透明質素合成酶基因及其表達的制作方法

專利名稱：透明質素合成酶基因及其表達的制作方法
對相關申請的交叉引用本發明是美國專利申請No.09/469,200(于1999年12月21日提交，題目為“透明質酸合成酶基因及其用途”)的美國部分繼續申請，后者是美國專利申請No.09/178,851(于1998年10月26日提交，題目為“透明質酸合成酶基因及其用途”)的美國繼續申請，美國專利申請No.09/178,851根據35 U.S.C.§119(e)要求美國專利申請No.60/064,435(于1997年10月31日提交，題目為“C組透明質素合成酶基因及其用途”)的利益。本發明根據35 U.S.C.§119(e)要求以下申請的公約優先權以及利益(1)美國專利申請No.60/297,788(于2001年6月13日提交，題目為“透明質素合成酶基因及其在枯草芽孢桿菌(BACILLUS SUBTILIS)中表達的方法”)；和(2)美國專利申請No.60/297,744(于2001年6月13日提交，題目為“透明質素合成酶基因及其表達方法”)。美國專利申請Nos.09/469,200、09/178,851、60/064,435、60/297,788和60/297,744的內容在此處清楚引入作為參考。
關于聯邦贊助的研究或開發的聲明美國政府依照來自美國國家健康研究所(National Institute ofHealth)的資助號碼GM35978而在本發明中擁有某些權利。
背景技術：
1.發明領域本發明涉及具有編碼酶活性透明質酸合成酶(HAS)的編碼區的核酸區段，并涉及該核酸區段在制備重組細胞中的應用，該重組細胞生產透明質酸合成酶及其透明質酸產物。透明質酸(hyalutonate)也已知為透明質酸(hyaluronic acid)或透明質素。
2.相關技術簡述鏈球菌感染的發生是全球主要的健康和經濟問題，特別是在發展中國家。原因之一是由于鏈球菌(Streptococcal)細菌具有不被身體的吞噬細胞即巨噬細胞和多形核細胞(PMNs)探測而生長的能力。這些細胞負責識別及吞入外源微生物。細菌逃避監視的一個有效途徑是通過將自身用多糖被膜進行包被，如透明質酸(HA)被膜。HA的結構在原核生物和真核生物中是相同的。由于HA通常是非免疫原性的，所以被囊化的細菌不引起免疫反應，因此不被破壞。此外，該被膜在體外具有抗PMNs吞噬的作用，且防止鏈球菌屬與巨噬細胞的附著。正由于此，在A組和C組鏈球菌屬中，HA被膜在天然和實驗室感染中是主要的病毒因子。A組鏈球菌屬負責多種人類疾病，包括咽炎、膿皰病、組織深部感染、風濕熱和中毒性休克樣綜合癥。C組類馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)負責骨髓炎、咽炎、腦膿腫和肺炎。就結構而言，HA是高分子量的重復二糖單元的線性多糖，該二糖單元由N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)。HA分子重復二糖的數目可超過30,000，Mr＞107。HA是唯一由哺乳動物和細菌細胞兩者都能合成的糖胺聚糖，該細菌細胞特別為A和C組鏈球菌和A型多殺巴斯德氏桿菌(Pasteurella multocida)。這些菌株生產分泌到培養基中的HA以及HA被膜。這些細菌合成HA的機制具有廣泛的醫學重要性，這是因為HA被膜的生產是鏈球菌用于逃避免疫系統監視的非常有效和聰明的途徑。此外，用HA包被的有機或無機分子具有使得其能夠逃脫宿主免疫系統探測和破壞的性質。HA是由哺乳動物和細菌細胞用透明質酸合成酶進行合成的，該酶定位于質膜上。人們相信HA在這些生物中的合成是多步驟的過程。起始步驟包括起始前體(UDP-GlcNAc或UDP-GlcUA)的結合。隨后進行延伸，包括向生長的寡糖鏈交替添加兩種糖。生長的多聚體從細胞的質膜區域伸出并伸到細胞外空間。盡管HA生物合成系統是最初研究的膜雜多糖合成途徑之一，但HA合成的機制仍然沒有充分理解。這可能是因為至今發展的體外系統是不足夠的，因為在該系統中未實現HA的從頭生物合成。HA多聚體生長的方向在那些本領域中的技術人員中仍然是有分歧的問題。單糖的添加可在生長的HA鏈的還原或非還原末端。此外，仍存在關于下面部分的問題，即(i)新生的鏈是否共價連接到蛋白質、UDP或脂質中間物上，(ii)鏈是否是用引物起始的，和(iii)成熟的多聚體從鏈球菌的質膜伸出的機制。理解HA生物合成的機制可使得能夠開發通過干擾該過程而控制鏈球菌和巴斯德氏菌屬(Pasteurella)感染的可選擇的策略。HA事實上已在脊椎動物中的每一種組織中得到了鑒定，且已在多種臨床應用中獲得了廣泛的應用，最引人注目的和適當的是作為關節內基質補加物和在眼外科中。科學文獻也顯示從最初認為HA主要是少數結締組織的基質和某些細菌菌株的被膜中的被動結構成分的理解轉變為對于該遍在大分子動態地參與許多生物學過程的認識例如在胚胎發生過程中調節細胞遷移和分化、細胞外基質組織和代謝的調節、在轉移、傷口愈合和炎癥的復雜過程中的重要作用等。進一步地，漸漸清楚的是HA是高度代謝活性的，且細胞非常關注其合成和分解代謝的過程。例如，組織中HA的半衰期在軟骨中為1～3周，在表皮中為＜1天。HA也用于許多技術應用(如潤滑化合物)、化妝品和神經藥物(neutraceutical)中。現在明白單獨一個蛋白質利用兩種糖底物合成HA，即HA合成酶是具有雙重催化性質的單一的酶。HA合成酶的縮寫HAS已得到廣泛支持以指代該類酶。Markovitz等人成功地表征了來自釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的HAS活性，并發現了酶的膜定位及其對糖核苷酸前體和Mg2+的需要。Prehm發現由B6細胞制備的延伸的HA被添加到培養基中的透明質酸酶消化，并提出HAS存在于質膜上。Philipson和Schwartz也顯示小鼠少突膠質細胞瘤細胞中HAS活性與質膜標記共分餾(cofractionated)。在糖胺聚糖合成進行時，HAS裝配了高Mr的HA，該HA同時從膜伸出到細胞外空間(或者在細菌的情況下，制備細胞被膜)。該生物合成模式在大分子中是獨特的，因為核酸、蛋白質和脂質是在細胞核、內質網/高爾基體、胞質或線粒體中合成的。生長的鏈向細胞外空間的伸出也使得能夠進行不受拘束的多聚體的生長，因此得到了異常大的HA，而合成局限于高爾基體或高爾基體后區室(post-GolgiCompartment)中限制了形成的多聚體的總量或長度。被限制的腔中高濃度的HA也可形成高粘度的環境，該環境對于其他細胞器的功能可為有害的。已有幾個研究試圖從形成被膜覆蓋物的鏈球菌菌株以及從真核細胞中溶解、鑒定及純化HAS。盡管對鏈球菌和鼠少突膠質細胞瘤的酶成功地用去污劑進行了溶解并進行了研究，但純化活性HAS以進一步研究或進行分子克隆的努力在數十年中仍然是不成功的。Prehm和Mausolf用高碘酸鹽氧化的UDP-GlcUA或UDP-GlcNAc以對鏈球菌膜中與HAS共純化的～52kDa的蛋白質進行親和標記。這導致了一個報道宣稱已克隆了C組鏈球菌HAS，不幸的是該報道是錯誤的。該研究未能證明活性合成酶的表達，且可能事實上克隆了一個肽轉運蛋白。Triscott和van de Rijn用毛地黃皂苷使來自鏈球菌膜的HAS以活性形式溶解。Van de Rijn和Drake用5-疊氮-UDP-GlcUA對42、33和27kDa的3種鏈球菌膜蛋白質進行了放射性標記，并認為33-kDa的蛋白質是HAS。然而如在后文所示的，HAS事實上為42-kDa的蛋白質。盡管有這些努力，但在理解HA合成的調節和機制中的進展基本上是停滯的，這是因為沒有HAS mRNA或HAS蛋白質的分子探針。1993年當DeAngelis等人報道編碼蛋白質HasA的A組鏈球菌基因的分子克隆或特征時，這種情況發生了重大的突破。該基因已知為細菌HA合成所需的操縱子的一部分，盡管現在稱為spHAS(釀膿鏈球菌的HAS)的該蛋白質的功能是未知的。隨后證明spHAS負責HA的延伸且是第一個鑒定、克隆及成功表達的糖胺聚糖合成酶。釀膿鏈球菌的HA合成操縱子編碼2個其他的蛋白質。HasB是UDP-葡萄糖脫氫酶，該酶是UDP-葡萄糖轉變為HA合成的底物之一UDP-GlcUA所必需的。HasC是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，該酶是葡萄糖1-磷酸與UTP轉變為UDP-葡萄糖所必需的。hasA和hasB基因向無被膜的鏈球菌菌株或糞腸球菌(Enteroccus faecalis)中的共轉染授予它們合成HA和形成被膜的能力。這提供了關于spHAS(hasA)是HA合成酶的第一個有力的證據。難捉摸的HA合成酶基因最終通過轉座子誘變方法進行了克隆，其中形成了無被膜的突變型A組菌株，該菌株含有HA合成操縱子的轉座子中斷。轉座子的已知序列使得能夠鑒定與鏈球菌DNA連接的區域，然后從野生型細胞中克隆。編碼的spHAS與酵母幾丁質合成酶家族具有5-10％的一致性，與非洲爪蟾(Xenopus laevis)蛋白質DG42(在原腸胚形成過程中發育性表達的)具有30％的一致性，DG42的功能當時是未知的。DeAngelis和Weigel在大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達了活性的重組spHAS，并顯示該單一的純化基因產物當在體外與UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc進行溫育時合成高Mr的HA，從而顯示HA合成所必需的兩種糖基轉移酶活性是由相同的蛋白質催化的，如首先于1959年提出的。利用下面的知識(i)spHAS是雙重作用的單一酶和(ii)spHAS、幾丁質合成酶和DG42之間的序列同源區，1996年4個實驗室同時對真核HAS cDNA的鑒定進一步鞏固了發明者的蛋白質假說，即HAS是編碼不同同工酶的多基因家族。在哺乳動物中很快發現了2個基因(HAS1和HAS2)，后來發現了第3個基因HAS3。在1999年12月21日提交的美國Serial No.09/469,200中對第2個鏈球菌seHAS或類馬鏈球菌透明質酸合成酶進行了鑒定和詳細的公開，其內容在此處特別地整體引入作為參考。seHAS蛋白質與spHAS酶具有高水平的一致性(約70％)。然而，該一致性是令人感興趣的，這是因為seHAS基因與spHAS基因不相互雜交。當提供兩種底物時，從表達重組seHAS的大腸桿菌中制備的膜合成HA。該結果證實Lansing等人聲稱已克隆了C組HAS的較早的報道是錯誤的。不幸的是，幾個研究已應用對該未進行表征的52-kDa鏈球菌蛋白質的抗體以研究什么是真核HAS。Itano和Kimata用不能合成HA的突變小鼠乳腺癌細胞系中的表達克隆來克隆第一個推定的哺乳動物HAS cDNA(mmHAS1)。HA合成有缺陷的亞克隆分成3個單獨的類別，這些類別在體細胞融合實驗中對于HA合成是互補的，這提示至少3個蛋白質是必需的。這些類別的2個維持了一些HA合成活性，而1個不顯示活性。將后一個細胞系用從親代細胞中制備的cDNA來進行瞬時轉染實驗以鑒定恢復HA合成活性的單一蛋白質。序列分析揭示～65kDa蛋白質的推定的一級結構，該蛋白質具有與spHAS相似的膜拓撲學。mmHAS1與spHAS具有30％的一致性，與DG42具有55％的一致性。在該報道出現的同月，3個其他的研究組提交了論文，該論文描述編碼最初認為是相同的小鼠和人的酶的cDNA。