香料活性肽的制作方法

專利名稱：香料活性肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及可從可可豆獲得、并且在與還原糖進行梅拉德反應(mailard reaction)后獨特鮮明風味的特殊肽。具體地，本發明涉及所述特殊肽在制備巧克力香料，特別地是可可香料和焦糖香料，花香料(floralflavour)或者具體地，糖果香料，面包香料，烘焙香料以及肉香料中的用途。
背景技術：
典型的可可香料在可可豆加工期間(包括發酵、干燥以及烘焙)釋發出來。
在發酵期間，可可種子蛋白通過微生物和酶促加工降解，主要產生親水肽和疏水氨基酸，它們為獨特巧克力香料的香料前體。所涉及的可可蛋白水解系統是非常有效的。可可的內源型蛋白水解活性由內源蛋白酶，氨肽酶和羧肽酶代表，它們協同地具有將完整蛋白水解為單個氨基酸和不同長度的寡肽的能力。
在烘焙期間發生多種化學反應，特別是梅拉德型反應和熱降解反應(脫羧、脫氨、氧化等)。涉及肽、氨基酸和還原糖的梅拉德反應產生被認為最終有助于最后的可可/巧克力香料的化合物。
不久前，有越來越多的證據被提出，那就是肽的大小及其氨基酸成分/序列在香料形成方面扮演著重要角色。研究了未烘焙和烘焙的發酵可可的氨基酸庫，并發現某些疏水氨基酸牽涉到可可香料的產生(Seilki，Rev.Int.Choc.28(1973)38-42)。
然而，由于游離氨基酸和多酚等的存在，鑒定可可豆中天然存在的肽相當困難。結果，迄今為止，本領域對存在于可可肽庫中的短鏈肽的性質知之甚少。
已經作出幾種嘗試來人工制備可可香料。這樣的一種嘗試包括使由未發酵的成熟可可豆所制備的丙酮干粉在pH 5.2條件下自溶(autolysis)，接著在還原糖的存在下烘焙(Voigt等，Food Chem.49(1994)，173-180)。Mohr等在Fette Seifen Anstriche 73(1971)515-521頁中報道了有關表現出形成巧克力香料潛力的肽級分的分離。而且，Voigt等在Food Chem.51(1994)7-14、177-184以及197-205頁的幾篇文章中報道了有關利用純化的貯藏蛋白和內源可可蛋白水解系統對香料前體的肽富集庫的制備，所述前體在與還原糖熱反應時產生巧克力樣香料。
還已經知曉果糖/葡萄糖以及疏水氨基酸的混合物在低水活性介質，如甘油或丙二醇等中熱反應，能引起巧克力樣的香氣。利用這類反應香料作為基礎，并組合某些上等料，最優的是香草，則能夠制備巧克力樣香料濃縮物。不過，由于這些反應物復雜的性質，難以獲得純凈和均衡的巧克力香料濃縮品，此外還為提供恒定品質造成了問題。
與巧克力的加工反應香料的發展相應，Schnermann等在“通過香氣提取物稀釋分析對牛奶巧克力和可可塊中主要有味物質的評價”(“Evaluation of key odorants in milk chocolate and cocoa mass by aromaextract dilution analyses”)(J.Agric.Food Chem.45，(1997)，867-872)中報道了來自可可或巧克力產品的揮發性化合物的鑒定和特征。揮發性圖譜研究的總目標是“合成”一種具有高度彈性的強烈人工巧克力香氣，以便定制巧克力或巧克力產品的香味類型。不過，迄今為止重建巧克力香氣的嘗試尚未成功。雖然獲得的合成混合物令人聯想到巧克力，但它們缺乏典型巧克力香料的濃郁品質(body)和強度。
目前，現有的人工巧克力香料缺乏期望的巧克力香氣強度和適當的濃郁品質。
因此，本發明的技術問題在于提供允許人工制備巧克力香料的手段，此香料優選應當具有典型巧克力香氣的所有組成以及適當的濃郁品質。
