調節植物光敏素c的表達以控制植物的開花時間的制作方法

專利名稱：調節植物光敏素c的表達以控制植物的開花時間的制作方法
技術領域：
本發明涉及調節植物開花(抽穗)時間的PHYC基因的利用。
背景技術：
水稻是一種短日照植物，表明它在日長變短的時候開花(圓錐花序(抽穗)顯露出來)。感受日長的光感受器稱為植物光敏素(phy)，色素結合分子。在水稻中，有3種光敏色素編碼基因，即PHYA、PHYB和PHYC(Kay S A etal.，Nucleic Acids Res.172865-2866，1989；Dehesh K et al.Mol.Gen.Genet.225305-313，1991，Tahir，M.et al.，Plant Physiol.1181535，1998)。
如同在單子葉植物如水稻的光敏色素突變體，從高粱屬(sorghum)的植物中已分離出phyB突變體(ma3R)(Childs K L et al.，Plant Physiol.113611-619，1997)。該ma3R突變體不僅表現出提早開花的表型，同時表現出葉綠素含量減少、莖桿徒長、頂端優勢增強，這與正常植物類型有明顯的區別。最近，本發明人從水稻中分離了phyA突變體并對其表型特點進行了詳細的研究。結果發現，不管在長日照還是短日照光周期條件下均沒有觀察到該突變植株與對照水稻即Nipponbare在開花時間上有明顯的區別(Takano M et al.，Plant Cell 13521-534，2001)。水稻se5突變體中所有光敏色素含量都低于可檢測水平，不管日長光周期條件如何都表現出提早開花表型(Izawa T et al.，Plant J.22391-339，2000)。盡管在質體血紅素氧化酶編碼基因中發現突變，然而，在該突變體中，所有的光敏色素基因，即PHYA、PHYB和PHYC沒有改變(Izawa T et al.，Plant J.22391-339，2000)。
至今，甚至在非常熟知的實驗模式植物-擬南芥(Arabidopsis thaliana)中還沒有分離到phyC突變體的報道，也沒有與植物開花時間有關的PHYC基因功能性分析的報道。
發明公開本發明通過考慮上述所提及的背景而進行的。本發明的一個目的是分離phyC突變體進而分析其表型以尋求PHYC基因的利用方法。具體而言，本發明提供開花(抽穗)的起動得到促進的phyC突變體及通過抑制PHYC基因表達以加快開花的方法。
本發明的發明人為達到上述目的進行了詳盡的研究。為了闡明PHYC基因的功能，通過利用突變體面板(Panel)突變體分離方法而得到了phyC突變體(Hirochika H.InMolecular Biology of Rice，Springer-Verelag(Tokyo)，pp43-58，1999)。
在該體系中，在短日照植物-水稻的組織培養物中通過激活反轉錄轉座子Tos17已獲得插入型突變體系。已經熟知，當水稻種子進行組織培養時，在水稻基因組中的稱作Tos17的反轉錄轉座子被激活并且通過轉座至其它染色體區域而將基因破壞。從種子經過形成愈傷組織而再生成成熟植物，可容易地獲得大量相互獨立的突變體品系。
從所獲得的這些突變體系中分離出感興趣的突變體。具體而言，980個突變體品系的每一個收集品系被置于稱為突變體面板的三維矩陣中，該突變體面板類似于十個微量滴定板堆積形成有八行的Z-軸，有十二行的Y-軸和有十行的X-軸。在每個軸的突變體系庫中提取DNA，并用于篩選感興趣的突變體。這些庫的DNA被用作含一套特異于PHYC基因和Tos17的LTR區域的引物的PCR體系中的模板。只有當Tos17反轉錄轉座子存在于PHYC基因的特異性引物附近時才能獲得擴增條帶(即Tos17插入到PHYC基因中時)。通過這種方法，只需要8次PCR擴增可確定感興趣的突變體是否存在于面板中，即是否存在于980個突變體系中。當特異性條帶被擴增時，相同的引物組合被用于對相同面板的X和Y軸上的突變體進行PCR擴增。在每一個軸上對有擴增的行進行確認。感興趣突變體的位置在三維矩陣內從這些行的交叉點上得到確證。