然而，通過特別的環境，4個實驗室的每一個在兩個物種中都發現了單獨的HAS同工酶。利用與Itano和Kimata的相似的功能克隆方法，Shyjan等人鑒定了HAS 1的人同系物。將腸系膜淋巴結cDNA文庫用于轉染鼠粘膜T淋巴細胞，然后篩選其在花結測定中粘著的能力。一個轉染子的粘著被公知的細胞表面HA-結合蛋白質即CD44的抗血清抑制，并被用透明質酸酶的預處理直接取消。因而，由該轉染子的花結(rosetting)需要HA的合成。對負責的cDNA的克隆和測序鑒定了hsHAS1。Itano和Kimata也報道從胎兒腦文庫中分離的人HAS1 cDNA。然而，由2個組報道的hsHAS1 cDNA在長度上有差異；它們編碼578或543個氨基酸的蛋白質。僅在較長的形式中證明了HAS活性。基于spHAS作為可信的HA合成酶和DG42、spHAS和NodC(根瘤菌屬(Rhizobium)中的β-GlcNAc轉移酶結瘤因子)中幾乎一致的區域的分子鑒定，Spicer等人用兼并RT-PCR方法克隆編碼稱為mmHAS2的第二個不同的酶的小鼠胚胎cDNA。顆粒排除測定探測到mmHAS2 cDNA向COS細胞中的轉染指導HA細胞被膜的從頭生產，因而提供了HAS2蛋白質可合成HA的有力證據。利用相似的方法，Watanabe和Yamaguchi篩選了人胎兒腦cDNA文庫以鑒定hsHAS2。Fulop等人獨立地用相似的策略鑒定RNA中的mmHAS2，該RNA從活躍地合成HA的卵丘細胞分離，其中HA合成是排卵前濾泡中正常卵丘延伸的關鍵過程。緊接在起始排卵周期之后、在HA合成開始之前和在當HA合成剛剛開始(3h)或已經明顯(4h)時的較晚時間從小鼠中分離了卵丘細胞-卵母細胞復合物。RT-PCR顯示HAS2 mRNA最初不存在，但3-4h之后高水平的表達，提示HAS2的轉錄調節該過程中的HA合成。兩種hsHAS2長度均為552個氨基酸，并為98％一致的。mmHAS1是583個氨基酸長的，且與578個氨基酸長的hsHAS1具有95％的一致性。最近Spicer等人用PCR方法在哺乳動物中鑒定了第三個HAS基因。mmHAS3是554個氨基酸長的，且分別與mmHAS1、mmHAS2、DG42和spHAS具有71、56和28％的一致性。Spicer等人也將3個人和小鼠基因定位于3個不同的染色體上(HAS1定位于hsChr 19/mmChr17；HAS2定位于hsChr 8/mmChr 15；HAS3定位于hsChr 16/mmChr 8)。3個HAS基因在不同染色體上的定位和遍及脊椎動物種類中的HA的出現提示該基因家族是古老的，且同工酶是在脊椎動物進化早期通過復制而出現的。細菌和真核HAS之間的高一致性(～30％)也提示它們兩者之間具有共同的祖先基因。可能在真核基因變得更大更復雜之前，原始的細菌從早期脊椎動物祖先中奪取HAS基因。可選擇地，細菌可能獲得較大的脊椎動物HAS基因并刪除了對于酶活性非關鍵的調節序列。Dawid及其同事對非洲爪蟾DG42的發現在這些最近的發展中起重要的作用，即使不知道該蛋白質是HA合成酶。但是DG42和spHAS有30％的一致性對于設計寡核苷酸是關鍵的，該寡核苷酸使得能夠鑒定哺乳動物HAS2。諷刺地是，DG2是真正的HA合成酶的確定證據僅在發現哺乳動物同工酶之后才報道，其時DeAngelis和Achyuthan在酵母(不能合成HA的生物)中表達了該重組蛋白質，并顯示當給分離的膜提供兩種底物時它們可合成HA。Meyer和Kreil也顯示來自用DG42的cDNA轉染的細胞的裂解產物合成增高水平的HA。既然其功能已知了，因此DG42可命名為XIHAS。所有HAS蛋白質共享共同的預測的結構特征，該特征包括大的中央結構域和蛋白質氨基和羧基末端的2-3個跨膜或膜相關結構域的族。包含高達～88％的預測的細胞內HAS蛋白質序列的中央結構域可能含有酶的催化區。該預測的中央結構域在spHAS中為264個氨基酸長(總蛋白質的63％)，在真核HAS成員中為307-328個氨基酸長(總蛋白質的54-56％)。膜結構域的準確的數目和方向和細胞外及細胞內環的拓撲組織對于任何HAS均未進行實驗確定。spHAS是已進行純化和部分進行表征的HAS家族成員。用spHAS/堿性磷酸酶融合蛋白質的最初研究顯示spHAS的N末端、C末端和大的中央結構域事實上位于細胞中。spHAS具有6個半胱氨酸，而HAS1、HAS2和HAS3分別具有13、14和14個Cys殘基。spHAS中6個Cys殘基中的2個是保守的且在HAS1和HAS2中是相同的。發現只有一個保守Cys殘基位于所有HAS家族成員的相同位置(spHAS中的Cys-225)。這可能是一個基本的Cys，由巰基毒物對它的修飾部分地抑制酶活性。對于HAS家族的任何成員尚未闡明二硫鍵的可能存在或對關鍵Cys殘基的鑒定，該二硫鍵或Cys殘基是下文提及的多重HAS功能的任何一種所需要的。除所提出的在質膜合成的獨特模式之外，HAS酶家族在HA的全部多聚化所必需的大量功能中是高度不尋常的。在HAS酶中存在至少6種分立的活性2個不同的糖核苷酸前體(UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA)的每一個的結合位點，2種不同的糖基轉移酶活性，將生長的HA多聚體錨定到酶上一個或多個結合位點(可能涉及B-X7-B基元)，以及以一次一個或兩個糖的方式移動生長的多聚體的棘齒樣轉運機制。這后一種活性可能與多聚體通過膜的逐步前進相一致。所有這些功能以及可能尚未知道的其他功能存在于大小在419(spHAS)到588(xHAS)個氨基酸的相對小的蛋白質中。盡管所有可用的證據支持僅有spHAS蛋白質是細菌或體外HA生物合成所必需的結論，可能的是較大的真核HAS家族成員是多成分復合物的部分。由于真核HAS蛋白質比spHAS大～40％，它們額外的蛋白質結構域可參與更精巧的功能，如細胞內運輸和定位、酶活性調節及介導與其他細胞成分的相互作用。關于存在多個編碼不同合成酶的脊椎動物HAS基因的意外發現有力地支持正形成的一致意見，即HA是細胞行為的重要調節劑，而不簡單地是組織中的結構成分。因而，在少于6個月中，該領域從一個已知的克隆的HAS(spHAS)發展為多基因家族，這保證我們對HA合成和生物學的理解的快速、大量和激動人心的未來進展。例如，在下文中公開的是來自多殺巴斯德氏桿菌、緣草履蟲小球藻病毒(Paramecium bursaria Chlorella virus)(PBCV-1)、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)、硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)質粒pXO1和Ectocarpus siliculosus病毒的HAS基因的序列。這些系統中透明質素合成酶的存在和來自這些不同的系統的透明質素合成酶的純化和應用顯示了在許多不同的真核和病毒來源(總的來說，是從微生物來源)中純化和分離編碼酶活性透明質素合成酶的核酸序列的能力。C組類馬鏈球菌菌株D181合成并分泌透明質酸(HA)。研究人員用該菌株和A組釀膿鏈球菌菌株如S43和A111研究HA的生物合成，并在其二價陽離子需求、前體(UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA)利用和最適pH方面對HA-合成活性進行了表征。傳統上，HA已通過從公雞雞冠或來自鏈球菌培養物的細胞外培養基中分離而商業地制備。為制備HA已發展的一種方法是通過應用生產HA的鏈球菌細菌的培養物。在此處整體引用作為參考的美國專利No.4,517,295描述了這樣一種程序，其中生產HA的鏈球菌是在富含CO2的生長培養基中于厭氧條件下進行發酵的。在這些條件下，HA得到生產并可從液體培養基中提取。通常感覺HA從公雞雞冠中的分離是費力且困難的，這是因為人們從較不純狀態的HA開始分離。從公雞雞冠分離的優點是生產的HA具有較高的分子量。然而，通過細菌發酵制備HA是較容易的，因為這是以較高的純度開始的。然而，通常以這種方式生產的HA的分子量比從公雞雞冠得到的小。此外，通過鏈球菌發酵制備的HA時常引起與從公雞雞冠中獲得的HA一樣的免疫反應。因此，使得能夠通過細菌發酵生產高分子量的HA的技術對于現有的程序是明顯的改進。如在前文所述的，高分子量的HA具有多種有用的應用—從美容到眼外科。由于其高粘度及其高生物相容性的潛力，HA在眼外科中作為玻璃體液的替代物具有特別的應用。由于其高粘度及其在長的時間段中保持濕潤的能力，HA也已用于通過HA的關節內注射治療賽馬的創傷性關節炎、用于作為潤滑劑的剃須膏及用于多種化妝品產品。事實上，1997年8月，美國食品和藥品局(Food and DrugAgency)批準在幾種關節炎的治療中使用高分子量的HA，該治療是通過將這種高分子量的HA直接注射入患病的關節中。通常，所用的HA的分子量越高越好。這是因為HA溶液的粘度隨溶液中單獨的HA多聚體分子的平均分子量而增加。不幸的是，非常高分子量的HA如高達107的已難以通過現有可用的分離程序獲得。然而，此處所公開的重組生產方法使得能夠生產具有分子量高達107或更大的HA。為了解決這些或其他的困難，需要可用于生產HA的新方法和構建體，該HA具有一種或多種改進的性質，如更大的純度或制備的容易性。特別地，需要用于生產比現有商業可達到的更大量的具有相對高分子量和相對純的HA的方法。仍然有另一種需要以能夠發展生產具有修飾的大小分布的HA(HAΔsize)以及具有修飾的結構的HA(HAΔmod)的方法。工業的酶生產是每年15億美元的商業，且這些產品的百分之七十是從芽孢桿菌物種生產的。使用芽孢桿菌物種中有效的表達系統的優點是芽孢桿菌是蛋白質的有效分泌者，因此在基因工程加工的蛋白質的生產過程中芽孢桿菌對大腸桿菌或酵母的替代獲得了所述的蛋白質增加的分泌。芽孢桿菌物種也是“通常認為是安全的(Generally Recognized As Safe)”或“GRAS”微生物，這與其他商業上使用的細菌菌株如大腸桿菌相反。芽孢桿菌已長期用于食品和飲料工業，以及用于抗生素的生產中。芽孢桿菌的一個優點是它不含有熱源物質或不生產毒素。在發酵中使用芽孢桿菌有大量的工業實踐，如在去污劑蛋白酶和α-淀粉酶的生產中。本發明解決了本領域中的一個或多個缺點。利用重組DNA技術，在芽孢桿菌細胞中生產酶活性HAS的方法已與生產HAS及其透明質酸產物的重組芽孢桿菌細胞的制備方法一起被公開并申請專利保護了，其中在所述細胞中已引入了具有編碼酶活性HAS的編碼區的純化的核酸片段。