發明簡述在通往本發明的深入研究過程中，現在已令人驚訝地認識到可可豆中含有許多種不同的、能引起未曾預期存在于可可豆中的味道的肽。因而在本發明的第一方面涉及所有可來自可可豆、并且可通過使選自Arg-Phe、Ala-Glu、Glu-Ala、Val-Ala、Phe-Glu、Thr-Leu、Tyr-Val、Val-Tyr、Pro-Val、Asp-Ala、Ala-Asp、Trp-Ala、Ala-Asp、Trp-Ala、Phe-Ala、Ala-Phe、Tyr-Ala、Ala-Tyr、Lys-Glu、Lys-Phe、Val-Lys、Val-Phe、Leu-Leu、Met-Tyr的肽與還原糖進行梅拉德反應獲得的香料活性化合物。
根據優選的實施方式，本發明提供了可通過使選自Leu-Leu、Val-Tyr、Tyr-Val、Ala-Phe、Ala-Asp、Val-Phe、Val-Lys、Leu-Leu或Val-Tyr的肽與還原糖進行梅拉德反應獲得的化合物，該化合物將產生由可可和/或焦糖香氣組成的巧克力香料。
根據可選的實施方式，所述肽選自Leu-Leu、Val-Tyr、Tyr-Val、Ala-Phe或Ala-Asp，已發現它們尤其可以產生優質的香氣和適宜的濃郁品質。根據優選的實施方式，所述肽為Val-Tyr、Tyr-Val或Leu-Leu，它們可以產生最好的可可香料。
根據可選的實施方式，所述肽選自Val-Phe或Val-Lys，它們可以產生焦糖香料。
而根據另一個實施方式，進行梅拉德反應的肽是Met-Thr，已發現它可以產生優質而強烈的肉香料。
至于待與上文所列的肽反應的還原糖，可以利用例如果糖、葡萄糖、木糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖。糖和肽優選在非水性溶劑，例如甘油、丙二醇、低水活性含水系統、乙醇、脂肪中，在提高的溫度，以及允許糖結合于所述肽的條件下進行反應。
根據另一個實施方式，提供了制備期望的香料，特別是巧克力香料、可可香料、焦糖或餅干或肉香料的工藝，其包括使選自Arg-Phe、Ala-Glu、Glu-Ala、Val-Ala、Phe-Glu、Thr-Leu、Tyr-Val、Val-Tyr、Pro-Val、Asp-Ala、Ala-Asp、Trp-Ala、Ala-Asp、Trp-Ala、Phe-Ala、Ala-Phe、Tyr-Ala、Ala-Tyr、Lys-Glu、Lys-Phe、Val-Lys、Val-Phe、Leu-Leu、Met-Tyr的一種或多種肽與還原糖進行梅拉德反應。
從梅拉德反應獲得的化合物，或者一般地所列的肽，可用來制備期望該化合物所提供的香氣的任何產品，例如食品、化妝品或藥品。
食品的例子有乳制品，任何類型的奶制品，例如，舉例來說，奶、酸奶、布丁、冰淇淋或糖食，例如巧克力。同樣，一般的嬰兒食品，或者甚至是寵物食品也可以用本發明的香料化合物加香。特別地，通過將本發明的化合物添加到寵物食品中增加其肉味，能夠提高動物對任何寵物食品的接受度。


圖1顯示了發酵5日的可可豆CNP提取物的RP-HPLC/ESI-MS的UV和總離子流圖譜；圖2顯示了MS/MS分析中FMOC衍生肽的斷裂模式；圖3顯示了不同發酵階段二肽的定量分析。
發明詳述在通往本發明的研究中，本發明人設計了從可可豆天然肽庫中分離和檢測肽的新的方法，該方法迄今為止還未被充分地認識到其可行性。