通過這些實驗，成功分離出phyC突變體，其中Tos17插入到PHYC基因的第一個外顯子編碼區。而且，發現在長日照條件生長下，phyC突變體開始開花(抽穗)大約比對照水稻要早1周。因此，第一次闡明了PHYC基因的編碼產物參與感受長日照光周期而延遲開花。至今，還沒有關于PHYC基因參與了確定植物開花時間的報道。這里獲得的結果顯示抑制PHYC基因的表達可以在長日照條件下促進植物開花。特別地，phyC突變體與野生型植株相比，除開花時間之外，不存在其它顯著區別的表型，因此通過抑制該基因的表達將非常有利于特異性的驅動開花。利用PHYC基因促進開花將非常有利于育種改良，例如，可更方便于創造有用的農業作物和裝飾植物，它們具有能適應其它栽培地區和栽培時期等的新特性。此外，水稻phyC突變體，在長日照條件下開花提前，作為一種新的早熟水稻品種是非常有價值的。
也就是說，本發明涉及利用在長日照條件下控制植物開花(抽穗)的PHYC基因，以促進植物開花，具體的說，(1)一種促進植物開花的核酸，其中所述核酸選自下述(a)至(c)中任一項(a)與植物PHYC轉錄物互補的反義核酸；(b)具有可特異性切割植物PHYC轉錄物的核酶活性的核酸；和(c)通過共抑制方式而可抑制植物phyC基因表達的核酸。
(2)根據(1)的核酸，所述植物是短日照植物。
(3)根據(2)的核酸，所述短日照植物是水稻。
(4)含有(1)-(3)中的任一核酸的載體。
(5)攜帶有(1)-(3)中的任一核酸或(4)的載體的轉化植物細胞。
(6)含有(5)所述的轉化植物細胞的轉基因植物。
(7)是(6)的轉基因植物的后代或克隆的轉基因植物。
(8)(6)或(7)的轉基因植物的繁殖材料。
(9)用于產生(6)或(7)的轉基因植物的方法，其中所述方法包括將(1)-(3)中的任一核酸或(4)的載體導入植物細胞和從所述植物細胞再生成植株的步驟。
(10)一種促進植物開花的方法，其中該方法包括抑制所述植物的細胞中的內源PHYC基因的表達。
(11)根據(10)的方法，其中該方法包括將(1)-(3)中的任一核酸或(4)的載體導入植物。
(12)根據(9)-(11)中任一的方法，所述植物是短日照植物。
(13)根據(12)的方法，所述短日照植物是水稻。
(14)一種水稻phyC突變體。
(15)一種水稻phyC突變體，其是(14)所述的突變體的后代或克隆。
(16)(14)或(15)中水稻突變體的繁殖材料。
本發明的發明人已經闡明了水稻phyC突變體在長日照條件下可以促進水稻開花。這表明有可能在長日照條件下通過抑制植物PHYC基因表達來啟動植物開花。
本發明提供可促進植物開花的核酸。本發明的一個優選方案，植物開花是通過抑制植物PHYC基因的表達來促進的。
通常地，術語“開花”是指花的開放；然而，在本發明的上下文關系中，術語“開花”可以適用于包括水稻(rice)在內的稻類(family)作物的植物，例如，術語“開花”指圓錐花序(抽穗)的出現。在本發明中，短語“促進開花”意指開花開始的提前。在本發明中，術語“長日照條件”是指在一天中黑暗期短于光周期反應所需的閾值黑暗期(臨界黑暗期)。具體而言，14小時光照/10小時黑暗的光周期被通常用作例子來說明。
在本發明中，上述所提及的PHYC基因是編碼phyC蛋白的基因，是一種植物色素結合蛋白即光敏色素。PHYC基因在許多植物中均有發現。因此，在本發明中，選擇用于在長日照條件下通過調節PHYC基因的表達來促進開花的植物優選的是短日照植物，更優選的是屬于稻類的植物。最優選的是水稻。短日照植物是那些形成花芽或它的花芽形成在不間斷黑暗時間長于臨界黑暗時間的光周期條件下被促進的植物。優選地，經本發明促進開花的植物例如是有價值的農作物和裝飾植物。具體而言，有用的作物可以是單子葉植物如水稻或雙子葉植物如大豆。裝飾植物可以是花卉植物如菊花、牽牛花、一品紅(poinsettia)和大波斯菊(cosmos)。
本發明的PHYC基因包括作為實際例子的水稻PHYC基因(Genbankaccession NoAB018442)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)PHYC基因(Genbankaccession NoZ32538)。
此外，利用本領域技術人員所熟知的方法，如雜交技術(Southern E M etal.Journal of Molecular Biology 98503，1975)或聚合酶鏈式反應(PCR)技術(Saiki R K et al.Science 2301350-1354，1985，Saiki R K et al.Science239487-491，1988)，可以分離上述所提及的PHYC基因的同源物，進而獲得這些基因的核苷酸序列信息。例如，利用水稻PHYC基因的核苷酸序列(Genbank accession NoAB0l8442)或其一部分序列作為探針的雜交技術，或使用能與PHYC基因雜交的特異性寡核苷酸作為引物的PCR技術可以從預期植物中分離出與PHYC基因高度同源的DNA。