發明概述本發明涉及應用重組DNA技術以在透明質酸(HA)制備領域中解決一種或多種問題。這些問題是通過分離和應用具有編碼酶活性透明質酸合成酶(HAS)基因的編碼區的核酸區段而解決的，所述基因為負責HA鏈生物合成的基因，如來自A或C組鏈球菌、多殺巴斯德氏桿菌、硫磺礦硫化葉菌和Ectocarpus siliculosus病毒的HAS基因。在此處公開的HAS基因是從適當的微生物來源的DNA克隆的，并通過基因工程插入到有用的重組構建體中，該構建體被引入到芽孢桿菌細胞中以制備HA及制備大量的HAS酶本身。術語“透明質酸合成酶”、“透明質素合成酶”和“HA合成酶”是可互換使用的以描述使糖胺聚糖多糖鏈多聚化的酶，該多糖鏈由β1，3和β1，4連接的交替的葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺糖組成。例如術語“seHAS”描述源自類馬鏈球菌的HAS酶，其中編碼seHAS酶的基因的表達通過提供逃避內吞作用和免疫監視的方式而與鏈球菌的A組和C組菌株的毒性相關。本發明涉及透明質酸合成酶基因、cDNA和基因產物(HAS)的分離和表征，其可用于使葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺多聚化以形成糖胺聚糖透明質酸。本發明鑒定了HAS座位，并公開了編碼來自類馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌、多殺巴斯德氏桿菌、硫磺礦硫化葉菌、炭疽芽孢桿菌pXO1和Ectocarpus siliculosus病毒的酶活性HAS基因的核酸序列。HAS基因也提供了新探針以估計細菌樣品生產透明質酸的潛力。通過應用在此處提出的技術和知識，本領域的技術人員將能夠獲得編碼HAS基因的額外的核酸區段。如那些本領域的技術人員可認識的，根據本公開內容，這些優點提供了顯著的效用以能夠控制HAS基因的表達和控制所產生的HAS基因產物即HAS酶的特性。因此，本發明針對純化的核酸區段的分離，該核酸區段具有編碼酶活性HAS的編碼區，不論它是原核還是真核來源的。這是可能的，因為該酶(事實上是基因)是在真核生物和一些原核生物兩者中發現的。也已知真核生物可生產HA并因而具有HA合成酶基因，該基因可連同本發明一起使用。本發明編碼HA合成酶的核酸區段定義為分離的不含總染色體或基因組DNA的，從而它們可易于通過重組DNA技術進行操作。因此，如在此處所用的，短語“純化的核酸區段”指分離的不含無關染色體或基因組DNA的DNA區段，并且該區段保持使得其能夠用于重組技術實踐的狀態，如分立的分離DNA片段形式的DNA，或者插入了這種片段的載體(如質粒、噬菌體或病毒)。本發明包含重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是包含重組載體的芽孢桿菌細胞，該載體包含具有編碼酶活性透明質素合成酶SEQID NO2、10、12、14、16、18或20的編碼區的純化的核酸區段。純化的核酸區段可以含有SEQ ID NO1、9、11、13、15、17或19的核苷酸序列。重組載體可通過轉化、轉染、轉導和電穿孔中的至少一種而引入芽孢桿菌細胞中。在上文中描述的編碼區可處于啟動子的控制之下，如革蘭氏陽性相容性啟動子或芽孢桿菌相容性啟動子。重組宿主細胞也可包括至少一種修飾的RNA聚合酶啟動子，其中當修飾的RNA聚合酶啟動子被RNA聚合酶識別時，RNA聚合酶能夠以比內源RNA聚合酶啟動子高的量表達RNA。這種修飾可為突變或串聯的啟動子元件的存在，該元件可為相同的或不同的啟動子元件。此外，重組宿主細胞可進一步包括至少一種在天然芽孢桿菌細胞中沒有發現的額外的mRNA穩定或去穩定元件。芽孢桿菌細胞可具有至少UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc之一的增強的生產。可選擇地，重組宿主細胞可進一步具有至少一種純化的核酸區段，該核酸區段具有編碼UDP-糖前體途徑酶中有功能活性的酶的編碼區，該酶如選自UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶及其組合的酶活性UDP-GlcUA生物合成途徑的酶。這種純化的核酸區段可在上述重組載體中提供或在不同的重組載體中提供。當在相同的載體上提供時，2個編碼區可處于至少一個啟動子的至少一個拷貝的控制下或在不同啟動子的控制下。至少一個編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的核酸區段的存在將向重組宿主細胞提供比天然宿主細胞更高的活性，其中該天然宿主細胞也表達內源UDP-糖前體生物合成途徑的酶。在進一步的選擇中，重組宿主細胞可包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，其中突變增加了從中轉錄的mRNA的半衰期、編碼具有增加的轉錄效率的mRNA或發生于UDP-糖前體生物合成基因中的核糖體結合位點中，從而核糖體對該核糖體結合位點具有增加的結合親和力。本發明進一步包含生產透明質酸的方法，該方法包含通過引入在上文中描述的純化的核酸區段而構建在上文中描述的重組宿主細胞，并使該重組宿主細胞在培養基上生長以分泌透明質酸。芽孢桿菌宿主可于約25℃到約42℃的溫度范圍生長于化學確定成分培養基、復合培養基或含有葡萄糖和至少N-乙酰葡糖胺和葡糖胺之一的培養基中。然后回收分泌的透明質酸，且回收的透明質酸可進一步從培養基中提取并然后純化。例如，透明質酸可通過至少過濾、離心和絮凝作用之一而從細胞和殘渣中分離，隨后濃縮透明質酸，然后通過至少一種選自沉淀、超濾和透析的方法從培養基中分離濃縮的透明質酸。該分離可進一步包括三氯乙酸的添加，這促進細胞和殘渣與透明質酸的分離。沉淀劑可為乙醇、有機溶劑或化合物和脂族的帶正電的鹽中的至少一種，且可選自乙醇、異丙醇、丙酮、鯨蠟基溴化三銨或鯨蠟基氯化吡啶鎓。本發明進一步包含通過在上文中描述的方法制備的透明質酸。
附圖簡述

圖1描述seHAS和spHAS基因之間的相互雜交不發生。用于泳道1和2的A組探針僅與A組DNA(泳道2)雜交，而用于泳道3和4的C組探針僅與泳道3雜交。圖2圖解說明seHAS與細菌、病毒和真核HAS蛋白質之間的關系。圖3圖解說明一些已知的透明質素合成酶之間可能的進化關系和相似性。圖4描述由各種基因工程處理的鏈球菌HAS酶生產的HA的大小分布。圖5圖解說明大腸桿菌中重組seHAS和spHAS的過表達。圖6描述枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)中的重組HA生產。圖7描述鏈球菌HA合成酶的純化。圖8描述由在酵母膜中表達的重組鏈球菌HAS合成的HA的凝膠過濾分析。圖9是用特殊抗體對重組seHAS的蛋白質印跡分析。圖10是由重組seHAS和spHAS生產的HA大小分布的動力學分析。圖11圖解seHAS的親水圖和預測的膜結合區域。圖12是膜中seHAS的拓撲學組織的圖形模型。圖13是由重組seHAS合成真正的HA的證明。圖14描述用特定的寡核苷酸和PCR對編碼seHAS、編碼spHAS或編碼seHAS和spHAS兩者的核酸序列的識別。圖15描述用于特定PCR雜交的寡核苷酸。圖16A是通過比較枯草芽孢桿菌168(單獨的pSM143載體)的HA合成與枯草芽孢桿菌168(含有seHAS的pSM143載體)的HA合成而描述活枯草芽孢桿菌中重組HA生產的圖。圖16B是圖16A中的部分的放大。圖17A是描述對活枯草芽孢桿菌中由spHAS生產的重組HA大小分布的營養性控制的圖。圖17B是描述與單獨含有載體的枯草芽孢桿菌相比的活枯草芽孢桿菌168中重組HA生產的圖。圖18A和圖18B是重組大腸桿菌的顯微照片。在圖18A中，墨汁染色(1,000×放大倍率)揭示具有pPmHAS的大腸桿菌K5細胞生產堅固的莢膜，該莢膜顯示為圍繞細胞的白色光環。在圖18B中，莢膜材料可通過用鏈霉菌屬(Streptomyces)的HA裂解酶的簡單處理而從大腸桿菌K5(pPmHAS)細胞中去除。PmHAS指導了HA多糖的多聚化。圖19是革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌中GAG生物合成的示意模型。圖20是證明來自乳房鏈球菌的HAS基因PCR擴增的瓊脂糖凝膠。圖21描述來自釀膿鏈球菌、類馬鏈球菌和乳房鏈球菌的HA合成酶活性。
發明詳述在詳細解釋本發明的至少一個實施方案之前，應理解的是本發明的應用不限于在下面的描述中提出的或在附圖中闡明的成分的構建和組織的細節。本發明能夠用于其他實施方案或能夠以各種途徑實踐或實現。同樣地，應理解的是在此處應用的措詞和術語是為了描述的目的，而不應該認為是限制性的。如在此處所用的，術語“核酸區段”和“DNA區段”是互換使用的，且指已分離的不含特定物種的總基因組DNA的DNA分子。因此，如在此處所使用的“純化的”DNA或核酸區段指含有透明質酸合成酶(“HAS”)編碼序列的DNA區段，然而該編碼序列是從源細胞的無關基因組DNA分離的或是純化的不含后者的形式。包括于術語“DNA區段”中的是DNA區段和這種區段的較小片段以及重組載體，該載體包括如質粒、粘粒、噬菌體、病毒等。相似地，包含分離的或純化的HAS基因的DNA區段指包括HAS編碼序列的DNA區段，該區段基本從其他天然存在的基因或蛋白質編碼序列中分離。在這方面，為簡單起見將術語“基因”用于指功能蛋白質、多肽或肽編碼單位。如本領域的技術人員將理解的，該功能術語包括基因組序列、cDNA序列或其組合。“基本從其他編碼序列分離的”指目標基因(在本情況下為HAS)形成了DNA區段的編碼區的重要部分，且該DNA區段不含有大的部分的天然存在的編碼DNA，如大的染色體片段或其他功能基因或DNA編碼區。當然，這指的是最初分離的DNA區段，但不排除后面加入的或由人們手工在區段中有意留下的基因或編碼區。由于某些與原核來源的應用相關的優點，人們很可能認識到從原核生物分離HAS基因的許多優點。特別地，人們可選擇利用I類或II類HAS，如來自類馬鏈球菌或釀膿鏈球菌的I類HAS或來自多殺巴斯德氏桿菌的II類HAS。鏈球菌基于不同的細胞壁糖類抗原而在分類學上細分為蘭斯非爾德類群。有18個不同的類群，但最普遍的病原體是A、B、C和D。以歷史的眼光看，最普遍的病原體也經常有特定的物種名字，但統一的蘭斯非爾德檢驗方法被認為是確定類型的明確方法并因而是有用的分類方案。可用作HAS基因的來源的鏈球菌物種包括A組鏈球菌，如釀膿鏈球菌和溶血鏈球菌(S.haemolyticus)，以及C組鏈球菌，如馬鏈球菌(S.equi)、類馬鏈球菌、獸瘟鏈球菌(S.zooepidemicus)、乳房鏈球菌和停乳鏈球菌(S.dysgalactiae)。從原核生物中分離HAS基因的一個這樣的優點是真核的酶一般可能需要重要的翻譯后修飾，該修飾僅可在真核宿主中實現。這將傾向于限制獲得的任何真核HA合成酶基因的應用性。此外，本領域的技術人員很可能認識到在應用原核的酶基因時，在時間和基因操作的容易性方面的額外的優點。這些額外的優點包括(a)原核基因由于相對小的基因組大小，以及在篩選相應的基因組文庫時減少的量，因此較容易分離；和(b)操作的容易性，這是因為由于不含有內含子，原核基因的編碼區的總大小是顯著較小的。此外，如果HAS基因的產物(即酶)需要翻譯后修飾，那么這將最好在該基因所源自的相似的原核細胞環境(宿主)中實現。優選地，根據本發明的DNA序列將進一步包括基因控制區，該控制區使得該序列能夠在選擇的重組宿主中表達。當然，應用的控制區的特性一般依賴于想要的特殊用途(如克隆宿主)而變化。在特別的實施方案中，本發明涉及分離的DNA區段和插入了編碼HAS基因的DNA序列的重組載體，該基因在其氨基酸序列中包括根據SEQ ID NO2、10、12、14、16、18和20中至少一個的氨基酸序列。此外，在其他特別的實施方案中，本發明涉及分離的DNA區段和插入了編碼基因的DNA序列的重組載體，該基因在其氨基酸序列中包括HAS基因或DNA的氨基酸序列，且特別地包括相應于類馬鏈球菌HAS、釀膿鏈球菌HAS、乳房鏈球菌HAS、多殺巴斯德氏桿菌HAS、硫磺礦硫化葉菌HAS、Ectocarpus siliculosus病毒HAS和炭疽芽孢桿菌質粒pXO1 HAS的HAS基因或cDNA。