經修飾的因子ix的制作方法

專利名稱：經修飾的因子ix的制作方法
技術領域：
本發明涉及尤其是用于對人施用的、特別是用于治療的多肽。所述的多肽是經修飾的多肽，其中所述的修飾使得上述多肽在施用于人體時引起免疫應答的傾向減弱。本發明特別涉及對人因子IX的修飾，該修飾使得體內使用時這些人因子IX蛋白基本上無免疫原性，或比任一未經修飾的相應蛋白的免疫原性低。
背景技術：
有許多例子表明治療蛋白的效率受限于針對所述治療蛋白的干擾性免疫反應。已有若干種小鼠單克隆抗體表現出治療多種人類疾病的前景，但在某些情況下由于誘導出相當程度的人抗鼠抗體(HAMA)應答而未能成功應用[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.1351530-1535]。對于單克隆抗體，已開發了多種技術以試圖減弱HAMA應答[WO 89/09622；EP0239400；EP 0438310；WO 91/06667]。這些重組DNA方法通常是減少最終的抗體構建體中小鼠的遺傳信息，同時增加最終構建體中人的遺傳信息。盡管如此，在許多情況下，所得的“人源化”抗體仍然引起患者的免疫應答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 681417-1420]。
抗體不是唯一一類作為治療劑施用的可引起免疫應答的多肽分子。即使是人源的并在人與人之間具有相同氨基酸序列的蛋白質仍可在人體中誘導免疫應答。明顯的實例包括粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的治療性應用(Wadhwa，M.等人(1999)臨床癌研究(Clin.Cancer Res.)51353-1361)和干擾素α2的治療性應用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein，R.等人(1988)新英格蘭醫學雜志(New Engl.J.Med.)3181409-1413)。在這些人蛋白具有免疫原性的情況下，可能發生了對這些蛋白的免疫耐受的破壞，否則對這些蛋白的免疫耐受將在這些受試者體內運行。
當人蛋白被作為替代治療，例如在蛋白的組成性缺乏如血友病A、血友病B、高歇氏病(Gauchers disease)和許多其他疾病的遺傳性疾病中，情況就不同了。在這些情況下，治療學替代蛋白可能一開始就作為外來分子而產生免疫應答，并且當個體能夠產生針對該治療劑的免疫應答時，該治療的功效將大打折扣。
不管該蛋白治療劑被宿主免疫系統視作外來分子還是本來存在的對該分子的耐受被克服了，對該蛋白的免疫反應的機理是相同的。誘導免疫應答的主要因素是在蛋白中存在可經由MHC II類分子的呈遞作用激活T-細胞活性的肽(即所謂的T-細胞表位)。此類T-細胞表位通常定義為任何能夠與MHC II類分子結合的氨基酸殘基序列。隱含地，″T-細胞表位″是指當其與MHC分子結合時可被T-細胞受體(TCR)識別的表位，并且至少原則上，這種表位可以通過與TCR相互作用而激活這些T-細胞以促進T-細胞應答。
MHC II類分子為一組在T輔助細胞的選擇和活化中起中心作用的高度多態性蛋白質。人類白細胞抗原群DR(HLA-DR)為該組蛋白質的主要同種型，但是，同種型HLA-DQ和HLA-DP行使相類似的作用。人群中的每一個體具有二至四個DR等位基因，兩個DQ和兩個DP等位基因。已解析了許多DR分子的結構，這些結構揭示了一個具有一些可結合肽的疏水殘基(口袋殘基)的疏水口袋的敞口肽結合溝[Brown等人，自然(Nature)(1993)36433；Stern等人(1994)自然(Nature)368215]。確定II類分子的不同同種異型的多態性促成了肽結合溝內用于結合肽的不同表面的大量多樣性，并在群體水平上確保了在識別外源蛋白質并引起對病原生物體的免疫應答的能力方面有最大的靈活性。
針對治療性蛋白的免疫應答通過MHC II類肽呈遞途徑進行。其間外來蛋白經吞噬和加工后與DR、DQ或DP型MHC II類分子結合以進行呈遞。MHC II類分子由專門抗原呈遞細胞(APC)如巨噬細胞、樹突狀細胞等表達。通過MHC II類肽復合體與T細胞表面的關聯性T-細胞受體的相互作用，及與某些其他共受體，如CD4分子的交聯結合可誘導T-細胞進入激活狀態。上述激活作用可導致細胞因子釋放，進一步激活其他淋巴細胞如B細胞產生抗體或激活T殺傷細胞形成完整的細胞免疫應答。
T細胞表位的鑒定是消除表位的第一步，然而，本領域中少有將表位鑒定和表位去除整合為一個方案的清楚的例子。因此，WO98/52976和WO00/34317中公開了鑒定具有與人MHC II類DR同種異型亞群結合的潛在能力的多肽序列的計算機穿線方法(computational threadingapproaches)。這些教導中，利用目的蛋白中合理的氨基酸置換除去預測的T細胞表位。然而，在該方案和其他基于計算的表位鑒定方法[Godkin，A.J.等人(1998)免疫學雜志(J.Immunol.)161850-858；Stumiolo，T.等人(1999)自然生物技術(Nat.Biotechnol.) 17555-561]中，預測的能夠結合MHC II類分子的肽可能不會在所有情況下(尤其是在體內由于加工途徑或其他現象)都起T細胞表位的作用。
同樣，例如用限定的MHC同種異型B細胞系作為MHC II類結合表面的來源以測量合成肽結合MHC II類分子的能力的體外方法可以應用于MHC II類配體的鑒定[Marshall K.W.等人(1994)免疫學雜志(J.Immunol.)1524946-4956；O′Sullivan等人(1990)免疫學雜志(J.Immunol.)1451799-1808；Robadey C.等人(1997)免疫學雜志(J.Immunol)1593238-3246]。然而，這些技術不適于篩選各種MHC同種異型的多種潛在表位，也不能確定結合肽能夠起T細胞表位的作用。
最近利用重組MHC分子與合成肽的可溶性復合體的技術已經得到應用[Kern，F.等人(1998)自然醫藥(Nature Medicine)4975-978；Kwok，W.W.等人(2001)免疫學趨勢(TRENDS in Immunology)22583-588]。這些試劑和方法用于鑒定人或實驗動物受試者的外周血樣中能結合特定MHC-肽復合物的T細胞克隆的存在，但是這些試劑和方法不適于篩選各種MHC同種異型的多種潛在表位。
T細胞活化的生物學測定提供了一個解讀試驗肽/蛋白序列引起免疫應答的能力的實用選擇。該類方法的例子包括Petra等人用對細菌蛋白葡萄球菌激酶的T細胞增殖進行測定，然后用合成肽刺激T細胞系的表位作圖[Petra，A.M.等人(2002)免疫學雜志(J.Immunol.)168155-161]。類似地，使用破傷風毒素蛋白的合成肽進行T細胞增殖測定導致明確了該毒素免疫顯性的表位區[Reece J.C.等人(1993)免疫學雜志(J.Immunol.)1516175-6184]。WO99/53038公開了一種方法，該方法利用分離的人免疫細胞亞型，促進它們的體外分化，在合成的目的肽存在時培養細胞，并測定培養的T細胞中任何誘導的增殖來確定受試蛋白的T細胞表位。同樣的技術也被Stickler等人[Stickler，M.M.等人(2000)免疫治療雜志(J.Immunotherapy)23654-660]描述過，在這兩個例子中，該方法都用于檢測細菌枯草桿菌蛋白酶的T細胞表位。這種技術需要小心應用細胞分離技術和補充多種細胞因子的細胞培養基以得到所需的免疫細胞亞型(樹突狀細胞、CD4+和/或CD8+T細胞)，并且無助于使用多種供體樣品的快通量篩選。
根據上述描述，由此可能期望鑒定、去除或至少減少給定的原則上具有治療價值但原本具有免疫原性的肽、多肽或蛋白中的T-細胞表位。人因子IX(這里簡寫為FIX)是這些有治療價值的分子之一，其是人體中血液凝固途徑的關鍵組分。
FIX為維生素K依賴的血漿蛋白，其在鈣離子、磷脂和因子VIIIa存在下通過將因子X轉化為其活性形式而參與血液凝固的固有途徑。FIX的主要催化能力是作為特異的絲氨酸蛋白酶對因子X中特定的精氨酸-異亮氨酸鍵起作用。通過因子XIa活化FIX，所述因子XIa從FIX切除活性肽而產生活化的FIX，其包含由一個或多個二硫鍵連接的兩條鏈。FIX的缺乏引起退行性X-連鎖的血友病B。
