抑制凋亡過程及改善細胞性能的制作方法

專利名稱：抑制凋亡過程及改善細胞性能的制作方法
技術領域：
本發明涉及防止或延遲重組細胞的程序性細胞死亡。更具體而言，本發明涉及通過在細胞中表達一種或多種抗凋亡多肽來抑制重組細胞的程序性細胞死亡。
本發明進一步涉及通過在細胞內表達一種或多種抗凋亡多肽來提高重組細胞的細胞相關產物、例如重組蛋白質如抗體的產量。此外，本發明提供了表達抗凋亡多肽的重組細胞。這種細胞可用于細胞性治療或用于產生細胞相關產物，特別是在大規模生物反應器中的商品化生產。
背景技術：
在制藥或商品化生產環境中，利用真核細胞生產高價值的治療性或診斷性蛋白質，受到有關可利用的發酵罐體積及發酵進行時間的嚴格限制。從經過一段時間制備成批發酵物來看，生產效率來自于使運行中每單位時間內的蛋白質生成速率最高，使運行停止時間最短，并使生產效率較低時的運行時間部分最少。
提高容器中的細胞密度是在生產中提高蛋白質產率的一個主要方法。通過營養補料方法、并利用保留細胞的系統灌注培養基，形成適當平衡的培養基組成，可以顯著提高細胞密度。這些方法除了提高細胞密度之外，還能有效提高分批培養物的整體壽命。
提高制備產率的另一基本方法是提高細胞自身生成蛋白質的速率，即提高比細胞產率(產生蛋白質的量/細胞/天)。傳統上，獲得具有高生產速率細胞的方法來自一個多步驟的過程，其中第一步利用目的蛋白質的基因轉染大的細胞群體，第二步長出較大群體的單細胞克隆，鑒定并選擇較高的生產細胞系，進一步建立細胞系。在轉染細胞群體中顯現蛋白質生產速率的不均一性，其原因一般在于，首先是新的遺傳物質在宿主細胞基因組中的整合位置的差異，其次是所整合的DNA序列總數(拷貝數)的差異。因此，還已開發了在宿主基因組中定位異源DNA整合位點的方法，以便將DNA序列整合到與高水平轉錄為RNA有關的位點。這些方法的例子中，關于NEOSPLA載體由美國專利5,648,267、5,733,779、6,017,733和6,159,730提供，關于同源重組則由美國專利5,830,698和5,998,144提供。
通過共轉染目的蛋白質的基因與可賦予毒劑抗性的另一蛋白質基因，也提供了選擇高生產細胞的方法。通過將生長中的細胞暴露給濃度增加的這樣一種毒劑，可以選擇具有較高抗性基因拷貝數的細胞。常常發現這些細胞經歷抗性基因的基因組擴增過程。編碼目的蛋白質的相鄰基因共同擴增，常引起目的蛋白質的細胞比產率水平提高(Ringold，J.Mol.Appl.Genetic 1(3)165-75(1981)；Kaufman，J.Mol.Biol.159(4)601-21 1982)。
在起源完全不同于生物化學工程細胞培養制備過程的生物學研究領域，過去十年來對程序性細胞死亡過程-凋亡已經頗為了解。與這些發展隨之而來的概念性突破是，存在導致細胞死亡的天然生理學過程。當然，細胞死亡也可以是破壞細胞完整性的創傷所致直接和立即的結果，從而使細胞或其遺留物發生壞死。作為疾病病程的一部分，或者對生理壓力的響應，凋亡可由自然的或自然發育的多種環境或刺激物啟動。例如，器官成熟或重組的發育過程涉及特定類型細胞的死亡，以便為其它新型細胞的出現讓路。在遺傳及生物化學水平上理解凋亡，并探索其干預方法，使之或促進、或終止，已成為醫學科學中相當令人關注的領域。
然而，已經開始將凋亡理解為哺乳動物細胞體外培養過程中勢必發生的細胞死亡的主要途徑。在實驗室和大規模制備環境中進行的細胞培養的基本形式稱為分批培養。分批培養開始于健康的、活躍生長的細胞接種物；培養物生長到峰值細胞密度，進入衰退期，然后經歷直至細胞群體相繼死去的過程。在后來的細胞培養衰退期，營養物開始耗盡，毒性代謝物濃度上升，環境變得對細胞形成壓力。另外，發酵環境本身可以產生其它壓力因素，例如硬件產生的剪切力、與攪拌有關的流體和氣體渦流，以及培養物通過管線的流動。已經證明，所有這些因素(營養限制、培養基中毒物及物理壓力)均可啟動培養中細胞的凋亡，從而整體上在限制培養物預期壽命中起作用。
最近發現了幾種在凋亡過程中起關鍵作用的蛋白質，并分離和克隆了它們的基因。腺病毒蛋白質E1B-19K是Bcl-2蛋白質家族的抗凋亡成員。細胞對感染的響應是啟動凋亡級聯。該防御機制用于從組織中去除被感染的細胞。然而，某些病毒通過編碼表達于感染過程早期的、可抑制凋亡的蛋白質，從而發展了對抗凋亡響應的方法。在腺病毒感染過程中，由腺病毒基因組的E1區調節病毒基因在細胞中表達。E1區由E1A和E1B兩個轉錄單位組成。E1B單位編碼腺病毒的兩個不同腫瘤抗原，19kDa和55kDa蛋白質。凋亡抑制劑E1B-19K的作用可理解為類似于抗凋亡蛋白質Bcl-2，可在細胞死亡途徑的多個階段抑制凋亡。據認為凋亡抑制的一個機理是通過穩定線粒體膜，從而防止將細胞色素C和其它前凋亡因子釋放到胞質溶膠中。(VanderHeiden Cell 91(5)627-37(1997))。細胞色素C參與結合到涉及啟動天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)級聯的復合物中的Apaf-1。Zou J.Biol.Chem.274(17)11549-56(1999)。Bcl-2家族成員(Bcl-XL)也通過直接結合Apaf-1來阻斷Apaf-1的活化。(Hu等人，J.Biol.Chem 273(10)5481-5(1998)；PNAS 95(8)4386-91(1998))。
普遍存在的膜蛋白質Aven是另一種抗凋亡蛋白質。Aven的抗凋亡活性是由于其能夠干擾天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活化子Apaf-1的自我締合，從而抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9活化(Chau Mol.Cell.631-40(2000))。已經表明，Aven還增強Bcl-XL在BHK(baby hamster kidney)細胞中的抗凋亡活性，提示Aven和Bcl-XL之間存在相互作用(Chau(2000))。
上述提高蛋白質產量的各種方法均成功進行了不同程度的實踐。盡管如此，仍然需要發展提高細胞相關產物、例如重組蛋白質產量的方法，特別是在大規模商品化生產中。此外還需要發展防止或延遲程序性細胞死亡的方法。
發明概述及目的本發明的一個目的在于提供防止或延遲重組細胞程序性細胞死亡的方法，其中該細胞不是小鼠骨髓瘤細胞。該方法包括在細胞中表達或誘導表達一種或多種抗凋亡多肽，例如細胞性Bcl-xL、Bcl-2、Aven、或病毒性蛋白質E1B-19K和p35，以便防止或延遲細胞程序性死亡，其中如果在細胞中表達一種抗凋亡多肽，則該抗凋亡多肽不是Bcl-xL相互作用因子，例如Aven。