例如，當DNA區段或載體編碼全長的HAS蛋白質時，或想要用于表達HAS蛋白質時，優選的序列是那些基本在SEQ ID NO2、10、12、14、16、18和20中至少一個中提出的。具有HA合成酶活性的核酸區段可通過在此處描述的方法分離。術語“基本在SEQ ID NOX中提出的序列”指基本相應于SEQID NOX的部分的序列，并且該序列與SEQ ID NOX的氨基酸序列相比只有相對少數的氨基酸不同或該序列是SEQ ID NOX的生物學功能等價物。術語“生物學功能等價物”是本領域中眾所周知的，并進一步在此處詳細定義為具有基本在SEQ ID NOX中提出的序列并且與原核生物生產HA或透明質酸被膜的能力相關的基因。例如，seHAS和spHAS編碼序列為約70％相同的且富含堿基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)。SeHAS的堿基含量為A-26.71％、C-19.13％、G-20.81％和T-33.33％(A/T＝60％)，而spHAS為A-31.34％、C-16.42％、G-16.34％和T-35.8％(A/T＝67％)。本領域的技術人員驚訝的是seHAS編碼序列不與spHAS基因雜交，反之亦然，盡管它們是70％相同的。該意想不到的不能相互雜交可歸因于在可讀框中錯配堿基造成的短中斷。SpHAS不能與seHAS相互雜交顯示于圖1中。SeHAS和spHAS編碼序列共同的相同核苷酸的最長一段僅20個核苷酸。此外，高度富含A-T的序列將形成比富含G-C的序列不穩定的雜交復合物。另一個可能的解釋是在兩個序列中均有幾個As或Ts區段，該區段可以以錯誤排列和不穩定的方式雜交。這將使得seHAS和spHAS基因序列相互不在可讀框內配對，因而降低了有效雜交的概率。由于70％相同的兩個編碼蛋白質的基因不能夠相互雜交的獨特現象，有益的是依照其功能考慮所述的核酸區段；即編碼酶活性透明質酸合成酶的核酸區段。本領域的技術人員可理解編碼酶活性透明質酸合成酶的核酸區段可含有對在SEQ ID NO1、2和9-20中提出的序列的保守的或半保守的替代，且仍然在本發明的范圍之內。特別地，本領域充滿從業者對核酸區段做結構改變(即編碼保守的或半保守的氨基酸替代)并仍然保持其酶或功能活性的例子。例如參見(1)Risler等人“結構相關蛋白質中的氨基酸替代。模式識別方法。”J.Mol.Biol.2041019-1029(1988)[“…根據氨基酸側鏈的觀察到的可交換性，僅可描繪4組；(i)Ile和Val；(ii)Leu和Met；(iii)Lys、Arg和Gln及(iv)Tyr和Phe。”]；(2)Niefind等人蛋白質模型的氨基酸相似系數和源自主鏈折疊Anoles的序列比對”J.Mol.Biol.219481-497(1991)[相似性參數使得能夠設計氨基酸替代]；和(3)Overington等人“環境特異性氨基酸替代表蛋白質折疊的三級模板和預測”Protein Science 1216-226(1992)[“觀察到的替代作為局部環境的函數的分析顯示有不同的模式…”可做相容的改變。]，每一個的內容都清楚地在此處整體引用作為參考。這些參考文獻和無數其他的文獻顯示在給出核酸序列時，本領域的技術人員可對該核酸序列進行替代和改變而不改變其功能性。同樣地，替代的核酸區段可與其未改變的親代高度相同，且保持其未改變的親代的酶活性，并仍然不能進行雜交。本發明公開了編碼酶活性透明質酸合成酶如seHAS、spHAS、suHAS和pmHAS的核酸區段。盡管seHAS與spHAS 70％相同且均編碼酶活性透明質酸合成酶，但它們不相互雜交。因而，本領域的技術人員可理解可對在SEQ ID NO1中列出的seHAS核酸區段進行替代而不背離本發明的范圍和權利要求。標準化的和可接受的功能等價氨基酸替代顯示于表I中。
表I 本發明另一個優選的實施方案是可進一步限定為重組載體的純化的核酸區段，該區段編碼根據SEQ ID Nos2、10、12、14、16、18或20的蛋白質。如在此處所用的，術語“重組載體”指已進行修飾以含有編碼HAS蛋白質或其片段的核酸區段的載體。該重組載體可進一步限定為包含啟動子的表達載體，該啟動子可操作地連接到該編碼HAS的核酸區段上。本發明進一步優選的實施方案是一個宿主細胞，該宿主細胞用包含HAS基因的重組載體制備為重組體。該優選的重組宿主細胞可為原核細胞。在另一個實施方案中，該重組宿主細胞可為真核細胞。如在此處所用的，術語“基因工程處理的”或“重組”細胞是要指向其中引入了重組基因如編碼HAS的基因的細胞。因此，基因工程處理的細胞與不含有重組引入的基因的天然存在的細胞可區別。因而，基因工程處理的細胞是具有人工引入的基因的細胞。重組引入的基因將為cDNA基因的形式，基因組基因的拷貝，或者包括位于啟動子附近的基因，該啟動子天然地與引入的特定基因無關。當人們想要用除鏈球菌之外的宿主生產重組HA合成酶時，有利的是應用原核系統如大腸桿菌、芽孢桿菌菌株、乳球菌屬(Lactococcus sp.)，或者甚至用真核系統如酵母或中國倉鼠卵巢細胞、非洲綠猴腎細胞、VERO細胞等。當然，在著手該工作時，通常需要的是使HA合成酶基因處于選擇的替代宿主中有功能的序列的控制之下。該適當的DNA控制序列以及其構建和使用通常是本領域中眾所周知的，如在下文中更加詳細討論的。例如，在一個優選的實施方案中，宿主細胞可為芽孢桿菌細胞，如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細胞，且在其中引入的載體含有與has基因可操作地連接的芽孢桿菌相容性啟動子。在更優選的實施方案中，宿主細胞是芽孢桿菌細胞，如嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、Bacillus clausii、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌、Bacillus metaterium、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringienisis)。在優選的實施方案中，編碼HA合成酶的DNA區段進一步包括本領域中公知的功能為復制或“復制子”起點的DNA序列，該序列使得能夠由特定的宿主進行連續的序列的復制。這種起點使得能夠制備染色體外定位的且復制的嵌合體區段或質粒，在其中連接了HA合成酶DNA序列。在更優選的的例子中，應用的起點是能夠在適合于生物技術應用的細菌宿主中復制的。然而，對于更加多功能的克隆DNA區段，想要的是可選擇地甚至額外地應用由其他想要應用的宿主系統識別的起點(如在穿梭載體中)。其他復制起點如SV40、多形瘤或牛乳頭狀瘤病毒起點的分離和應用是本領域的技術人員眾所周知的，其中所述病毒可應用于許多高等生物的克隆或表達。在某些實施方案中，本發明因而可按照重組轉化載體而限定，該載體包括編碼HA合成酶的基因序列和適當的復制起點，并在選擇的控制區的控制之下。因而，本領域的技術人員可理解的是按照本發明的公開內容，可使用其他的方式獲得HAS基因或cDNA。例如，可獲得聚合酶鏈反應或RT-PCR生產的DNA片段，該片段含有來自許多來源的基因或cDNA的全長互補物，該來源包括鏈球菌的其他菌株，或者來自真核來源如cDNA文庫。事實上可將任何分子克隆方法用于生成根據本發明的DNA片段。因而，通常對用于DNA分離的特定方法的唯一限制是分離的核酸應該編碼生物學功能性等價物HA合成酶。一旦已分離DNA，則將其與選擇的載體連接在一起。事實上可應用根據本發明的任何克隆載體以實現該優點。一般有用的載體包括用于原核生物的質粒和噬菌體，及甚至用于真核生物的病毒載體。例子包括pKK223-3、pSA3、重組的λ、SV40、多形瘤、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒和反轉錄病毒。然而，人們相信當應用能夠在乳球菌屬或芽孢桿菌菌株和大腸桿菌兩者中復制的載體時，最終可實現特別的優點。如這些由Dao和Ferretti的pSA3載體或Trieu-Cuot等人的pAT19載體所示例的載體使得人們能夠在容易操作的宿主如大腸桿菌中進行克隆群體選擇，并隨后轉移入食品等級的乳球菌屬或芽孢桿菌菌株中以生產HA。這些是用于生產某些食品和生物技術產品的良性和充分研究的生物。這些在下面情況中是有利的，即人們可通過基因劑量作用(即通過擴增而提供額外拷貝的HA合成酶基因)和/或包括額外的基因來增加乳球菌屬或芽孢桿菌菌株合成HA的能力，從而增加HA前體的可用性。細菌合成HA的固有能力也可通過形成額外的攜帶HA合成酶基因的質粒拷貝或擴增該質粒而增加。該擴增可導致質粒拷貝數目及因此的HA合成酶基因拷貝數目中10-倍的增加。可進一步增加HA合成酶基因拷貝數目的另一個程序是向質粒中插入多拷貝的基因。另一種技術可包括將HAS基因整合入染色體DNA中。該額外的擴增尤其可行，這是因為細菌HA合成酶基因是小的。在一些計劃中，將染色體DNA-連接的載體通過使用能夠在選擇的宿主中表達插入的DNA的載體來應用于轉染宿主，該宿主是為篩選的目的而選擇的，如大腸桿菌。在另一個優選的實施方案中，HA合成酶基因是通過同源或異源重組而引入到宿主細胞染色體中的。has基因在這種構型中更加穩定，尤其是當無藥物選擇時。多種載體可用于將has基因引入到芽孢桿菌中，如pTLH或pKSV7，或者引入到酵母中，如YIp211，或者引入到動物細胞中，如pcDNA/FRT。首先將DNA通過轉化、轉導或電穿孔引入到宿主細胞中。然后將具有has基因的DNA區段穩定地整合入宿主染色體中。例如，spHAS基因用于通過轉導和整合修復鏈球菌染色體的突變；該操作結果導致HA的生產(DeAngelis等人，1993)。當應用真核來源如皮或滑膜成纖維細胞或公雞雞冠細胞時，人們想要首先通過制備cDNA文庫而進行。這是首先通過從上述細胞中分離mRNA而實施的，隨后用具有反轉錄酶活性的酶制備雙鏈cDNA并與選擇的載體連接。在本領域中對于雙鏈cDNA的制備許多可能性都是可用且公知的，且所有這種技術都認為是可采用的。優選的技術包括反轉錄。一旦獲得了雙鏈cDNA群體，則在選擇的宿主中通過可接受的技術制備cDNA文庫，如通過連接入適當的載體中并在適當的宿主中擴增。由于所獲得的極大數目的克隆及通過在此處提出的技術篩選極大數目克隆的容易性，人們可想要應用噬菌體表達載體以克隆和表達篩選cDNA克隆，如λgt11、λgt12、λGem11和/或λZAP。在某些其他的實施方案中，本發明涉及分離的DNA區段和重組載體，它們在其序列中包括基本在SEQ ID NOS1、9、11、13、15、17和19的至少一個中提出的核酸序列。例如，術語“基本在SEQID NO1中提出的”是以與上述的相同的意義使用的，意思是核酸序列基本相應于SEQ ID NO1的部分，且具有相對少的與SEQ ID NO1的密碼子不同或不是功能等價物的密碼子。術語“功能等價物密碼子”在此處用于指編碼相同氨基酸的密碼子如精氨酸或絲氨酸的6個密碼子，且也可指編碼在表I中提出的生物學等價的氨基酸的密碼子。也可理解氨基酸和核酸序列可包括額外的殘基，如額外的N-或C-末端氨基酸或額外的5’或3’核酸序列，且仍然是基本如在此處公開的序列之一中提出的，只要該序列滿足上文提出的標準，該標準包括當涉及蛋白質表達和酶活性時維持生物學的蛋白質活性。末端序列的添加特別地應用于核酸序列，該序列包括如在側面與編碼區的5’或3’部分相接的多種非編碼序列，或可包括已知在基因中存在的多種內部序列。