本發明涉及人凝血因子IX(FIX)并涉及含有前肽(粗體)和激活肽(下劃線)的FIX蛋白分泌形式的氨基酸序列，以單字母代碼描述如下TVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT本發明的一個特別的目的是提供經修飾的FIX蛋白，其中通過減少潛在的T細胞表位數而改變免疫特性。
其他人已提供了FIX分子[US5,171,569；EP0195592；EP0430930]及其重組產生和純化的方案[US5,714,583；US4,770,999]，但是這些教導沒有說明T細胞表位對該蛋白免疫原性的重要性，根據本發明的方案不認為這些教導以特異性或受控制的方式直接影響所述特性。
非常希望提供具有減少或者沒有可能在人類受試者中誘導免疫應答的FIX。
發明概述和描述本發明提供了修飾形式的FIX，其中，通過減少或去除大量潛在的T-細胞表位的方式對該因子的免疫學特性進行修飾。
本發明公開了在FIX一級序列內鑒定到的由于具有與MHC II類分子結合的可能性而是潛在T-細胞表位的序列。該公開尤其涉及本文上面所給的人FIX蛋白序列，其含有433個氨基酸殘基。
本發明公開了在人中具免疫原性的FIX一級序列的主要區域，因此，本發明提供了對這些序列進行修飾以消除或者降低這些位點的免疫原性效力所需的關鍵信息。
在一個實施方案中，含有免疫原性區的合成肽可以在藥物組合物中提供以促進對整個分子的耐受原應答。
在另一個實施方案中，本文公開的在表位區內修飾的FIX分子可以用于藥物組合物。
總之，本發明涉及下述內容●一種經修飾的分子，其具有FIX的生物學活性，且當其在體內應用時基本上無免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物學活性但未經修飾的分子；●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過從原始的未經修飾的分子中去除一個或多個T-細胞表位而實現的；●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過減少能與來自所述分子的肽相結合的MHC同種異型的數量來實現的；●如上所述的分子，其中，去除了一個T-細胞表位；●如上所述的分子，其中，所述原本存在的T-細胞表位是MHC II類配體或通過呈遞在II類分子上后有刺激或結合T-細胞的能力的肽序列；●如上所述的分子，其中該肽序列選自如表1中所示的肽序列；●如上所述的分子，其中在任何原本存在的T細胞表位中1-9個氨基酸殘基，優選地1個氨基酸殘基發生了改變；●如上所述的分子，其中，氨基酸殘基的改變為在特定位點處用另外的氨基酸殘基替代原本存在的氨基酸殘基、向原本存在的氨基酸殘基添加另外的氨基酸殘基或將原本存在的氨基酸殘基缺失；●如上所述的分子，其中，按表2所示進行一個或多個氨基酸殘基的替代；●如上所述的分子，其中(額外地)如表3中所示進行一個或多個氨基酸殘基替代，以減少能夠結合源自該分子的肽的MHC同種異型的數目；●如上所述的分子，其中，如果必要，一般可通過替代、添加或缺失特定氨基酸進行額外的進一步改變，以恢復所述分子的生物學活性；●如上所述的FIX分子，其中一個或多個氨基酸替代在相應于表2或表3中特定的任何氨基酸位置進行；●如上所述的FIX分子，其中一個或多個氨基酸替代在相應于表2或表3中特定的任何氨基酸位置進行，但是排除任何那些從血友病B突變數據庫已知的與功能蛋白不匹配的替代；●藥物組合物，其包含具有結合MHC II類活性的上面的肽或修飾肽的任何一種；●DNA序列或分子，其編碼如上或如下所定義的任何一種所述特異修飾的分子；●藥物組合物，其包含如上述和/或權利要求中定義的具有FIX生物學活性的經修飾分子，并可任選地包含藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑；●用于制備具有FIX生物學活性的修飾分子的方法，所述修飾分子為在以上引用的權利要求的任一項中所定義的修飾分子，所述方法包括以下步驟(i)確定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；(ii)通過任意方法，包括利用體外或硅片上(in silico)的技術或生物學試驗確定所述肽與MHC分子的結合，由此鑒定所述蛋白的氨基酸序列中潛在的一個或多個T-細胞表位；(iii)設計新的序列變體，其中，經鑒定的潛在T-細胞表位內有一個或多個氨基酸經過修飾，由此基本上減弱或去除了所述T-細胞表位的活性，這一效果可由體外或硅片上(in silico)的技術或生物學試驗通過所述肽與MHC分子的結合來確定；(iv)通過重組DNA技術構建所述序列變體，并檢測所述的變體以便鑒定一個或多個具有所需性質的變體；和(v)任選地重復步驟(ii)-(iv)；●如上所述的方法，其中步驟(iii)是通過在任何原本存在的T-細胞表位中替代、添加或缺失1-9個氨基酸殘基來進行的；●如上所述的方法，其中，所述的改變是參照同源蛋白質序列和/或硅片上(in silico)建模技術進行的；●如上所述的方法，其中以上步驟(ii)是通過下述步驟進行的(a)選擇具有已知氨基酸殘基序列的肽的一個區域；(b)然后由所選擇的區域中順序抽取預定統一大小且至少由3個氨基酸殘基組成的重疊氨基酸殘基片段；(c)通過對存在于抽樣氨基酸殘基片段中的每個疏水氨基酸殘基側鏈賦值求和，計算每一抽樣片段的MHC II類分子結合分值；和(d)根據計算出的該片段的MHC II類分子結合分值鑒定至少一個適于修飾的片段，以在基本上不減弱所述肽的治療功效的前提下改變肽的整體MHCII類結合分值；步驟(c)優選地通過下述步驟利用經改進而包含了12-6范德華配體-蛋白能量排斥項和配體構象能量項的Bhm評分函數(scoringfunction)進行，所述步驟為(1)提供MHC II類分子模型第一數據庫；(2)提供所述MHC II類分子模型的容許肽主鏈(allowed peptide backbone)的第二數據庫；(3)從第一數據庫中篩選模型；(4)從第二數據庫中篩選容許肽主鏈；(5)鑒定在每個抽樣片段中存在的氨基酸殘基側鏈；(6)確定存在于每個抽樣片段中的所有側鏈的結合親和性值；以及對每一所述模型和每一所述主鏈重復步驟(1)到(5)；●選自表1的具有潛在的MHC II類結合活性且由未經修飾的FIX產生的13聚體(mer)T-細胞表位肽，及其在制備在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低于具有相同生物學活性的任何未修飾分子的FIX中的用途；●由上述的13mer T-細胞表位肽中的至少9個連續的氨基酸殘基組成的肽序列，及其在制備在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低于具有相同生物學活性的任何未修飾分子的FIX中的用途；●在生物學T細胞測定中使用一組合成肽以對人FIX的免疫原性區作圖；●在生物學T細胞測定中使用一組FIX蛋白變體以選擇顯示體外最小免疫原性的變體；●在生物學T細胞測定中使用一組合成肽以選擇顯示體外最小免疫原性的肽序列；●使用T細胞刺激的生物學分析以選擇在幼稚T細胞測定中刺激指數小于2.0、優選小于1.8的蛋白變體；