更具體而言，本發明的一個目的在于，提供防止或延遲包含編碼一種或多種目的多肽的一種或多種異源多核苷酸的重組細胞程序性細胞死亡的方法，該目的多肽為例如，抗體如抗CD154(IDEC-131)、抗CD20抗體(例如RITUXAN，FDA批準用于治療非霍奇金(non-Hodgkin’s)淋巴瘤的嵌合抗CD20，由ATCC登錄號69119生成，ZevalinTM)、抗CD80(IDEC 114)抗體、抗CD23抗體(IDEC 152)、抗CD4抗體(IDEC 151)、以及抗腫瘤抗原抗體、酶、受體、細胞因子、細胞表面因子、細胞代謝物、細胞分泌因子、病毒性因子以及膜結合因子。
本發明另一目的在于提供提高重組細胞的細胞相關產物產量的方法。該方法包括在細胞中表達或誘導表達一種或多種抗凋亡多肽，以便提高該細胞的細胞相關產物的產量，其中如果在細胞內表達一種抗凋亡多肽，則該抗凋亡多肽不是Bcl-xL相互作用因子，例如Aven。
本發明另一目的在于提供提高重組細胞產量的方法。該方法包括在細胞中表達或誘導表達一種或多種抗凋亡多肽，以便提高該重組細胞的產量，其中如果在細胞內表達一種抗凋亡多肽，則該抗凋亡多肽不是Bcl-xL相互作用因子，例如Aven。
本發明另一目的在于提供用于產生細胞相關產物的重組細胞。該重組細胞表達或可誘導表達至少兩種抗凋亡多肽。
本發明另一目的在于提供用于產生細胞的一種或多種生物功能的細胞群體。該細胞群體表達或可誘導表達至少兩種抗凋亡多肽。
本發明另一目的在于提供用于細胞性治療的細胞群體。該細胞群體表達或可誘導表達一種或多種抗凋亡多肽。
附圖簡述

圖1描述用于表達抗體IDEC 131的NEOSPLA表達載體。
圖2描述可誘導型表達載體，質粒PX+E1B-19K。
圖3描述可誘導型表達載體，質粒PX+Aven+E1B-19K。
圖4描述Aven cDNA多核苷酸和Aven多肽氨基酸序列。
圖5描述E1B-19K cDNA多核苷酸和E1B-19K多肽氨基酸序列。
圖6描述細胞存活力數據比較了(1)單獨轉染GFP、(2)轉染GFP+Aven、(3)轉染GFP+E1B-19K、(4)轉染GFP+Aven+E1B19K的細胞以及(5)未轉染的親本細胞在去除葡萄糖培養3天的存活率。
圖7描述細胞存活力數據比較了(1)單獨轉染GFP、(2)轉染GFP+Aven、(3)轉染GFP+E1B-19K、(4)轉染GFP+Aven+E1B19K的細胞在有和無類固醇誘導下，去除葡萄糖培養3天的存活率。
圖8描述抗凋亡多肽的誘導表達數據比較表達E1B-19K和Aven的類固醇誘導的細胞以及未轉染的CHO細胞系有關存活率和抗體產生水平的分批培養性能。
圖9描述抗凋亡多肽的誘導表達數據比較轉染E1B-19K和Aven的細胞在有和無類固醇誘導這些轉染基因表達的情況下，有關存活率和抗體產生水平的分批培養性能。
圖10包含表明CHO細胞系(CHO-K1)在去除血清及耗盡培養基后經歷凋亡的結果。
圖11a和11b包含在10％FBS中培養的表達Aven、Bcl-xL以及Bcl-xL+Aven的細胞，隨后暴露于無血清培養基中培養的存活力數據。
圖12a、b和c也包含存活率數據，其中將表達Aven、Bcl-xL和Bcl-xL+Aven的CHO細胞在無血清培養基中培養，培養之后測定細胞存活率。
圖13a、b和c描述了實施例所用誘導型表達系統。
圖14顯示抗凋亡基因α-Aven和α-E1B-19K在CHO細胞中的誘導型表達。
圖15包含使用6孔培養物的葡萄糖去除實驗結果。
圖16-21包含在轉瓶培養中進行的葡萄糖去除實驗結果。
圖22圖解描述了表達IDEC-131的CHO細胞系的產生以及所用的包含抗凋亡基因的誘導型表達載體。
圖23-26包含其它的轉瓶結果。
圖27比較了在誘導或非誘導條件下，IDEC 131在不同細胞系中的相對表達。
圖28-31包含生物反應器研究#1的結果。
圖32-34包含生物反應器研究#2的結果。
圖35-37包含生物反應器研究#3的結果。
發明詳述如上所述，本發明涉及防止或延遲重組細胞、特別是重組細胞、優選產生細胞相關產物的哺乳動物細胞的程序性細胞死亡。本發明發現，抑制細胞中凋亡可以提高細胞存活率及細胞性能。因此，本發明提供了通過在細胞中表達一種或多種抗凋亡多肽來防止或延遲重組細胞程序性細胞死亡的方法。本發明還通過在細胞中表達一種或多種抗凋亡多肽來提高重組細胞中細胞相關產物的產量。此外，本發明提供了用于產生細胞相關產物或細胞性治療的重組細胞。
該方法抑制培養中的哺乳動物及其它真核細胞細胞死亡的能力，可用于提高由目的細胞產生的任何天然或異源蛋白質、或病毒的產量。目的天然和異源產物目標應包括但不限于由哺乳動物或其它真核細胞天然產生或經遺傳操作后產生的抗體、細胞因子、生長因子、激素、血清蛋白質、受體、酶、配體、細胞分泌因子、細胞代謝物、以及病毒載體。遺傳操作技術應包括標準的重組DNA技術，其中將目的靶基因整合到哺乳動物基因組或染色體外元件，以使整合的基因表達異源蛋白質。本申請所述技術適用于在細胞培養過程中發生凋亡的所有哺乳動物及其它真核細胞系。合適的細胞系包括但不限于中國倉鼠卵巢(CHO)、幼倉鼠腎(BHK)、人胚腎(HEK)293、NSO骨髓瘤、COS、NFO哺乳動物細胞及其它真核細胞，例如Sf-9、Sf-21和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)昆蟲細胞。這些細胞系可以從諸如美國典型培養物保藏中心(ATCC)等來源獲得。該技術適用于經歷程序性細胞死亡、并可以經遺傳操作產生如上所述異源目的蛋白質的任何真核細胞。
靶蛋白質和病毒應包括可以在哺乳動物或其它真核細胞中產生的、用于生物技術或制藥應用的蛋白質和病毒。用于該技術的幾種可能的目的蛋白質包括但不限于生長因子和細胞因子，例如人生長激素、粒細胞集落刺激因子(生長因子)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、紅細胞生成素、白細胞介素1α和β、2、3、4、6、8、10、11、13、15、17和18、干擾素α和γ、內皮生長因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、胰島素、瘦素(leptin)、神經生長因子、腫瘤壞死因子-α、血小板源性生長因子、轉化生長因子、骨形態發生蛋白質(bonemorphogenic protein)以及干細胞因子；酶，例如核酸酶、胰蛋白酶、抑酶肽和激酶；細胞培養試劑，例如層粘連蛋白、膠原和纖連蛋白；血漿和血清蛋白質，例如轉鐵蛋白組織纖溶酶原激活劑、纖溶酶原、纖溶酶和凝血酶以及因子VIII、IX、和X；細胞因子、細胞因子受體、生長因子及其它受體、配體和細胞結合因子的單克隆抗體；受體，例如腫瘤壞死因子受體1和2；紅細胞生成素受體、轉鐵蛋白受體、白細胞介素受體、瘦素受體、P和L選擇蛋白、ICAM、VCAM；配體，例如FAS配體和CD配體；代謝物，例如脂質、脂肪、核苷酸以及碳水化合物；病毒性載體，例如腺病毒、逆轉錄病毒以及腺伴隨病毒。雖然該清單包括許多當前產生的異源蛋白質及其它產物，但該技術同樣適用于其培養中的真核生產細胞在生產過程中經歷凋亡的其它當前及未來的蛋白質和產物。
