專利名稱：含有含多不飽和脂肪酸的甘油三酯的油或脂肪的生產方法
發明
背景技術：
領域本發明涉及含有甘油三酯的油或脂肪，其中在所述甘油三酯的1和3位連接有中鏈脂肪酸，并且在甘油三酯的2位連接有至少一種選自具有18個或更多個碳原子和3個或更多個雙鍵的ω6系列多不飽和脂肪酸及具有18個或更多個碳原子和2個或更多個雙鍵的ω9系列多不飽和脂肪酸的多不飽和脂肪酸，本發明還涉及所述油或脂肪的生產方法以及含有這些油或脂肪的組合物。
背景技術：
二十碳五烯酸(可稱作“EPA”)和二十二碳六烯酸(可稱作“DHA”)是具有許多生理學功能，例如對成人疾病如動脈硬化和血栓形成的預防效果；抗癌作用和增強學識獲得的作用的ω3系列多不飽和脂肪酸，并且它們已經在用于特定保健用途的藥物和食品中得到應用。然而，近來人們對除ω3系列多不飽和脂肪酸以外的其它多不飽和脂肪酸(例如，ω6系列和ω9系列多不飽和脂肪酸)的生理學功能的興趣日益增加。
在人體內通過生物合成途徑合成的多不飽和脂肪酸由兩種代表性的系列組成，即ω3系列和ω6系列(ω表示從脂肪酸的甲基末端數第一個雙鍵所處位置的碳原子數)。ω6系列多不飽和脂肪酸的已知實例包括亞油酸、γ-亞麻酸、雙高-γ-亞麻酸和花生四烯酸。
花生四烯酸占組成重要器官(如血和肝)的脂肪酸的約10％(例如，在人血磷脂類的脂肪酸組成中，花生四烯酸占11％、二十碳五烯酸占1％并且二十二碳六烯酸占3％)，它作為細胞膜的主要構成成分參與調節膜的流動性，并且顯示與人體代謝有關的各種功能。另一方面，它還起作為前列腺素的直接前體的重要作用。近來，人們把注意力特別集中在了花生四烯酸作為嬰兒營養的作用，其可以作為作用于神經的內源性大麻酯(如，2-花生四烯酰單甘油和anandamide)的脂肪酸成分。雖然人類不能合成亞油酸，但在攝入植物油后，碳鏈的不飽和及增長經過重復，可以轉化成γ-亞麻酸、雙高-γ-亞麻酸和花生四烯酸。因此，如果食用了富含亞油酸的食物，在正常情況下可以合成足夠量的花生四烯酸。然而，在患有成人疾病的患者、易患成人疾病的人、嬰兒和老年人中，由于參與生物合成的酶的活性降低，由此導致花生四烯酸缺乏，優選直接以復合脂肪酸的油和脂肪(甘油三酯)的形式直接攝取花生四烯酸。
雖然所攝取的油和脂肪(甘油三酯)當進入小腸時一般是通過胰脂酶來水解的，但這種胰脂酶對1、3位是特異性的，能夠將甘油三酯的1、3位切斷，形成兩個分子的游離脂肪酸，同時形成一個分子的2-單酰甘油(可稱作“2-MG”)。由于這種2-MG極易溶于膽汁酸并且具有高度的吸收性，因而2-位脂肪酸一般認為是容易吸收的。除此之外，當2-MG被溶解于膽汁酸中時，它通過增加游離脂肪酸的吸收而起表面活性劑的作用。隨后，游離脂肪酸和2-MG與膽固醇和磷脂類一起生物合成膽汁酸復合微膠粒，然后摻入小腸的上皮細胞中并在其中發生三酰甘油的再合成，之后以乳糜微粒的形式最終釋放至淋巴中。
然而，需要花生四烯酸的人同時還具有弱的胰脂酶活性(例如，已知胰脂酶活性還隨年齡的增大而降低)，而胰脂酶的活性與油/脂肪(甘油三酯)吸收的第一階段有關，因此，這些人不能從含有花生四烯酸的食物及油和脂肪(包括微生物發酵的油和脂肪形式的含花生四烯酸的油和脂肪)中吸收足夠量的花生四烯酸。
因此，其中1、3位連接有中鏈脂肪酸(其容易被胰脂酶所水解)并且第2位連接有花生四烯酸的甘油三酯，對需要花生四烯酸的人來說是最佳的油和脂肪(甘油三酯)。日本未審專利申請8-214891公開了一種含有甘油三酯的油或脂肪的生產方法，其中所說的甘油三酯含有多不飽和脂肪酸，其1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且第2位連接有多不飽和脂肪酸，但其唯一具體的描述是第2位連接有EPA或DHA的甘油三酯的生產方法，而沒有具體公開第2位連接有花生四烯酸的甘油三酯的生產方法。
日本未審專利申請2000-270885公開了一種通過讓脂酶對甘油三酯1、3-位進行特異性作用來生產結構脂質的方法，其中連接至目標甘油三酯第1和3-位的脂肪酸的碳原子數為12或更少，并且連接至第2-位的脂肪酸的90％或更多是多不飽和脂肪酸。這里，允許被脂酶作用的油或脂肪是，例如，其中98％或更多是EPA甘油三酯的甘油三酯，并且該甘油三酯是通過讓非位置特異性脂酶對甘油和多不飽和脂肪酸或其低級醇酯進行作用同時脫水而合成的。然而，在上述方法中，需要高純度的多不飽和脂肪酸或其低級醇酯而不是混合物，但目前還難以廉價地獲得它們，因而通過前述方法來生產目標產物并不現實。
另一方面，已知一種通過發酵廉價地生產含有多不飽和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)的方法。Yuji Shimada(發酵和生物工程雜志(Journal ofFermentation and Bioengineering)，83，321-327(1997)，“德列馬根霉(Rhizopus delemar)脂酶在酸解中的脂肪酸特異性”公開了一種使用這種微生物油來生產在第1和第3位連接的是辛酸的甘油三酯的方法，在該方法中，將含有25wt％花生四烯酸的微生物油(同時以可用作底物)通過1、3-位特異型脂酶發酵。然而，由于在這種微生物油中，花生四烯酸與甘油三酯相連接的位置是隨機的，即使通過酶將第1和第3位的脂肪酸用辛酸差不多完全取代，所得油中1，3-辛酰-2-花生四烯酰-甘油(可稱作“8A8”)的比例最大程度也不會超過原料油中2-位所連接的花生四烯酸的比例。在此情形中，與第2-位連接的花生四烯酸的比例至多25wt％，并且實際上，由于還存在其中在多個位置連接有花生四烯酸的甘油三酯，因此連接至第2-位的花生四烯酸的比例為25wt％或更少。根據Shimada等(發酵和生物工程雜志，83，321-327(1997))的報道，雖然將所得甘油三酯通過高效液相色譜進行了分析，但由于8A8、1，3-辛酰-γ-亞麻酰-甘油(可稱作“8G8”)和1，3-辛酰-2-雙高-γ-亞麻酰-甘油(可稱作“8D8”)的保留時間是相同的，因而不能準確測得甘油三酯中8A8的比例。然而，由于8A8、8G8和8D8的總和為約20mol％，所得的甘油三酯在含有25mol％以上的8A8方面不能令人滿意。
在按此方式使用微生物油作為原料油的情形中，由于花生四烯酸與甘油三酯相連接的位置是隨機的，因而就必須使用具有較高含量花生四烯酸的甘油三酯作為原料，以便增加目標8A8的比例。
然而，1、3-位特異型脂酶對脂肪酸的反應活性隨著碳鏈長度的增長以及雙鍵數量的增加而越低。此外，當討論脂酶的反應活性時，雙鍵的位置、即從羧基開始計數，插入雙鍵的碳原子的位置，也是重要的考慮因素。例如，雖然脂酶對α-亞麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)顯出高度的反應活性，但對γ-亞麻酸(6，9，12-十八碳二烯酸)顯出極低的反應活性；并且雖然對DPAω3系列(7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸)顯出高度的反應活性，但對DPA ω6系列(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)顯出極低的反應活性。也就是說，對具有18個或更多個碳原子的ω6系列多不飽和脂肪酸而言，脂酶存在對具有3個或更多個雙鍵的不飽和脂肪酸顯出低反應活性的問題，以及對ω9系列多不飽和脂肪酸而言，脂酶存在對具有2個或更多個雙鍵的不飽和脂肪酸顯出低反應活性的問題。因此，為獲得含有較高濃度目標甘油三酯的油或脂肪(其中在甘油三酯的第1、3-位連接有中鏈脂肪酸，并且在甘油三酯的第2位連接有至少一種選自具有18個或更多個碳原子和3個或更多個雙鍵的ω6系列多不飽和脂肪酸及具有18個或更多個碳原子和2個或更多個雙鍵的ω9系列多不飽和脂肪酸的多不飽和脂肪酸)，就必須使用含有較高濃度的至少一種選自具有18個或更多個碳原子和3個或更多個雙鍵的ω6系列多不飽和脂肪酸及具有18個或更多個碳原子和2個或更多個雙鍵的ω9系列多不飽和脂肪酸的多不飽和脂肪酸的油或脂肪作為原料油或脂肪。然而，這種油或脂肪的含量越高，反應活性就越低，并且反應產率越差。這種反應產率的降低導致形成大量未反應的甘油三酯(原料甘油三酯和其中1、3-位的脂肪酸中只有一個變成中鏈脂肪酸的甘油三酯)，其結果是，目標甘油三酯的比例不能得到增加。因此，強烈需要開發一種增加目標甘油三酯比例的切合實際的方法。