●用分離自健康供體的PBMC構建FIX蛋白的T細胞表位圖和包括下面步驟的篩選方法i)用合成肽或者完整蛋白免疫原進行體外抗原接觸，培養時間長達7天；ii)加入IL-2并培養長達3天；iii)加入接觸過抗原的T細胞到自體照射的PBMC中并且用抗原再次攻擊，培養時間為4天和iv)通過任何合適的方法測量增殖指數；●在幼稚T細胞測定中能夠引起刺激指數大于1.8、優選大于2.0的FIX衍生肽序列；●在幼稚T細胞測定中刺激指數大于1.8、優選大于2.0的FIX衍生肽序列，其中肽被最小程度地修飾并在幼稚T細胞測定中檢驗發現其刺激指數小于2.0；●FIX衍生肽序列和野生型蛋白序列具有100％的氨基酸同一性，并且能夠在T細胞測定中引起的刺激指數為1.8或者更大、優選大于2.0；●如上所述的FIX肽序列，其被修飾而和野生型蛋白序列的氨基酸同一性小于100％，并且在T細胞測定中引起的刺激指數小于2.0；●一種含有經修飾的肽序列的FIX分子，當該修飾的肽序列單獨測試時，其在T細胞測定中引起的刺激指數小于2.0；●一種含有經修飾的FIX分子，該修飾使得在T細胞測定中測試時引起比未修飾的蛋白分子降低的刺激指數；●一種FIX分子，其中用T細胞測定對免疫原性區進行了作圖，然后對其進行修飾，使得在T細胞測定中重新試驗時，修飾的蛋白引起的刺激指數比親本(未修飾的)分子小、最優選小于2.0；●一種FIX分子，其中用T細胞測定對免疫原性區進行作圖，T細胞測定利用來自血友病B病人的細胞，然后對免疫原性區進行修飾，使得在T細胞測定中重新試驗時，該修飾蛋白引起的刺激指數小于親本(未修飾的)分子所引起的刺激指數。
術語″T細胞表位″根據本發明的理解是指這樣的氨基酸序列，其可以結合MHC II類分子、可刺激T細胞和/或也可在與MHC II類的復合體中結合(不必可測得地活化)T細胞。
此處及后附權利要求中所用的術語“肽”是指包含兩個或多個氨基酸的化合物。氨基酸之間通過肽鍵(定義見下)相連。肽的生物生產中涉及20種不同的天然氨基酸，任意數量的所述氨基酸可按任意的順序連接形成肽鏈或環。用于生物生產肽中的天然氨基酸全部具有L-構型。可應用常規的合成方法利用L-氨基酸、D-氨基酸或兩種不同構型的氨基酸的各種組合制備合成肽。一些肽僅包含少量的氨基酸單元。例如含有不到10個氨基酸單元的短肽有時被稱作“寡肽”。其他的包含大量氨基酸殘基，例如達100個或更多個氨基酸殘基的肽稱作“多肽”。習慣上將含有3個或3個以上氨基酸的任何肽鏈看作“多肽”，而通常將“寡肽”視為特定類型的短“多肽”。因而本文所提到的“多肽”應理解為也包括“寡肽”。而且，所提到的“肽”包括多肽、寡肽和蛋白。不同的氨基酸排列形式形成不同的多肽或蛋白。因此，多肽的數量以及可形成的不同蛋白的數量實際上是無限的。“α碳(Cα)”是肽鏈的碳-氫(CH)組分中的碳原子。“側鏈”是Cα的側基，其可包含簡單的或復雜的基團或部分，且具有與所述肽的大小相比可顯著變化的外形大小。
本發明可應用于與此處公開的FIX具有基本上相同的一級氨基酸序列的任何FIX分子，因此包括利用基因工程手段或其他方法獲得的、可能包含多于或少于433個氨基酸殘基的FIX分子。本公開的許多肽序列和從非人源FIX蛋白得到的肽序列一樣或者至少和那些非人FIX蛋白得到的肽序列基本一樣。這些蛋白序列因此同樣都位于本發明范圍之內。
本發明是為了克服實際應用中存在的下述問題，即將可溶性蛋白引入自體生物中可引發免疫應答，產生可與所述可溶性蛋白相結合的宿主抗體。本發明通過提供施用于人宿主時引起免疫應答的傾向發生改變的FIX蛋白以試圖解決這個問題。根據本文描述的方法，發明人已經發現了含有驅動對該蛋白產生免疫應答的關鍵性T細胞表位的FIX分子區域。
本發明中形成經修飾的FIX的總的方法包括下述步驟
(a)確定多肽或其中一部分的氨基酸序列；(b)通過任意方法，包括利用體外或硅片上(in silico)的技術或生物學試驗確定所述肽與MHC分子的結合，由此鑒定所述蛋白的氨基酸序列中潛在的一個或多個T-細胞表位；(c)設計新的序列變體，其中，經鑒定的潛在T-細胞表位內有一個或多個氨基酸經過修飾，由此基本上減弱或去除了所述T-細胞表位的活性，這一效果可由體外或硅片上(in silico)的技術或生物學試驗通過所述肽與MHC分子的結合來確定。構建此序列變體以避免由所述的序列變體產生新的潛在T-細胞表位，否則所述的新的潛在T細胞表位又通過此種方式進行修飾以基本上減弱或消除T-細胞表位活性；和(d)根據已知的重組技術通過重組DNA技術構建所述序列變體，并檢測所述的變體以便鑒定一個或多個具有所需性質的變體。
對于步驟(b)中對潛在T-細胞表位的鑒定可依照本領域已公知的方法進行。在WO 98/59244；WO 98/52976；WO 00/34317中也公開了適當的方法，并優選用于鑒定從FIX衍生的肽對MHC II類分子的結合傾向。
在實施例1中公開了另一種非常有效的通過計算鑒定T-細胞表位的方法，它是本發明的優選實施方案。
涉及人FIX蛋白序列的根據上述方案中步驟(b)的分析結果列于表1。
表1人FIX中具有潛在人MHC II類結合活性的肽序列TVFLDHENANKIL，VFLDHENANKILN，NKILNRPKRYNSG，KILNRPKRYNSGK，KRYNSGKLEEFVQ，GKLEEFVQGNLER，EEFVQGNLERECM，EFVQGNLERECME，GNLERECMEEKCS，ECMEEKCSFEEAR，CSFEEAREVFENT，REVFENTERTTEF，
EVFENTERTTEFW，TEFWKQYVDGDQC，EFWKQYVDGDQCE，KQYVDGDQCESNP，QYVDGDQCESNPC，PCLNGGSCKDDIN，DDINSYECWCPFG，NSYECWCPFGFEG，ECWCPFGFEGKNC，CPFGFEGKNCELD，FGFEGKNCELDVT，CELDVTCNIKNGR，LDVTCNIKNGRCE，CNIKNGRCEQFCK，EQFCKNSADNKVV，NKVVCSCTEGYRL，KVVCSCTEGYRLA，EGYRLAENQKSCE，YRLAENQKSCEPA，PAVPFPCGRVSVS，VPFPCGRVSVSQT，GRVSVSQTSKLTR，VSVSQTSKLTRAE，SKLTRAEAVFPDV，EAVFPDVDYVNST，AVFPDVDYVNSTE，PDVDYVNSTEAET，VDYVNSTEAETIL，DYVNSTEAETILD，ETILDNITQSTQS，TILDNITQSTQSF，DNITQSTQSFNDF，QSFNDFTRVVGGE，NDFTRVVGGEDAK，TRVVGGEDAKPGQ，RVVGGEDAKPGQF，GQFPWQVVLNGKV，FPWQVVLNGKVDA，WQVVLNGKVDAFC，QVVLNGKVDAFCG，VVLNGKVDAFCGG，GKVDAFCGGSIVN，DAFCGGSIVNEKW，GSIVNEKWIVTAA，SIVNEKWIVTAAH，EKWIVTAAHCVET，KWIVTAAHCVETG，WIVTAAHCVETGV，HCVETGVKITVVA，TGVKITVVAGEHN，VKITVVAGEHNIE，ITVVAGEHNIEET，TVVAGEHNIEETE，HNIEETEHTEQKR，RNVIRIIPHHNYN，NVIRIIPHHNYNA，IRIIPHHNYNAAI，RIIPHHNYNAAIN，HNYNAAINKYNHD，AAINKYNHDIALL，NKYNHDIALLELD，HDIALLELDEPLV，IALLELDEPLVLN，ALLELDEPLVLNS，LELDEPLVLNSYV，EPLVLNSYVTPIC，PLVLNSYVTPICI，LVLNSYVTPICIA，NSYVTPICIADKE，SYVTPICIADKEY，TPICIADKEYTNI，ICIADKEYTNIFL，KEYTNIFLKFGSG，TNIFLKFGSGYVS，NIFLKFGSGYVSG，IFLKFGSGYVSGW，LKFGSGYVSGWGR，SGYVSGWGRVFHK，GYVSGWGRVFHKG，SGWGRVFHKGRSA，GRVFHKGRSALVL，RVFHKGRSALVLQ，SALVLQYLRVPLV，ALVLQYLRVPLVD，LVLQYLRVPLVDR，LQYLRVPLVDRAT，QYLRVPLVDRATC，LRVPLVDRATCLR，VPLVDRATCLRST，PLVDRATCLRSTK，TCLRSTKFTIYNN，TKFTIYNNMFCAG，FTIYNNMFCAGFH，TIYNNMFCAGFHE，NNMFCAGFHEGGR，NMFCAGFHEGGRD，AGFHEGGRDSCQG，PHVTEVEGTSFLT，TEVEGTSFLTGII，TSFLTGIISWGEE，SFLTGIISWGEEC，TGIISWGEECAMK，GIISWGEECAMKG，ISWGEECAMKGKY，CAMKGKYGIYTKV，GKYGIYTKVSRYV，YGIYTKVSRYVNW，GIYTKVSRYVNWI，TKVSRYVNWIKEK，SRYVNWIKEKTKL，RYVNWIKEKTKLT