根據本發明，可以利用本領域技術人員已知的任何適當方法，在細胞中表達一種或多種抗凋亡多肽。例如，可以引入編碼一種或多種抗凋亡多肽的一種或多種多核苷酸構建體。該構建體可以是表達構建體，并可包括與編碼一種或多種抗凋亡多肽的多核苷酸有效連接的至少一種誘導型啟動子。在一個實施方案中，使用蛻皮激素誘導型系統，通過類固醇以劑量依賴方式控制一種或多種抗凋亡多肽的表達。美國專利5,534,418詳述了這種系統，在此全文引入以供參考。
也可應用其它啟動子。在真核細胞中使用的合適病毒性轉錄啟動子的例子有猿猴病毒40、腺病毒、Rous肉瘤病毒和巨細胞病毒的啟動子。可以利用刺激異源基因轉錄的反式作用轉錄活化子活化啟動子。例如，SV 40 T抗原、腺病毒E1A和E1B蛋白質可以作用于異源基因的某些病毒性啟動子，包括CMV主要即早起(MIE)啟動子。具有反式作用活性的其它分子包括皰疹病毒即早期蛋白質、C-myc、以及人和猿猴AIDS病毒的基因。
在另一實施方案中，該表達構建體包括可誘導的啟動子和可篩選的或可選擇的標志，以便選擇或檢測表達一種或多種抗凋亡多肽的細胞。本發明可以使用任何合適的選擇或篩選標志，例如綠色熒光蛋白質(GFP)或增強的綠色熒光蛋白質(EGF)。
根據本發明，可以表達一種或多種抗凋亡多肽。抗凋亡多肽包括具有抑制或降低細胞凋亡活性的任何多肽。例如，抗凋亡多肽可以由異源多核苷酸、例如真核細胞或病毒的基因編碼。在一個實施方案中，抗凋亡多肽是Bcl-2家族、Aven家族、腺病毒或桿狀病毒抗死亡蛋白質家族成員或其片段。在另一實施方案中，抗凋亡多肽是Bcl-2、Bcl-xL、Aven、E1B-19K或p35。在另一實施方案中，如果表達一種抗凋亡多肽，則其不是Aven、Bcl-xL相互作用因子、保護細胞防止天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1所誘導凋亡的因子、抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶由細胞色素c和dATP活化的因子、結合抗凋亡Bcl-2成員的因子、或結合Apaf-1的因子。
在重組細胞中，抗凋亡多肽可以單獨表達、或與其它分子聯合表達。例如，可以只表達Aven、或共表達Aven和E1B-19K。可以使用一種或多種表達構建體表達兩種或多種抗凋亡多肽。在一個實施方案中，重組細胞將Aven與一種或多種其它抗凋亡多肽聯合表達。
本發明的重組細胞包括本領域技術人員已知、并可以得到的任何合適細胞。在一個實施方案中，該重組細胞是哺乳動物細胞，例如人、小鼠或嚙齒類動物細胞。在另一實施方案中，該重組細胞是BHK細胞或CHO細胞，例如CHO 5C11。此外，本發明方法可應用于大規模生物反應器或商品化生產培養裝置中的重組細胞。其它合適的細胞包括COS、CV-1、SP2/0和雜交瘤。
根據一個實施方案，本發明的重組細胞包含編碼一種或多種目的多肽的一種或多種異源多核苷酸。該多肽可以是任何多肽，包括而非限制于抗體、酶、受體、細胞因子、細胞表面因子、細胞代謝物、細胞分泌因子、病毒性因子以及膜結合因子。在一個實施方案中，該多肽是抗體，包括而非限制于抗CD154(gp 39)抗體(IDEC-131)、抗CD20(Rituxan、ZevalinTM)抗體、抗CD80(B7.1)抗體(IDEC 114)、抗CD23抗體(IDEC 152)、抗CD4抗體(IDEC151)以及抗腫瘤抗原抗體。
根據本發明的另一特征，表達一種或多種抗凋亡多肽可提高重組細胞產生的細胞相關產物的產量。細胞相關產物可以是因細胞性能而產生的任何產物。例如，細胞相關產物可以是重組表達的或內源性的蛋白質、抗體、酶、受體、細胞因子、細胞表面因子、膜結合因子或多核苷酸。在一個實施方案中，細胞相關產物是病毒性因子、細胞代謝物、或任何細胞成分。在另一實施方案中，細胞相關產物可以是細胞本身。
本發明也提供用于產生細胞相關產物的重組細胞。這些細胞表達或可誘導表達一種或多種抗凋亡多肽。在一個實施方案中，這些細胞表達至少兩種抗凋亡多肽。這些細胞因其提高的存活力和細胞性能，例如提高的細胞相關產物的產量，也可用于細胞性治療。
為進一步闡明本發明而提供以下實施例。這些實施例并非意圖、亦不應被解釋為進一步限制本發明。
實施例1載體和轉染稱為NEOSPLA(圖1)的IDEC專利表達載體包含分為外顯子1和2的新霉素磷酸轉移酶基因、編碼抗體IDEC 131的人免疫球蛋白輕鏈、小鼠二氫葉酸還原酶基因、編碼抗體IDEC 131的人免疫球蛋白重鏈基因。在本發明優選實施方案建立細胞系的過程中，第一輪轉染使用該NEOSPLA載體。NEOSPLA表達載體充分描述于美國專利5,648,267、5,733,779、6,017,733、6,159,730，在此全文引入以供參考。
此處所述本發明實施方案產生的所需高價值蛋白質是人源化的抗CD154抗體(IDEC 131)。CD154是不成熟及成熟的B淋巴細胞表面分子CD40的配體，在與抗體交聯時可誘導B細胞增殖。抗CD154抗體充分描述于美國專利6,001,358，在此全文引入以供參考。
考慮到組成型表達抗凋亡基因可能長期干擾需要連續生長的生產細胞系的細胞分裂，優選實施方案利用可誘導型啟動子系統，而非組成型啟動子。然而在本發明某些特定實施方案中，組成型表達抗凋亡基因完全可能適當并合乎需要。
本發明優選實施方案利用的載體pVgRXR(來自Invitrogen，Carlsbad，CA)，具有蛻皮激素可誘導型表達系統的特征。來自果蠅(Drosophila)的功能性雜合蛻皮激素類固醇激素受體的兩個亞基都組成型表達于調節子載體pVgRXR，而最后驅動目的基因表達的雜合蛻皮激素反應性啟動子(p-A-HSP)位于第二個類固醇激素誘導型表達載體中。首先利用pVgRXR轉染哺乳動物細胞，然后通過暴露于Zeocin來選擇據推測可表達功能性雜合蛻皮激素類固醇激素受體的穩定細胞系。在誘導劑類固醇松甾酮A(ponasterone A)的存在下，該功能性雜合蛻皮激素類固醇激素受體結合于雜合蛻皮激素反應性啟動子的上游，從而活化目的基因的表達。通過瞬時轉染帶有便于測量的基因產物例如β半乳糖苷酶的誘導型表達載體，在給這些細胞系提供類固醇激素時，可以測定該類固醇激素可誘導型啟動子刺激轉錄的能力。其中多數穩定的Zeocin抗性細胞系將不誘導類固醇反應性基因。