通過電噴射離子化(electrospray ionization，ESI)質譜測量法聯合利用色譜條件以及使用三氟乙酸/乙腈(TFA/ACN)溶劑系統的RP-HPLC，對可可豆肉粉(CNP)提取物進行分析，結果由于大多數離子相對低的豐度(1-6×104)，僅檢測到極少的物質。這被認為是由“裸露”游離氨基酸和短鏈肽較差的離子化造成的。上柱前用FMOC進行衍生，接著對CNP提取物進行LC/MS分析，結果檢測到數目眾多的峰(圖1)。發明人闡明了所有存在的一系列單一同位素離子，并根據已知的氨基酸保留時間和分子離子質量，繪制了潛在肽的質量列表(表1)。全部未知質量在減去由FMOC部分引起的質量單位222之后，表現出與多達5個殘基的合成肽數據庫的陽性匹配。
表1LC/MSa對CNP提取物中可疑肽質量的鑒定保留時間(min) 分子離子質量[M+H]+13.50-19.2 551.1，625.3，840.419.33-19.5 510.3，707.219.5-22.0 516.222.18-22.38631.122.4-22.57 326，544.4，755.822.9-23.24 441.1，512.024.13-24.34706.5，526.0，403.8，801.024.4-26.5 411，455.126.61-26.81503.0，517.127.24-27.62437.128.14-30.5 425，498.1，45931.6-31.96 427.0，487.1，876.432.43-33.29353.9，387.9，453.0，572.333.5-34.99 467.1，501，735.135.1-36.88 535，850.137.98-38.49749.1，791.1，678.139.41-39.85720.2，883.140.22-40.71692.1，697.241.33-42.01759.1，800.245.59-46.06690.248.59-49.08738.2a，來自圖1。在ms/ms分析中，粗體質量表明了來自FMOC部分的典型分子離子m/z 179的存在。
表2串聯MS/MS對肽的鑒定和特征描述保留時間(min) 分子離子[M+1]+肽質量 肽序列14 840.4 617.4 RGTVVS19 625.3 402.3 IRD19.6 510.3 287.3 IR20.49 516.2 293.2 KF22.5 544.4 321.4 RF或FR22.8 441.1 218.1 EA25.3 411 188 AV25.25 517.1 294.1 EF或FE24.7 455.1，437.0b232.1 IT或LT25.3 503.1 280.1 YV或VY26.1 437.1 214.1 VP27.1 425 202 AD28.49 498.1 275.1 WA或AW29.7 459 236 AF31.7 876.4 653.4 EEETF32 487.1 264.1 VF或FV33.5 467.1 244.1 LL，LY或YL35 501 278 FL36 535 312 MY40 697.2 253.2 AY40 720.2 497.2 EK43 690.2 467.2 KV46 738.2 515.2 FK
b，分子離子減去水分子。
為確定肽的氨基酸序列進行了衍生肽的碰撞誘導斷裂。人工分析了每個肽的斷裂模式。正如所指出的那樣，氨基酸和肽的FMOC衍化引入了附加質量222。在MS/MS過程中，所觀察到的衍生肽的主要斷裂如下與FMOC芳香部分的丟失相應的單一同位素離子m/z 179.2±0.1(參見圖3)。m/z 179的丟失產生了肽質量加上與FMOC O-C＝O部分相應的44的離子(圖3)。所觀察到的其它斷裂是C-末端氨基酸的丟失，產生與N-末端氨基酸加上44質量單位相應的分子離子，揭示了肽序列的身份。另外，同時發生的44質量單位的丟失產生了肽的分子離子。對于因為Lys或Tyr殘基的存在而攜帶附加FMOC部分的肽而言，進行了類似的斷裂模式的觀察。