為了分離這些DNA，雜交反應通常在嚴謹條件下進行。雜交條件是6M尿素，0.4％SDS和0.5X SSC或相當條件下作為嚴謹條件。也可采用更高嚴格的雜交條件，例如6M尿素，0.4％SDS和0.1X SSC而獲得高度同源的DNA。分離到的DNA的序列可以采用已知方法來確定。
通常是基于序列同源性來確定所分離的DNA是否編碼phyC蛋白。序列同源性可以用稱作BLASTN(核苷酸水平)或BLAST(氨基酸水平)的程序來查找(Altschul，s.f.et al.，J.Mol.Biol.215403-410，1990)。這些程序是以Karlin和Altschul的BLAST運算法則為基礎的(Proe.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，1993)。如果用BLASTN分析核苷酸序列，可以進行參數設定，例如分值(score)＝100和字長(wordlength)＝12。如果用BLASTX分析氨基酸序列，可以進行參數設定，例如分值(score)＝50和字長(wordlength)＝3。氨基酸序列可以用Altschul et al中描述的Gapped BLAST程序分析(Nucleic Acids Res.253389-3402，1997)。當用BLAST和Gapped BLAST程序進行序列分析時，可采用各程序的默認參數。這些特殊的分析方法已廣為人知(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
在本發明的方法中，為了獲得促進開花的植物，是將抑制PHYC基因表達的DNA插入到合適的載體并且導入植物細胞，進而再生成完整的植株。術語“PHYC基因表達的抑制”包含轉錄和翻譯抑制，不僅包括了完全終止DNA的表達，也包括降低其表達水平。
在本發明中，為了抑制內源植物基因的表達，本領域技術人員可以利用如反義技術來達到。Ecker et al將反義RNA通過電穿孔法導入的瞬間基因表達而第一次證實了反義技術在植物細胞中的有效性(Ecker J R andDavis R W.PNAS 835372，1986)。之后，在煙草和矮牽牛花中也觀察到反義效應使靶基因的表達水平減少(Krol A R et al.Nature 333866，1988)。目前，抑制植物基因表達的技術已確立。通過反義核酸來抑制靶基因的表達存在多種機制，即形成三鏈抑制轉錄起始；RNA聚合酶形成局部開環結構的地方形成雜交而引起的轉錄抑制；與正在合成的RNA通過雜交而引起轉錄抑制；在內含子和外顯子之間的接點處形成雜交而引起剪接抑制；在剪接體(spliceosome)位點形成雜交引起剪接抑制；與mRNA形成雜交而抑制mRNA從胞核轉移到胞質；在加帽(capping)位點或多聚腺苷酸添加位點(polyA)處通過雜交引起剪接抑制；在翻譯起始因子的結合位點處形成雜交而引起翻譯起始的抑制；在起始密碼子附近的核糖體結合位點處通過雜交引起翻譯抑制；在mRNA上的翻譯區或多核糖體結合位點內通過雜交引起多肽延長抑制；在核苷酸與蛋白質互作位點形成雜交引起基因表達的抑制；等等。這些不同的機制分別抑制靶基因的轉錄、剪接和翻譯過程以抑制基因表達(Hirashima and Inoue，New Biochemistry Experimetn Vol.2 Nucleic acidIV，Replication and Expression of Gene，Japanese Biochemical Society ed.，Tokyo Kagaku Dojin，pp.319-347，1993)。因此，本發明提供與植物PHYC基因轉錄產物互補的反義核酸。上述所提及反義核酸包括反義DNA，反義RNA和編碼反義RNA的DNA。
在本發明中，反義核酸能夠用于上述提及的機制來抑制靶基因的表達。在一個具體實施方案中，反義核酸設計成互補于mRNA的5’非翻譯區能夠引起有效的翻譯抑制。然而，也可利用互補于編碼區或3’非翻譯區的核酸。本發明包括的反義DNA不僅可從翻譯區而且可從非翻譯區來進行設計。使用的反義DNA連接于合適啟動子的下游，而且更優選地，包含翻譯終止信號的序列連接于其3′末端。
