75-88和Staros JV、Wright RW、Swingle DM、Anal Biochem.1986年7月；156(1)220-2。
在磁場下的凝集試驗包括將枝接有抗生蛋白鏈菌素的磁性膠態顆粒與“PEG-生物素”分析物混合。選擇的檢測方法是在顯微鏡下直接觀察。
對10-4-10-2的給定顆粒濃度(以體積φ計)，改變分析物的濃度C以檢測該測量的靈敏度極限。
對每一測量而言，將所述混合物吸入厚度為50微米的扁平毛細管，將其放置在兩個平面磁鐵之間，這樣產生的磁場大于約50mT并且與毛細管的軸平行。該磁場由市售平面磁鐵產生。將磁場施加2分鐘并在沒有磁場的情況下在顯微鏡下觀察毛細管。當在顯微鏡下可以看到有鏈和聚集體(參見圖2)時，該檢測為陽性，當在熱攪拌作用下顆粒立即再次分散時，該檢測為陰性。
根據該實施方式的發現，分析物濃度降低至10-9mol/l時，本發明方法檢測結果仍然為陽性。而作為對照，當分析物濃度低于10-5mol/l，傳統凝集檢測是不可能進行的。
在一補充研究中，測得鏈的平均長度為待測定的分析物(生物素化的BSA，8-12生物素/BSA)的濃度的函數。圖3顯示了在10mT的磁場中30分鐘之后鏈的平均長度(實線)以及在沒有磁場下24小時之后鏈的平均長度(虛線)，橫坐標為生物素化的BSA的濃度。
注意到，使用磁場可以快速檢測濃度低至10-9mol/l甚至更低的分析物，這說明靈敏度比目前銷售的測量方法的高。
此外，注意到形成的鏈的平均長度隨分析物濃度的增加而增加。因此，本發明的方法也能夠通過測定鏈的平均長度來定量測定待測定的分析物。
實施例2枝接有抗-vWF免疫球蛋白G(IgG)的磁性膠態顆粒的制備和von Willebrand因子的檢測制備200μl在磷酸鹽緩沖液中的膠態顆粒溶液(20mM，pH7.2)，它含有1體積％的磁性膠態顆粒(直徑為206nm，可從法國Ademtech獲得)。
為了激活這些顆粒，向該溶液中加入200μl的0.01g/l 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDAC)水溶液，并在44℃下將混合物持續攪拌20分鐘。然后用0.001％的吐溫20水溶液洗滌除去過量的EDAC。
接下來，通過將400μl激活的膠態顆粒溶液加入到400μl的IgG溶液(1.7μl IgG以20mg/ml于398μl水中)中將IgG枝接到膠態顆粒上。在44℃下將該溶液持續攪拌20分鐘，然后在室溫下保持10分鐘。
然后用飽和緩沖液沖洗將過量的IgG溶液除去(含有0.001％吐溫20的甘氨酸-BSA緩沖液)。通過1.2μm過濾器過濾分離由此獲得的枝接顆粒。
由此制得的枝接顆粒具有控制密度和取向的枝接抗體。此外，枝接穩定，即使在溶液中有表面活性劑和其它蛋白的情況下。就vonWillebrand因子的測定而言，使用含有200％(2國際單位)vonWillebrand因子的LiatestvVF校準血漿(STAvWF Calibrator，可從Diagnostica Stago獲得)，并且基本上按照本測試說明書中所述的步驟，只是使用枝接磁性顆粒的膠體溶液。
用Owren-Koller緩沖液制備含100％、1％、0.1％von Willebrand因子的血漿稀釋液。使用該Owren-Koller緩沖液作為對照(0％)。
接下來，向1體積的各稀釋液中加入2體積的甘氨酸緩沖液和3體積的枝接磁性顆粒的膠體溶液。
然后將所得溶液放置在橫截面為50μm的正方形毛細管中。將該裝配放置在強度為70mT的磁場中持續5分鐘。除去磁場之后，將該樣品放置在光學顯微鏡的平臺上。圖4A、B、C和D顯示了所研究的不同稀釋樣品在顯微鏡下的外觀。尤其注意到，所述方法還可以可見地分辨出相對于對照物(0％)為0.1％的樣品。這一結果比Liatest的2％的檢測域值要好。
權利要求
1.一種檢測和/或定量液體介質中的至少一種分析物的方法，其特征在于使用表面經所述待檢測和/或待測定的分析物的至少一種特異性配體官能化的磁性膠態顆粒，并且所述方法包括(1)將所述顆粒與所述待分析的介質接觸，(2)對所述介質施加一磁場，其強度足夠使所述磁性顆粒組裝成鏈狀，(3)將所述磁場保持足夠時間，以使所述分析物與至少兩個分別存在于鏈的兩個相鄰顆粒上的特異性配體偶聯或結合，(4)去除磁場，和(5)檢測所述分析物是否存在，并根據情況，通過是否存在恒定的磁性膠態顆粒鏈來檢測其濃度。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述顆粒是超順磁的膠態顆粒。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述超順磁膠態顆粒是用含水鐵氧流體與聚合物共沉淀或者在有機相中用鐵氧流體乳化而獲得的。