預期ω6系列多不飽和脂肪酸--雙高-γ-亞麻酸--可以顯示出I型前列腺素前體的作用、抗血栓形成作用、降血壓作用、抗運動障礙作用、抗炎作用、延遲的變態反應抑制作用、皮膚防護作用和抗癌作用。因此，雖然同樣需要開發在1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且在2位連接有雙高-γ-亞麻酸的甘油三酯，但具有高含量雙高-γ-亞麻酸的油和脂肪(甘油三酯)是未知的，并且還沒有找到關于生產這種甘油三酯的方法。
已知ω9系列多不飽和脂肪酸，如5，8，11-二十碳三烯酸(20∶3 ω9系列，可稱作Mead酸)和8，11-二十碳二烯酸(20∶2 ω9系列)作為結構脂肪酸之一而存在于缺乏基本脂肪酸的動物組織中。然而，它們僅以少量存在，因而它們的分離和純化極其困難。這些多不飽和脂肪酸能夠成為體內白三烯3族的前體，并且它們的生理學活性是很有前景的靶點，據報道的實例包括抗炎、抗過敏和抗風濕作用(日本未審專利申請7-41421)。因此，雖然同樣需要開發在1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且在2位連接有ω9系列多不飽和脂肪酸的甘油三酯，但具有高含量ω9系列多不飽和脂肪酸的油和脂肪(甘油三酯)是未知的，并且還沒有找到關于生產這種甘油三酯的方法。
發明公開本發明的目的是提供一種含有甘油三酯的油或脂肪，其中在所述甘油三酯的第1、3-位連接有中鏈脂肪酸，并且在所述甘油三酯的第2位連接有至少一種選自具有18個或更多個碳原子和3個或更多個雙鍵的ω6系列多不飽和脂肪酸及具有18個或更多個碳原子和2個或更多個雙鍵的ω9系列多不飽和脂肪酸的多不飽和脂肪酸，本發明還提供所述油和脂肪的生產方法以及含有這些油或脂肪的組合物。
本發明的發明人首先針對含有40wt％或更多花生四烯酸的油或脂肪(甘油三酯)的工業化生產方法進行了深入研究，以便達到生產其中在3位連接有中鏈脂肪酸并且在2位連接有花生四烯酸的甘油三酯的含量為25mol％或更多的油或脂肪的目的，結果，通過控制培養基中碳源的濃度，意想不到地獲得了含有45wt％或更多花生四烯酸的油或脂肪(甘油三酯)。
此外，為達到生產含有高含量的在第1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且在第2位連接有雙高-γ-亞麻酸或ω9系列多不飽和脂肪酸的甘油三酯的油或脂肪的目的，本發明的發明人進行了深入的研究，結果，通過使用產花生四烯酸微生物的突變株，獲得了含有高含量雙高-γ-亞麻酸或ω9系列多不飽和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)。
此外，為了改進酶的反應效率，本發明的發明人進行了深入的研究，結果，通過提高反應溫度，意想不到地成功地改進了反應效率。
此外，本發明的發明人通過選擇固定載體，成功地獲得了具有高度熱穩定性的固定化酶，使得在高反應溫度下使用酶成為可能，由此導致本發明的完成。此外，由這些方法獲得的實驗室結果可以容易地擴大規模，從而供適宜于前述油或脂肪工業化生產的方法。
因此，本發明提供了一種含有甘油三酯的油或脂肪，其中在所述甘油三酯的第1-和第3-位連接有中鏈脂肪酸，并且在所述甘油三酯的第2位連接有至少一種選自具有18個或更多個碳原子和3個或更多個雙鍵的ω6系列多不飽和脂肪酸及具有18個或更多個碳原子和2個或更多個雙鍵的ω9系列多不飽和脂肪酸的多不飽和脂肪酸，本發明還提供了所述油和脂肪的生產方法以及含有這些油或脂肪的組合物。
根據本發明，可以生產例如，在1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且在2位連接有花生四烯酸的甘油三酯的含量為25mol％或更多的油或脂肪；含有在1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且在2位連接有雙高-γ-亞麻酸的甘油三酯的油或脂肪；或者含有在1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且在2位連接有ω9系列多不飽和脂肪酸的甘油三酯的油或脂肪，由于這些油和脂肪具有許多生理學功能，它們可以廣泛用于特定保健用途的藥物、食品等等，并且在工業上是極其有用的。
發明的最佳實施方式本發明涉及含有甘油三酯的油或脂肪的生產方法，其中在所述甘油三酯的第1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且在第2位連接有多不飽和脂肪酸，該方法通過將構成含有多不飽和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)的1、3-位的長鏈脂肪酸酯交換成中鏈脂肪酸來完成，本發明還涉及含有在1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且在2位連接有多不飽和脂肪酸的甘油三酯的油或脂肪。
本發明中，為防止伴隨用作原料的油或脂肪(甘油三酯)中多不飽和脂肪酸比例的增加而出現的未反應的油或脂肪(原料甘油三酯和其中1、3-位中僅有一個脂肪酸轉化成了中鏈脂肪酸的甘油三酯)的增加所引起的反應產率的降低，酶反應的溫度應當為30-50℃，并且優選40-50℃。
可以在本發明中使用的、可特異性地作用于甘油三酯1、3-位酯鍵的脂酶的實例包括由屬于根霉屬(Rhizopus)、根毛霉屬(Rhizomucor)和曲霉屬(Aspergillus)的微生物生產的脂酶以及豬胰脂酶。這些脂酶也可使用可商購獲得的產品。可商購獲得的產品的實例包括，但不限于，德列馬根霉(Rhizopus delemar)的脂酶(Tanabe Seiyaku)、米赫根毛酶(Rhizomucormiehei)的脂酶(Novo Nordisk，Lipozyme IM)和墨曲霉(Aspergillus niger)的脂酶(Amano Pharmaceutical，Lipase A)，以及可以使用的任何脂酶，前提條件是它對1、3-位是特異性的。
前述的脂酶是以固定在固定載體上的脂酶的形式使用，為的是給酶賦予耐熱性，以便允許反應溫度達到30℃或更高并且優選40℃或更高，從而提高反應效率。雖然硅藻土或陶瓷都曾用作固定載體，但在本發明中，通過對適宜于賦予耐熱性的固定載體進行研究，證實孔徑為約100埃或更大的多孔離子交換樹脂是有效的。