本發明的反義核酸可通過如硫代磷酸酯的方法，根據SEQ ID NO3所示DNA序列信息來制備(Stein CA et al.Nucleic Acids Res.163209-3221，1998)。制備的核酸可以通過已知的方法而用于轉染目標植物。優選地，反義核酸序列與欲轉染植物的內源基因或基因的一部分互補。然而，只要基因的表達能夠被有效的抑制，不必要求完全互補。本發明的反義核酸優選地是90％或更高，最優選為95％或更高的與靶基因轉錄物互補。利用反義核酸來有效的抑制靶基因的表達，反義核酸應當至少有15或更多個核苷酸長度，優選為100或更多個核苷酸，最優選為500或更多個核苷酸長度。使用的反義核酸通常短于5kb并且優選的短于2.5kb。
另一個抑制內源基因表達的方法是核酶技術。核酶是具有催化活性的RNA分子。核酶已知具有許多不同類型的活性。核酶作RNA切割酶的研究使得可以設計出能夠在RNA的特定位點進行切割的核酶。因此，本發明提供能夠特異切割植物PHYC基因轉錄物的核酶活性的核酸。上述提及的本發明的核酸包括具有核酶活性的RNA和編碼這些RNA的DNA。
對于核酶，如I組內含子類型和包含于RnaseP中的M1RNA，可以是比較大，具有400個核苷酸或更多，也有比較小的，如包括錘頭狀和發夾狀的具有活性區域的約40個核苷酸的核酶(Koizumi M and Otsuke E.Tanpakushitsu Kakusan Koso 352191，1990)。例如，已知錘頭狀類型核酶的自我剪切結構域可以切割序列G13U14C15的C15的3′側。對于切割活性非常重要的是第9位的A與U14形成配對。進而，研究表明當第15位堿基是A或U而不是C時也發生切割(Koizumi M et al.FEBS Lett.228225，1988)。因此，如果設計核酶具有互補于靠近靶標序列的RNA序列的底物結合位點，該核酶可以被用作限制性內切酶類似的RNA切割核酶以識別靶RNA中的序列UC，UU或UA(Koizumi M et al.FEBS Lett.228225，1988；Koizumi Mand Otsuke E.Tanpakushitsu Kakusan Koso 352191，1990；Koizumi M et al.Nucleic Acids Res.177059，1989)。
此外，發夾狀類型核酶在本發明的上下文中是有用的。例如在煙草環斑病毒的衛星RNA負鏈中發現有發夾狀類型的核酶(Buzayan J M.Nature323349，1986)。該核酶也可以設計成靶特異性切割RNA(Kikuchi Y andSasaki N.Nucleis Acids Res.196751，1992，Kikuchi H.Chemistry and Biology30112，1992)。
設計用于切割靶的核酶，例如連接于啟動子如花椰菜花葉病毒35S啟動子，和轉錄終止子序列而在植物細胞中轉錄。然而，如果非必要序列被加在轉錄RNA的5′或3′末端，核酶活性可能喪失。在這種情況下，為了準確地從包含核酶序列的轉錄RNA中僅切出核酶的部分，可以將另外一個順式作用的修飾核酶置于該核酶的5′或3′側(Taira K et al.Protein Eng.3733，1990，Dzianott A M and Bujarski J J.PNAS 864823，1989，Grosshans C A andCech R T.Nucleic Acids Res.193875，1991，Taira K et al.Nucleic Acids Res.195125，1991)。此外，可經前后排列的如此結構單元以對在靶基因中的多個位點進行切割而獲得更好的效果(Yuyama N et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.1861271，1992)。因此，可以使用這種核酶來特異性切割本發明所述的靶轉錄物從而抑制該基因的表達。
內源基因表達的抑制也可通過共抑制來達到，這是通過用含有與靶基因序列相同或相似的序列的核酸轉化而產生的共抑制。“共抑制”是指這樣一種現象，當與靶內源基因相同或相似的序列的基因通過轉化導入植物時，靶內源基因和所導入的外源基因的表達均受到抑制。共抑制的機制還不完全清楚，但在植物中經常發生(Curr.Biol.7R793，1997，Curr.Biol.6810，1996)。因此，本發明提供通過共抑制而對植物PHYC基因表達有抑制效果的核酸。本發明所述核酸包括通過共抑制而產生抑制效果的DNA和RNA。