4.如權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于所述磁性膠態顆粒大小在5-10000nm之間，更優選在100-500nm之間。
5.如權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于所述特異性配體通過吸附相互作用、共價相互作用和/或高親合力相互作用固定到所述顆粒的表面上。
6.如權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于所固定的配體是高親合力鍵合偶聯的兩個成對物之一。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述配體為選自如下偶聯對的一個配對物(聚)碳水化合物/electin；生物素或生物素化的化合物/抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素、蛋白受體及其特異性配體；和半抗原/抗體。
8.如權利要求1-7任一項所述的方法，其特征在于所固定的配體是選自如下的化合物肽；包括糖蛋白、脂蛋白和其它類似或衍生結構的自由或絡合形式的蛋白質；免疫球蛋白；核酸，如DNA或RNA及其同源物；糖類如單糖或二糖、低聚糖和多糖；脂類；激素；受體；代謝物和其它生物物質。
9.如權利要求1-8任一項所述的方法，其特征在于目標分析物是抗原、抗體和核酸和/或蛋白質。
10.如權利要求1-9任一項所述的方法，其特征在于待分析的介質預先經過預處理，以便使分析物對其特異性配體之一的至少兩個分子具有反應活性。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于所述預處理包括用高親合力偶聯成對物之一官能化所述分析物。
12.如權利要求1-11任一項所述的方法，其中所檢測和/或定量的分析物為諸如病毒、細菌或原生動物和其它感染劑的病原體的抗體；腫瘤抗體；針對變應原的抗體或者自身抗體。
13.如權利要求1-11任一項所述的方法，其中所檢測和/或定量的抗原為自由抗原，例如血蛋白和諸如凝血因子的因子、代謝物、激素或介體；或者與載體相連的抗原，例如微生物的表面抗原、膜結合的受體；血型抗原和主要組織相容性系統的抗原。
14.如權利要求1-13任一項所述的方法，其特征在于所述磁性膠態顆粒還帶有第二標記。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于所述標記能夠通過肉眼、光學、機械和/或電的方式表征。
16.如權利要求14或15所述的方法，其特征在于所述標記選自彩色顏料和熒光劑或磷光劑。
17.如權利要求1-16任一項所述的方法，其特征在于使用多種磁性膠態顆粒，分別用各待測定分析物的至少一種特異性配體對這些磁性膠態顆粒進行官能化。
18.如權利要求1-17任一項所述的方法，其特征在于所述磁場是連續的。
19.如權利要求18所述的方法，其特征在于所述連續磁場的磁通量密度為5-500mT，優選10-100mT。
20.如權利要求1-19任一項所述的方法，其特征在于所述磁場是交變的。
21.如權利要求1-20任一項所述的方法，其特征在于所述鏈的表征通過顯微鏡觀察直接進行，和/或根據情況通過任意的光學、機械和/或電方法間接進行。
22.如權利要求21所述的方法，其特征在于所述鏈的表征是通過光度測定法或濁度測定法進行的。
23.如權利要求21所述的方法，其特征在于所述鏈的表征是通過圖像處理進行的。
24.如權利要求23所述的方法，其特征在于使用CCD照相機作為圖像捕獲設備。
25.如權利要求21-24任一項所述的方法，其特征在于使用激光作為光源。
26.一種檢測液體介質中分析物的試劑盒，其特征在于它至少包括表面經所述目標分析物的至少一種特異性配體官能化的磁性膠態顆粒。
27.如權利要求1-25任一項所述的方法用于檢測和/或定量微流體系統中的至少一種分析物的用途。
全文摘要
本發明涉及一種檢測和/或定量液體介質中的至少一種分析物的方法，其特征在于使用表面經所述待檢測和/或待測定的分析物的至少一種特異性配體官能化的磁性膠態顆粒，并且所述方法包括將所述顆粒與所述待分析的介質接觸；對所述介質施加一磁場，其強度足夠使所述磁性顆粒組裝成鏈狀；將所述磁場保持足夠時間，以使所述分析物與至少兩個分別存在于鏈的兩個相鄰顆粒上的特異性配體偶聯或結合；去除磁場，并檢測所述分析物是否存在，并根據情況，通過是否存在所述恒定的磁性顆粒鏈來檢測其濃度。
文檔編號C12Q1/68GK1589405SQ02823033
公開日2005年3月2日 申請日期2002年11月20日 優先權日2001年11月20日
發明者熱羅姆·比貝特, 讓·博德里, 阿蘭·魯索 申請人:斯達高診斷公司, 熱羅姆·比貝特