本發明的發明人是通過下述方法來選擇前述的固定載體的。即，使用離子交換樹脂來純化蛋白質，將蛋白質分離所基于的原理是以離子鍵合為基礎來吸附和解吸蛋白質。通過使用這個原理，本發明的發明人推斷認為可以通過將酶吸附至離子交換樹脂來固定蛋白質形式的酶。親水性樹脂載體，即多糖型載體如纖維素或瓊脂糖，常用于蛋白質的純化。然而，這種親水性能夠阻礙油或脂肪的酯交換。因此，經過深入研究，結果斷定被認為具有優越親液性的聚合物型或陶瓷型樹脂適合這種選擇。這些離子交換樹脂主要被用于水處理，以前還未曾用于酶的吸附純化。接下來，離子交換樹脂被分成陰離子交換樹脂和陽離子交換樹脂。當將目標脂酶的基團吸附在這兩種離子交換樹脂上時，發現它們牢固地吸附在陽離子交換樹脂上。此外，當將酶吸附至聚合物型陽離子交換樹脂上時，聚合物型的離子交換樹脂可以比凝膠型離子交換樹脂吸附更多的酶，由此可以固定具有高活性的酶。這種聚合物型樹脂的孔徑可以隨著由苯乙烯、乙烯基苯、苯酚、丙烯酸類、增塑劑等等組成的原料的組合而改變。由于這些陽離子交換樹脂包括弱堿類型和強堿類型，因而所顯示的結果是使用代表性陽離子交換樹脂所進行研究的結果。
將如下所示的含有40wt％花生四烯酸的微生物油(甘油三酯含量為95％或更多)與辛酸進行酶催化反應，并且在40℃下反應2天之后，根據甘油三酯中摻入的辛酸的量(mol％)比較酶活性程度。反應條件如下所示。
在40℃下反應48小時，同時振動(分析)在反應完成之后，將反應液體與固定化酶分離，并且用己烷將反應液體萃取至堿性。將經過萃取的甘油三酯級分的一部分用甲醇鈉甲基化，獲得脂肪酸甲酯。將所得的脂肪酸甲酯通過氣相色譜(GC)分析，測定辛酸甲酯的量。用作原料的含花生四烯酸的油中不含辛酸，通過酶活性摻入的辛酸可以通過GC來測定。按此方式，將酶活性表示為反應完成之后通過GC分析測得的辛酸比例的值(mol％)。
在上表中，Dow Chemical的離子交換樹脂當孔徑為100-1000埃時定義為大孔性的，當孔徑為100埃或更小時定義為凝膠。Mitsubishi Chemical將孔徑為300埃或更大的離子交換樹脂定義為大孔性的。因此，DowexMarathon WBA(商標名稱，Dow Chemical)是孔徑為100埃或更大的離子交換樹脂。
當證實Dowex Marathon WBA(商標名稱，Dow Chemical)的性能時，由于這種樹脂顯示出令人滿意的結果，因此針對以下幾個因素確認它是有效的。
1、它是孔徑為100埃或更大的多孔樹脂。
2、根據Dowex Marathon WBA(商標名稱，Dow Chemical)和DowexMarathon A(商標名稱，Dow Chemical)之間以及Diaion WA 10(商標名稱，Mitsubishi Chemical)和Diaion WA 30(商標名稱，Mitsubishi Chemical)之間的比較，多孔型的優點超過凝膠型的優點。
3、根據Dowex Marathon WBA(商標名稱，Dow Chemical)和DowexMarathon A之間的比較，雖然固定化酶可以通過具有陽離子交換基團來制備，但當生產更優選的高度活性形式時，具有弱堿性陽離子交換基團優于具有強堿性基團。
4、由于Amberlite IRA904(商標名稱，Rohm and Haas)的離子交換能力低于Dowex Marathon WBA(商標名稱，Dow Chemical)，因此所得的活性更低。
基于這些因素，固定載體的優選形式不是凝膠，而是具有許多100埃或更大的孔的多孔(高度多孔性的)樹脂，并且優選是具有弱堿性陽離子交換基團而不是強堿性基團、同時還具有高離子交換能力的載體。
此外，考慮到用于脂質的酶催化轉化，這種載體優選具有親液性能。由于酶反應在油或脂肪的內部發生，所以固定在孔內的酶也因為原料油或脂肪進入親液性樹脂而能夠參與反應，由此增加了反應速率并且提高了反應效率。進而，由于在反應過程中對熱敏感的酶與熱接觸的時間被縮短，以及由此導致酶壽命的延長，可以進一步說明這是提高生產率的一種適宜的方法。
前述的離子交換樹脂僅僅是所舉的實例，并且樹脂是不斷推陳出新的，在市場會出現更好的樹脂。當這種改進類型的樹脂變得可利用時，顯然它的活性將會等于或大于Dowex Marathon WBA(商標名稱，DowChemical)。
在本說明書中，雖然使用Dowex Marathon WBA(商標名稱，DowChemical)作為離子交換樹脂，但樹脂不限于這種固定載體，而是可以使用所有的樹脂，只要它們是能夠賦予等于或大于前述樹脂的耐熱性的離子交換樹脂即可。
此外，本發明的一個目的是通過使用具有耐熱性的固定化酶有效地生產其中目標1、3-位上酯連接有中鏈脂肪酸并且第2-位上酯連接有多不飽和脂肪酸的甘油三酯而不引起反應效率的降低并同時保持位置特異性，即使是在1、3-位特異型的脂酶顯示低反應活性的含有多不飽和脂肪酸的油或脂肪的情形中。因此，除選擇固定載體外，還可以使用賦予耐熱性的方法，它的一個實例是通過用交聯劑如京尼平(genipin)交聯劑處理固定化酶來賦予高程度的耐熱性。
對一份固定載體來說，將固定載體懸浮于0.5-20重量份1、3-位特異型脂酶的水溶液中，隨后逐漸向懸浮液中添加2-5份冷丙酮(例如，-80℃)并同時攪拌，形成沉淀物。然后，通過將此沉淀物減壓干燥，制得固定化酶。作為一個更簡單的方法，將0.05-0.4份的1、3-位特異型脂酶溶解于最少量的水中并且與1份固定載體混合并同時攪拌，隨后減壓干燥，制得固定化酶。雖然通過此方法可使約90％的脂酶固定至載體上，但是由于它在該狀態時不能顯出任何酯交換活性，因此可以通過在添加有1-10％水的底物(原料油或脂肪和中鏈脂肪酸)中預處理來最有效地活化固定化酶，并且優選在添加有1-3％水的底物中預處理，隨后再在生產中使用。
取決于酶的類型，添加到反應體系中的水的量是極其重要的。如果反應體系中不含水，則酯交換反應很難進行，而如果存在大量的水，則會發生水解，由此降低甘油三酯的回收率(由于水解形成了甘油二酸酯和甘油單酸酯)。然而，在這種情形中，通過使用經過前述預處理而活化的固定化酶，添加到反應體系中的水的量不再重要，并且即使是完全無水時，酯交換反應也會有效發生。此外，通過選擇酶制劑的類型，也可以取消固定化酶的水活化處理。
本發明中，起脂酶的底物作用的原料油或脂肪是指含有至少一種多不飽和脂肪酸的油或脂肪，其中所說的多不飽和脂肪酸選自具有18個或更多個碳原子和3個或更多個雙鍵的ω6系列多不飽和脂肪酸及具有18個或更多個碳原子和2個或更多個雙鍵的ω9系列多不飽和脂肪酸，但是不含ω3系列多不飽和脂肪酸，并且可以使用含有80wt％或更多、優選90wt％或更多并且更優選95wt％或更多甘油三酯的油或脂肪用作所說的油。
本發明通過使用具有耐熱性的固定化酶來提高酶反應溫度，結果，可以有效生產出目標甘油三酯，同時沒有引起反應效率的降低，即使是本發明的油或脂肪中含有具有低反應活性的多不飽和脂肪酸時。因此，本發明中，即使其中至少一種選自具有18個或更多個碳原子和3個或更多個雙鍵的ω6系列多不飽和脂肪酸及具有18個或更多個碳原子和2個或更多個雙鍵的ω9系列多不飽和脂肪酸的多不飽和脂肪酸的總量為30wt％或更多、42wt％或更多或50wt％或更多的油或脂肪也可以使用，所述總量是相對于所述油或脂肪中脂肪酸的總量而言的。此外，具有18個或更多個碳原子和3個或更多個雙鍵的ω6系列不飽和脂肪酸的實例包括花生四烯酸和雙高-γ-亞麻酸，而具有18個或更多個碳原子和2個或更多個雙鍵的ω9系列多不飽和脂肪酸的實例包括6，9-十八碳二烯酸、8，11-二十碳二烯酸和5，8，11-二十碳三烯酸。
此外，原料油或脂肪中的多不飽和脂肪酸的含量越高，所獲得的含有甘油三酯的油或脂肪中在1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且2位連接有相同多不飽和脂肪酸的甘油三酯的濃度越高。更具體說，可以使用含有15wt％或更多、優選25wt％或更多并且更優選30wt％或更多相同多不飽和脂肪酸的油或脂肪(相對于油或脂肪中脂肪酸的總量而言)。更具體說，可以使用含有25wt％或更多、優選30wt％或更多、更優選40wt％或更多、更優選45wt％或更多并且首選50wt％或更多花生四烯酸的油或脂肪(相對于油或脂肪中脂肪酸的總量而言)。