肽是13肽，氨基酸用單字母代碼表示。
涉及本發明的經修飾分子的根據上述方案中步驟(c)和(d)的設計和構建結果列于表2和表3。
表2導致人FIX T細胞表位去除的替代(WT＝野生型殘基)
表3導致相應于一個或多個MHC同種異型的潛在T-細胞表位去除的額外替代
檢測T細胞表位的另一個技術方法是通過生物學T細胞測定。對于檢測人FIX分子內的T細胞表位，一個特別有效的方法將是檢驗表1中所有或者任何肽序列引起體外培養的人T細胞的增殖性應答的能力。優選的方法將是利用血友病B個體的外周血單核細胞(PBMC)，實際上，由于個體中的遺傳缺陷，FIX蛋白抗原可以成為外來蛋白。從這種意義上說，該蛋白很可能代表體內的強抗原，并且本發明人已經建立了現在可從這些個體的PBMC體外建立多克隆或單克隆T細胞系，并且這些細胞系可以用作蛋白中T細胞表位作圖的有效細胞系。這可以通過將T細胞進行幾輪抗原(FIX)體外刺激后立即在IL-2存在下增殖而完成。為了建立多克隆T細胞系，2-3輪抗原刺激通常足夠產生大量抗原特異性細胞。這些細胞被用于篩選大量的合成肽(例如以肽庫的形式)，并且它們可以低溫保藏以備用。在包括將FIX抗原和PBMC共同孵育7天后的最初一輪完成后，隨后在最優選的作為抗原呈遞細胞的自體經照射PBMC存在下，進行抗原的再次攻擊。這些輪的抗原選擇進行3-4天，并且引入包括用IL-2刺激的增殖階段，可以每3天加入IL-2，總的時間約9天。最后的再次攻擊用已經“靜息”的T細胞(即沒有被IL-2刺激已經約4天了)進行。如前所述使用最優選的自體抗原呈遞細胞，用抗原(例如合成肽或完整蛋白)刺激這些細胞約4天，隨后測量增殖應答(如果有的話)。可以用任何方便的方法測量增殖應答，一種公知的方法例如是使用3H-胸腺嘧啶摻入測定。
所以，本文上面所實施的方法包括產生來自血友病B個體的PBMC樣品的T細胞系或者寡克隆培養物、用合成肽或者完整蛋白制品體外刺激所述細胞系或培養物、體外測定單獨的合成肽或蛋白的增殖效果(如果存在)、產生單個合成肽或完整蛋白的修飾變體、重新檢驗所述修飾肽或蛋白的促進T細胞系或培養物產生顯著增殖性應答的后續能力。
尤其有用的是建立個體的寡克隆培養物的T細胞系，在這些個體中已經開始了先前的治療性替代治療并且該替代治療已經導致對該治療性蛋白的免疫應答的誘導。在該方案中，尤其希望利用來自這類所謂的“抑制劑病人(inhibitor patient)”的PBMC樣品，因為預期有許多這些個體的T細胞庫所定義的FIX蛋白的表位圖將代表能夠進行體內呈遞的大多數優勢肽表位。在這種意義上說，來自在先前顯示出免疫應答的病人的PBMC構成了體內接觸治療性蛋白的產物，并且如果來自這些個體的PBMC細胞系原則上是用于體外免疫記憶測定，它還提供了實際的好處有能力對任何給定的刺激肽或蛋白進行更大幅度的增殖性應答。這降低了進行增殖測定的技術挑戰，并且在這種情況下可以有機會定義免疫顯性表位的可能的序位，如對于FIX，本文中通過計算發現其含有多種MHC II類肽配體并因此含有多種或者復雜的(即重疊的)T細胞表位。
盡管從以前用治療性FIX替代治療導致誘導對FIX產生免疫應答的個體建立寡克隆培養物的T細胞系是尤其有用的，但是這些個體不是唯一的可用于對體內相關的免疫原性表位作圖的細胞的來源。也可以使用健康共同的幼稚T細胞，然而，此時對任何個體肽所得到的刺激指數的大小較低而需要敏感的測量從背景中看出該肽或蛋白所誘導的刺激。本發明人已經用熟知的技術建立了這種測定的實施方法，其中等于或大于2.0的刺激指數可用以測量誘導的增殖，其中刺激指數為測得的受試(多)肽的增殖分值(例如如果用3H-胸腺嘧啶摻入，則為每分鐘的計數)與沒用受試(多)肽接觸的細胞中測得的增殖分值的商。這種類型的合適方法在實施例2中詳述。
當在生物學測定中鑒定了多種潛在表位，尤其是發現許多肽序列能夠刺激T細胞時，也可以進行該蛋白的結構特征與其通過MHC II類呈遞途徑引起免疫應答的傾向的認識。例如，當知道了目的蛋白的晶體結構時，可以分析晶體學B因子分值以證明該蛋白內的結構無序，該晶體學B因子分值參數被認為與鄰近生物學相關的免疫顯性肽表位相關[Dai G.等(2001)生物化學雜志(J.Biological Chem.) 27641913-41920]。當在FIX絲氨酸蛋白酶結構域和FIX的EGF樣結構域晶體結構上進行這種分析[PDB ID1RFN，Hopfner，K.P.等(1999)結構(Structure)7.989]時表明很可能在絲氨酸蛋白酶結構域中存在多個免疫顯性表位，在該結構域的235個氨基酸殘基中有至少11個高于B因子平均分值的峰。相反，較小(57個殘基)的EGF樣結構域顯示出2個高于B因子平均分值的峰，這表明可能有兩個生物學相關的T細胞表位位于該結構域。所以，在本發明的方案中，該數據表明在表2和表3所列出的氨基酸替代中，最優選的替代包括那些針對包含在EGF樣結構域的133-161位殘基和分散在整個絲氨酸蛋白酶結構域但從250位纈氨酸殘基開始的殘基的替代。
在實踐中，將產生許多的變體FIX蛋白并且檢驗所需的免疫和功能特征。可以參考血友病B突變的公開數據庫[例如數據庫“http//www.umds.ac.uk/molgen/”]，也可以將在表2和表3中列出的已知為血友病B的致病突變排除于分析之外，或者為了恢復該蛋白的功能活性，可以選擇地進行補償突變。在一切情況下，最優選通過熟知的重組DNA技術生產變體蛋白，雖然可以考慮包括FIX片段的化學合成的其他方法。
本發明涉及這樣的FIX類似物，其中至少一個氨基酸殘基的替代在導致該蛋白的活性顯著降低或一個或多個潛在T細胞表位被除去的位置處進行。最優選提供FIX分子，其中氨基酸修飾(例如替代)在親本分子的免疫原性最強區進行。本發明主要的優選實施方案包括這樣的FIX分子，其中改變任何MHC II類配體以消除肽對MHC同種異型的結合或者減少該肽結合MHC同種異型的數目。
為了除去T細胞表位，優選在所預測的肽序列中合適的位點進行氨基酸替代以完成T細胞表位活性的減小或者消除。實踐中，合適的位點優選等同于在MHC II類結合溝所提供的口袋之一中結合的氨基酸殘基。
最優選的是在所述肽的稱作P1或P1錨的位置改變在裂縫的第一口袋內的結合。公認地，肽的P1錨殘基和MHC II類結合溝的第一口袋之間的結合相互作用的質量是整個肽的總結合親和性的主要決定因素。在所述肽的這一位置的適當替代是替代為不易容納到所述口袋中的殘基，例如替代為更親水的殘基。所述肽中處于如下位置的氨基酸殘基也被認為是落入本發明的范圍內，所述位置為與MHC結合裂縫的其他口袋區域結合的位置。
可以理解，由給定的潛在T-細胞表位內的單一氨基酸替代導致該表位去除的路線是最優選的。也可以在單一表位內進行組合替代，例如，這可能對于單獨定義的表位間彼此重疊的情況特別適宜。此外，在給定的表位內的單氨基酸替代或在一個表位內的組合氨基酸替代也可以在非對應于MHC II類結合溝的″口袋殘基″的位置，而是在所述肽序列內的任意位點上進行。替代可參照同源結構或由本領域已知的硅片上(insilico)技術產生的結構方法進行，也可以根據本發明分子的已知結構特征進行。所有此類替代均落入本發明的范圍內。
也可以考慮在上面所鑒定的肽之外進行氨基酸替代，特別是與在所列肽內進行的替代相結合的情況下。例如可以考慮利用某種改變恢復變體分子的結構或生物學活性。這種補償性的改變和在FIX多肽中缺失或添加特定的氨基酸殘基以得到具有所需活性的變體的改變，以及在任何本發明公開的肽中進行的改變均落入本發明的范圍內。
本發明的范圍涉及經修飾的FIX，含有上述經修飾的FIX蛋白或經修飾的FIX蛋白片段的組合物及其相關的組合物應認為均落入本發明的范圍內。另一方面，本發明涉及編碼經修飾的FIX實體的核酸。另一方面本發明涉及利用經修飾的FIX蛋白對人進行治療的方法。
實施例1有多種因素對決定蛋白或多肽的總體結構起重要作用。首先是肽鍵，即將氨基酸連接在一起形成鏈的鍵，它是一種共價鍵。這種鍵是平面結構的，實質上是一種取代的酰胺。“酰胺”指含-CONH-基團的一組有機化合物中的任何一個化合物。