為了獲得利用本發明上述提及的核酸而產生PHYC基因受到共抑制的植物，例如將能表達含有PHYC基因序列或該基因類似序列的DNA的載體DNA導入靶植物，繼而選擇具有phyC突變體表型的植株，即在長日照條件下能夠促進開花。用于共抑制的基因不必完全相同但應當與靶基因序列有至少70％或更高，優選80％或更高，最優選90％或更高(如95％或更高)的相同性。
另外，本發明所述內源基因的抑制可以向植物導入引起相對于靶基因而言的顯性陰性表型的基因來達到。術語“能引起顯性陰性表型的基因”意指該基因的表達可消除或降低植物中原始存在的野生型內源基因的活性。
此外，本發明提供上述的核酸、包含所述核酸的載體、具有所述核酸或包含所述核酸的載體的轉化植物細胞、含有所述轉化植物細胞的轉基因植物、上述轉基因植物的后代或克隆的轉基因植物和所述轉基因植物的育種材料。
另外，本發明提供一種生產上述轉基因植物的方法，包括將本發明的核酸導入到植物細胞并由植物細胞再生成植物體的步驟。
本領域技術人員可以通過已知的方法，例如農桿菌介導法、電穿孔法和粒子槍法等將本發明所述核酸導入到植物細胞。
例如Nagel et al.的方法被用作是農桿菌法(Microbiol.Lett.67325，1990)。根據該方法，用重組載體轉化農桿菌并通過已知方法如葉盤法導入到植物細胞中。當本發明所述的核酸為DNA時，上述載體包含例如啟動子，在導入植物后以表達指物中的DNA。通常，本發明所述的DNA被置于這種啟動子的下游，同時將終止子序列置于所述DNA的下游。為了該目的的重組載體可由本領域技術人員根據所采用的轉染方法或植物類型來確定。例如，上述所提及的啟動子可以是來源于花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動子或來源于玉米的遍在蛋白(ubiquitin)啟動子(未經審查公開的日本專利申請No.(JP-A)Hei 2-79983)。
例如，上述的終止子可以是源自花椰菜花葉病毒的終止子或胭脂堿合成酶終止子。然而，并不限于所舉例子，只要在植物中能夠發揮啟動子或終止子功能的啟動子或終止子均可選用。
用本發明所述的核酸進行轉染的植物可以是外植體。任選地，從所述植物制備出培養細胞，進而用所述核酸導入該培養細胞。例如，本發明所述的“植物細胞”可以是從葉、根、莖、花、種子角質鱗片、愈傷組織和培養細胞懸浮液的細胞。
此外，為了有效的選擇本發明所述核酸已經被導入的轉化植物細胞，上述的重組載體優選為攜帶有合適的選擇標記基因或與攜帶有選擇標記基因的質粒載體一起導入植物細胞。例如，為所述目的的選擇標記基因可以是賦予對潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶基因；賦予對卡那霉素或慶大霉素(gentamycin)抗性的新霉素磷酸轉移酶基因；賦予對除草劑膦絲菌素(phosphinothricin)抗性的乙酰轉移酶(acetyltransferase)基因。
用重組載體進行轉染的植物細胞平鋪或培養于已知的選擇性培養基上，其培養基中含有根據所導入的選擇性標記基因而選取的合適的選擇性藥物。通過這種方法，可以獲得轉化的植物培養細胞。
接下來，本發明所述核酸已導入的轉化植物細胞再生出植物體。植物的再生可采用依植物細胞類型來選擇本領域已知的方法來進行(Toki et al.Plant Physiol.1001503-1507，1995)。已有幾種成熟的再生轉化水稻植株的技術，而且這些技術已在本發明所屬領域內被廣泛使用。例如，水稻植物可以在如下步驟之后進行再生(1)用聚乙二醇法將基因導入原生質體中(適合于Indica水稻品種)(Datta S K et al.，In Gene Transfer To Plants(Potrykus I andSpangenberg Eds.)pp 66-74，1995)；(2)用電脈沖法將基因導入原生質體中(適合于Japonica水稻品種)(Toki et al.Plant Physiol.1001503-1507，1992)；(3)用基因槍法(Particle gun)將基因直接導入細胞中(Christou et al.，Bio/technology，9957-962，1991)；或者(4)用農桿菌介導法將基因導入細胞(Hiei et al.Plant J 6271-282，1994)。在本發明中，這些是優選的方法。