利用上述策略確定短鏈肽的N-末端和C-末端氨基酸，導致23個肽的鑒定20個二肽，1個三肽，1個五肽，和1個六肽。然而在由同量異序氨基酸，例如由Gln和Lys或者Ile和Leu組成的二肽的情況下，不能夠實現N-或C-末端氨基酸清楚的鑒定。
對發酵周期過程中每個鑒定肽的命運進行作圖。數據顯示于圖3。正如預期的那樣，沒有任何一個肽存在于未發酵的豆中。不過，多數鑒定的肽能夠在1天的發酵豆中檢測得到。對發酵豆(1-7天)中肽的定量分析顯示，對于一組肽(A組)，它們的濃度在發酵3-5天之間達到一個平臺，接著其濃度出現小而明顯的下降。而對于另一組肽(B組)，在發酵3-5天之間達到最高濃度之后再不表現出變化。C組肽在發酵1-2天內達到最高濃度，而在延長的發酵期間沒有進一步的變化。這些數據證明鑒定的肽隨著可可豆的發酵獨特地出現。
在可可貯藏蛋白序列數據庫(2S和21-kDa白蛋白，以及10-、14-、37-、41-kDa豌豆球蛋白(vicillin)多肽)中對所鑒定肽的氨基酸序列進行計算機查找，顯示了與每一種肽100％的匹配。數據明白無誤地證明所有鑒定的肽均是可可來源的，并來自于貯藏蛋白的降解。
為評估鑒定的可可二肽及以上鑒定的化合物的合成類似物的巧克力香料潛力，研究了總計36個二肽(表3)。為弄明白以肽為基礎的梅拉德反應，每個肽的N-末端氨基酸與其C-末端氨基酸互換。所有肽在加工反應中進行了測試。
最初通過在多個不同時間嗅聞來評估所有的樣品。數據顯示于表3。選擇一組11個肽樣品進行大規模嗅覺評估。基于嗅覺評估，二肽Val-Tyr和Tyr-Val清晰地表現出均衡的巧克力香氣。令人驚訝地，來自Tyr-Val的巧克力香氣與Val-Tyr相比更強烈。
表3基于肽的反應香料的香氣特征的評估肽香氣屬性肽香氣屬性IR香辛味，雜味AF焦糖味，水果味RI香辛味，雜味YA焦糖味，雜味KF雜味AY巧克力味面包味，堅果味，烘焙FR雜味KE味，巧克力味RF焦糖味，面包味 EK雜味AE淡焦糖味KF強焦糖味EA淡焦糖味VK焦糖味AV雜味KV雜味VA焦糖味，雜味FV雜味FE焦糖味，雜味VF焦糖味TL雜味，肉味 LL水果味，可可味，花味YV均衡巧克力味LY雜味VY巧克力味，輕微雜味 YL雜味PV烘焙味，面包味 LF雜味VP雜味FL雜味DA雜味，焦糖味MY強烈肉味AD餅干味，焦糖味 YMNCAWA焦糖味，香辛味，雜味FKNCA
AD 餅干味，焦糖味 EFNCAWA 焦糖味，香辛味，雜味LTNCAAW 雜味ITNCAFA 焦糖味，雜味TINCA基于肽的加工反應釋放的香氣類型，最被看好的肽填充了灰顏色。
下列實施例舉例說明本發明，而并非將其限制于此。
實施例180kg成堆的優質西非Amelonado可可豆以香蕉葉覆蓋在象牙海岸的Abengoorou Idefor農場發酵。在7天的發酵周期過程中以1天的間隔取樣，陽光下干燥，人工脫皮，并船運至NRC/洛桑。可可豆被保存于-20℃。
合成肽獲自于Bachem。HPLC級乙腈、甲醇和水來自Merck。三氟乙酸、三乙胺和fluoroscamine來自Fluka。
可溶性肽提取物的制備使干燥的可可豆通過豆軋碎機(Brook Crampon)，接著通過風選機(John Gordon)以除去豆殼。將豆肉于-20℃保存在棕色瓶中。將可可豆肉(20-30g)在普通磨機中(IKA，M-20)碾磨數秒。使豆肉粉通過0.8-mm的篩子，并于4℃保存(NRC參考文獻14C181-0至14C18-7)。