特別地，真核生物中has基因產物的氨基酸序列比在原核生物中發現的大大約40％。慮及遺傳密碼的簡并性以及保守和半保守的替代，與SEQID NOS1、9、11、13、15、17或19的核苷酸具有約40％～約80％的一致性的；或者更優選地為約80％～約90％的一致性的；或者更加優選地為約90％～約99％的一致性的。序列為“基本如在SEQ ID NOS1、9、11、13、15、17或19中提出的”序列；基本與那些在SEQ ID NOS1、9、11、13、15、17或19中提出的序列相同的序列也可功能性地定義為能夠在標準或較低嚴格性雜交條件下與含有SEQ ID NOS1、9、11、13、15、17或19的互補物的核酸區段雜交的序列。適當的標準雜交條件是本領域技術人員眾所周知的，并在此處明確地提出。如在此處所用的術語“標準雜交條件”用于描述這樣的條件，即在該條件下基本互補的核酸區段將形成標準的沃森-克里克堿基對。已知有許多因子決定結合或雜交的特異性，如pH、溫度、鹽濃度、如甲酰胺和二甲基亞砜等試劑的存在、雜交的區段的長度等。當預期將較短的核酸區段用于雜交時，例如約14和約100個核苷酸之間的片段，雜交的鹽和溫度優選的條件將包括40-50℃時1.2-1.8×的高磷酸鹽緩沖液(HPB)。自然地，本發明也包含與在SEQ ID NOS1、9、11、13、15、17或19中提出的序列互補或基本互補的DNA區段。“互補”的核酸序列是那些能夠根據標準的沃森-克里克互補原則進行堿基配對的。如在此處所用的，術語“互補序列”指基本互補的核酸序列，如可由在上文中提出的相同的核苷酸比較進行估計的，或定義為能夠與SEQ ID NOS1、9、11、13、15、17或19的核酸區段進行雜交的。不管其本身編碼序列的長度怎樣，本發明的核酸區段可與其他DNA序列組合，如啟動子、聚腺苷酸化信號、額外的限制性酶切位點、多克隆位點、抗原決定部位標記、多組氨酸區域、其他編碼區段等，從而其總長度可有相當大的變化。因此預期可應用幾乎任何長度的核酸片段，其總長度優選地受到在想要的重組DNA規程中制備和使用的容易性的限制。自然地，也應理解本發明不局限于分別為SEQ ID NOS1、9、11、13、15、17和19和SEQ ID NOS2、10、12、14、16、18和20的特定的核酸和氨基酸序列。因此重組的載體和分離的DNA區段可不同地包括HAS編碼區本身、在基本編碼區中具有選擇的替代或修飾的編碼區，或者它們可編碼較大的多肽，然而該多肽包括HAS-編碼區，或可編碼具有氨基酸序列變體的生物學功能性等價物蛋白質或肽。長期以來猜測Carter A型多殺巴斯德氏桿菌的被膜含有透明質酸(HA)。多殺巴斯德氏桿菌的透明質酸的表征導致它和seHAS和spHAS蛋白質之間的有趣的酶學差異。多殺巴斯德氏桿菌細胞產生易于看到的細胞外HA被膜，且由于兩種鏈球菌HAS是膜蛋白質，所以檢驗了雞霍亂病原體的膜制備物。在早期的試驗中，當在與那些測量鏈球菌HAS活性的條件相似的條件下測定時，源自單獨超聲處理的粗制膜組分具有非常低水平的UDP-GlcNAc-依賴性UDP-[14C]GlcUA向HA的整合[～0.2pmol的GlcUA轉移(礸蛋白質)-1h-1]。來自具有重組hasA質粒的大腸桿菌的酶也首先是抗分離的。這些結果與用相似的方法從鏈球菌獲得的易于探測的量相反。在蛋白酶抑制劑存在時用冰冷的裂解酶處理的可選擇的制備規程與超聲處理一起使得能夠從兩種革蘭氏陰性細菌的物種中基本恢復HAS活性。特定的HAS活性，即轉移的5-10pmolGlcUA(μg蛋白質)-1h-1，通常能從野生型多殺巴斯德氏桿菌的粗制膜中用新方法獲得。在UDP-GlcNAc不存在時，在較高分子量的材料中幾乎未整合來自UDP-[14C]GlcUA的放射性(是用同一方法對兩種糖前體進行測定結果的不到1％)。從無被膜的突變體TnA制備的膜當補充了兩種糖前體時不具有可探測的HAS活性(數據未顯示)。用聚丙烯酰胺葡聚糖S-200柱的凝膠過濾分析顯示，自材料在孔隙體積(Void volume)洗脫開始，在體外合成的14C-標記的產物的大多數的分子量≥8×104Da，該值相應于由至少400個單體組成的HA分子。該產物對鏈霉菌透明質酸酶消化敏感但抗蛋白酶處理。對HAS測定的參數進行改變以由多殺巴斯德氏桿菌的膜使UDP-糖向多糖的整合最大化。鏈球菌spHAS需要Mg2+，因此該金屬離子包括在多殺巴斯德氏桿菌的膜的最初測定中。多殺巴斯德氏桿菌HAS(pmHAS)在Tris-類型的緩沖液中從pH6.5～8.6為相對活性的，最適值為pH7。HAS活性在中性pH下至少1h期間內相對于溫育時間是線性的。pmHAS在較高離子強度時是明顯低活性的，這是因為向含有pH7的50mM Tris和20mM MgCl2的反應體系中加入100mM的NaCl減少了～50％的糖整合。在pH7時測定了pmHAS的金屬離子特異性。在存在EDTA的無金屬條件下，沒有探測到放射性標記的前體向多糖的整合(＜5％的最大信號)。在試驗的金屬離子(Mg、Mn、Co、Cu和Ni)中Mn2+離子在最低濃度時具有最大的整合率。Mg2+給出Mn2+刺激的50％，但是在10-倍高的濃度上。10mM的Co2+或Ni2+支持較低水平的活性(分別為1mM Mn2+測定的20％或9％)，但提供了10mM Cu2+的膜是無活性的。事實上，使10mM Cu2+和20mM Mg2+與膜制劑混合幾乎不導致標記向多糖中的整合(＜8％的單用Mg的值)。pmHAS的最初表征是在Mg2+存在時進行的。酶對其糖核苷酸前體的結合親和力是通過測量表現KM值而測定的。[14C]GlcUA或[3H]GlcNAc向多糖的整合是分別在不同的UDP-GlcNAc或UDP-GlcUA濃度進行監控。在含Mg2+的緩沖液中，UDP-GlcUA的～20μM的表觀KM值和UDP-GlcNAc的～75μM的表現KM值是用滴定數據的Hanes-Woolf圖([S]/v對[S])來確定的。兩種糖的Vmax值是相同的，這是因為相應于1/Vmax的Hanes-Woolf圖的斜率是相同的。與用Mg2+測定的結果相比較，在Mn2+存在時UDP-GlcNAc的KM值增加了約25-50％到～105μM，且Vmax增加了2-3-倍。來自多殺巴斯德氏桿菌、類馬鏈球菌或釀膿鏈球菌的HA合成酶利用UDP-糖，但它們在pH和金屬離子依賴性和KM值方面具有一些不同的動力學最適值。該酶在pH7時是最大活性的；然而，據報道pmHAS在微酸性pH時具有更大的活性且在大于pH7.4時相對無活性。在體外測定條件下pmHAS利用Mn2+比利用Mg2+更有效，但細菌細胞中生理學金屬輔因子的特性是未知的。作為比較，在前文用鏈球菌酶的研究中Mg2+大大好于Mn2+，雖然在比最適的Mg2+濃度低～10-倍的濃度時Mn2+作用是最大的。pmHAS結合UDP-糖明顯地比spHAS更緊密。對于每一種底物，在粗制膜中測量的pmHAS的KM值比那些從發現于鏈球菌膜中的HAS獲得的低約2-3-倍UDP-GlcUA分別為50或39μM，UDP-GlcNAc分別為500或150μM。通過動力學分析，pmHAS的Vmax在Mn2+存在時比在Mg2+存在時高2-3-倍，但在用前一種離子的測定中UDP-GlcNAc的KM值稍微增加了。該明顯降低的親和力提示增加的多聚化速率不是歸因于Mn2+離子/糖核苷酸復合物與酶活性位點的更好的結合的。因此，可能的是Mn2+增強了一些其他的反應步驟，改變了酶的另一個位點/結構，或修飾了磷脂膜環境。pmHAS的基因序列和蛋白質序列分別顯示于SEQ IDNO9和10中。小球藻病毒(Chlorella virus)PBCV-1編碼可合成透明質素的有功能的糖基轉移酶。該發現與通常對病毒的以下觀察相反，即(a)病毒利用宿主細胞的糖基轉移酶來生成新的糖結構或者(b)在病毒體成熟過程中積聚宿主細胞的糖綴合物。此外，通常認為HA僅限于動物和少數其毒性細菌病原體中。盡管已對許多植物糖類進行了表征，但在植物或原生生物細胞中以前未發現HA或相關的類似物。脊椎動物、細菌和病毒HAS酶具有幾個序列相似區。在對病毒PBCV-1[緣草履蟲小球藻病毒]的基因組雙鏈DNA進行測序時，發現了一個ORF[可讀框]即A98R(訪問號#442580)，該ORF編碼與多種HAS具有28～33％的氨基酸一致性的567個殘基的蛋白質。該蛋白質命名為cvHAS(小球藻病毒HA合成酶)。編碼PBCV-1的基因序列和其編碼的蛋白質序列分別顯示于SEQ ID NO7和8中。PBCV-1是大的(直徑為175-190nm)多角體噬斑形成性病毒科(藻DNA病毒科)的原型，該科病毒在某些單細胞的真核小球藻樣綠藻中復制。PBCV-1病毒體含有至少50個不同的蛋白質和位于外層糖蛋白被膜內側的脂質成分。PBCV-1基因組是具有共價閉合發夾末端的線性且無序列改變的330-kb長的dsDNA分子。基于其推斷的氨基酸序列，A98R基因產物應為整合膜蛋白質。為了檢驗該假說，在大腸桿菌中生產了重組A98R，并對膜組分進行了HAS活性的測定。UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc是通過源自在質粒pCVHAS上含有A98R基因的細胞的膜組分而整合到多糖中的(平均的特異性活性為2.5pmoles GlcUA轉移/礸蛋白質/分鐘)，而不是通過來自對照細胞的樣品的(＜0.001pmoles GlcUA轉移/礸蛋白質/分鐘)。在用pCVHAS轉化的細胞的可溶性組分中未探測到活性。UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc對于多聚化是同時需要的。其活性在10mMMnCl2存在時的pH7.2的Hepes緩沖液中是最適的，而在不含該金屬離子時探測不到活性。在相似的濃度Mg2+和Co2+的有效性僅為Mn2+的～20％。pmHAS具有相似的金屬需求，但其他HAS偏好Mg2+。重組A98R酶合成了平均分子量為3-6×106Da的多糖，該多糖比由重組spHAS或DG42 x1HAS在體外合成的HA小(分別為～107Da和～5-8×106Da)。該多糖被Streptomyces hyaluroniticusHA裂解酶完全降解，該酶能使HA解聚，但不使結構上相關的糖胺聚糖如肝素和軟骨素解聚。對PBCV-1感染的小球藻細胞進行了A98R基因表達的檢查。在感染后～15分鐘出現了～1,700個核苷酸的A98R轉錄物，且該轉錄物在感染60分鐘之后消失，從而顯示A98R是早期基因。隨后，對來自未感染的和PBCV-1感染的小球藻細胞的膜組分在感染后50和90分鐘進行了HAS活性的測定。感染的細胞而不是未感染的細胞具有活性。與細菌來源的重組A98R酶一樣，放射性標記從UDP-[14C]GlcUA向多糖的整合依賴于Mn2+和UDP-GlcNAc兩者。該放射性標記的產物也被HA裂解酶降解。破壞的PBCV-1病毒體不具有HAS活性。對PBCV-1感染的小球藻細胞用高度特異性的125I-標記的HA-結合蛋白質進行了HA多糖的分析。來自感染后50和90分鐘時細胞的提取物含有大量的HA，但來自未感染的藻類或破壞的PBCV-1病毒體不含有HA。標記的HA-結合蛋白質也與感染后50和90分鐘的完整感染細胞進行相互作用，但不與健康細胞相互作用。因此，新合成的HA多糖的相當大部分是固定于感染的藻類的細胞外表面的。細胞外HA在病毒與其藻類宿主之間的相互作用中不起明顯的作用，這是因為通過在PBCV-1噬斑測定的頂層瓊脂中包括睪丸透明質酸酶(465單位/ml)或自由HA多糖(100μg/ml)，噬斑的大小和噬斑的數目均未改變。