轉化植物細胞再生出的植株進而在馴化(acclimatization)培養基上培養。然后，在經過環境適應性培養基上培養后的植株在正常的栽培條件下生長，而獲得促進開花的植株。當這些植株成熟和結果后而獲得相應的種子。
由此再生和生長的轉基因植物中導入的外源核酸可用已知的方法來驗證，如PCR或Southern雜交，或通過分析來自植物的核酸的核苷酸序列。也可以用J.Sambrook et al中的已知方法來提取轉基因植物中的核酸(Molecular Cloning，2ndedition，Cold Spring Harbor laboratory Press，1989)。
為了分析存在于再生植株中的含有本發明所述核酸的外源基因，通過上述方法從再生植株中提取的核酸作為模板進行擴增反應。當本發明所述的核酸是DNA時，其擴增反應可以在含有根據該DNA的核苷酸序列來合適篩選核苷酸序列設計合成的寡核苷酸作為引物的反應混合物中進行。可以通過重復DNA變性、退火和延伸步驟的數十個循環的擴增反應來獲得含有本發明所述DNA序列的擴增DNA片段。各自擴增DNA片段通過如在含有擴增產物的瓊脂糖凝膠中進行電泳來分離。然后即能確認與本發明的DNA相應的擴增片段。
一旦獲得本發明的核酸已經插入到染色體的轉基因植株，即可通過有性繁殖或無性繁殖來獲得其后代。同樣，也可以通過由上述植物或其后代或克隆獲得可繁殖性材料(如種子、果實、插條、塊莖、塊根、芽、愈傷組織和原生質體)大規模生產所述植物。
在本發明中，正如上面所提及的，通過抑制PHYC基因的表達來達到植物開花的提前。
此外，本發明提供水稻phyC突變體，它們的后代或克隆和phyC突變體的可繁殖性材料。
本發明的水稻phyC突變體不僅包括可在長日照條件下促進開花的水稻phyC突變體(純合突變體)，還包括雜合突變體。雜合突變體可用于生產純合突變體。此外，本發明的水稻phyC突變體除包括根據本發明中所分離出的phyC突變體(純合和雜合體突變體)，也可通過利用實施例中所描述的突變體面板的方法來新分離得到phyC突變體(純合和雜合體突變體)。
附圖的簡要說明

圖1顯示在phyC突變體中Tos17反轉錄轉座子的插入位點。在panel A的黑框顯示Tos17插入的邊界；Tos17插入在組氨酸(H)殘基224和谷氨酸(E)殘基245之間。Panel B表明Tos17在染色體上的插入位點。
圖2顯示證實phyC突變體分離的圖。PhyC突變的雜合突變體進行自交，用Southern雜交對獲得后代(#1-9)進行分析，其所用的探針可檢測用XhoI處理后而得到包含PHYC基因的3.8kb片段。(+/+)野生型；(+/-)雜合phyC突變體和(-/-)純合phyC突變體。
圖3顯示用競爭性RT-PCR方法檢測出的PHYC基因轉錄物的表達水平。Log(Comp)表示競爭者濃度的對數值。PhyC表示PHYC轉錄物，Comp表示源自競爭者序列的擴增產物。(+/+)野生型；(+/-)雜合phyC突變體和(-/-)純合phyC突變體。
圖4顯示在田間中生長的phyC突變體的開花(抽穗)時間。OsphyA-2phyA突變體，(+/±)野生型或自交之后分離出的雜合突變體，OsphyC-1phyA突變體。
圖5顯示用Nipponbare回交phyC突變體所得到的F2代分離群的基因型與開花時間之間的關系。
圖6顯示在長日照和短日照光周期條件下phyC突變體的開花(抽穗)時間。在水平軸上的14L/10D和10.5L/13.5D分別表示為長日照和短日照條件。
實施本發明的最佳方式本發明通過下述實施例而得到詳細的解釋，但并不局限于這些實施例。
phyC突變體的分離本發明通過突變體面板方法來分離phyC突變體。PHYC基因的引物是基于水稻PHYC cDNA序列(Genbank Accession NO.AB018442)來設計的。由于該基因很大，故設計了6條引物以覆蓋phyC基因的整個序列(BR，DR，EF，FR，GF和HR)(表1)。同時，設計了兩條針對Tos17兩末端的LTR序列向外的引物(表2)。
表1


*BR1，DR1，EF1，FR1，GF1和HR1分別表示為BR，DR，EF，FR，GF和HR的嵌套引物。
**表示在水稻PHYC cDNA序列(Genbank Accession NO.AB018442)上的引物位點位置。
表2

*LTR2和LTR5分別為LTR1和LTR4的嵌套引物.