將可可豆肉粉(1g)懸浮于10ml提取溶劑(30％(v/v)甲醇/0.1％(v/v)TFA)中。使懸液在最大速度經受1分鐘勻漿處理(Polytron，Kinematica AG)，并在4℃以15,000rpm離心15分鐘。小心取出清亮上清，通過0.22μm濾片并凍干。干粉溶于5％AcA，通過0.22μm濾片并以小份保存于-20℃。
FMOC衍化將可溶性肽提取物(50-100μl)或者合成肽及氨基酸溶液(10-40nmol/100μl)與400μl硼酸鹽緩沖液(0.1M，pH 10.4)混合。溶液與FMOC試劑(500μl，5.8mM溶于丙酮中)(Einarsson等，J.Chromatogr.66(1983)，3688-3695)劇烈混合。混合物用2ml戊烷-乙酸乙酯(80∶20)萃取2次。含有FMOC衍生物的水相通過RP-HPLC聯合ESI質譜儀進行分析。
LC-MS分析質量測量和肽斷裂利用FinniganMat離子陷阱LCQ質譜儀聯合光譜HPLC系統(FinniganMat)進行。該系統的組成為quaternary pump(TSPP4000)、自動注射器(TSP AS3000)和UV/VIS檢測器(型號UVIS 205，來自Linear Instruments)，配備有高壓不銹鋼流動池(flow cell)(體積1.6μl，路徑長度2mm)。LC流被引導至LCQ質譜儀，而不用分流器。典型地利用如下條件毛細管溫度200℃，套氣流70；輔助氣流10；電源電壓5kV。其它參數如制造商所建議的在校準/調整操作中自動調節。對于多數強離子的MS/MS分析，碰撞誘導的離解能被設置在35％。多數強離子的質量選擇和取舍窗口為1質量單位。
未衍化樣品利用RP C18柱(Nucleosil 100-3 C18HD；3μm，2×150mm，Macherey-Nagel)與線性梯度增長的溶劑B(0.05％TFA/80％ACN(v/v)于水中)在溶劑A(0.045％TFA(v/v)于水中)中分析如下在0％B中等度洗脫10分鐘，0-25％B中25分鐘，25-50％B中10分鐘，50-100％B中5分鐘，接著在100％B中等度洗脫5分鐘。流速為0.2ml/分，并在215nm處檢測。FMOC-衍生物在同一個柱子上利用線性梯度分離0-35％B5分鐘，35-100％B 65分鐘，以及100％B中等度洗脫5分鐘。流速為0.2ml/分，并在260nm處完成檢測。
肽反應模式將預先確定的二肽(305mg)和D-果糖(75mg)混合物添加到50ml有蓋Schott瓶中的預熱(120℃)丙二醇中。用0.01N NaOH(75μl)將反應液的pH調至pH 7.5到8.5。在磁力攪拌器上攪拌反應混合物。反應混合物被加熱達60分鐘，冷卻至室溫并于4℃貯存。
感官評定為初步篩選，小組成員評估并描述加工反應物的香氣特征。在任何給定的時間通過嗅聞最多評估6個反應樣品。這個過程用隨機混合的樣品集合重復3次，以便獲得更高的可信度和更可靠的感官數據。對于大多數看好的侯選物，受訓感官評審小組進行額外的特征描繪。總計17個接受面包屑和/或巧克力評估訓練的小組成員參與了香氣嗅聞測試。測試分別單獨進行(1次1人)，并且數天后重復評估。小組成員不知道相同的香氣評估兩次的事實。基于肽的反應香料嗅聞瓶在測試前1天制備將紙條浸在反應香料中，以便大約1cm的紙被弄濕。然后溫和晃動，切成大約5cm長，并置于20-ml帶蓋玻璃廣口瓶中。廣口瓶用3位數字代碼編碼，并以隨機順序放置在托盤上。在開始運作前，小組成員嗅聞商業焦糖、黑巧克力、可可和餅干香料作為參照。在液體和巧克力辨味的情況下，小組成員按1-9的等級評定不同屬性。辨味會用改變的樣品代碼重復3次。在所有測試的二肽中，以下被認為具有優良的巧克力香氣Tyr-Val、Val-Tyr、Leu-Leu、Pro-Val、Val-Phe和Lys-Glu。
權利要求