PBCV-1基因組也具有編碼UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-GlcDH)和谷氨酰胺果糖-6-磷酸氨基轉移酶(GFAT)的額外基因。UDP-GlcDH將UDP-Glc轉變為UDP-GlcUA，即HA生物合成的必需前體。GFAT將果糖-6-磷酸轉變為葡糖胺-6-磷酸，即UDP-GlcNAc代謝途徑中的中間物。與A98R HAS一樣，這兩個PBCV-1基因在感染早期表達并編碼酶活性蛋白質。多個酶在HA生物合成途徑中的存在顯示HA生產一定在小球藻病毒的生活史中發揮重要的功能。鏈球菌、脊椎動物和PBCV-1的HA合成酶具有許多基元，該基元為以相同的相對順序存在至少2～4個相同的殘基的模式。這些保守的基元可能反映如在圖2中所示的HA生物合成中關鍵的結構域。圖2是分別來自類馬鏈球菌和乳房鏈球菌的C組seHAS和suHAS；來自釀膿鏈球菌的A組spHAS；小鼠同工酶mHAS1、mHAS2和mHAS3；人同工酶hHAS1、hHAS2和hHAS3；蛙同工酶xlHAS1和xlHAS2；最初的PBCV-1病毒HAS、cvHAS以及新病毒HASs vNC、vMA、vAL和vCA；大鼠rnHAS2；雞ggHAS2；牛btHAS2和兔同工酶ocHAS2和ocHAS3的蛋白質序列的比對。圖2的比對是用Mutalin 5.4.1版的多重比對程序實現的(版權I.N.R.A.法國1989、1991、1994、1996；用等級聚類(hierarchical clustering)的多重序列比對，Corpet，Nucl.AcidsRes.，1610881(1988))。在比對的較下面的線上提供了一致線(consensus line)。一致線中的大寫字母代表所列的所有HAS蛋白質中相同的殘基，而小寫字母代表那些在所有情況下均不相同的一致殘基。一致線也含有下面的符號！是I、V的任何一個；$是L、M的任何一個；％是F、Y的任何一個；#是N、D、Q、E、B、Z的任何一個。符號比較表為blosum62，缺口權重為12，且缺口長度權重為2。當對更多的糖基轉移酶進行測序時，也發現了HAS和其他從UDP-糖前體合成β-連接的多糖的酶之間相似性的區域。例子包括細菌纖維素合成酶、真菌和細菌幾丁質合成酶和各種HAS。當糖基轉移酶的三維結構信息積聚時，這些相似的結構基元的重要性將變得明顯。圖3描述已知的透明質素合成酶之間的可能的進化關系。圖3的系統樹是用DNAsis多重比對程序通過Higgins-Sharp算法生成的。計算的匹配百分數顯示于系統樹的每一個分支上。本發明的DNA區段包含生物學功能性等價物HAS蛋白質和肽。這種序列可作為已知天然發生于核酸序列及其編碼的蛋白質中的密碼子豐余性和功能性等價性的結果而出現。可選擇地，功能性等價物蛋白質或肽可通過應用重組DNA技術而生成，其中基于對交換的氨基酸的特性的考慮可進行對蛋白質結構的改變。人工設計的改變可通過應用定點誘變技術而引入，如改進酶活性或HAS蛋白質的抗原性，或者檢驗HAS突變體以在分子水平檢查HA合成酶活性。同樣地，HAS編碼區中的特定改變可導致具有修飾的大小分布或結構構型的HA的生產。本領域的技術人員可理解可以以生產改變的透明質酸合成酶的方式對HAS編碼區進行處理，這反過來能夠生產具有不同多聚體大小和/或功能能力的透明質酸。例如，可以以透明質酸合成酶具有改變的糖底物特異性的方式對HAS編碼區進行改變，從而透明質酸合成酶生成新的透明質酸樣的多聚體，該多聚體整合了不同的結構如以前未整合的糖或糖衍生物。該新整合的糖將產生具有不同功能特性的透明質酸、具有較小或較大多聚體大小/分子量的透明質酸或兩者。在給定HAS編碼序列的情況下，本領域的技術人員可以理解可對HAS編碼序列進行改變和/或替代，從而可實現這些想要的特性和/或大小的修飾。表II列出了重組seHAS的糖核苷酸特異性和鎂離子需求。
表II重組seHAS的糖核苷酸特異性和鎂離子需求存在的第二個糖核苷酸HA合成*(μM)UDP-[24C]GlcUA UDP-[3H]GlcNAcdpm(％)dpm(％)無 90(2.1％) 8(1.2％)UDP-GlcNAc(300) 4134(100％)……UDP-GlcUA(120) …… 635(100％)UDP-Glc(160) 81(1.9％) 10(1.5％)UDP-GalNAc(280) 74(1.7％) 19(2.9％)UDP-GalA(150)58(1.4％) 19(2.9％)UDP-GlcNAc+EDTA 31(0.7％) ……UDP-GlcUA+EDTA …… 22(3.4％)*膜(324 ng蛋白質)與120μM UDP-[24C]GlcUA(2.8×104dpm)或300μM UDP-[3H]GlcNAc(2×104dpm)在37℃溫育1小時。在顯示的第二個非標記的糖核苷酸存在時使用放射性標記的糖核苷酸。HA合成酶活性是如在申請中描述的進行確定的。如在此處所用的術語修飾的結構”表示含有通常不發現于天然存在的HA多糖中的糖或衍生物的透明質酸多聚體。術語修飾的大小分布”指大小分布通常不發現于天然酶中的透明質酸分子的合成；所設計的大小比正常的小或大。不同大小的各種透明質酸產物已應用于各個領域，如藥物送遞中。如果約4～約20個單糖的透明質酸多聚體可以以好的量制備，那么在血管發生和傷口愈合中的應用將有很大潛力。小的透明質酸寡糖的另一個特別的應用是用于醫學目的的重組人蛋白質的穩定化。這種蛋白質的主要問題是其從血液中的清除和短的生物學半衰期。對該問題的一個現有的解決方法是偶聯一個小分子的屏蔽，該屏蔽防止該蛋白質太快地從血液循環中清除。非常小分子量的透明質酸非常適用于該角色且為非免疫原性的和生物相容性的。附著到藥物或蛋白質上的較大分子量的透明質酸可用于導向具有透明質酸的內吞受體的網狀內皮細胞系統。在該公開內容的啟示下，本領域的技術人員可理解有幾個途徑可對由透明質酸合成酶制備的透明質酸多聚體的大小分布進行調節以得到不同的大小。首先，產物大小的動力學控制可通過降低溫度、降低酶反應時間及降低一種或兩種糖核苷酸底物的濃度而進行改變。降低這些變量的任何一項或全部將得到透明質酸產物的較小的量和較小的大小。這些方法的缺點是產物的產量也將降低，且可能難以實現天與天或批與批之間的可重復性。其次，HA多聚體的大小分布可通過改變酶合成大的透明質酸產物的內在能力而調節。對蛋白質的改變可通過重組DNA技術進行處理，如特定氨基酸的替代、缺失和添加(或者甚至通過代謝處理引入輔基)。然后這種產生內在較慢的酶的改變使得能夠通過動力學方式對透明質酸的大小進行更多的可重復性控制。最終的透明質酸大小分布是通過酶的某些特征決定的，該特征依賴于序列中的特定的氨基酸。在鏈球菌酶和真核透明質酸合成酶之間絕對保守的殘基的20％中，在特定的位置有一套氨基酸控制或巨大地影響酶可制備的透明質酸多聚體的大小。這些殘基的任何一個的特定的改變都可產生修飾的HAS，該HAS產生具有修飾的大小分布的HA產物。在透明質酸釋放之前對降低酶可制備的透明質酸的內在大小的seHAS、spHAS、suHAS、pmHAS或cvHAS進行的改變將提供生產透明質酸產物的有力方式，該透明質酸產物的大小比天然的酶的小或潛在的大。最后，大分子量的透明質酸可用特定的透明質酸酶進行降解以制備低分子量的透明質酸。然而，該實踐非常難以實現可重復性，且人們必須小心翼翼地再次純化透明質酸以去除透明質酸酶和不想要的消化產物。如在圖4中所示的，可對透明質素合成酶進行處理以同正常的野生型酶相比生產不同大小的透明質酸多聚體，特別是較小的。該圖顯示一系列spHAS酶的HA大小的分布(分子量測量為百萬道爾頓)，對每一種酶均用定點誘變進行了處理以使其與天然的酶具有單一的氨基酸改變。每一種均用丙氨酸替代了不同的半胱氨酸殘基。具有空心符號的5個曲線的聚合代表下面的spHAS蛋白質野生型、C124A、C261A、C366A和C402A。實心的圈代表僅為部分活性的很少表達的C225A蛋白質。實心三角形代表C280A spHAS蛋白質，人們發現該蛋白質可合成比正常的酶或所示的其他變體范圍小許多的HA多聚體。這種實踐顯示對透明質酸合成酶進行處理以合成想要的HA產物大小的范圍是可行的。在此處公開的編碼透明質酸合成酶的HAS基因的任何一種也可通過定點誘變進行處理以生產合成想要的HA產物大小范圍的酶。結構上修飾的透明質酸在概念上與通過在想要的HAS或spHAS中改變特定的氨基酸而改變透明質酸產物的大小分布是沒有區別的。預期UDP-GlcNAc的衍生物是特別有用的，在其中N-乙酰基團是缺失的UDP-GlcN或是用另一個化學上有用的基團進行替代的。強的底物特異性必須依賴于保守的20％的氨基酸中的特定氨基酸亞組。對一個或多個這種殘基的特定的改變生成了有功能的合成酶，該合成酶可比天然的酶以較低的特異性與一種或多種底物進行相互作用。然后該改變的酶將利用可選擇的天然或特定的糖核苷酸以整合糖衍生物，該糖衍生物設計為使得不同的化學性質能夠用于下面的目的(i)為了普通或定向的藥物遞送、放射學程序等，使結構上修飾的透明質酸與特定的藥物、蛋白質或毒素共價偶聯；(ii)使透明質酸自身或與其他支持體進行共價偶聯以形成凝膠或其他具有更強的物理特性的三維生物材料，及(iii)使透明質酸與一種表面進行偶聯以形成生物相容性的膜或單分子層。也可對細菌進行基因工程處理以生產透明質酸。例如，我們生成了含有HAS基因以及糖核苷酸前體之一的基因的枯草芽孢桿菌菌株。我們之所以選擇該菌株是因為它經常用于生產人用產物的生物技術工業中。這些細菌想要作為能夠以比現在用野生型天然菌株可獲得的更大量生產透明質酸的細菌世代的第一個世代原型。例如，構建了3個枯草芽孢桿菌菌株以含有透明質素合成酶(spHAS)和UDP-葡萄糖脫氫酶(hasB)的釀膿鏈球菌基因之一或兩者，其結果顯示于表III中。基于對HA進行探測和定量的敏感的商業放射分析測定，可確定具有兩個基因的菌株(#3菌株)生產HA并將其分泌到培養基中。親代菌株或僅有脫氫酶基因的菌株(#1菌株)不生產HA。僅含有spHAS基因的#2菌株生產HA，但僅為#3菌株所生產的約10％。瓊脂糖凝膠電泳顯示由#3菌株分泌到培養基中的HA具有非常高的分子量。表III數據表明枯草芽孢桿菌168可以通過重組DNA技術引入spHAS基因和hasB基因，從而經過基因工程處理而生產和分泌HA。盡管在不引入hasB基因的情況下，該修飾的菌株也能生產HA，但是有了hasB之后，HA的水平會大大提高。枯草芽孢桿菌168含有兩個基因(tauD和gtaB)，它們能夠提高HA合成所需的兩種糖核苷酸的水平。表IV證明當對其進行處理以含有并(在質粒pSM143中，ATCC)表達seHAS以及特定seHAS變體(該變體是進行處理以生產與野生型相比大小不同的HA的)時，枯草芽孢桿菌168也制備HA，即使在hasB基因不存在時。特別地，變體seHAS(C226A)和seHAS(C281A)支持活枯草芽孢桿菌168細胞中的HA合成。這些后一種情況中的HA合成水平比用表達spHAS和hasB基因觀察到的低，這歸因于HA合成所需的兩種前體的較低的內源水平。用從枯草芽孢桿菌168細胞分離的膜的體外試驗證明由這些修飾的HAS酶制備的HA的大小分布分別比由野生型seHAS制備的大和小，其中所述枯草芽孢桿菌168細胞用含有hasB和seHAS(C226A)或seHAS(C281A)變體的質粒進行轉化了。在枯草芽孢桿菌中從野生型seHAS生產的HA的大約大小是1.5MDa。在地衣芽孢桿菌和糞腸球菌(Enterococcus faecalis)中也已證明了重組HA從spHAS基因的生產。圖6是對HA染色的瓊脂糖凝膠的數字圖象。在具有編碼spHAS(pPD41Δ5)的質粒的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和糞腸球菌菌株中可看到HA生產。作為負對照，將含有無功能的hasA基因(pPD41ΔEcoRV)的質粒引入到每一個菌株中，且這些菌株均不能生產HA。