建立了在足以支持類固醇誘導的水平上穩定表達雜合類固醇激素受體的改造的細胞系以后，利用質粒轉染該細胞系，該質粒包含處于類固醇反應性啟動子控制之下的目的基因以及嘌呤霉素顯性可選擇標志基因。然后通過嘌呤霉素選擇得到穩定表達該啟動子的細胞系。給予這些細胞系類固醇激素后，再分析其誘導目的基因的能力。其中多數細胞系不受類固醇誘導。如上所述，Evans在美國專利5,534,418中充分描述了類固醇誘導系統，特此全文引入以供參考。
在本發明建立細胞系的實施方案的抗體IDEC 131后階段，第二輪和第三輪分別使用該蛻皮激素可誘導型系統。第二個轉染步驟是將pVgRXR引入IDEC 131細胞系。第三個轉染步驟是引入蛻皮激素可誘導基因，含有或不含綠色熒光蛋白質(GFP)基因。
修飾Invitrogen表達載體pIND，以便能夠接納另外多達三個目的基因，再經修飾去除顯性可選擇性標志基因新霉素磷酸轉移酶，替換為可選擇性嘌呤霉素抗性基因。在隨后的各輪轉染中，修飾表達載體包括攜帶Aven基因、E1B-19K基因以及同時攜帶這兩種基因的實施方案，在每種情況下均含有以及不含GFP。所述載體的例子如圖2和3所述。圖2描述了修飾的Invitrogen表達載體PX+E1B-19K；圖3則描述修飾的Invitrogen表達載體PX+Aven+E1B-19K。在第三輪轉染中使用這種載體產生各自或聯合表達這兩種抗凋亡蛋白質的細胞系。當GFP響應類固醇的誘導而在這些CHO細胞中表達時，便提供了蛋白質表達的陽性標志，可用于通過流式細胞術分類并選擇高表達的類固醇可誘導型細胞。
Aven cDNA多核苷酸和Aven多肽氨基酸序列的詳細序列表如圖4所示；E1B-19K cDNA多核苷酸和E1B-19K多肽氨基酸的序列表如圖5所示。
實施例2細胞群體的起源治療性蛋白質商品化生產所用哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，是永生化細胞系，可以一代一代無限地持續經歷連續不斷的分裂循環。這與正常二倍體動物細胞原代培養物明顯相反，后者壽命有限，約50代顯現衰老及停止分裂。
一般而言，通過從單細胞產生細胞群體，可以獲得標準均一性水平的細胞系。雖不認為絕對可以證明某一群體具有單細胞祖先來源，但是已經建立了公認可得到很高這種概率的嚴格方法。該方法名為單細胞克隆，通過在培養基中稀釋懸浮細胞而完成，使分到每個細胞培養孔的單位體積中的細胞在統計上少于1個。利用目視及自動化方法支持該統計方法，確保每個培養孔中的細胞不多于1個。當這些孔中出現小的群體時，可以認為其極有可能是單細胞來源。該方法即為下述實施例7和8所用的產生細胞群體的方法。
獲得均一性細胞群體的另一方法是根據流式細胞術測定標準，選擇表型均一的一群細胞。流式細胞術方法依次測定各個細胞的熒光或光散射特征，并依據該測量值決定每個細胞收集與否。該方法非常有效，可以產生高均一性細胞群，然后進行擴增，并入特定群體中。然而，盡管該群體可能具有均一性，并且利用任何測定方法均可能難以與上述單細胞來源的群體相區分，但根據單細胞來源的標準來判定，它并非是克隆性的。流式細胞術方法的優點在于，與單細胞來源的群體相比，可以更快速地獲得具有目的特征的較大的均一性群體。該流式細胞術選擇方法即為以下實施例5和6所用的產生群體的方法。如下所述，該流式細胞術可選擇性特征為表達綠色熒光蛋白質(GFP)。
實施例3細胞系歷史本發明所述細胞系的直接親本CHO 5C11細胞系具有支持抗凋亡基因表達的兩個顯著特征，并證明此處所述本發明方法及優選實施方案。該親本細胞系分泌目的蛋白質，抗體IDEC 131，并表達胞質溶膠雜合蛻皮激素類固醇激素受體，這是可誘導抗凋亡基因表達的系統的組分。
CHO 5C11細胞系來源于Columbia University建立的中國倉鼠卵巢細胞系CHO DG44(Urlaub，PNAS 83(17)6519-23(1986))。CHODG44細胞系的二氫葉酸還原酶(DHFR)表達缺陷，因而依賴所轉染的DHFR的表達，以便獲得對用于選擇基因組擴增的毒劑氨甲蝶呤的抗性。在CHO 5C11細胞系建立過程中，從DG44階段開始，經歷了兩次主要轉染事件。
利用包含抗體IDEC 131編碼序列的NEOSPLA載體進行CHO DG44細胞系的第一次轉染。在細胞群體可能來源于單細胞的條件下進行新霉素選擇，并擴增抗體生產細胞系。選擇所產生的一株高產量新霉素抗性細胞系G418，進一步建系。
通過5nM、50nM、最后500nM逐步提高氨甲蝶呤濃度，每一步均在細胞群體可能來源于單細胞的選擇條件下進行，使抗體生產細胞系G418經受進一步的選擇壓力及抗體表達擴增，產生的細胞系鑒定為500E9。
在第二次轉染步驟中，將500nM氨甲蝶呤抗性細胞系通過電穿孔轉染載體pVgRXR，于Zeocin(來自Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)中選擇，從而使宿主細胞具有類固醇可誘導型表達系統。在該細胞系可能來源于單細胞的條件下，選擇轉染后得到的Zeocin抗性細胞系。然后通過瞬時轉染類固醇可誘導型β-半乳糖苷酶基因，測試各個細胞系的可誘導性，得到類固醇受體可誘導型細胞系CHO 5C11。細胞系CHO 5C11具有質粒pVgRXR的單個整合位點，進一步說明其可能來源于單細胞。
在第三次轉染步驟中，使用CHO 5C11細胞系作為本發明此處公開的實施例所用的系列轉染細胞系的親本。修飾Invitrogen載體系統，使其進一步表達多達3種另外的單個基因，并引入嘌呤霉素抗性的顯性選擇性標志。故而構建了6個載體系統，其中分別包含(1)綠色熒光蛋白質(GFP)，(2)GFP+Aven，(3)GFP+E1B-19K，以及(4)GFP+Aven+E1B-19K(5)E1B-19K，和(6)Aven+EIB-19K。GFP是發熒光的標志蛋白質，其表達使得可以利用流式細胞術進行選擇。Aven和E1B-19K是兩種上述抗凋亡蛋白質的基因。
對于包含GFP的質粒，轉染后的細胞群體首先在嘌呤霉素選擇性壓力下生長，產生各個轉染群體穩定表達蛋白質的混合體。通過流式細胞儀監測類固醇誘導的GFP表達，跟蹤其中每個群體響應類固醇誘導而表達轉染基因的能力，利用流式細胞術正選擇高熒光細胞并混合。利用細胞裂解物的Western印跡研究來證實其它新轉染基因的表達。該方法產生蛋白質表達速率均一的細胞群體，但該群體并非來源于單細胞。
在另一方法中，利用包含E1B-19K的載體(上列第5種)以及包含E1B-19K和Aven的載體(上列第6種)轉染并經嘌呤霉素選擇穩定轉化的細胞，將其分離為可能的單細胞培養物，并擴增至可以由此鑒別高度可誘導型群體。然后通過系列培養擴增這種可能是單細胞來源的群體，最后用于下述實驗性實施例3和4。