連接相鄰氨基酸的Cα的平面肽鍵如下所示 由于O＝C和C-N原子位于一個相對剛性的平面中，所以不會發生沿這些軸的自由旋轉。因此，圖中虛線所示的平面有時被稱作“酰胺”平面或“肽平面”，肽主鏈中的氧(O)、碳(C)、氮(N)和氫(H)原子位于其中。Cα原子位于酰胺平面中相對的角上。由于肽或酰胺平面中的O＝C和C-N原子基本上不發生旋轉，所以多肽鏈包含一系列連接Cα原子的平面肽鍵。
第二個對決定多肽或蛋白的整體結構或構象起重要作用的因素是每一酰胺平面繞共有Cα鍵的轉角。此后術語″轉角″和″扭轉角″是等同的術語。假定O、C、N和H原子保留在酰胺平面中(這通常是一種正確的假設，盡管在一些構象中這些原子會輕微的偏移平面)，這些轉角確定了N和R多肽主鏈構象，即相鄰殘基之間的結構。這兩個轉角稱為φ和Ψ。因此，一套φi和Ψi角(其中，腳標i代表多肽鏈中的特定殘基)有效地規定了多肽鏈的二級結構。在文獻中定義了用于確定φ和Ψ角的慣例，即在給定的多肽中酰胺平面形成0度角的參考點，以及哪個角是φ角，哪個角是Ψ角的定義。參見Ramachandran等，Adv.Prot.Chem.23283-437(1968)，285-94頁，這些頁中的內容在此引入作為參考。
本發明的方法可應用于任何蛋白，并部分基于下述發現，即人MHCII類分子結合溝的主要口袋1錨定位點對特定氨基酸側鏈具有設計好的特異性。這一口袋的特異性由MHC II類分子β鏈第86位的氨基酸的身份來確定。這一位點位于口袋1的底部并決定可容納于這一口袋中的氨基酸側鏈的大小。Marshall，K.W.，J.Immunol.，1524946-4956(1994)。如果這一殘基是甘氨酸，則所有的疏水性脂肪族和芳香族氨基酸(疏水性脂肪族氨基酸是纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸，芳香族氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)均可容納于所述的口袋中，優選芳香族側鏈。如果這一口袋殘基是纈氨酸，則該氨基酸的側鏈伸到口袋中并限制了可容納的肽側鏈的大小，所以只有疏水性脂肪族側鏈可容納進去。因此在氨基酸殘基序列中，無論哪里發現了帶有疏水性脂肪族或芳香族側鏈的氨基酸，即有存在MHC II類限制性T-細胞表位的可能性。但是，如果所述的側鏈是疏水性脂肪族側鏈，其與T-細胞表位相關的可能性約是芳香族側鏈的兩倍(假定1型口袋近似平均地分布于全球種群中)。
將本發明具體化的計算機方法描繪出肽區域包含T-細胞表位的可能性，該方法如下(1)掃描預定長度肽片段的一級序列，并鑒定存在的所有疏水性脂肪族和芳香族側鏈。(2)對疏水性脂肪族側鏈賦予比芳香族側鏈高的值；優選約兩倍于賦予芳香族側鏈的值，例如，給疏水性脂肪族側鏈賦值為2，給芳香族側鏈賦值為1。(3)將所述肽中的預定統一長度的每一重疊氨基酸殘基片段(窗口)中確定存在的值總和起來，再將某一特定片段(窗口)的總值賦予該片段(窗口)中間位置的某個單個氨基酸殘基，優選賦予大約處于抽樣片段(窗口)中間點的氨基酸。將這一過程對每一抽樣的重疊氨基酸殘基片段(窗口)重復進行。因此，所述肽的每一氨基酸殘基均被賦予了一個值，該值與T-細胞表位存在于此特定片段(窗口)中的可能性相關。(4)用按照上述步驟3中的描述計算、賦予的值對被評估的整個氨基酸殘基序列的氨基酸坐標作圖。(5)序列中具有預定值(例如該值為1)的所有部分均被認為可能包含T細胞表位，并且在需要時可進行修飾。在這一方面本發明提供了通用的方法，由此可描述可能包含T-細胞表位的肽區域。在這些區域中對所述的肽進行修飾有可能改變MHC II類的結合特性。
依照本發明的另一方面，可利用考慮了肽與MHC II等位基因模型之間的相互作用的更復雜計算方法來更精確地預測T-細胞表位。根據這一方面，對肽中存在的T細胞表位的計算預測考慮到基于所有已知MHCII類分子的結構構建至少42個MHC II類等位基因模型；使用這些模型計算鑒定T細胞表位的方法；對每一模型構建肽主鏈文庫以允許在相關肽主鏈α碳(Cα)位置具有已知的變異性；在肽和MHC II類分子間相互作用關鍵的位置處，對與每一模型對接(dock)的每一主鏈，相對于20種氨基酸選項中每一種構建氨基酸側鏈構象文庫；以及將這些主鏈和側鏈構象文庫與評分函數結合用于選擇與特定MHC II類分子對接的特定肽的最佳主鏈和側鏈構象并得出該相互作用的結合分值。
MHC II類分子模型可從Brookhaven蛋白數據庫(″PDB″)中的許多類似的結構出發通過同源建模推導得出。它們可通過使用引入了模擬退火算法的半自動同源建模軟件(Modeller，Sali A. & Blundell TL.，1993.J.Mol Biol 234779-815)并結合用于能量最小化的CHARMm力場(購自Molecular Simulations Inc.，San Diego，Ca.)來制備。也可以應用其他的建模方法。
本發明的方法與下述的其他計算方法有著顯著的不同，這些方法在于利用從實驗中得來的關于一小組MHC II類分子結合溝中每一位點的每一種氨基酸選項的結合數據文庫(Marshall，K.W.等，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids，1(3)157-162)(1995)；或利用類似的實驗結合數據以定義所述的溝中特定結合口袋類型的結合特性(同樣利用相對小的MHC II類分子亞組)然后將這一口袋文庫中的口袋類型進行‘混合和匹配’以人工構建更“實際的”MHC II類分子(Sturniolo T.等，Nat.Biotech，17(6)555-561(1999)。這兩種現有方法的主要缺陷在于實驗的復雜性和需要合成大量的肽變體造成僅有少量的MHC II類分子可通過實驗掃描。因此第一種已知的方法僅能預測少量的MHC II類分子。第二種已知的方法還假設在不同II類等位基因的背景下在一個分子中襯有類似氨基酸的口袋將具有相同的結合特性，故其另外的缺陷在于，僅僅可“實際地”地構建出那些包含口袋文庫中所包含的口袋的MHC II類分子。利用本發明的建模方法可推導出任意數量和類型的MHC II類分子的結構，因此可特異性地選擇等位基因以代表全球種群的特征。此外，掃描的MHC II類分子的數量可通過構建更多的模型而增加而無需通過復雜的實驗獲得額外的數據。利用主鏈文庫使得被掃描的各種肽在與特定的MHC II類分子結合時其Cα原子位置處可進行變化。這也與上述現有技術中的計算機方法不同，在那些方法中依賴于利用簡化的肽主鏈來掃描結合在特定口袋中的氨基酸。這些簡化的主鏈不可能代表在“真正的”肽中存在的主鏈構象，從而導致對肽結合的預測不準確。本發明的主鏈文庫是通過疊加蛋白數據庫中所有與MHC II類分子結合的肽的主鏈，并考慮到位于結合溝內的11個氨基酸的每個氨基酸的Cα原子之間的均方根(RMS)差而構建的。盡管該文庫可來自少量合適的可獲得的小鼠和人的結構(當前為13種)，但為了允許存在甚至更大變異的可能性，將每一C″-α位點的RMS數提高50％。然后確定每一氨基酸的平均Cα位置，圍繞這一點劃一個球，其半徑等于在該位置的RMS差加50％。該球體代表所有可允許的Cα位置。
自具有最小RMS差的Cα(上述口袋1中氨基酸殘基的Cα，等同于結合溝中11個殘基的位置2)起運作，將所述的球三維網格化，網格內的每個頂點作為該氨基酸的Cα的可能位置。將后續的酰胺平面(相應于與后續氨基酸的肽鍵)移動到這些Cα的每一個上面，將φ和Ψ角以設定的間隔逐步地轉動以便于安置后續的Cα。如果后續的Cα落入對這一Cα而言‘可被允許的位置球’中，則此二肽的方向即可被接受，如果其落入所述球之外則所得的二肽不能被接受。對每一后續Cα位置均重復這一過程，使肽從所述的口袋1Cα‘種子’開始生長，直到全部9個后續的Cα的位置均根據之前Cα的所有可能排列確定下來。然后對口袋1前的單個Cα重復上述步驟1次以上以構建定位于結合溝內的主鏈Cα位置文庫。