表III含有spHAS和hasB基因的枯草芽孢桿菌168中HA的生產
(*)大多數HA在培養基中但一些是細胞結合的；HA是用購自Pharmacia的HA Test 50試劑盒進行確定的。
表IV枯草芽孢桿菌1 68中生產的透明質素(HA)
使100ml培養物生長過夜；培養基通過購自Corgenix(透明質酸Chugai”)的HA檢驗試劑盒進行分析。這些實驗利用通常與這些基因相連的鏈球菌啟動子以驅動蛋白質表達。人們預期用在革蘭氏陽性的或芽孢桿菌相容的啟動子控制下的spHAS或seHAS讀框構建菌株將產生更好的結果。所用的載體是革蘭氏陽性/大腸桿菌穿梭載體，該載體在枯草芽孢桿菌中具有中等的拷貝數和紅霉素抗性基因(使得在枯草芽孢桿菌中能夠對8μg/ml產生抗性，在大腸桿菌中能夠對175μg/ml產生抗性)。所用的枯草芽孢桿菌宿主菌株是來自BGSC的1A1且可形成孢子，該菌株具有色氨酸需求但在其他方面是野生型的。細胞生長和HA生產是在SpizizensMinimal Media加色氨酸、葡萄糖、痕量元素和紅霉素(8μg/ml)中進行的。在32℃時的劇烈攪拌中進行生長直到培養基耗盡(～36個小時)。表III和IV證明這些進行了生物工程加工的細胞當用spHAS或seHAS基因轉化時能夠生產透明質酸，它們正常時是不能生產的。在此處描述的HAS基因的任何一個也能夠引入到非透明質酸生產性細菌中以生成能夠生產透明質酸的生物工程加工的菌株。當轉向在此處所描述的來自基因組DNA或cDNA的HAS基因之一的表達時，人們可制備用于重組制備HAS蛋白質的表達系統。用于在原核或真核系統中表達的DNA區段的處理可通過重組表達領域中的技術人員通常知道的技術來實現。HAS可成功表達于真核表達系統中，然而本發明者主張細菌表達系統可用于所有目的的HAS制備。人們相信細菌表達最終將在應用的容易性、生產成本和因而獲得的材料的數量方面比真核表達更有利。鏈球菌透明質素合成酶(seHAS)的純化顯示于表V和圖7中。來自純化方案的各個階段的級分是通過在12.5％的凝膠上的SDS-PAGE進行分析的，然后將其用考馬斯亮藍R-250染色。泳道分子量標記；1，含有重組seHAS-H6的大腸桿菌全細胞膜；2，在用去污劑對膜進行增溶后的不溶性級分；3，去污劑增溶的級分；4，從Ni-NTA層析樹脂中流過的；5-9，5次連續的對柱的洗滌(每次以兩倍柱的體積)；10，單一條帶的洗脫的純HA合成酶。spHAS的純化與seHAS所顯示的相同(Tlapak-Simmons，1999)。
表V 人們認為用編碼HAS的DNA區段對宿主細胞的轉化將提供獲得HAS蛋白質的方便方法。人們同樣認為cDNA、基因組序列及其組合適合于真核表達，這是因為宿主細胞當然將對基因組轉錄物進行加工以產生有功能的mRNA進行蛋白質翻譯。本發明的另一個實施方案是制備蛋白質組合物的方法，該方法包含使包含編碼蛋白質的載體的重組宿主細胞生長，該蛋白質包括根據SEQ ID NOS2、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列或具有保守的或半保守的氨基酸變化的功能相似物。宿主細胞將在允許核酸表達和蛋白質生產的條件下生長，隨后對這樣生產的蛋白質進行回收。HAS和最終HA(包括宿主細胞)的生產，允許核酸表達、蛋白質生產和回收的條件按照本公開內容和在此處描述的方法是本領域的技術人員所知的。表達透明質酸的優選的宿主是原核生物，如類馬鏈球菌和其他鏈球菌物種的適當成員。然而，也已知HA可用表達重組HA合成酶的異源宿主細胞來合成，如芽孢桿菌、腸球菌屬(Enterococcus)或甚至埃希氏菌屬(Escherichia)的物種成員。本發明表達HA合成酶最優選的宿主是用本發明的HAS基因轉化的細菌，如乳球菌屬(Lactococcus)物種、枯草芽孢桿菌或大腸桿菌。用于本發明的HA表達方法的最優選的宿主包括芽孢桿菌物種，這是因為這種細胞是有效的工業分泌者，且幾個物種已命名為GRAS生物。可用于本發明的方法的芽孢桿菌細胞的例子包括但不局限于嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、Bacillus clausii、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、Bacillusmetaterium、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。最優選的宿主是枯草芽孢桿菌。相似地，人們相信幾乎任何真核表達系統均可用于表達HAS，如可應用基于桿狀病毒(baculovirus)的、基于谷氨酰胺合成酶的、基于二氫葉酸還原酶的系統、基于SV-40的、基于腺病毒的、基于巨細胞病毒的、基于酵母的等。對于這種方式的表達，人們可以使編碼序列靠近或在啟動子的控制之下。在本領域中可以理解的是為了使編碼序列在這種啟動子的控制之下，人們使蛋白質的轉錄讀框的轉錄起始位點的5’末端位于選擇的啟動子“下游”(即3’)的約1個和約50個核苷酸之間。同樣地，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表達載體系統如pYES2也可在如顯示于圖8中的GAL啟動子的控制之下生產HAS。圖8顯示spHAS或xlHAS酶是用pYES2質粒在重組酵母中表達的。當提供了UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc時，每一種酶都制備高分子量的HA，如在這些凝膠過濾層析曲線中觀察到的(HA峰值在約13ml～約25ml)。圖8表示用表達于酵母膜上的重組HAS合成的透明質酸的凝膠過濾分析。用標準方法將DNA片段亞克隆入pYES2酵母表達載體(購自Invitrogen)中以產生pYES/HA，所述DNA片段編碼(a)相應于spHAS的419個氨基酸殘基的可讀框(最初的Val密碼子變為Met)或(b)x1HAS蛋白質。來自具有該構建體的細胞的膜是通過用玻璃珠攪拌而制備的。源自pYES/HA構建體的樣品含有大量的HA合成酶活性，且“42kDa”的HAS蛋白質是通過用特異性抗體的蛋白質印跡進行探測的；來自僅具有載體的細胞的膜既不具有活性也不具有免疫反應性條帶(未顯示)。使膜(315μg蛋白質)首先與無載體的UDP-[14C]GlcUA(1μCi14C)和900μM未標記的UDP-GlcNAc在50mM pH7的Tris、20mM MgCl2、1mM DTT和0.05M NaCl(450μl反應體積)中于30攝氏度溫育1.5分鐘。在該脈沖標記之后，然后將非放射性標記的UDP-GlcUA添加至終濃度為900μM。樣品(100μL)是在脈沖后于“追蹤(chase)”后的1.5分鐘(深色圓圈)和15分鐘(黑色方形)和45分鐘(黑色三角形)獲取的。該反應是通過添加SDS至2％并于95攝氏度加熱1分鐘而終止的。在將半數樣品注射入在0.2M NaCl、5mMpH8的Tris中平衡的聚丙烯酰胺葡聚糖S-500HR凝膠過濾柱(Pharmacia；1×50cm)中之前用離心(10,000×g，5分鐘)使樣品澄清。該柱于0.5ml/分鐘的速度洗脫，且級分(1ml)中的放射活性是通過在加入了BioSafeII cocktail(4.5ml，ResearchProducts Intl.)之后用液體閃爍計數法進行定量的。孔隙體積和總包含體積(totally included volume)分別在14ml和35.5ml的洗脫體積。藍色葡聚糖的峰值(平均為2×106Da)在25-27ml處洗脫。在真核酵母細胞中表達的重組HAS在體外生成高分子量的透明質酸。當預期真核表達時，人們一般也想要將適當的聚腺苷酸化位點(如5’-AATAAA-3’)插入到包括HAS基因或DNA的轉錄單位中，如果在最初的克隆區段中不含有該聚腺苷酸化位點的話。一般地，使聚腺苷酸化添加位點置于蛋白質終止位點下游約30～2000個核苷酸的位置，并處于轉錄終止子之前。人們預期事實上任何常用的真核宿主細胞可用于根據此處的HAS表達。用于表達本發明的HAS cDNA的優選的細胞系的例子包括一般用于真核表達的細胞系，如293、AtT-20、HepG2、VERO、HeLa、CHO、WI38、BHK、COS-7、RIN和MDCK細胞系。這一般包括提供具有編碼HAS酶的重組DNA區段且能夠表達該酶的重組宿主的步驟；將重組宿主在下面條件下培養于培養基中，該條件使得克隆的HAS基因或cDNA能夠轉錄且適合于透明質酸的生產；及分離和純化HAS酶或從重組宿主中分泌的透明質酸。通常，適合于克隆的HAS基因或cDNA表達的條件將依賴于所應用的啟動子、載體和宿主系統。例如，當人們應用lac啟動子時，人們可以通過引入可刺激lac轉錄的材料如異丙基硫代半乳糖苷而誘導轉錄。例如，克隆的seHAS和spHAS基因是為了如在圖5中所示的純化HAS的目的而在大腸桿菌中表達為含有HIS6的蛋白質的。當應用其他啟動子時，可需要不同的材料以誘導或增量調節轉錄。圖5描述大腸桿菌中重組seHAS和spHAS的過表達。膜蛋白質(每泳道5μg)是用10％(w/v)的凝膠在還原性條件下通過SDS-PAGE進行分級分離的。該凝膠用考馬斯亮藍R-250進行染色、照相、掃描并用molecular dynamics personal densitometer(PDSI P60型號)進行定量。HA合成酶的位置用箭頭標記。泳道A是天然的spHAS(A組)；泳道C是天然的seHAS；泳道E是重組seHAS；泳道P是重組spHAS；泳道V是單獨的載體。所用的標準是Bio-rad的低Mr并以kDa顯示。除獲得合成酶表達之外，人們優選地想要提供有利于HA合成的環境，這是通過引入編碼糖核苷酸前體生物合成所需的酶的適當基因，或者通過使用含有前體提供酶(precursor-supplyingenzyme)的底物的生長培養基而實現的，該底物如N-乙酰葡糖胺或葡糖胺(GlcNAc或GlcNH2)和葡萄糖(Glc)。人們將進一步想要在透明質酸酶缺陷的宿主中整合基因，從而由酶合成的產物將不在培養基中降解。此外，可選擇宿主使HA的生產最適化。例如，適當的宿主是生產大量糖核苷酸前體以支持HAS酶并使得該酶能夠生產大量的HA的。這種宿主可天然地存在，或者可由各種技術包括誘變或重組DNA技術來制備。糖核苷酸合成酶的基因，特別是生產UDP-GlcUA所必需的UDP-Glc脫氫酶也可連同HAS基因或cDNA分離并整合到載體中。本發明的一個優選的實施方案是含有這些輔助的重組基因或cDNA的宿主，因而使得能夠有糖核苷酸及因此的HA的增加的生產。人們相信用于培養宿主細胞的方法不是特別關鍵的。為了有用的細節，人們可以參考美國專利Nos.4,517,295；4,801,539；4,784,990或4,780,414的公開內容，它們均在此處明確地整體引用作為參考。當應用原核宿主如類馬鏈球菌時，人們可能想要在厭氧的條件下在富含CO2的液體生長培養基中使細菌發酵。