此外，可以使用通過微生物生產的油用于本發明的原料油或脂肪。優選使用可以生產作為甘油三酯的脂肪酸成分的至少一種選自具有18個或更多個碳原子和3個或更多個雙鍵的ω6系列多不飽和脂肪酸及具有18個或更多個碳原子和2個或更多個雙鍵的ω9系列多不飽和脂肪酸的多不飽和脂肪酸的微生物。
具有生產花生四烯酸能力的微生物的實例包括被孢霉屬(Mortierella)、耳霉屬(Conidiobolus)、腐霉屬(Pythium)、疫霉屬(Phytophthora)、青霉屬(Penicillium)、枝孢屬(Cladosporium)、毛霉屬(Mucor)、鐮孢屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、紅酵母屬(Rhodotorula)、蟲霉屬(Entomophthora)、刺孢囊霉屬(Echinosporangium)和水霉屬(Saprolegnia)。屬于被孢霉屬(Mortierella)被孢霉亞屬(Mortierella)的微生物包括長形被孢霉(Mortierella elongata)、微小被孢霉(Mortierella exiqua)、喜濕被孢霉(Mortierella Hygrophila)和高山被孢霉(Mortierella alpina)。這些菌株的具體實例包括長形被孢霉Mortierella elongataIF08570、微小被孢霉Mortierella exiquaIF08571、喜濕被孢霉Mortierella HygrophilalF05941和高山被孢霉Mortierella alpinaIF08568、ATCC16255、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70和CBS754.68。
所有這些菌株都可以從日本大阪財團法人發酵研究所(IFO)、美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)和真菌菌種保藏中心(Centrralbure voor Schimmelcultrres，CBS)無限制地獲得。除此之外，也可以使用長形被孢霉Mortierella elongata SAM0219菌株(NIBH保藏號FERM P-8703)(NIBH保藏號FERM BP-1239)，該菌株是由本發明的研究人員從土壤中分離出來的。
為培養本發明中所用的微生物菌株，可以將微生物菌株的孢子或菌絲體或者通過預先培養微生物菌株所獲得的預培養物液體接種于液體或固體培養基中。當使用液體培養基時，一般使用葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、甘油、甘露糖醇等作為碳源，但并不只限于這些。可以使用的氮源的實例包括天然氮源，如蛋白胨、酵母提取物、麥胚抽提物、牛肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米淀粉stiplica、大豆蛋白、脫脂大豆和棉籽殘余物以及有機氮源，如尿素，和無機氮源，如硝酸鈉、硝酸銨和硫酸銨。除此之外，必要時可以使用無機鹽，如磷酸鹽、硫酸鎂、硫酸鐵和硫酸銅以及維生素等作為痕量營養源。關于這些培養基成分沒有特別的限制，前提條件是它們的濃度不能損害微生物的生長。就實際而言，氮源的濃度一般來說應當為0.1-40wt％，優選1-25wt％。所添加的氮源的初始量一般是0.1-10wt％，并且優選0.1-6wt％，并且氮源可以在培養的過程中添加。
使用被孢霉屬被孢霉亞屬微生物來工業化生產含有花生四烯酸的油和脂肪的方法是已知的(“通過高山被孢霉Mortierella alpina 1S-4提高花生四烯酸的生產”，J.Am.Oil Chem.Soc.，75，1501-1505頁(1998)，“無機物添加對高山被孢霉Mortierella alpina 1S-4生長形態和花生四烯酸生產的影響”，J.Am.Oil Chem.Soc.，75，1815-1819頁(1998))。然而，由于花生四烯酸相對于脂肪酸總量的比例最大是45wt％，優選原料油和脂肪中存在45wt％或更多的花生四烯酸，以便通過酶法生產本發明的含有25mol％或更多、優選30mol％或更多8A8的油或脂肪(甘油三酯)。增加花生四烯酸比例的一種有效手段是減少培養基中的碳源。當減少培養基中的碳源時，微生物會同化所積累的油和脂肪，并且由于首先同化飽和的脂肪酸，使得甘油三酯中花生四烯酸的比例最終得到增加。盡管這類手段在理論上是可行的，但在現實中，由于甘油三酯的同化，所產生的含有高含量花生四烯酸的油和脂肪(甘油三酯)的量是極少的，使得這種方法作為用于提供反應底物的生產方法是完全不切實際的。因此，本發明的發明人，通過控制培養基中的碳源，成功地工業化生產出了含有45wt％或更多花生四烯酸的油和脂肪(甘油三酯)。培養由生物生長階段及油和脂肪積累階段組成，其中生物生長階段從培養過程的第2-4天開始延續，油和脂肪積累階段從培養過程的第2-4天以后開始延續。碳源的初始濃度應當是1-8wt％并且優選2-4wt％，應當僅僅在生物生長階段及油和脂肪積累階段的早期逐漸增加碳源，并且連續添加的碳源的總量應當是2-20wt％，并且優選5-15wt％。此外，通過根據氮源的初始濃度添加一定量的氮源，使在生物生長階段逐漸添加的碳源的量在培養過程的第7天及之后、優選在培養過程的第6天及之后、并且更優選在培養過程的第4天及之后培養基中的碳源濃度變成0，建立了工業化生產具有45wt％或更多目標花生四烯酸含量的油或脂肪的方法。
雖然產花生四烯酸微生物的培養溫度隨著所用的微生物而不同，但應當是5-40℃并且優選20-30℃，并且在使微生物于20-30℃下生長之后，應當繼續在5-20℃下培養，以便生產不飽和脂肪酸。通過按此方式控制溫度，可以使所形成的脂肪酸中多不飽和脂肪酸的比例增加。培養基的pH是4-10，并且優選是5-9，并且培養通過通氣攪拌培養、搖床培養或靜置培養來進行。培養通常要進行2-30天，優選5-20天并且更優選5-15天。
除控制培養基中碳源的濃度外，作為增加含花生四烯酸的油和脂肪中的花生四烯酸比例的另一種手段，也可以通過將含有花生四烯酸的油和脂肪選擇性水解來獲得具有高含量花生四烯酸的油和脂肪。由于用于此選擇性水解的脂酶不具有針對甘油三酯的位置特異性，并且水解活性的降低與雙鍵的數量成正比，因而被水解的是脂肪酸的酯鍵而不是多不飽和脂肪酸的酯鍵。由于在所得多不飽和脂肪酸偏甘油酯之間出現酯交換反應，因而所得的甘油三酯具有增加含量的多不飽和脂肪酸(“花生四烯酸的強化用假絲酵母屬(Candida)cylindracea脂酶選擇性水解得自被孢霉屬的單細胞油”，J.Am.Oil Chem.Soc.，72，1323-1327頁(1998))。按此方式，可以使用通過對含花生四烯酸的油或脂肪進行選擇性水解而獲得的具有高含量花生四烯酸的油或脂肪作為本發明的原料油或脂肪。可以用作本發明的原料油或脂肪的是那些花生四烯酸含量為25wt％或更多、優選30wt％或更多、更優選40wt％或更多、更優選45wt％或更多并且首選50wt％，或更多的那些，并且不限于通過本說明書所述方法獲得的油或脂肪。
此外，本發明還能夠使用含有雙高-γ-亞麻酸或ω9系列多不飽和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)作為原料油或脂肪。