實施例4細胞培養系統及培養基CHO 5C11細胞系在Gibco產品(Grand Island，NY)無血清培養基CHO SSFM II中生長。不斷利用新鮮培養基將一部分較高細胞密度的培養物傳到新的培養物中，從而使細胞培養物連續生長。下述實驗性實施例7和8使用無血清CHO SSFM II培養基的無葡萄糖品種。已經在小規模系統、例如包含1-2ml培養體積的細胞培養皿以及包含50-200ml體積培養物的轉瓶中，使用分批或終末(terminal)培養物進行了實驗性研究。
本發明的實施可以應用于大量細胞類型、培養系統及培養基。商業化培養系統一般包括體積為1-50,000升的生物反應器。細胞通常在游離懸浮生長，但附著依賴型以及聚集型細胞的例子也很常見。許多參考文獻發表了大規模培養方法及相關要點，示例性文獻有R.J.Freshney，Animal Cell Culture″A Practical Approach，2ndEd.，Oxford University Press，New York，1992以及M.Butler，Mammalian Cell BiotechnologyA Practical Approach，OxfordUniversity Press，New York，1991。詳述細胞培養基要點的典型參考文獻為ATCC Media Handbook，Cote等人，American Type CultureCollection出版，Rockville，MD，1984。
實施例5本研究如圖6所述，比較了(1)單獨轉染GFP、(2)轉染GFP和Aven、(3)轉染GFP和E1B-19K、(4)轉染GFP及聯合轉染Aven和E1B19K的細胞、以及(5)未轉染的親本細胞，在細胞培養皿中培養3天的細胞存活率。細胞在正常培養基、即CHO SSFM II中生長，直至開始進行實驗性培養，為此更換培養基為無葡萄糖培養基，通過添加5μM松甾酮A誘導所轉染基因。無葡萄糖環境使細胞遭受嚴重的營養危機，因而形成強烈的凋亡刺激。
所有培養物最初的存活率為95％，在無葡萄糖環境中第1天結束后，存活率下降，Aven+E1B-19K培養物的存活率降到80％，所有其它培養物均降到約70％。在其后的兩天中，Aven+E1B-19K培養物的存活率一直明顯高于其它培養物。第2天結束后，E1B-19K轉染以及Aven轉染的兩種培養物與兩種對照培養物、即GFP(單獨)以及未轉染的親本細胞系相比，其存活率差異顯著。因而第2天，Aven+E1B-19K培養物的存活率為80％，Aven和E1B-19K培養物的存活率均約60％，而對照培養物為30％-40％。第3天，Aven+E1B-19K培養物為75％存活率，E1B-19K培養物為45％存活率，Aven培養物以及兩種對照培養物均顯示零存活率。
這些數據表明，E1B-19K與Aven每個基因的單獨表達，在經受營養匱乏壓力的CHO細胞中具有抗凋亡作用，E1B-19K單獨表達的作用顯著強于單獨的Aven。E1B-19K和Aven兩個基因的共同作用相對于其單個作用具有協同性，即聯合表達的作用強于其單個作用的簡單相加。觀察到單獨Aven在第3天似乎對存活限度沒有益處，與E1B-19K聯合表達比單獨表達EIB-19K的細胞存活限度高20％，更支持了這一結論。
實施例6本研究如圖7所述，比較了(1)單獨轉染GFP、(2)轉染GFP和Aven、(3)轉染GFP和E1B-19K、(4)轉染GFP并聯合轉染Aven和E1B19K的細胞、以及(5)未轉染的親本細胞的細胞性能。這5種細胞類型均在有和無松甾酮A存在下培養，從而得到總共10個實驗組。
開始測試轉瓶培養前2天，在實驗期間將包含類固醇的細胞培養基中加入5μM松甾酮A，以便充分誘導抗凋亡基因。在轉瓶中將250K細胞/ml接種在含葡萄糖的正常培養基中，開始每次實驗培養。第2天將培養基更換為無葡萄糖培養基，繼續培養。
為方便觀察數據，將實驗結果分成5張圖，顯示以培養天數為函數的存活率。
●圖7a顯示有和無松甾酮A的對照的單獨GFP培養物，在第2天存活率急劇下降。
●圖7b顯示有和無松甾酮A的Aven培養物，松甾酮的存在(誘導Aven表達)可有效提高小部分細胞在培養第3天的存活。
●圖7c顯示有和無松甾酮A的E1B-19K細胞，其兩種培養物的存活率均顯著高于對照(圖6a)和單獨Aven(圖6b)，類固醇的存在導致存活顯著提高。
●圖7d顯示有和無松甾酮A的E1B-19K+Aven細胞。這些細胞在松甾酮存在下第3天的存活率為80％，而此時其它所有培養物已經完全死亡，直到培養第5天存活率降到零。
●圖7e關注兩個完全不同的組的直接比較(head-to-headcomparison)，GFP對照組顯示較低的存活率，而E1B-19K組顯示極高存活率；這兩種細胞類型均處于松甾酮存在下。
這些數據證實了實施例1的結果，即單獨E1B-19K和單獨Aven的表達具有抗凋亡提高存活率的作用，單獨E1B-19K的作用顯著并高于單獨Aven，聯合表達這兩種基因產生協同作用，即超過各個基因作用相加所預期的結果。抗凋亡作用與這些轉染基因的表達特別有關，觀察到該作用完全依賴于類固醇誘導，進一步支持了這一點。
實施例7圖8所述研究包括，比較轉染E1B-19K和Aven兩者的穩定細胞系與作為對照的親本5C11細胞系的細胞培養生長及抗體產生的性能。通過轉染后的單細胞克隆得到本實施例以及實施例4中的轉染細胞系(E1B-19K和Aven)。
以3×105細胞/ml接種轉瓶培養物，按分批培養生長9天。在兩種培養物中加入5μM的類固醇松甾酮，該濃度可有效誘導所轉染的類固醇可誘導型基因。每日提取培養樣品，獲得細胞計數，并通過ELISA測定抗體濃度。
數據表明，培養物直至第6天均具有相似的性能。第6天出現微小差別，對照培養物的存活率略微下降至低于E1B-19K+Aven培養物，E1B-19K+Aven的抗體滴度略微高于對照培養物。隨后3天內，這些差別日益增大。第9天對照培養物的存活率降到28％，而E1B-19K+Aven培養物的存活率為78％。對照培養物的最終滴度為247mg/L，而E1B-19K+Aven培養物達到309mg/L，提高了約20％。
實施例8圖9所述研究測試了穩定轉染E1B-19K+Aven的細胞系中的類固醇誘導作用。因此以300K細胞/ml接種E1B-19K+Aven細胞的兩個培養物；第2天，其中一個(實驗)培養物加入5μM松甾酮A，另一個(對照)不加類固醇。在培養的前6天，這兩個培養物顯示相似的性能，利用類固醇誘導的培養物顯示存活率稍高。到第8天，對照培養物的存活率降到60％，而類固醇誘導的細胞系保持90％存活。第9天，對照培養物的存活率為35％，而類固醇誘導的培養物為70％。最后，在第10天，對照培養物為30％存活，而誘導細胞系為40％存活。對照培養物的最終滴度為240mgs/升，而類固醇誘導的培養物的最終滴度為290mgs/升，提高了約20％。