生成的主鏈數目取決于幾種因素‘可被允許的位置球’的大小；對口袋1位點處′最初的球′網格化的細度；用于定位后續Cα的φ和Ψ角逐步旋轉的細度。利用這一程序可以構建大的主鏈文庫。主鏈文庫越大越可能發現對MHC II類分子結合溝內的特定肽而言的最適主鏈。鑒于和結合結構域的氨基酸可能存在沖突，所以不是所有的主鏈均適合于與所有MHC II類分子模型‘對接’(docking)，故對每個等位基因建立亞文庫以包含適合被該等位基因容納的主鏈。利用所述的主鏈文庫并結合MHC II類分子模型可以構建出由與每一容許主鏈對接的每一MHC II類分子結合溝的每一位點中的每一氨基酸的容許側鏈構象所組成的詳盡數據庫。可以利用簡單的立體重疊函數構建這一數據組，其中，主鏈與MHC II類分子對接，氨基酸側鏈在所需位置被嫁接到主鏈上。將側鏈上可旋轉的鍵以設定的間隔逐步旋轉，記錄下依賴于該鍵的原子的最終定位。將所述原子與結合溝側鏈原子間的相互作用記錄下來，根據下述的標準確定是否接受這些位置如此定位的所有原子的重疊總量不能超過預定值。因此，構象搜索的嚴謹度是在鍵的逐步旋轉中所用的間隔及對總重疊的預定限度的函數。如果已知特定的口袋是剛性的，則后一值可較小，但若已知口袋側鏈的位置相對靈活則嚴謹度可放松。這樣便可以模擬結合溝口袋內靈活性的變化。針對與每一MHC II類分子對接后每一主鏈的所有位點上的所有氨基酸重復這種構象搜索以建立詳盡的側鏈構象數據庫。
用適當的數學表達式評價MHC II類分子模型與肽配體構象的結合能量，所述的肽配體構象需通過掃描上述的主鏈/側鏈構象大數據庫根據經驗獲得。這樣，通過對每一長度在9-20個氨基酸范圍內變化(盡管對于每一次掃描長度是一定的)的可能肽進行下述計算，可以掃描蛋白以搜索潛在的T-細胞表位選擇MHC II類分子及適合于該分子的肽主鏈，將相應于所需肽序列的側鏈移植到其上。對于氨基酸的每一容許構象(由上述數據庫獲得)，收集與主鏈上特定位點的特定側鏈相關的原子身份和原子間距數據。沿主鏈對每一側鏈重復此過程，利用評分函數推導肽得分。保留該主鏈的最佳得分，對所選模型的每一容許主鏈重復該過程。比較所有容許主鏈的得分，最高的得分被認為是該MHC II類模型中所需肽的得分。對每一模型用從掃描的蛋白得到的所有可能肽重復上述過程，列出肽相對于模型的得分。
在本發明中，用于結合親和力計算的每種配體都是選自上述肽或蛋白的氨基酸片段。因此所述配體為來自已知序列的肽、多肽或蛋白的長度為約9到20個氨基酸的選定氨基酸鏈。此后術語“氨基酸”和“殘基”視為等同的術語。將移植到選自上述主鏈文庫的主鏈上的待檢測肽中的連續氨基酸形式的配體，通過肽主鏈上C″-α原子坐標定位到來自MHC II類分子模型庫的MHC II類分子的結合裂縫中，并從容許構象的數據庫中選擇每一側鏈的容許構象。相關的原子身份和原子間距也可以從這一數據庫獲得并用于計算肽結合分數。將對MHC II類結合口袋具有高親和力的配體作為侯選者標記出來用于定點誘變。在標記的配體中(也由此在目的蛋白中)進行氨基酸替代，然后用評分函數重新測定以確定使結合親和力降低到預定的閾值以下的變化。這些變化即可引入到目的蛋白中以去除T-細胞表位。
肽配體與MHC II類分子結合溝的結合涉及非共價鍵相互作用，其包括但不限于氫鍵、靜電相互作用、疏水(親脂)相互作用和范德華相互作用。它們被包括在下面將詳細描述的肽評分函數中。應當理解，氫鍵是非共價鍵，其可在極性或帶電的基團之間形成，由被兩個其他原子共享的氫原子構成。氫供體中的氫帶正電荷，而氫受體帶有部分負電荷。為肽/蛋白相互作用的目的，氫鍵供體可以是連接氫的氮，或連接在氧或氮上的氫。氫鍵受體原子可以是沒有連接氫的氧、沒有連接氫并具有一或兩個連接的氮或僅有一個連接的硫。某些原子，如連接了氫的氧或亞胺氮(如C＝NH)，既可以是氫受體也可以是氫供體。氫鍵的能量在3-7Kcal/mol，大大強于范德化鍵，但弱于共價鍵。氫鍵具有高度的方向性，且當供體原子、氫原子和受體原子共線時最強。靜電鍵是在帶有相反電荷的離子對間形成的，根據庫侖定律這種相互作用的強度與原子間距離的平方成反比。離子對間的最佳距離是約2.8。在肽/蛋白相互作用中，可在精氨酸、組氨酸或賴氨酸和天冬氨酸或谷氨酸之間形成靜電鍵。該鍵的強度依賴于電離基團的pKa和介質的介電常數，盡管其與氫鍵的強度類似。
親脂相互作用是蛋白和肽配體之間發生的有利疏水-疏水相互作用。這種相互作用通常出現在埋于結合溝口袋中的肽的疏水性氨基酸側鏈間，以使它們不暴露在溶劑中。將疏水殘基暴露于溶劑中是非常不利的，因為周圍的溶劑分子將被迫在彼此間形成氫鍵而形成籠狀結構。所致的熵值降低是非常不利的。親脂性原子可以是既非極性又不是氫受體的硫和非極性的碳原子。
范德華鍵是相距3-4的原子間的非特異性的力。它比氫鍵和靜電鍵弱、特異性低。原子周圍的電荷分布隨時間變化，并且在任何瞬間電荷分布均是不對稱的。這種瞬間的電荷不對稱性誘導臨近原子中的類似不對稱性。在范德華接觸距離中所導致的原子之間的吸引力達到最大，而在約1到2處迅速消失。相反，當原子間隔的距離小于此接觸距離時，由于原子外部的電子云重疊使不斷增強的斥力成為主導。盡管與靜電和氫鍵相比，此吸引力相對較弱(約0.6Kcal/mol)，但所述斥力對于決定肽配體是否能與蛋白成功結合可能非常重要。
在一個實施方案中，利用Bhm評分函數(SCORE1方法)評估結合常數(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8(3)243-256(1994)，該文獻在此全文引入作為參考)。在另一個實施方案中，用評分函數(SCORE2方法)評估結合親和力作為配體含有T-細胞表位的指示物(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，12(4)309-323(1998)，該文獻在此全文引入作為參考)。但是上述文獻中描述的Bhm評分函數是用于評估下述情況中配體對蛋白的結合親和力的，即已知所述的配體可成功地與所述蛋白結合，且蛋白/配體復合物的結構已解析，這一結構已列于蛋白數據庫(″PDB″)中。因此，利用已知的陽性結合數據對評分函數作了發展。為了區分陽性和陰性的結合體，需向方程中加入排斥項。此外，可通過以成對的方式計算親脂相互作用，而非利用上述Bhm函數中基于面積的能量項來進行更理想的結合能量評估。因此，在一個優選實施方案中，用經修飾的Bhm評分函數評估結合能。在經修飾的Bhm評分函數中，在評估蛋白和配體之間的結合能(ΔGbind)時考慮了下述參數由于配體的平移和轉動熵的整體損失造成的結合能減低(ΔG0)；理想氫鍵的貢獻(ΔGhb)，其中至少一個配對物是中性的；無擾離子相互作用的貢獻(ΔGionic)；親脂配體原子和親脂受體原子之間的親脂相互作用(ΔGlipo)；由于配體中內在自由度的凍結，即繞每一C-C鍵的旋轉自由度降低而造成的結合能損失(ΔGrot)；蛋白和配體之間相互作用的能量(EVdW)。考慮到這些項給出等式1(ΔGbind)＝(ΔG0)+(ΔGhb×Nhb)+(ΔGionic×Nionic)+(ΔGlipo×Nlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(EvdW)其中N是對于特定項符合的相互作用的數目，在一個實施方案中，ΔG0、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipo和ΔGrot是常數，其值分別為5.4、-4.7、-4.7、-0.17和1.4。
Nhb項依照等式2計算Nhb＝∑h-bondf(ΔR，Δα)×f(Nneighb)×fpcsf(ΔR，Δα)是罰函數，其解決氫鍵自理想情況的巨大偏離，其依照等式3計算f(ΔR，Δ-α)＝f1(ΔR)×f2(Δα)其中如果ΔR＜＝TOL 則f1(ΔR)＝1，或者如果ΔR＜＝0.4+TOL 則f1(ΔR)＝1-(ΔR-TOL)/0.4，或者如果ΔR＞0.4+TOL則f1(ΔR)＝0并且