本發明的發明人早已開發出有效生產含有雙高-γ-亞麻酸的油或脂肪(甘油三酯)的方法(日本未審專利申請5-91887)。此外，就有效生產含有ω9系列多不飽和脂肪酸(例如，6，9-十八碳二烯酸(18∶2 ω9)、8，11-二十碳二烯酸(20∶2 ω9)或5，8，11-二十碳三烯酸(20∶3 ω9))的油或脂肪(甘油三酯)的方法而言，本發明的發明人早已開發出通過使用其中Δ12不飽和酶受到抑制或缺失的突變株來生產含有ω9系列多不飽和脂肪酸的油或脂肪的方法，其中所說的突變株通過對屬于被孢霉屬被孢霉亞屬的微生物進行突變處理而獲得(日本未審專利申請5-91888、日本未審專利申請10-57085和日本未審專利申請5-91886)。然而，關于通過使用含有多不飽和脂肪酸的油或脂肪作為原料油或脂肪來生產其中1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且2位連接有多不飽和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)卻沒有任何描述，本發明是第一次對其進行了生產。此外，還可以使用其中雙高-γ-亞麻酸或ω9系列多不飽和脂肪酸的比例得到增加的油或脂肪作為原料油或脂肪，其中使雙高-γ-亞麻酸或ω9系列多不飽和脂肪酸的比例得到增加是通過使用控制培養基中碳源濃度的方法或者使用通過選擇性水解含花生四烯酸的油或脂肪來獲得具有高含量花生四烯酸的油或脂肪的方法(該方法用于增加含花生四烯酸的油或脂肪中花生四烯酸的比例)實現的。
可以使用選自6-12碳原子的脂肪酸的中鏈脂肪酸作為本發明中所用的中鏈脂肪酸。具有6-12個碳原子的中鏈脂肪酸的實例包括辛酸和癸酸，以及它們的低級醇酯及含有6-12碳原子的脂肪酸作為組成脂肪酸的油和脂肪，并且它們可以呈任何形式。
雖然通過使用具有耐熱性的固定化酶(其中不發生活性的退化)提高反應溫度使本發明的反應產率得到了最大程度的增加，但是通過重復進行前述的酯交換反應，可以進一步增加反應產率。更具體說，在使固定化酶對原料油或脂肪和中鏈脂肪酸的混合物進行作用之后，從反應產物中回收固定化酶(具有耐熱性的脂酶)，隨后通過超精餾或用堿性己烷萃取除去游離的脂肪酸，然后向所得的油或脂肪中添加中鏈脂肪酸，通過讓前面回收的固定化酶對中鏈脂肪酸進行作用獲得反應產物。使用這種方法的結果是反應效率得到增加，并且可以獲得含有80wt％或更多其中中鏈脂肪酸連接在1、3-位甘油三酯的油或脂肪。關于前述步驟的反應次數沒有限制，并且可以進行多次這樣的反應，只要酶沒有喪失活性即可。
本發明的酶反應可以間歇式或連續式進行，前提條件是可以獲得其中在1、3位連接有中鏈脂肪酸并且2位連接有多不飽和脂肪酸的甘油三酯。此外，在間歇式反應的情形中，固定化脂酶可以回收并且重復使用，只要它沒有喪失活性即可。
為獲得含有其中在1、3位連接有中鏈脂肪酸并且2位連接有多不飽和脂肪酸的目標甘油三酯的油(甘油三酯)，首先將固定化酶從反應產物中分離出來，之后將在酯交換過程中斷開的1、3-位所連接的脂肪酸分離出來，然后將過量的反應底物形式的中鏈脂肪酸從反應由或脂肪中分離出來。可以使用的去除所說脂肪酸和中鏈脂肪酸的方法包括堿性脫氧、蒸汽蒸餾、真空超精餾、柱色譜、溶劑萃取或它們的任何組合。此外，在大型工業化規模生產的情形中，從大體積的油和脂肪中去除所說的脂肪酸和中鏈脂肪酸時，優選通過超精餾來除去之。
在按此方式去除游離脂肪酸后，所得油的甘油三酯含量為95wt％或更多，并且甘油三酯的含量可以通過利用超精餾等方法除去油中所存在的百分之幾的甘油二酸酯和甘油單酸酯來得到進一步增加。除此之外，如果必要的話，也可以進行常規的油精制處理，并且其實例包括脫氧、脫膠、脫色和脫臭。
本發明的油和脂肪的實例包括，含有30-90mol％、優選30-80mol％、更優選45-80mol％并且首選60-80mo1％甘油三酯的油和脂肪，其中在甘油三酯的1、3-位連接有中鏈脂肪酸，并且在甘油三酯的2位連接有至少一種選自具有18個或更多個碳原子和3個或更多個雙鍵的ω6系列多不飽和脂肪酸及具有18個或更多個碳原子和2個或更多個雙鍵的ω9系列多不飽和脂肪酸的多不飽和脂肪酸，并且連接至第2位的多不飽和脂肪酸的實例包括花生四烯酸、雙高-γ-亞麻酸、6，9-十八碳二烯酸、8，11-二十碳二烯酸和5，8，11-二十碳三烯酸。油和脂肪的具體實例包括，含有25mol％或更多、優選30mol％或更多并且更優選40mol％或更多在1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且在2位連接有花生四烯酸的甘油三酯的油和脂肪；含有5mol/％或更多、優選10mol％或更多并且更優選20mol％或更多在1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且在2位連接有雙高-γ-亞麻酸的甘油三酯的油和脂肪；及含有5mol％或更多、優選10mol％或更多并且更優選20mol％或更多在1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且在2位連接有5，8，11-二十碳三烯酸的甘油三酯的油和脂肪。
前述的本發明的油和脂肪，例如含有25mol％或更多在1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且在2位連接有花生四烯酸的甘油三酯的油和脂肪；含有在1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且在2位連接有雙高-γ-亞麻酸的甘油三酯的油和脂肪；或者含有在1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且在2位連接有ω9系列多不飽和脂肪酸的甘油三酯的油和脂肪，具有無限可能性的用途，并且可以用作食品、飲料、化妝品和藥物的原料或添加劑。就本發明油和脂肪的用途和用量而言，沒有任何限制。
例如，食品組合物的實例不僅包括普通食品，而且還包括功能型食品、營養補充型食品、新生兒(pronatis)配方食品、嬰兒配方食品、兒童食品、懷孕期間食用的食品和老年人食品。含有油和脂肪的食品的實例包括，本身含有油和脂肪的天然食物，如肉、魚和堅果；制備期間加入油和脂肪的食物，如湯；使用油或脂肪作為加熱介質的食物，如炸面圈；油類食物，如奶油；加熱過程中添加油和脂肪的加工食品，如曲奇餅以及在最終加工過程中噴灑或涂布油和脂肪的食物，如硬質餅干。此外，油和脂肪還可以添加到農用食物制品、發酵食物制品、牲畜食物制品、海產品食物制品或不含油和脂肪的飲料中。此外，還可以是功能型食品和藥物的形式，其實例包括經腸營養素、粉劑、顆粒劑、錠劑、藥劑、混懸劑、乳液、糖漿劑和其它加工形式。
下面將通過實施例對本發明作更詳細的解釋。然而，本發明不限于這些實施例。
實施例1(通過固定化1、3-位特異型脂酶來賦予耐熱性)將100g離子交換樹脂載體(Dowex Marathon WBA，Dow Chemical)懸浮于80ml德列馬根霉(Rhizopus delemar，Talipase Powder，TanabeSeiyaku有限公司)的12.5％水溶液中，接著減壓干燥，獲得固定化脂酶。此外，將25g陶瓷載體形式的不同固定載體(SM-10，NGK)懸浮于100ml德列馬根霉(Rhizopus delemar，Talipase Powder，Tanabe Seiyaku有限公司)的10％水溶液中，接著逐漸添加300ml冷丙酮(-80℃)并同時攪拌，形成沉淀。然后將此沉淀減壓干燥，獲得固定化脂酶。