1.香料活性化合物，其可通過使選自Arg-Phe、Ala-Glu、Glu-Ala、Val-Ala、Phe-Glu、Thr-Leu、Tyr-Val、Val-Tyr、Pro-Val、Asp-Ala、Ala-Asp、Trp-Ala、Ala-Asp、Trp-Ala、Phe-Ala、Ala-Phe、Tyr-Ala、Ala-Tyr、Lys-Glu、Lys-Phe、Val-Lys、Val-Phe、Leu-Leu、Met-Tyr的肽與還原糖進行梅拉德反應獲得。
2.根據權利要求1的化合物，其中二肽是Leu-Leu、Val-Tyr、Tyr-Val、Ala-Phe或Ala-Asp。
3.根據權利要求1的化合物，其中二肽是Val-Phe或Val-Lys。
4.根據權利要求1的化合物，其中二肽是Met-Tyr或Pro-Val。
5.根據前述權利要求任一項的化合物，其中還原糖是果糖、葡萄糖、木糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖。
6.選自Leu-Leu、Val-Tyr、Tyr-Val、Ala-Phe、Ala-Asp、Val-Phe、Val-Lys的肽在制備巧克力香料中的用途。
7.選自Leu-Leu、Val-Tyr、Tyr-Val、Ala-Phe或Ala-Asp的肽在制備可可香料中的用途。
8.選自Val-Phe或Val-Lys的肽在制備焦糖香料中的用途。
9.選自Phe-Val或Lys-Glu的肽在制備面包香料中的用途。
10.Met-Thr在制備肉香料中的用途。
11.制備巧克力香料的工藝，其包括使選自Leu-Leu、Val-Tyr、Tyr-Val、Ala-Phe、Ala-Asp、Val-Phe、Val-Lys、Leu-Leu和Val-Tyr的肽與還原糖進行梅拉德反應。
12.制備可可香料的工藝，其包括使選自Leu-Leu、Val-Tyr、Tyr-Val、Ala-Phe和Ala-Asp的肽與還原糖進行梅拉德反應。
13.制備焦糖香料的工藝，其包括使選自Val-Phe和Val-Lys的肽與還原糖進行梅拉德反應。
14.制備肉香料的工藝，其包括使Met-Tyr與還原糖進行梅拉德反應。
15.根據權利要求10到14中任一項的工藝，其中還原糖包括果糖、葡萄糖、木糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖。
16.根據權利要求1到5中任一項的化合物或者選自Arg-Phe、Ala-Glu、Glu-Ala、Val-Ala、Phe-Glu、Thr-Leu、Tyr-Val、Val-Tyr、Pro-Val、Asp-Ala、Ala-Asp、Trp-Ala、Ala-Asp、Trp-Ala、Phe-Ala、Ala-Phe、Tyr-Ala、Ala-Tyr、Lys-Glu、Lys-Phe、Val-Lys、Val-Phe、Leu-Leu、Met-Tyr的肽在制備食品、化妝品或藥品中的用途。
17.根據權利要求15的用途，其中食品是巧克力、奶、酸奶、布丁、冰淇淋、飲料、嬰兒食品、預制食品、加工香料(process flavor)或寵物食品。
全文摘要
本發明涉及可從可可豆獲得、并且在與還原糖進行梅拉德反應后引起獨特鮮明風味的特殊肽。具體地，本發明涉及所述特殊肽在制備巧克力香料，具體地是可可香料和焦糖香料，花香料或者具體地，糖果香料，面包香料，烘焙香料以及肉香料中的用途。
文檔編號A23L1/231GK1561165SQ02819415
公開日2005年1月5日 申請日期2002年9月6日 優先權日2001年10月1日
發明者S·科赫哈, C·E·漢森, M·A·朱利瑞特 申請人:雀巢產品有限公司