如果Δα＜30° 則f2(Δα)＝1，或者如果Δα＜＝80°則f2(Δα)＝1-(Δα-30)/50，或者如果Δα＞80° 則f2(Δα)＝0TOL是氫鍵鍵長中所能允許的偏差＝0.25ΔR是H-O/N氫鍵鍵長與理想值＝1.9的偏差Δα是氫鍵鍵角∠N/O-H..O/N與180°理想值的偏差f(Nneighb)區分蛋白表面的凹凸部分，并因此賦予口袋中的極性相互作用比蛋白表面的極性相互作用更高的權重。這一函數根據下述等式4計算f(Nneighb)＝(Nneighb/Nneighb，0)α，其中α＝0.5Nneighb為蛋白中與任意給定蛋白原子之間的距離小于5的非氫原子的數量。
Nneighb，0是常數＝25fpcs是考慮到每氫鍵的極性接觸表面面積的函數，由此可以區分強和弱的氫鍵，其值由下述的標準確定當Apolar/NHB＜102時fpcs＝β或當Apolar/NHB＞102時fpcs＝1Apolar是極性蛋白-配體接觸面的大小NHB是氫鍵的數目β是常數＝1.2由于假定了相同的幾何相關性，在實施經修飾的Bhm評分函數時，離子相互作用的貢獻ΔGionic用與上述有關氫鍵的類似方式計算。
Nlipo項按下述的等式5計算Nlipo＝∑lLf(rlL)根據下述標準，對于所有親脂配體原子l和所有親脂蛋白原子L，計算f(rlL)當rlL＜＝R1時 f(rlL)＝1
當R2＜rlL＞R1時 f(flL)＝(rlL-R1)/(R2-R1)當rlL＞＝R2時f(rlL)＝0其中R1＝rlvdw+rLvdw+0.5R2＝R1+3.0rlvdw是原子l的范德華半徑rLvdw是原子L的范德華半徑Nrot項是氨基酸側鏈中可旋轉的鍵的數目，其被視為無環的sp3-sp3及sp3-sp2鍵的數目。末端-CH3或-NH3的旋轉未考慮進去。
最終，項Evdw依照如下等式6計算Evdw＝ε1ε2((r1vdw+r2vdw)12/r12-(r1vdw+r2vdw)6/r6)，其中ε1和ε2是取決于原子身份的常數r1vdw+r2vdw是范德華原子半徑r是原子對間的距離。
關于式6，在一個實施方案中，ε1和ε2常數被賦予如下原子值，分別為C0.245，N0.283，O0.316，S0.316(即分別對于碳、氮、氧和硫原子)。對于式5和6，給予范德華半徑如下原子值，分別為C1.85，N1.75，O1.60，S2.00。
應當理解上述等式中所有預定的值和給定的常數都是在現有的對蛋白配體相互作用的理解局限內具體相對于此處所用的計算類型確定的。因此，隨著這種評分函數的進一步精練，這些值和常數也會因此而改變，任何能在蛋白和配體結合能的評估方面給出所需結果的適宜數值均可使用，而且，其也落入本發明的保護范圍內。
如上所述，所述的評分函數應用于由上述側鏈構象、原子身份和原子間距數據庫中提取的數據。為本說明書的目的，該數據庫中包含的MHC II類分子數是42個模型加上4個已解析的結構。從上述描述中可清楚地了解到，本發明的計算構建方法的模塊性質意味著，可簡單地添加新的模型，并利用肽主鏈文庫和側鏈構象搜索功能進行掃描以創建其它的可通過上述的肽評分函數處理的數據集。這使得被掃描的MHC II類分子庫可以很容易地增加，或者如果可以獲得相關數據，則可以替換結構和相關數據以創建現有等位基因的更精確的模型。
本發明的預測方法可以相對于包含大量已通過實驗確定了其對不同MHC II類分子的親和力的肽的數據集進行校準。將計算值與實驗數據相比較，可確定一截斷值，已知該值之上所有經實驗確定的T-細胞表位都得以正確的預測。
應當理解，盡管上述評分函數與現有的一些復雜方法相比相對簡單，但計算進行得非常迅速。還應當理解的是，其目的并不在于計算出對接到所選擇的MHC II類蛋白結合溝內的每種肽的真正結合能本身。根本的目的在于獲得相對的結合能數據以助于根據所選蛋白的一級結構(即氨基酸序列)預測T-細胞表位的定位。相對高的結合能或結合能高于選定的閾值意味著在配體中存在T-細胞表位。然后可以將所述配體進行至少一輪氨基酸替代，并再次計算結合能。由于計算可迅速進行，對肽序列的這些操作可在現有成本劃算的計算機硬件上于程序用戶界面中互動進行。由此不需要對計算機硬件進行大量投資。
本領域的技術人員應當了解，也可使用其他軟件達到相同的目的。特別是可以使用能將配體對接入蛋白結合位點的更復雜的軟件，并與能量最小化相結合。對接軟件的例子包括DOCK(Kuntz等，J.Mol.Biol.，161269-288(1982))，LUDI(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8623-632(1994))和FLEXX(Rarey M.等，ISMB，3300-308(1995))。分子建模和操作軟件的例子包括AMBER(Tripos)和CHARMm(Molecular Simulations Inc.)。使用這些計算方法將嚴重限制本發明方法的信息吞吐量，這是由于進行必要的計算所需的處理時間導致的。但是可行的方式為，將這些方法作為‘二級篩選’以獲得關于通過本發明的方法發現為‘陽性結合體’的肽的更精確的肽結合能計算值。用于復雜的分子機械或分子動力學計算的處理時間的限制性是由進行所述計算的軟件設計和目前計算機硬件技術的限制共同確定的。可以預期在將來，隨著編寫更高效的代碼和計算機處理器速度的不斷提高，在更易控制的時間框架內進行上述計算是可行的。有關用于大分子的能量函數的其他信息和有關在折疊蛋白結構內發生的多種相互作用的考慮可參考下述文獻Brooks，B.R.，等.，J.Comput.Chem.，4187-217(1983)，有關蛋白-配體一般相互作用的信息參見Dauber-Osguthorpe等，Proteins 4(1)31-47(1988)，這些文獻均全文引入作為參考。其他有用的背景資料也可參見Fasman，G.D.編，Prediction of ProteinStructure and the Principles of Protein Conformation，Plenum Press，New York，ISBN0-306 4313-9。
實施例2用合成肽測定幼稚T細胞的方法MHC、肽和T細胞受體(TCR)的相互作用提供了T細胞識別的抗原特異性的結構基礎。T細胞增殖測定檢驗肽與MHC的結合和TCR對MHC/肽復合體的識別。本實施例的體外T細胞增殖測定包括刺激含有抗原呈遞細胞(APC)和T細胞的外周血單核細胞(PBMC)。用合成肽抗原進行體外刺激，在某些實驗中使用完整蛋白抗原。用3H-胸苷(3H-Thy)測量刺激的T細胞增殖并對洗滌的固定細胞進行閃爍計數估計摻入的3H-Thy的存在。
從國家血液部門(National Blood Service，Addenbrooks Hospital，Cambridge，UK)得到保存時間小于12小時的人血血沉棕黃層。從Amersham Pharmacia Biotech(Amersham，UK)得到菲可帕克(Ficoll-paque)。含有L-谷氨酰胺、50μg/ml鏈霉素、10μg/ml慶大霉素和0.1％人血清白蛋白的用于培養初級人淋巴細胞的無血清AIMV培養基得自Gibco-BRL(Paisley，UK)。合成肽得自Pepscan(荷蘭)和BabrahamTechnix(Cambridge，UK)。
對血沉棕黃層輕微離心從血漿和血小板中分離出紅血球和白血球。除去并扔掉頂層部分(含有血漿和血小板)。在磷酸鹽緩沖液(PBS)中1∶1稀釋紅血球和白血球并鋪在15ml菲可帕克(Amersham Pharmacia，AmershamUK)上。根據生產商推薦的條件進行離心并從血清+PBS/菲可帕克界面收獲PBMC。用PBS(1∶1)混合PBMC并通過離心收集。除去并扔掉上清液，將PBMC沉淀重新懸浮在50ml PBS中。通過離心再次沉淀細胞并拋棄PBS上清液。用50ml AIMV培養基重新懸浮細胞并在此時計數并用錐蟲藍染料排除估計存活率。再次離心收集細胞并拋棄上清液。細胞重新懸浮以低溫保藏，密度為3×107/ml。保藏培養基為90％(v/v)熱失活的AB人血清(Sigma，Poole，UK)和10％(v/v)DMSO(Sigma，Poole，UK)。將細胞轉移到受調節的冰凍容器(Sigma)并且在轉移到液氮以長期保存前將其置于-70℃過夜。當需要使用時，在37℃水浴中快速解凍然后轉移到10ml預熱的AIMV培養基。