接下來，讓4g含有40wt％花生四烯酸的微生物油(含有95％甘油三酯，SUNTGA40S，Suntory有限公司)、8g辛酸、600mg前述固定化脂酶和240μl水在30℃下反應48小時并同時攪拌(130rpm)。待反應完成之后，取出反應液體獲得活化的固定化脂酶。
將這種活化的固定化脂酶用于以下實施例2、3、4、5和7中。
實施例2(固定化酶長期反應后的酶穩定性)將0.48g固定化酶(德列馬根霉Rhizopus delemar脂酶，載體DowexMarathon WBA或SM-10)添加到4g含有25wt％花生四烯酸的微生物油(含有95％以上的甘油三酯，SUNTGA40S，Suntory有限公司)和8g辛酸的混合物(底物)中，并且使其在30℃下反應48或72小時并同時攪拌(130rpm)，接著從反應產物中取出反應油或脂肪，添加新的底物并且重復同樣的反應80天。在這種長期反應之后，將與前述相同的底物添加到回收的固定化酶中，并且使其在30℃下反應48小時，隨后在反應完成時用堿性己烷萃取從反應油或脂肪中萃取出甘油三酯。通過GC分析測定甘油三酯中所摻入的辛酸(8∶0)和甘油三酯中所摻入的花生四烯酸，以便測定固定化酶的活性。表1中顯示了GC分析值的辛酸比例(在脂肪酸組成中的比例mol％)作為反應活性(酶活性)，同時表1中還顯示了GC分析值的花生四烯酸的比例(在脂肪酸組成中的比例mol％)作為殘基特異性。由于固定化脂酶將SUNTGA25第1、3-位的脂肪酸酯交換成辛酸，因而將保留在甘油三酯中的花生四烯酸的量認為是連接在甘油三酯2-位上的花生四烯酸的量。
表1
根據這些結果，說明Dowex Marathon WBA是優越的。也就是說，與SM-10相比，即使是在長期反應之后，Dowex Marathon WBA也沒有顯示出反應活性的降低，并且位置特異性與SM-10相當。因此，可以容易地斷定Dowex Marathon WBA在熱穩定性方面是有效的。
實施例3(使用含有25wt％花生四烯酸的微生物油(含有95％以上的甘油三酯，SUNTGA25，Suntory有限公司)和含有40wt％花生四烯酸的微生物油(含有95％以上的甘油三酯，SUNTGA40S，Suntory有限公司)作為原料油生產8A8[酶反應處理重復三次])將28g SUNTGA25和SUNTGA40S、56g辛酸和4.8g固定化酶(德列馬根霉Rhizopus delemar脂酶，載體Dowex Marathon WBA)在30℃下反應48小時并同時攪拌(130rpm)。在去除了固定化脂酶的反應油中，存在有在酯交換過程中斷開的原料油(甘油三酯)1、3-位所連接的脂肪酸及中鏈脂肪酸形式的過量反應底物，通過堿性己烷萃取除去這些脂肪酸，獲得經過一次處理的油。將12g經過一次處理獲得的油、24g辛酸和1.8g固定化酶在30℃下反應48小時并同時攪拌(130rpm)。通過與前述相同的處理除去中鏈脂肪酸等，獲得經過兩次處理的油。然后，將3g經過兩次處理獲得的油、8g辛酸和0.6g固定化酶在30℃下反應48小時并同時攪拌(130rpm)。通過與前述相同的處理除去中鏈脂肪酸等，獲得經過三次處理的油。
使用SUNTGA25或SUNTGA40S作為原料油時的反應液體的脂肪酸組成(mol/％)示于表2和3中。
表2 原料油SUNTGA25
表3 原料油SUNTGA40S
由于連接至甘油三酯中的脂肪酸的組成按mol％表示，因此如果原料油1、3-位的所有脂肪酸均被酯交換成辛酸，則辛酸將是66.6％。因此，重復反應的結果使得辛酸的比例增加至60％。
實施例4(8A8的分析方法)在使用1、3-位特異性脂酶將原料油1、3-位連接的脂肪酸酯交換成中鏈脂肪酸的方法中所報道的反應使用的是魚油或TGA-25(SUNTGA25，Suntory有限公司)作為原料油。然而，在這兩種反應中，評價是根據按照實施例3所示反應所獲得的油(甘油三酯)中的脂肪酸組成(mol％)變化來進行的，并且由于沒有分析其中1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且第2位連接有多不飽和脂肪酸的甘油三酯，因而不可能確定發明是否得到實現。在本實施例中，為使本發明得到清楚闡述，使用8A8作為實例來說明分析方法，其是本發明的目標化合物之一。
通過將高效液相色譜(HPLC)和氣相色譜(GC)聯合進行定量測定，來測定8A8。
柱反相柱(Cosmosil 4.6×250mm 5C18-MS)溶劑丙酮/乙腈(1∶1)，1ml/分鐘分析時間55分鐘柱加熱爐溫度40℃檢測器差示折光檢測器(比色皿溫度40℃)樣品注射5μl溶解于氯仿中的油(甘油三酯)的10％溶液[GC分析方法]柱Frontier Ultra ALLOY UA-17-15M-0.1F(15m×0.25mm×0.1μm)柱溫260℃-(1℃/分鐘)-290℃-(10℃/分鐘)-390℃(5分鐘)分析時間45分鐘注射口溫度溫度310℃
檢測器溫度370℃(氫電離檢測器)載氣氦線速度40cm/分鐘樣品注射1μl溶解于己烷中的油(甘油三酯)的1％溶液當將其中1、2、3-位連接有任意脂肪酸的原料油的甘油三酯表示為XXX(X＝任意脂肪酸)時，酯交換有一個辛酸的甘油三酯變成XX8并且酯交換有兩個辛酸的甘油三酯變成8X8。還可以是其中8X8中第2-位的脂肪酸經過分子內位移而形成88X的甘油三酯，并且在此情形中，酯交換進一步導致形成888。
在HPLC分析中，甘油三酯可以在分子種類的水平上進行分離(然而，AAP(其中1、2-位連接有花生四烯酸并且第3-位連接有棕櫚酸的甘油三酯)和APA(其中1、3-位連接有花生四烯酸并且第2-位連接有棕櫚酸的甘油三酯)無法區分并且顯示相同的保留時間)。這種HPLC分析可以計算888、8X8、XX8和XXX的比例。然而，盡管8X8分子種類組中存在有目標8A8，但是遺憾的是由于8A8、8D8和8G8都顯示相同的保留時間，因而無法區分它們。
在GC分析中，可以區分用HPLC無法區分的8A8、8D8和8G8(此外，還可以區分8A8和88A)。然而，盡管可以檢測888、8X8和XX8，但由于發生了分解，因而無法檢測XXX。
因此，通過將HPLC分析和GC分析聯合，便可以計算出甘油三酯中8A8的比例。
當對實施例3的經過三次處理的油進行分析時，獲得下面的結果。
按此方式，通過8A8的分析首次發現了本發明的顯著效果。
實施例5(使用SUNTGA40S作為原料油來生產8A8，酶反應溫度40℃)將1g SUNTGA40S、2g辛酸和0.2g固定化酶(德列馬根霉Rhizopusdelemar脂酶，載體Dowex Marathon WBA)在40℃下反應48小時并同時攪拌(130rpm)。在去除固定化脂酶之后，反應油中存在有在酯交換過程中斷開的原料油(甘油三酯)1、3-位所連接的脂肪酸及過量反應底物形式的中鏈脂肪酸，并且使用與實施例3相同的方法將這些脂肪酸除去，獲得經處理的油。所得經處理的油的脂肪酸組成(mol％)示于表4中。此外，還顯示了使用實施例3的SUNTGA40S作為原料油的經過一次處理的油作為30℃反應溫度的對照。
表4
將反應溫度從30℃提升至40℃的結果，辛酸的取代率從45.46％增加至51.77％并且反應活性得到增強。