實施例7和8的凋亡壓力是在持續9-10天的分批培養過程中形成的營養耗盡及毒性。凋亡表現為細胞突然死亡，對于對照細胞而言，開始于分批培養的第6或7天。結合前兩個實施例的結論是，表達轉染的抗凋亡基因E1B-19K和Aven的聯合作用在于延遲培養物的壽命，提高培養物的抗體滴度約20％，并且這兩種基因的活性的確依賴于類固醇的誘導。
實施例9其它蛋白質治療性產物的實例上述代表本發明實施方案的實施例是關于人源化抗CD154抗體(IDEC 131)的生產。CD154是不成熟及成熟的B淋巴細胞表面分子CD40的配體，在與抗體交聯時可誘導B細胞增殖。
本領域技術人員可以將本發明方法應用于治療性蛋白質產物、特別是抗體及其通過哺乳動物細胞發酵方法制備，其優選實例如下人RSV融合蛋白質的抗體，如美國專利5,811,524、5,840,298、5,866,125、5,939,068、5,955,364和5,958,765所述。
人CD20的抗體，為治療B細胞淋巴瘤而設計，如美國專利5,736,137和5,776,456所述。
用于人類治療的包括舊世界猴(old world monkey)部分以及人源部分的嵌合重組抗體，如美國專利5,658,570、5,681,722、5,693,780、5,750,105和5,756,096所述。
包含人γ1恒定結構域的人CD23的單克隆抗體，可抑制B細胞由IL-4誘導的IgE生成，如美國專利6,011,138所述。
針對人B7.1(CD80)和B7.2(CD86)的靈長類源化抗體在治療自身免疫性疾病以及防止移植排斥中用作特異性免疫抑制劑，如美國專利6,113,898所述。
包含舊世界猴可變序列以及人恒定結構域序列的針對人CD4 γ1恒定結構域的嵌合抗體，如美國專利6,136,310所述。
實施例10Aven在血清去除后增強Bcl-xL的功能許多哺乳動物細胞在培養中需要血清進行增殖，除非其已經適應在無血清環境中生長。血清為細胞提供生長因子、營養、代謝物、激素以及細胞因子，并已經表明在生物反應器培養過程中提供抗凋亡作用。我們已經表明，CHO-K1在血清去除后經歷凋亡(圖10以及Mastrangelo等人，Bioreg.Bioeng.67(5)544-54(2000)，Figueroa等人，Bioreg.Bioeng.7(3)211-222(2001))。在生物產物的生產過程中可發生營養物及生長因子的耗盡，故而引入血清去除研究作為該環境的細胞培養模型。
為確定是否可以改造細胞以克服這種傷害，將生長于10％FBS并表達Aven、Bcl-xL和Bcl-xL+Aven的CHO細胞隨后暴露于無血清培養基。然后在去除后的數天監測存活率，如圖11A所示。血清去除2天后，觀察到改造的細胞系優于親本CHO K-1細胞。在血清去除后的前2天，表達Aven提供了保護作用，使此時培養物的存活率保持在高于90％。實際上，在去除2天時，CHO-aven細胞的存活率高于CHO-bcl-xL，并與CHO-bcl-xL+aven相當。然而，血清去除2天以后，與Bcl-xL提供的保護相比，表達Aven所提供的保護作用極小。總而言之，CHO-bcl-xL+aven的性能超過CHO-bcl-xL、CHO-aven和親本CHO K-1。血清去除3天以后，Aven和Bcl-xL聯合提供的增強的保護作用明顯，并在暴露于無血清培養基以后維持5天。CHO-bcl-xL+aven保持大于85％的存活率；而CHO-K1的存活率剛過20％，CHO-bcl-xL同時顯示小于60％的存活率。去除9天以后也測定存活率，以觀察該保護作用是否可長期維持(圖11B)。血清去除9天后，親本CHO-K1細胞的存活率為7％，而表達一種抗凋亡基因的細胞的存活率略高于10％。然而，CHO-bcl-xL+aven保持24％的存活率，兩倍于只表達一種基因的細胞，并比對照高三倍。
實施例11Aven在4和5天耗竭培養基(spent medium)中增強Bcl-xL的功能許多生物反應器在運行末期經常碰到代謝廢物及細胞溶質碎片的積累，連同營養及生長因子的耗盡，產生不利于細胞存活的環境。為了模擬這種環境，將CHO細胞暴露于4和5天培養物的培養基中，評價表達Aven、Bcl-xL和Bcl-xL+Aven的作用。為得到耗竭培養基，將CHO K-1細胞在DMEM完全培養基中傳代并擴增4或5天，然后收集培養基。收集時觀察到細胞在4和5天的耗竭培養基中的存活率差異顯著。CHO K-1擴增4天以后，培養基(黃/橙色)因代謝廢物積累、血清耗盡(緩沖液特性)以及培養物自分泌信號而酸化，可是培養物仍存活(存活率大于75％)，但100％貼壁。培養5天后，CHO K-1存活率急劇降低到30％以下，細胞完全脫離培養瓶，并伴隨培養基進一步酸化(深黃色)。培養基持續酸化可能主要歸因于大部分細胞死亡并溶解，將細胞內溶物釋放到培養基中。如圖10所示，將CHO細胞暴露于4和5天的耗竭培養基的培養條件下，可誘導凋亡。
為檢測耗竭培養基中的細胞存活率，將細胞用PBS洗滌兩次，以確保去除血清，然后暴露于耗竭培養基中。暴露于4天耗竭培養基中以后，改造的CHO K-1細胞系在幾乎所有時間點的存活率均高于親本CHO K-1(圖12A和12B)。Aven單獨表達可增強暴露后3天的存活率，此時存活率已降到類似于親本CHO K-1的水平(圖12A)。為確定這是克隆特征還是所表達基因的特征，將兩個不同的CHO-aven克隆暴露于4天的耗竭培養基中。引人注目的是，兩個克隆均顯示相同的特征性保護模式，其中存活率在前3天增強，然后下降到等于或低于野生型CHO細胞的水平。相反，表達Bcl-xL的CHO細胞對4天耗竭培養基顯示不同的敏感性模式(圖12B)。在暴露后第1天，CHO-bcl-xL與其它細胞系包括CHO-K1相比，存活率下降最為顯著。在暴露后第2天，CHO-bcl-xL的存活率穩定，與親本CHO-K1相比，Bcl-xL的表達在暴露于耗竭培養基期間提供了保護作用。在暴露于4天的耗竭培養基中的每一天，CHO-bcl-xL+aven的存活率均等于或好于CHO-aven、CHO-bcl-xL以及親本CHO K-1。在暴露于4天的耗竭培養基的4天中，攜帶兩種抗凋亡基因的細胞系的存活率保持高于85％，而同一時間親本CHO-K1和CHO-aven的存活率約為40％。