用12組引物對在突變體面板上的9600個個體進行PCR篩選(6條PHYC特異性引物)×(2條Tos17特異性引物)。當用BR和LTR4引物時可以發現特異性擴增。在用于突變體面板的DNA池中，包括了來自80(X-軸)到120(Z-軸)個個體的DNA，即由于每一個個體的DNA被稀釋1/120到1/80而使每一條模板的濃度非常低。此外，一次PCR很難檢測到特異性擴增，這是由于Tos17的LTR序列富含AT而使所設計的引物的Tm值非常低。因此，為了增加靈敏性和特異性，設計了與上述各引物之下游對應的額外引物(BR1，DR1，EF1，FR1，GF1，HR1，LTR2和LTR5)，并且進行兩次PCR(嵌套式PCR)以檢測擴增。結果，可以觀察到許多非特異性條帶，因此還需要用Southern雜交來鑒定特異性條帶。切出鑒定出條帶并提取出其中的DNA片段。對該DNA片段進行測序以確定Tos17的插入位點。Tos17插入在發色團(開環的四吡咯)結合位點(244th氨基酸)的上游(圖1)，表明這是一個無義突變。
同樣，可通過Southern雜交來確定Tos17的插入。根據報道的水稻PHYC基因組DNA序列，當水稻基因組DNA用XhoI消化時，預期產生來自野生型的水稻基因組3.8kb的條帶(D.Basu et al.Plant Mol.Biol.4427-42，2000)。相反，Tos17插入突變體則預期分別產生7.5kb和0.4kb兩條條帶。從phyC雜合突變體的自交后代(#1-9)提取DNA，用能識別到用XhoI處理產生的含有PHYC基因的3.8kb的探針進行Southern雜交(對于突變體，使用的探針包含phyC cDNA的全長，可以識別7.5kb片段)。這樣可以獲得預期的結果。此外，發現Tos17插入突變體經過分離至純合突變體(#2，5，6和7)和雜合突變體(#1，4，8和9)，在#3中沒有發現Tos17(圖2B)。從這些結果可知，獲得了一個phyC突變體系(osphyC-1)。
PHYC基因轉錄物的RT-PCR驗證為了驗證在所分離的phyC突變體中PHYC基因缺少表達，雜合phyC突變體經過自花授粉，從其后代(#1-9)中提取DNA用于確定所述它們的基因型。此外，提取RNA以用在表1中所述的BR和EF引物進行競爭性RT-PCR(圖3)。使用競爭性DNA，其兩端攜帶有BR和EF序列的DNA片段，在它們之間是與phyC cDNA無關的340bp序列。結果，在野生型(#3)或雜合phyC突變體(#1，4，8和9)中擴增出PHYC基因，但在純合phyC突變體(#2，5，6和7)并沒顯示預期大小的條帶，這表明純合突變體中沒有PHYC基因的表達。
phyC突變體對開花(抽穗)時間的影響為了研究開花時間，Nipponbare和phyC突變體的種子于2000年6月28日進行播種，并于2000年7月14日移栽到田間。這些水稻植物在自然日長的條件下生長并觀察開花的時間。如圖4中所示，phyA突變體(osphyA-2)對照和由自交phyC突變體分離的雜合突變體分離體或野生型在播種后第60到61天開花，然而phyC突變體在第54天開花，比前者早約一周。
此外，為了驗證phyC突變體與開花提前的時間之間的關系，phyC突變體與Nipponbare進行回交，研究分析F2代分離群的開花時間和基因型。在F2群(n＝54)和對照Nipponbare群(n＝63)于2002年5月15日播種后于2002年6月5日移栽到田間。如圖5所示，分離雜合體和野生型個體(n＝45)在播種后平均93.2天開花，而沒有早于播種后第91天開花的。另一方面，phyC突變體(n＝9)在平均第83.1天后開花而沒有晚于第84天后才開花的。在該群體中，基因型完全與開花時間相關。Nipponbare對照平均在94.1天后開花，幾乎與雜合體和野生型個體的開花時間完全一樣。
而且，為了測試在短日照和長日照條件下的開花時間，將植株置于可以控制氣候的人工氣候室中生長(短日照10.5小時光照/13.5黑暗，長日照14小時光照/小時10黑暗)(圖6)。在短日照條件下，在Nipponbare和phyA突變體及phyC突變體之間不存在區別。所有這些植株均大約在50天開花。在長日照條件下，Nipponbare和phyA突變體約需90天才能開花，然而phyC突變體在約83天后即開花，提前了約1周。因此，PHYC基因被認為具有感受長日照光周期和使開花延遲的功能。
此外，對phyC突變體的表現型，除開花時間外，包括諸如植株高度、植株特性、葉綠素含量和葉綠素a/b的比率進行了研究分析。然而，沒有觀察到任何顯著的區別。
工業實用性本發明提供了利用植物PHYC基因促進開花(抽穗)的方法。PhyC突變體除在此所述開花時間外，并沒有在其它表型上發生改變(例如在植株高度、植物特性、葉綠素含量和葉綠素a/b比率)。由此，抑制PHYC的表達以乎可以針對性的促進開花。利用PHYC基因來促進開花將充分地有助于育種改良，例如有助于創造有用的農作物和裝飾植物而使其具有適合于在其它栽培地區和栽培時期的新特性。本發明也提供植物phyC突變體，其開花在長日照光周期條件下受到促進。水稻phyC突變體將是非常有前景的早熟水稻新品種。
序列表<110>獨立行政法人農業生物資源研究所(National Institute of Agrobiological Sciences)生物系特定產業技術研究推進機構(Bio-oriented Technology Research AdvancementInstitution)<120>調節植物光敏素C的表達以控制植物的開花時間<130>MOA-A0103P<140>
<141>