實施例6(生產含有45wt％或更多花生四烯酸的油或脂肪(甘油三酯))使用高山被孢霉Mortierella alpina CBS754.68作為產花生四烯酸的微生物，將1000L含有2％葡萄糖、6％食用大豆蛋白、0.3％KH2PO4、0.05％MgCl2·6H2O、0.05％CaCl2·2H2O和0.1％大豆油的培養基(pH6.0)放入2000L通氣攪拌培養罐中，并且在溫度26℃、空氣流速1.0vvm、攪拌速率80rpm且罐內壓1.0kg/cm2G的條件下開始通氣攪拌培養。依次在培養的第1和2天添加5％葡萄糖，第3天添加4.5％葡萄糖并且第4天添加1.5％葡萄糖。此外，第3天將溫度降至21℃并且在此溫度下繼續培養。第7天葡萄糖耗盡，并且繼續培養直至第16天。培養16天期間花生四烯酸的比例達到61wt％，并且所產生的量(以花生四烯酸計)保持在12g/L。此外，由于在培養的第13天，花生四烯酸的比例已達到60wt％，因而足以縮短培養的期限。過濾回收所得的微生物并且萃取出油或脂肪，得到含有55wt％或更多花生四烯酸的油或脂肪(甘油三酯)(可稱作SUNTGA55)。
實施例7(使用SUNTGA55作為原料油來生產8A8，酶反應溫度40-41℃[連續式反應])將10g固定化酶(德列馬根霉Rhizopus delemar脂酶，載體DowexMarathon WBA)填充至夾套式玻璃柱(1.8×12.5cm，體積31.8ml)，并且通過讓由SUNTGA55和辛酸以1∶2比例組成的混合油以恒定流速流經柱子來進行連續式反應。此外，將柱溫設定至40-41℃。前述連續式反應的流速和反應效率以所得油中存在的辛酸和花生四烯酸的mol％來顯示(表5)表5
根據表5中所示的結果，使用3.5-5.5ml/h的流速連續92天進行反應。結果示于表6。
表6
即使在40-41℃的條件下，酶活性也沒有突然降低并且連續生產進行了92天。
收集這種連續式反應所獲得的油，并且在第92天時，通過分子超精餾去除被反應所斷開的脂肪酸和反應底物形式的中鏈脂肪酸，并且按照實施例4的方法測定油中的8A8和888的比例，發現它們分別達到了40.1mol％和7.31mol％。
使用與實施例1不同的固定載體制備的固定化酶(德列馬根霉Rhizopus delemar脂酶，載體陶瓷載體(SM-10))進行類似的連續式反應，但是由于這種固定化酶的耐熱性程度低，因而在反應開始后第30天獲得的油中，辛酸的mol％為32.4％。此外，當按照實施例4的方法測定油中的888的比例時，發現它達到11.6mol％。
由此可見，即使使用具有高比例多不飽和脂肪酸的油作為反應原料，只要使用本發明的具有耐熱性的固定化酶，就可以實現實際水平的生產，同時不會出現反應效率降低。此外，由于888的比例明顯很低，因而還清楚地說明了酶的位置特異性得到了充分的保持，即使是在提高了反應溫度的情況下。
實施例8(使用含雙高-γ-亞麻或ω9系列多不飽和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)作為原料油或脂肪酸，在40-41℃酶反應溫度下生產在1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且在2-位連接有雙高-γ-亞麻酸或ω9系列不飽和脂肪酸的甘油三酯[間歇式反應])本發明的發明人開發了含有雙高-γ-亞麻酸或ω9系列多不飽和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)的生產方法。含雙高-γ-亞麻酸的油或脂肪(甘油三酯)通過使用具有產花生四烯酸能力并且具有低Δ5不飽和活性的微生物(例如，高山被孢霉Mortierella alpina SAM1860突變株(NIBH保藏號FERMP-3589))，按照日本未審專利申請5-91887中所述的方法來獲得；含ω9系列多不飽和脂肪酸的油或脂肪(甘油三酯)通過培養具有產ω9系列多不飽和作脂肪酸能力的微生物(例如，高山被孢霉Mortierella alpina SAM1861突變株(NIBH保藏號FERM P-3590))，按照日本未審專利申請5-91888中所述方法來獲得；含有Mead酸的油或脂肪(甘油三酯)通過按照日本未審專利申請10-57085所述的方法對具有產花生四烯酸能力的微生物進行突變處理來獲得。通過培養其中Δ12不飽和活性被降低或缺失并且至少Δ6不飽和活性和/或增鏈活性得到增強的突變株[例如，高山被孢霉Mortierella alpinaSAM2086(NIBH保藏號FERM P-15766)]，通過培養能夠在添加Δ5不飽和酶抑制劑的培養基中生產ω9系列多不飽和脂肪酸的微生物，或者在向培養過所說微生物的培養物液體中添加Δ5不飽和酶抑制劑之后進行附加培養，按照日本未審專利申請5-91886中所述的方法，可以獲得含有8，11-二十碳二烯酸的油或脂肪(甘油三酯)。
將1g含有44wt％雙高-γ-亞麻酸的油或脂肪(可稱作“SUNTGD”)、1g含有16wt％8，11-二十碳二烯酸的油或脂肪(可稱作“SUNTG20∶2”)或1g含有24wt％5，8，11-二十碳三烯酸的油或脂肪(可稱作“SUNTGM”)、2g辛酸和0.2g固定化酶(德列馬根霉Rhizopus delemar脂酶，載體DowexMarathon WBA)混合，并且在40℃下反應48小時并同時攪拌(130rpm)。在去除固定化脂酶的反應油中，存在有在酯交換過程中斷開的原料油或脂肪(甘油三酯)1、3-位所連接的脂肪酸及過量反應底物形式的中鏈脂肪酸，然后使用與實施例3相同的方法將這些脂肪酸除去，獲得經處理油或脂肪。在所得的油或脂肪中，1，3-辛酰-2-雙高-γ-亞麻酰-甘油、1，3-辛酰-2-8，11-二十碳二烯酰-甘油或1，3-辛酰-2-5，8，11-二十碳三烯酰-甘油的比例分別為34％、14％或26％。
此外，在本實施例中，將固定化酶按照與實施例1相同的方法，使用4g原料油或脂肪、8g辛酸、600mg前述固定化脂酶和240μl水來活化。
實施例9(應用于奶粉)通過將0.3g實施例7獲得的含有40.1wt％8A8的甘油三酯混入奶粉中，制備具有增強的花生四烯酸吸收性的奶粉。
實施例10(應用于脂肪輸注劑)在添加了400g實施例7獲得的含有40.1wt％8A8的甘油三酯、48g純化蛋黃卵磷脂、20g油酸、100g甘油和40ml 0.1N氫氧化鈉并且用勻化器分散之后，加入注射用蒸餾水使體積達到4升。然后用高壓噴霧乳化器進行乳化，制成脂質乳液。將200ml這種脂質乳液的等分試樣添加至塑料袋中，然后將塑料袋通過高壓蒸汽在121℃下滅菌20分鐘，得到脂肪輸注劑。
實施例11(京尼平交聯劑在固定化1、3-位特異型脂酶中的應用)將100g離子交換樹脂載體(Dowex Marathon WBADow Chemical)懸浮于80ml德列馬根霉(Rhizopus delemar，Talipase Powder，TanabeSeiyaku有限公司)的12.5％水溶液中并且輕微攪拌2小時，然后加入8ml京尼平的5％水溶液，之后在室溫下連續輕微攪拌6小時。隨后，逐漸添加240ml冷丙酮(-80℃)并同時攪拌，形成沉淀。然后將該沉淀減壓干燥，獲得固定化酶。
將4g SUNTGA40S、8g辛酸、600mg前述固定化脂酶和240μl水的混合物在30℃下反應48小時并同時攪拌(130rpm)。在反應完成之后，取出反應液體，獲得活化的固定化酶。
實施例12(通過在1、3-位特異型脂酶的活化中使用京尼平交聯劑來增強耐熱性)將4.8g實施例1和11中所獲得的固定化酶(德列馬根霉Rhizopusdelemar脂酶，載體Dowex Marathon WBA)、28g SUNTGA40S和56g辛酸在30℃下反應48小時并同時攪拌(130rpm)。從反應產物中取出反應油或脂肪，接著添加新的底物并且在30℃、40℃、50℃和60℃下反應480小時并同時攪拌(130rpm)。