暴露于5天的耗竭培養基后，與暴露于4天的耗竭培養基相比，細胞死亡率顯著提高。如圖12C所示，暴露于5天的耗竭培養基的細胞培養物，在暴露2天以后存活率急劇下降。CHO-Kl在4天耗竭培養基中的存活率為68％，但由于5天培養基的毒性增高，其存活率水平急劇下降到14％。然而，改造的CHO細胞系的性能再次超過親本CHOK-1。與親本CHO K-1相比，在兩個不同克隆中的Aven表達對暴露于5天的耗竭培養基所致程序性細胞死亡提供了某種保護作用。表達Bcl-xL提供了更強的毒性防護作用，其5天的耗竭培養基中的存活率超過40％。共表達Bcl-xL和Aven對暴露于5天的耗竭培養基以后的細胞死亡率改變最大，在該環境中2天后的存活率為48％。然而，在毒性更大的5天的耗竭培養基中，表達兩種基因相比單獨表達Bcl-xL所提供的增強的保護作用不如以前在4天培養基中所觀察到的那么大。CHO-bclxL+aven在4天的耗竭培養基中的存活率始終高于CHO-bclxL將近20個百分點，而在高度酸化和高毒性的5天的耗竭培養基中，該差別小于8個百分點。
實施例12使用蛻皮激素可誘導型表達系統另外進行的去除研究圖13a和13b圖解描述了本實施例所用的先前所述蛻皮激素可誘導型系統及載體系統。如圖13c進一步所示，由pVgRXR表達RXR和VgEcR，加入配體(即松甾酮A)可誘導異二聚體RXR和VgEcR結合到雜合的蛻皮激素反應元件(EGRE)，從修飾的蛻皮激素受體中的VP16反式激活結構域活化轉錄。
如圖14所示，CHO細胞包含表達α-GFP、α-Aven或α-E1B-19K的可誘導型表達系統，利用5μM松甾酮A進行誘導。
如圖15所示，使用該可誘導型表達系統進行葡萄糖去除實驗(其中在實驗開始之前，處于6孔培養物中的細胞群體經5μM松甾酮誘導48小時)，隨時間測定細胞存活率。圖16包含GFP對照組的轉瓶結果，圖17為表達E1B-19K的細胞，圖18包含在轉瓶中去除葡萄糖的條件下，表達E1B-19K的細胞與表達GFP的細胞比較的細胞存活率結果。
圖19、20和21分別包含經松甾酮A誘導后，表達Aven、Aven+E1B19K以及Aven+E1 B19K與GFP比較的實驗結果。
這些結果提供了進一步的證據，證明Aven和E1B-19K經松甾酮A誘導后穩定表達，單獨Aven可對葡萄糖去除所誘導的凋亡提供微小的保護作用，但是共表達Aven可以顯著增強E1B-19K對葡萄糖去除所啟動的凋亡的保護作用。
實施例13利用IDEC-131抗凋亡細胞系(14C6)的結果在本實施例中，表達IDEC-131的CHO細胞系(單細胞分離物)與500nM的氨甲蝶呤接觸，并轉染可組成性表達類固醇受體異二聚體的pVgRXR載體(Invitrogen載體)，產生5C11，在Zeocin抗性條件下培養。
這些細胞然后轉染經修飾包含抗凋亡基因的相同可誘導型表達載體(包含Aven+E1B-19K基因的修飾的Invitrogen載體)，利用松甾酮A誘導這些細胞，轉染細胞培養于Zeocin/嘌呤霉素抗性條件下(這些實驗如圖22圖解所示)。
然后根據包括生長率、比產率(pg/細胞/天)、可誘導型蛋白質表達(通過western印跡)以及抗體滴度(ELISA/HPLC)的標準，將該細胞系與原始的500 E9細胞系作比較。
這些實驗評價了表達E1B-19K以及表達Aven和E1 B19K的14個細胞系。在誘導及非誘導條件下，于100mL體積、1x雙份、2x三份進行這些實驗。
圖22-26包含這些實驗的結果。此處所含結果表明，表達E1 B19K可延長細胞培養時間(w/wo誘導)，但是可以證明其對細胞生長的作用，卻不增強抗體生成。
相反，共表達Aven+E1 B 19K的細胞誘導后可延長細胞培養時間多達3天，并顯著增強抗體滴度(相對于親本CHO細胞系500E9多達20-30％)。這些細胞系顯示這些抗凋亡基因低水平組成型表達。
實施例14生物反應器反應器研究#1在這些實驗中，利用補料分批方法的5L生物反應器評價3個細胞系(14C6、15C3和15E2)。這3個實驗利用單反應器、誘導及非誘導條件下的雙反應器、3種不同方法以及高密度接種進行。
圖28-31包含這些生物反應器研究的結果。該研究結果表明，誘導和非誘導的15C3細胞系的細胞存活率、活細胞密度以及滴度均高于500E9。
該實驗結果進一步表明，15C3的比產率高于14C6，但兩者均低于500 E9細胞系。還觀察到松甾酮誘導并未提高15C3細胞系的抗體滴度。
實施例15生物反應器研究#2在這些實驗中，再次以松甾酮A為誘導劑，在對數早期的誘導條件下培養15C3抗體生產細胞系。圖32-37包含這些結果，表明未誘導培養物產生的存活率、細胞密度以及滴度均高于500E9細胞系。
具體而言，未誘導培養物的抗體滴度高出500E9 20-30％。還觀察到該誘導可提高培養物壽命，但未提高抗體滴度，比產率低于500E9細胞系。
實施例16生物反應器研究#3在100％的新鮮培養基中高密度接種相同的500E9和15C3細胞系，于對數中期誘導，進行第3個生物反應器研究。圖35-37包含該研究的結果。這些結果表明，15C3培養物產生的細胞衍生物以及滴度均高于500E9，未誘導培養物的滴度高出500E9 20-30％。誘導也提高培養物壽命，但未提高抗體滴度。該結果還表明，15C3的比產率低于500E9。
因此，總而言之，上述實施例所述實驗結果證明，CHO DG44細胞系遭受長期培養及葡萄糖去除時經歷凋亡性細胞死亡，單獨或聯合表達抗凋亡基因的細胞系顯示，在表達兩種測試的抗凋亡基因(Aven和E1B-19K基因)的CHO細胞系的轉瓶和生物反應器培養物中，細胞存活率及產率提高。
這些結果表明，表達一種或多種抗凋亡基因，優選在可誘導型啟動子、如蛻皮激素可誘導型表達系統的調節下表達，提供了增強細胞培養物、例如產生目的重組蛋白質的哺乳動物細胞培養物的比產率的不同方法。
本申請引用的全部專利和非專利參考文獻在此全文引入以供參考。
盡管詳述發現的說明書已經描述了本發明的幾個實施方案，應當理解以上說明書只是說明、而非限制本公開發明。本發明僅受以下權利要求的限制。
權利要求
1.防止或延遲重組細胞中程序性細胞死亡的方法，其中該細胞不是小鼠骨髓瘤細胞，其包含在細胞內表達一種或多種抗凋亡多肽，以便防止或延遲細胞的程序性細胞死亡，其中如果在細胞內表達一種抗凋亡多肽，則該抗凋亡多肽不是Aven。
2.權利要求1的方法，其中所述細胞包含編碼一種或多種目的多肽的一種或多種異源多核苷酸。
3.權利要求1的方法，其中所述目的多肽選自抗體、酶、受體、細胞因子、細胞表面因子、細胞代謝物、細胞分泌因子、病毒性因子以及膜結合因子。
4.權利要求3的方法，其中所述抗體選自抗CD154抗體(IDEC-131)、抗CD20抗體(Rituxan、ZevalinTM、抗B7抗體(IDEC 114)、抗CD23抗體(IDEC 152)、抗CD4抗體(IDEC 151)以及抗腫瘤抗原抗體。
5.權利要求1的方法，其中一種或多種抗凋亡多肽的表達受與編碼所述一種或多種抗凋亡多肽的多核苷酸有效連接的至少一種可誘導型異源啟動子控制。
6.權利要求5的方法，其中所述可誘導型異源啟動子可由類固醇誘導。
7.權利要求5的方法，其中所述可誘導型異源啟動子是蛻皮激素啟動子。