<150>JP 2001-266330<151>2001-09-03<160>16<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>1gtgatggcag accatcaacc 20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>2ccagtgtctc catcatcatc c21
<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>3catacctaag cgggaaaggg ac 22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>4aaagggacaa acctcgggct tg 22<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>5cgtacaagtt ccatgaggat gagc 24<210>6<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>6gaggtgattg ctgagtgcaa gag 23<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>7atcgaccaga ggcttcccta tg 22<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>8tggcttccat gacaggtaat cc 22<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列
<400>9gcctaattga gacagcaact gcg 23<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>10ttggctgttg acatcactgg 20<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>11acgagcttct ggcttatgta aagg24<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>12tggcggaaca tctcttgtat cag 23<210>13<211>24
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>13ttggatcttg tatcttgtat atac24<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>14gctaatacta ttgttaggtt gcaa24<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>15ctggacatgg gccaactata cagt24<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>16attagcttgt atatatattt aaca2權利要求
1.一種促進植物開花的核酸，其中所述核酸選自下述(a)至(c)中任一項(a)與植物PHYC轉錄物互補的反義核酸；(b)具有可特異性切割植物PHYC轉錄物的核酶活性的核酸；和(c)通過共抑制方式而抑制植物phyC基因表達的核酸。
2.根據權利要求1的核酸，其中所述植物是短日照植物。
3.根據權利要求2的核酸，所述短日照植物是水稻。
4.含有權利要求1-3中任意一項核酸的載體。
5.攜帶有權利要求1-3中任意一項的核酸或權利要求4的載體的轉化植物細胞。
6.含有權利要求5所述的轉化植物細胞的轉基因植物。
7.一種轉基因植物，其是權利要求6的轉基因植物的后代或克隆。
8.權利要求6或7的轉基因植物的繁殖材料。
9.用于產生權利要求6或7的轉基因植物的方法，其中所述方法包括將權利要求1-3中任意一項的核酸或權利要求4的載體導入植物細胞，和從所述植物細胞再生成植物的步驟。
10.一種促進植物開花的方法，其中該方法包括抑制所述植物的細胞中的內源PHYC基因的表達。
11.根據權利要求10的方法，其中該方法包括將權利要求1-3中任意一項的核酸或權利要求4的載體導入植物。
12.根據權利要求9-11中任意一項的方法，其中所述植物是短日照植物。
13.根據權利要求12的方法，其中所述短日照植物是水稻。
14.一種水稻phyC突變體。
15.一種水稻phyC突變體，其是權利要求14所述的突變體的后代或克隆。
16.權利要求14或15的水稻phyC突變體的繁殖材料。
全文摘要
利用突變體面板(mutant panel)分離突變體的方法分離了水稻phyC基因突變體，發現在長日照條件下比對照植株開花要早1周左右。該結果表明可以通過調節phyC基因的表達來促進長日照條件下植物的開花。利用phyC基因來促進植物開花將大大有利于培育出具有適合于在其它栽培地區和栽培時期等新特性的有用的農作物和裝飾植物。此外，水稻phyC基因突變體，在長日照條件下可促進開花，將是非常有前景的快熟水稻新品種。
文檔編號C12N15/29GK1571840SQ0282082
公開日2005年1月26日 申請日期2002年8月30日 優先權日2001年9月3日
發明者高野誠, 廣近洋彥, 官尾安藝雄 申請人:獨立行政法人農業生物資源研究所, 生物系特定產業技術研究推進機構