隨后，從反應產物中取出反應油或脂肪，并且按與前述相同的方式添加新的底物，接著在30℃下反應48小時并同時攪拌(130rpm)。
表7將實施例1獲得的固定化德列馬根霉Rhizopus delemar酶在各溫度下保持480小時后8∶0(辛酸)的轉化率
表8將實施例11獲得的固定化德列馬根霉Rhizopus delemar酶在各溫度下保持480小時后8∶0(辛酸)的轉化率
結果，用京尼平處理過的固定化酶在60℃下保持480小時之后，仍意想不到地保留了其初始活性的88％。
實施例13以表4的分析結果為基礎，在使用含有25％花生四烯酸的SUNTGA25(Suntory有限公司)作為原料的情形中，酶反應之后的油中8A8的比例為18.9％。此外，當使用高含量花生四烯酸的SUNTGA40S(含有40％花生四烯酸的甘油三酯，Suntory有限公司)作為原料時，獲得27.5％8A8的油。
對酶的固定化進行研究以增加酶反應后油中8A8的比例。固定化用的載體是離子交換樹脂的多孔樹脂(Dowex Marathon WBA)，酶固定化過程中的載荷量可以在一定范圍內改變。因此，按照實施例1，在酶的固定化過程中，固定化與實施例1相同量、兩倍量和一半量的酶，來制備固定化酶。分別使用這些固定化酶，按與實施例2相同的方式，將0.48g各固定化酶添加至作為原料的SUNTGA40S和8g辛酸的混合油中，并且在30℃下攪拌(130rpm)反應72小時。
表9顯示了固定化酶中所含的脂酶的量與反應完成之后油中8A8的比例之間的關系。即使用SUNTGA40S(與實施例4所用的相同的原料)重復了三次酶反應，油中的8A8的比例僅為27.5％。相反，在表9所示固定化酶(使用實施例1的兩倍量)的情形中，油或脂肪中的8A8的比例能夠增加至38.9％，盡管只進行了一次反應。
表9
*酶含量是以每100g實施例1的固定化酶中10g Talipase粉末為基礎，并且按這個量的倍數來表示。
權利要求
1.一種含有甘油三酯的油或脂肪的生產方法，其中所說的甘油三酯的第1和第3位連接有中鏈脂肪酸并且第2位連接有多不飽和脂肪酸，該方法包括讓可特異性作用于甘油三酯1、3-位酯鍵的脂酶對中鏈脂肪酸和原料油或脂肪的混合物進行作用，其中所說的原料油或脂肪含有選自具有18個或更多個碳原子和3個或更多個雙鍵的ω6系列多不飽和脂肪酸及具有18個或更多個碳原子和2個或更多個雙鍵的ω9系列多不飽和脂肪酸中的至少一種多不飽和脂肪酸，但不含ω3系列多不飽和脂肪酸；其中，使用固定在離子交換樹脂載體上的脂酶，所說的離子交換樹脂載體是多孔性的并且孔徑為約100埃或更大。
2.權利要求1的生產方法，其中重復進行如下步驟來獲得反應產物讓固定化脂酶對原料油或脂肪和中鏈脂肪酸的混合物進行作用，從反應產物中回收固定化酶，除去游離的脂肪酸獲得反應油或脂肪，向所說的油或脂肪中添加中鏈脂肪酸并且讓前面回收的固定化脂酶對其進行作用以便獲得反應產物。
3.權利要求1或2的生產方法，其中讓固定化脂酶在40℃或更高的反應溫度下進行作用。
4.權利要求1-3任一項的生產方法，其中原料油或脂肪中存在的選自具有18個或更多個碳原子和3個或更多個雙鍵的ω6系列多不飽和脂肪酸及具有18個或更多個碳原子和2個或更多個雙鍵的ω9系列多不飽和脂肪酸中的至少一種多不飽和脂肪酸的總量相對于所說油或脂肪中脂肪酸的總量為30wt％或更高。
5.權利要求1-4任一項的生產方法，其中具有18個或更多個碳原子和3個或更多個雙鍵的ω6系列多不飽和脂肪酸是花生四烯酸或雙高-γ-亞麻酸，并且具有18個或更多個碳原子和2個或更多個雙鍵的ω9系列多不飽和脂肪酸是6，9-十八碳二烯酸、8，11-二十碳二烯酸或5，8，11-二十碳三烯酸。
6.權利要求1-5任一項的生產方法，其中中鏈脂肪酸是游離中鏈脂肪酸、中鏈脂肪酸的低級醇酯或含有中鏈脂肪酸作為組成脂肪酸的油或脂肪的形式。
7.權利要求1-6任一項的生產方法，其中中鏈脂肪酸是具有6-12個碳原子的脂肪酸。
8.權利要求7的生產方法，其中具有6-12個碳原子的中鏈脂肪酸是辛酸和/或癸酸。
9.權利要求1-8任一項的生產方法，其中原料油或脂肪是含有15wt％或更多相同多不飽和脂肪酸的油或脂肪，以所說油或脂肪中脂肪酸的總量計。
10.權利要求1-8任一項的生產方法，其中原料油或脂肪是含有25wt％或更多花生四烯酸的油或脂肪，以所說油或脂肪中脂肪酸的總量計。
11.權利要求1-10任一項的生產方法，其中原料油或脂肪是通過微生物生產的。
12.權利要求1-10任一項的生產方法，其中原料油或脂肪是從屬于被孢霉屬的微生物中提取的。
13.權利要求12的生產方法，其中屬于被孢霉屬的微生物是屬于被孢霉亞屬的微生物。
14.一種油或脂肪或甘油三酯，其中含有30-90mol％在甘油三酯的第1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且第2位連接有選自具有18個或更多個碳原子和3個或更多個雙鍵的ω6系列多不飽和脂肪酸及具有18個或更多個碳原子和2個或更多個雙鍵的ω9系列多不飽和脂肪酸中的至少一種的多不飽和脂肪酸的甘油三酯。
15.權利要求14的油或脂肪或甘油三酯，其中與第2位連接的多不飽和脂肪酸是選自6，9-十八碳二烯酸、8，11-二十碳二烯酸和5，8，11-二十碳三烯酸中的至少一種多不飽和脂肪酸。
16.一種含有25mol％或更多甘油三酯的油或脂肪或甘油三酯，其中所說甘油三酯的第1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且第2位連接有花生四烯酸。
17.一種含有5mol％或更多甘油三酯的油或脂肪或甘油三酯，其中所說甘油三酯的第1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且第2位連接有雙高-γ-亞麻酸。
18.一種含有5mol％或更多甘油三酯的油或脂肪或甘油三酯，其中所說甘油三酯的第1、3-位連接有中鏈脂肪酸并且第2位連接有5，8，11-二十碳三烯酸。
19.一種食品組合物，含有按照特定營養要求共混的權利要求14-18任一項的油或脂肪或甘油三酯。
20.權利要求19的食品組合物，其中所說的食品組合物是功能型食品、營養補充型食品、新生兒配方食品、嬰兒配方食品、兒童食品、懷孕期間食用的食品或老年人食品。
21.一種動物飼料，含有共混的權利要求14-18任一項的油或脂肪或甘油三酯。
22.一種治療性營養食品，含有權利要求14-18任一項的油或脂肪或甘油三酯，并且根據情況，與適宜于口服、腸道或非腸道施用的中性載體共混。
23.一種藥物組合物，含有至少一種權利要求14-18任一項的油或脂肪或甘油三酯。
全文摘要
本發明涉及一種含有甘油三酯的油或脂肪的生產方法，其中所說的甘油三酯的第1和第3位連接有中鏈脂肪酸并且第2位連接有多不飽和脂肪酸，該方法包括讓可特異性作用于甘油三酯1和3－位酯鍵的脂酶對中鏈脂肪酸和原料油或脂肪的混合物進行作用，其中所說的脂酶固定在孔徑為約100埃或更大的離子交換樹脂載體上，所說的原料油或脂肪含有選自具有18個或更多個碳原子和3個或更多個雙鍵的ω6系列多不飽和脂肪酸及具有18個或更多個碳原子和2個或更多個雙鍵的ω9系列多不飽和脂肪酸中的至少一種多不飽和脂肪酸，但不含ω3系列多不飽和脂肪酸；本發明還涉及通過該方法獲得的油或脂肪或甘油三酯以及這種油或脂肪或甘油三酯在食品、飼料和藥物組合物中的用途。
文檔編號A23C11/04GK1522301SQ0281343
公開日2004年8月18日 申請日期2002年7月2日 優先權日2001年7月2日
發明者秋元健吾, 角田元男, 東山堅一, 藤川茂昭, 一, 昭, 男 申請人:三得利株式會社