8.權利要求5的方法，其中所述重組細胞進一步包含與所述至少一種可誘導型異源啟動子有效連接的可篩選或可選擇的標志。
9.權利要求8的方法，其中所述可篩選或可選擇的標志是綠色熒光蛋白(GFP)或增強的綠色熒光蛋白(EGF)。
10.權利要求1的方法，其中所述抗凋亡多肽由真核細胞或病毒中的基因編碼。
11.權利要求1的方法，其中所述抗凋亡多肽選自Bcl-xL、Bcl-2、Aven、E1B-19K和p35。
12.權利要求1的方法，包含表達一種抗凋亡多肽。
13.權利要求12的方法，其中所述抗凋亡多肽是E1B-19K。
14.權利要求1的方法，包含表達至少兩種抗凋亡多肽。
15.權利要求14的方法，其中所述至少兩種抗凋亡多肽包括E1B-19K和Aven。
16.權利要求1的方法，其中所述重組細胞是哺乳動物細胞。
17.權利要求16的方法，其中所述重組細胞選自人類細胞、小鼠細胞以及嚙齒類動物細胞。
18.權利要求16的方法，其中所述重組細胞是CHO細胞。
19.權利要求18的方法，其中所述重組細胞是CHO 5C11。
20.權利要求16的方法，其中所述重組細胞是BHK細胞。
21.權利要求1的方法，其中所述重組細胞處于商品化生產的大規模生物反應器或培養裝置中。
22.提高重組細胞的細胞相關產物產量的方法，其包含在細胞中表達一種或多種抗凋亡多肽，以便提高該細胞的細胞相關產物產量，其中如果在細胞內表達一種抗凋亡多肽，則該抗凋亡多肽不是Aven。
23.權利要求22的方法，其中所述細胞相關產物選自重組蛋白質、抗體、酶、受體、細胞因子、細胞表面因子、細胞代謝物、細胞分泌因子、病毒性因子、膜結合因子以及多核苷酸。
24.權利要求23的方法，其中所述抗體選自抗CD154抗體(IDEC-131)、抗CD20抗體(Rituxan、ZevalinTM、抗B7抗體(IDEC 114)、抗CD23抗體(IDEC 152)、抗CD4抗體(IDEC 151)以及抗腫瘤抗原抗體。
25.權利要求22的方法，其中一種或多種抗凋亡多肽的表達受與編碼所述一種或多種抗凋亡多肽的多核苷酸有效連接的至少一種可誘導型異源啟動子控制。
26.權利要求25的方法，其中所述可誘導型異源啟動子可由類固醇誘導。
27.權利要求25的方法，其中所述可誘導型異源啟動子是蛻皮激素啟動子。
28.權利要求25的方法，其中所述重組細胞進一步包含與所述至少一種可誘導型異源啟動子有效連接的可篩選或可選擇的標志。
29.權利要求28的方法，其中所述可篩選或可選擇的標志是綠色熒光蛋白(GFP)或增強的綠色熒光蛋白(EGF)。
30.權利要求22的方法，其中所述抗凋亡多肽由真核細胞或病毒中的基因編碼。
31.權利要求22的方法，其中所述抗凋亡多肽選自Bcl-xL、Bcl-2、Aven、E1B-19K和p35。
32.權利要求22的方法，包含表達一種抗凋亡多肽。
33.權利要求32的方法，其中所述抗凋亡多肽是E1B-19K。
34.權利要求22的方法，包含表達至少兩種抗凋亡多肽。
35.權利要求34的方法，其中所述至少兩種抗凋亡多肽包括E1B-19K和Aven。
36.權利要求22的方法，其中所述重組細胞是哺乳動物細胞。
37.權利要求36的方法，其中所述重組細胞選自人類細胞、小鼠細胞以及嚙齒類動物細胞。
38.權利要求36的方法，其中所述重組細胞是CHO細胞。
39.權利要求38的方法，其中所述重組細胞是CHO 5C11。
40.權利要求36的方法，其中所述重組細胞是BHK細胞。
41.權利要求22的方法，其中所述重組細胞處于商品化生產的大規模生物反應器或培養裝置中。
42.提高重組細胞產量的方法，其包含在細胞中表達一種或多種抗凋亡多肽，以便提高該重組細胞的產量，其中如果在細胞內表達一種抗凋亡多肽，則該抗凋亡多肽不是Aven。
43.用于產生細胞相關產物的重組細胞，其表達或能夠表達至少兩種抗凋亡多肽。
44.權利要求43的重組細胞，其中所述抗凋亡多肽由真核細胞或病毒的基因編碼。
45.權利要求43的重組細胞，其中所述抗凋亡多肽選自Bcl-xL、Bcl-2、Aven、E1B-19K和p35。
46.權利要求43的重組細胞，其中所述至少兩種抗凋亡多肽包括E1B-19K和Aven。
47.權利要求43的重組細胞，其中所述細胞相關產物選自重組蛋白質、抗體、酶、受體、細胞因子、細胞表面因子、細胞代謝物、細胞分泌因子、病毒性因子、膜結合因子以及多核苷酸。
48.權利要求43的重組細胞，其中所述抗體選自抗CD154抗體(IDEC-131)、抗CD20抗體(Rituxan、ZevalinTM、抗B7抗體(IDEC 114)、抗CD23抗體(IDEC 152)、抗CD4抗體(IDEC 151)以及抗腫瘤抗原抗體。
49.權利要求43的重組細胞，其中一種或多種抗凋亡多肽的表達受與編碼所述一種或多種抗凋亡多肽的多核苷酸有效連接的至少一種可誘導型異源啟動子控制。
50.權利要求49的重組細胞，其中所述可誘導型異源啟動子可由類固醇誘導。
51.權利要求49的重組細胞，其中所述可誘導型異源啟動子是蛻皮激素啟動子。
52.權利要求49的重組細胞，其中所述重組細胞進一步包含與所述至少一種可誘導型異源啟動子有效連接的可篩選或可選擇的標志。
53.權利要求52的重組細胞，其中所述可篩選或可選擇的標志是綠色熒光蛋白(GFP)或增強的綠色熒光蛋白(EGF)。
54.權利要求43的重組細胞，其中所述重組細胞是哺乳動物細胞。
55.權利要求43的重組細胞，其中所述重組細胞選自人類細胞、小鼠細胞以及嚙齒類動物細胞。
56.權利要求43的重組細胞，其中所述重組細胞是CHO細胞。
57.權利要求56的重組細胞，其中所述重組細胞是CHO 5C11。
58.權利要求43的重組細胞，其中所述重組細胞是BHK細胞。
59.權利要求43的重組細胞，其中所述細胞在商品化生產的大規模生物反應器或培養裝置中產生細胞相關產物。
60.細胞群體，用于產生所述細胞的一種或多種生物功能，其表達或能夠表達至少兩種抗凋亡多肽。
61.用于細胞性治療的細胞群體，其表達或能夠表達一種或多種抗凋亡多肽。
全文摘要
本發明涉及通過在細胞內表達一種或多種抗凋亡多肽來防止或延遲程序性細胞死亡，從而防止或延遲細胞內程序性細胞死亡。本發明還涉及通過在細胞內表達一種或多種抗凋亡多肽來提高細胞相關產物的產量，從而提高該細胞的細胞相關產物的產量。本發明還提供了用于產生細胞相關產物或用于細胞性治療的重組細胞。
文檔編號C12N15/85GK1526011SQ02813851
公開日2004年9月1日 申請日期2002年7月10日 優先權日2001年7月10日
發明者M·里夫, M·J·貝滕鮑格, B·小菲格羅亞, E·埃羅, M·哈德維克, M 里夫, 攣, 聘衤捫, 貝滕鮑格 申請人:Idec藥物公司