在96孔平底板(PBMC密度為2×105PBMC每孔)中用蛋白和肽抗原刺激PBMC。在37℃下將PBMC孵育7天后用3H-Thy(Amersham-Pharmacia，Amersham，UK)脈沖。對于本研究，可以產生并使用以3個氨基酸遞增而覆蓋FIX全序列的合成肽(15聚體)或者得自表1的所有或者任何肽或者含有在表2或表3中詳述的替代的肽。每種肽都單獨地一式三份地針對從20個未接觸抗原供體中分離的PBMC進行篩選。在每個供體測定中使用先前已經顯示具有免疫原性的兩種對照肽和一種強的非記憶抗原KLH。
對照抗原如下
將肽溶解于DMSO中使其終濃度為10mM，然后將這些貯存液在AIMV培養基中稀釋到原來的1/500(終濃度20μM)。向平底96孔板中加入肽使其終濃度為2和20μM(體積為100μl)。通過錐蟲藍染料排除估計解凍的PBMC的存活率。然后將細胞重新懸浮(密度為2×106個細胞/ml)，向每個含有肽的孔中移入100μl(2×105個PBMC/孔)。在每個肽濃度下測定一式三份的孔培養物。在5％CO2、37℃的潮濕空氣中孵育平板7天。用1μCi3H-Thy/孔的脈沖細胞18-21小時后收獲到過濾墊上。用Wallac微量培養板β頂層平板計數器(Perkin Elmer)或類似儀器測定CPM值。結果表達為刺激指數，用下面的式子確定受試肽的增殖CPM未處理孔的增殖CPM對于這種幼稚T細胞測定，認為大于2.0的刺激指數是陽性分值。當同一受試肽在多于一個供體樣品中得到的刺激指數大于2.0時，認為其為可能的免疫優勢表位的證據。
權利要求
1.一種經修飾的分子，其具有人因子IX的生物學活性，且當其在體內應用時基本上無免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物學活性但未經修飾的分子。
2.如權利要求1所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過從原始的未經修飾的分子中去除一個或多個T-細胞表位而實現的。
3.如權利要求1或2所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過減少能與源自所述分子的肽相結合的MHC同種異型的數量來實現的。
4.如權利要求2或3所述的分子，其中，去除了一個T-細胞表位。
5.如權利要求2-4中任意一項所述的分子，其中，所述原本存在的T-細胞表位是MHC II類配體或經呈遞在II類分子上后顯示出刺激或結合T-細胞的能力的肽序列。
6.如權利要求5所述的分子，其中，所述的肽序列選自如表1所示的肽序列。
7.如權利要求2-6中任意一項所述的分子，其中，任何原本存在的T-細胞表位中的1-9個氨基酸殘基發生了改變。
8.如權利要求7所述的分子，其中，有一個氨基酸殘基發生了改變。9.如權利要求7或8所述的分子，其中，所述氨基酸殘基的改變是用其他的氨基酸殘基在特定的位置處替代、添加或缺失原本存在的氨基酸殘基。
10.如權利要求9所述的分子，其中，按表2所示進行一個或多個氨基酸殘基的替代。
11.如權利要求10所述的分子，其中，排除已知形成與功能蛋白不匹配的人因子IX遺傳突變的這類替代。
12.如權利要求10所述的分子，其中，另外還按表3所示進行一個或多個氨基酸殘基的替代以減少能與源自所述分子的肽相結合的MHC同種異型的數量。
13.如權利要求9所述的分子，其中，按表3所示進行一個或多個氨基酸的替代。
14.如權利要求13所述的分子，其中，排除已知形成與功能蛋白不匹配的人因子IX遺傳突變的這類替代。
15.如權利要求7-14中任意一項所述的分子，其中，通過其它進一步的改變恢復所述分子的生物學活性。
16.如權利要求15所述的分子，其中，其它進一步的改變是替代、添加或缺失特定的氨基酸。
17.如權利要求7-16中任意一項所述的修飾分子，其中，所述氨基酸的改變是參照同源蛋白序列進行的。
18.如權利要求7-16中任意一項所述的修飾分子，其中，所述氨基酸的改變是參照硅片上(in silico)建模技術進行的。
19.如權利要求1-18中任意一項所述的修飾分子，其與相應的野生型蛋白序列的氨基酸同一性小于100％并且當在T細胞測定中檢測時引起小于2.0的刺激指數。
20.如權利要求1-18中任意一項所述的修飾分子，當在T細胞測定中檢測時與未修飾蛋白分子相比其引起降低的刺激指數。
21.編碼權利要求1-20中任意一項所述的經修飾人因子IX分子的DNA序列。
22.一種藥物組合物，其包含上述任意一項權利要求中所定義的具有人因子IX生物學活性的經修飾分子，并可任選地包含可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
23.制備上述任意一項權利要求中所定義的具有人因子IX生物學活性的經修飾分子的方法，該方法包括下述步驟(i)確定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；(ii)通過任意方法，包括利用體外或硅片上(in silico)的技術或生物學試驗確定所述肽與MHC分子的結合，由此鑒定所述蛋白的氨基酸序列中潛在的一個或多個T-細胞表位；(iii)設計在已鑒定的潛在T-細胞表位內有一個或多個氨基酸被修飾的新序列變體，其中所述修飾為替代、添加或缺失任意原本存在的T-細胞表位中的1-9個氨基酸殘基，這一效果可由體外或硅片上(in silico)的技術或生物學試驗通過所述肽與MHC分子的結合來確定，或通過肽-MHC復合物與T-細胞的結合來確定；(iv)通過重組DNA技術構建所述序列變體，并檢測所述的變體以便鑒定一個或多個具有所需特性的變體；和(v)任選地重復步驟(ii)-(iv)。
24.如權利要求23所述的方法，其中，步驟(ii)是通過下述步驟進行的(a)選擇具有已知氨基酸序列的所述肽的一個區域；(b)由所選擇的區域中順序抽取預定統一大小且至少由3個氨基酸殘基組成的重疊氨基酸殘基片段；(c)通過對存在于抽樣氨基酸殘基片段中的每個疏水氨基酸殘基側鏈賦值求和，計算每一抽樣片段的MHC II類分子結合分值；和(d)根據計算出的該片段的MHC II類分子結合分值鑒定至少一個適于修飾的片段，以在基本上不減弱所述肽的治療功效的前提下改變肽的整體MHC II類結合分值。
25.如權利要求24所述的方法，其中，步驟(c)通過下述步驟利用經改進而包含了12-6范德華配體-蛋白能量排斥項和配體構象能量項的Bhm評分函數進行，所述步驟為(1)提供MHC II類分子模型的第一數據庫；(2)提供所述MHC II類分子模型的容許肽主鏈的第二數據庫；(3)從所述的第一數據庫中篩選模型；(4)從所述的第二數據庫中篩選容許肽主鏈；(5)鑒定在每個抽樣片段中存在的氨基酸殘基側鏈；(6)確定存在于每個抽樣片段中的所有側鏈的結合親和性值；以及對每一所述的模型和每一所述的主鏈重復步驟(1)到(5)。
26.一種選自表1所示序列的13mer T-細胞表位肽，其具有潛在的MHC II類結合活性且產生自未經修飾的人因子IX。
27.一種肽序列，其由如權利要求26所述的13mer T-細胞表位肽中的至少9個連續的氨基酸殘基組成。
28.與野生型人因子IX有100％氨基酸同一性的9-15mer肽序列，當在T細胞測定中檢測時，其引起大于2.0的刺激指數。
29.如權利要求26-28中任意一項所述的肽序列的用途，用于生產在體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低于具有相同生物學活性的任何未經修飾分子的人因子IX。
30.如權利要求26-28中任意一項所述的肽序列的用途，用于生產與相應野生型蛋白序列相比較氨基酸同一性小于100％并且當在T細胞測定中檢測時引起比未修飾的人因子IX分子要低的刺激指數或者至少小于2.0的刺激指數的人因子IX。
全文摘要
本發明具體涉及人因子IX的修飾而導致因子IX蛋白在體內使用時其基本無免疫原性或者比任一未經修飾的相應蛋白的免疫原性要低。本發明還涉及源自具有免疫原性的人因子IX的T細胞表位序列。
文檔編號C12N15/57GK1547608SQ02816759
公開日2004年11月17日 申請日期2002年8月30日 優先權日2001年9月4日
發明者F·J·卡爾, F J 卡爾, G·卡特 申請人:默克專利有限公司