這使得能夠有比在好氧情況下更大的HA生產。另一個考慮是厭氧生長的鏈球菌細胞不生產致熱性外毒素。適當的生長條件可依照本公開內容對其他的原核宿主進行設定，如本領域的技術人員公知的。一旦已構建了合適的宿主并在適合于HA生產的條件下進行培養，那么人們將想要分離這樣生產的HA。一般地，HA將被分離或由重組生物釋放到周圍的培養基中，從而使得能夠易于用公知的技術從培養基中分離HA。例如，HA可至少通過過濾、離心和絮凝作用之一而從細胞和殘渣中分離，且三氯乙酸的添加可進一步促進細胞和殘渣與透明質酸的分離。然后HA可通過沉淀、超濾和透析的至少一種而從培養基中分離。沉淀劑包括醇如乙醇和異丙醇、有機溶劑或化合物如丙酮或有機(脂族的帶正電荷的)季銨鹽如鯨蠟基氯化吡啶鎓(CPC)或鯨蠟基溴化三銨(CTB)。用于分離HA的優選的技術描述于美國專利No.4,517,295中，該專利在此處引入作為參考，在其中于發酵末期將有機羧酸即三氯乙酸添加到細菌懸浮液中。三氯乙酸導致細菌細胞凝塊并死亡，并促進這季銨鹽些細胞和關聯的殘渣與想要的產物HA分離的容易性。將澄清的上清液濃縮并透析以去除包括有機酸的低分子量的污染物。前述的程序利用通過過濾盒的過濾程序，如那些含有0.22μm孔大小的濾器。繼續滲濾直到溶液的導電性降低到約0.5百萬歐姆。濃縮的HA是通過添加過量的試劑級的乙醇或其他有機溶劑而沉淀的，且沉淀的HA然后通過用乙醇洗滌和真空干燥進行干燥、凍干以去除乙醇。然后HA可再溶解于pH8的硼酸鹽緩沖液中，并用CPC或某些其他的有機銨鹽如一種混合的三甲基溴化銨溶液CETAB于4攝氏度進行沉淀。沉淀的HA是通過粗過濾進行回收的，并重懸于1MNaCl中，如進一步在上文中參考的專利中描述的進行滲濾和濃縮。結果所得的HA是過濾除菌的，并依賴于想要的最終用途易于轉變為適當的鹽、干粉或無菌的溶液。
A.可采用的一般的基因工程方法如果將無強大的細胞膜屏障的細胞用作宿主細胞，那么轉化可通過本領域的技術人員眾所周知的磷酸鈣沉淀方法實現。然而，其他方法也可用于將DNA引入細胞中，如通過核注射、陽離子脂質、電穿孔、原生質體融合或通過由DuPont開發的BIOLISTICTM生物顆粒送遞系統(1989)。使用DuPont系統的優點是高的轉化效率。如果使用原核細胞或含有大量細胞壁結構的細胞，那么優選的轉化方法是用氯化鈣誘導感受態的鈣處理或電穿孔。含有想要的克隆和控制序列的適當的載體的構建應用標準的連接技術。將分離的質粒或DNA片段進行切割、剪切并以想要構建想要的質粒的形式進行再連接。切割是在適當的緩沖液中通過用限制性內切酶處理來實現的。通常，在約20μl緩沖液中約1μg的質粒或DNA片段使用約1單位的酶。用于特定的限制性內切酶的合適緩沖液和底物數量由生產商詳細說明。于37℃約1小時的溫育時間是可用的。在溫育之后，蛋白質通過用酚和氯仿提取而去除，且核酸是通過乙醇沉淀從水相級分中回收的。如果需要平末端，那么將制劑于15℃用10單位的聚合酶I(Klenow)處理15分鐘、進行酚-氯仿提取并用乙醇沉淀。為了連接，約等摩爾量的想要成分(進行了剪切以提供正確配對)用每0.5μg DNA約10單位的T4 DNA連接酶進行處理。當將切割的載體用作成分時，有用的是通過用細菌堿性磷酸酶預處理以防止切割的載體的再連接。對于在構建的質粒中證實功能序列的分析，第一個步驟是通過于30-32℃進行轉化以克隆入特定的感受態大腸桿菌SURE細胞(Stratagene)中而擴增質粒DNA。其次，將重組質粒用于轉化大腸桿菌K5菌株Bi8337-41，該菌株可生產UDP-GlcUA前體，且成功的轉化體是通過適當的抗生素抗性進行選擇的。然后對來自轉化體文庫的質粒進行篩選以獲得展示HA生產的細菌菌落。將這些菌落挑取、擴增，且將質粒用限制酶切作圖進行純化和分析。然后將顯示功能性HAS基因跡象的質粒進一步通過本領域的技術人員公知的許多序列分析技術進行表征。
B.來源和宿主細胞培養物和載體通常，將原核生物用于DNA序列的起始克隆和本發明中有用的載體的構建。人們相信適當的來源為革蘭氏陽性細胞，特別是那些源自C組鏈球菌菌株的。具有單一的膜但具有厚細胞壁的細菌如葡萄球菌(Staphylococci)和鏈球菌(Streptococci)是革蘭氏陽性的。革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌含有兩層不連續的膜，而不是一層圍繞細胞的膜。革蘭氏陰性生物傾向于具有較薄的細胞壁。革蘭氏陽性生物的單一的膜與革蘭氏陰性細菌的內膜類似。通常，將含有源自與宿主細胞相容的物種的復制起點和控制序列的質粒載體與這些宿主一起使用。該載體通常帶有復制起點，以及能夠在轉化的細胞中提供表型選擇的標記序列。例如，大腸桿菌一般用源自一個大腸桿菌物種的質粒pBR322進行轉化。pBR322含有氨芐青霉素和四環素抗性基因，從而提供了鑒定轉化細胞的簡單方法。pBR質粒或pUC質粒或其他微生物質粒或噬菌體也必須含有或經修飾后含有可由微生物用于表達其蛋白質的啟動子。這種啟動子可為異源的啟動子，即來自其他生物的啟動子，只要該啟動子與宿主細胞相容，即該啟動子可被宿主細胞的RNA聚合酶識別，從而RNA聚合酶轉錄宿主相容性啟動子附著的基因。這些最經常用于重組DNA構建體的啟動子包括lacZ啟動子、tac啟動子、T7噬菌體啟動子和色氨酸(trp)啟動子系統。盡管這些是最經常使用的，也已發現并使用了其他的微生物啟動子，且已發表了關于其核苷酸序列的細節，從而使得技術人員能夠將它們功能性地與質粒載體進行連接。此外，該啟動子可為具有增加的啟動子活性的修飾的RNA聚合酶啟動子。對啟動子的修飾可為突變或串聯加入兩個或多個啟動子元件。當以串聯方式提供兩個或多個啟動子元件時，該兩個或多個啟動子元件可為相同的啟動子元件或兩個或多個不同的啟動子元件。如在此處所用的術語“串聯啟動子元件”可理解為指兩個或多個啟動子序列，其中每一個該序列都可操作地連接到編碼序列上，從而該啟動子序列通過介導編碼序列向mRNA的轉錄而指導由編碼序列編碼的多肽的生產。串聯啟動子以及構建體及其在芽孢桿菌細胞表達中的應用詳細描述于美國專利Nos.5,955,310和6,255,076中，該專利分別于1999年9月21日和2001年7月3日授予Widner等人，在此處明確地將其內容整體引入作為參考。此外，當本發明的重組載體含有超過一個核酸區段時，其中每一個區段都具有編碼蛋白質的編碼區，如具有編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區的核酸區段和具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區的核酸區段，則每一個核酸區段均可操作地連接到啟動子上。兩個或多個核酸區段可連接到相同的啟動子上，且該單一的啟動子可驅動兩個基因的表達，或者兩個或多個核酸區段可連接到不同的啟動子上。除原核生物之外，也可使用真核微生物如酵母培養物。釀酒酵母或普通的面包酵母是真核微生物中最普遍使用的，盡管通常許多其他的菌株也是可用的。對于在糖酵母(Saccharomyces)中的表達，例如質粒YRp7是普遍使用的。該質粒已含有trp1基因，該基因提供對無色氨酸時缺乏生長能力的酵母突變菌株的選擇標記，例如ATCC No.44076或PEP4-1。然后作為酵母宿主細胞基因組的特征的trp1損害的存在提供了通過在無色氨酸存在時生長而探測轉化體的有效環境。酵母載體中適當的啟動序列包括半乳糖利用基因、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的啟動子，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構酶、磷酸葡糖異構酶和葡糖激酶。在構建適當的表達質粒中，與這些基因相關的終止序列也連接到表達載體中想要表達的序列的3’以提供mRNA的聚腺苷酸化和終止。其他具有由生長條件控制的轉錄的額外優點的啟動子是乙醇脫氫酶2、細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關的降解性酶類和前文所述的甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶類的啟動子區域。含有酵母相容性啟動子、復制起點和終止序列的任何質粒載體均為適當的。除微生物之外，源自多細胞生物的細胞培養物也可用作宿主。原則上，任何這樣的細胞培養物均為可用的，不論其來自脊椎動物還是無脊椎動物培養物。然而，對脊椎動物具有最大的興趣，且脊椎動物細胞在培養物中的繁殖在最近幾年中已成為常規程序。這種有用的細胞系的例子為VERO和HeLa細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系和WI38、BHK、COS和MDCK細胞系。對于在哺乳動物中的應用，對表達載體的控制功能通常是由病毒材料提供的。例如，常用的啟動子是源自多形瘤、腺病毒2、牛乳頭狀病毒和使用頻率最大的猿猴病毒40(SV40)的。SV40病毒的早期和晚期啟動子是特別有用的，這是因為兩者均易于作為也含有SV40病毒復制起點的片段而從病毒獲得。也可使用較小的或較大的SV40片段，前提是其包括了從HindIII位點延伸到位于病毒復制起點的Bg1I位點的約250bp長的序列。進一步地，也可能且經常想要的是利用通常與想要的基因序列相關的啟動子或控制序列，只要這種控制序列與宿主細胞系統相容。復制起點可通過構建包括外源起點(如源自SV40或其他病毒(如多形瘤、腺病毒(Adeno)、BPV)來源的)的載體來提供，或者通過宿主細胞染色體復制機制來提供。如果載體是整合入宿主細胞染色體中的，那么后一種機制經常是足夠的。
C.真實的HA合成酶從C組類馬鏈球菌的高度被囊化的菌株中的分離。命名為seHAS的編碼的蛋白質具有417個氨基酸(計算的分子量為47,778且PI為9.1)，且是迄今鑒定的HAS家族的最小的成員(圖2)。seHAS在SDS-PAGE中也遷移得異常快(Mr～42kDa)(圖5和9)。圖9是用特異性抗體對重組seHAS的蛋白質印跡分析的圖示。含有重組seHAS(E；泳道2、7和9)或spHAS(P；泳道3、6、8和10)的C組(C；泳道1)或A組(A；泳道4)鏈球菌膜和大腸桿菌膜(9μg/泳道)是通過還原性SDS-PAGE而進行分級分離及轉移到硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜條是如在申請中描述的那樣用純化的IgG組分進行探測和顯影的，該IgG組分是針對下面的spHAS區的中央結構域肽E147-T161(泳道1-4)；C-末端肽(泳道5-6)；完整的蛋白質(泳道7和8)；重組中央結構域(泳道9和10)。來自單獨用載體轉化的細胞的非免疫性IgG或膜不著色，如在泳道5中所示。seHAS和spHAS蛋白質編碼序列(分別為SEQ ID NOS1和13)是72％相同的。推斷的seHAS的蛋白質序列是通過與合成的肽抗體的反應性來證實的(圖9)。在大腸桿菌中表達的重組seHAS是作為主要蛋白質在膜中回收的(圖5)，并在UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA存在時在體外合成了非常大分子量的HA(圖10)。圖10表示對由seHAS和spHAS生產的HA大小分布的動力學分析。含有等量seHAS或spHAS蛋白質的大腸桿菌膜如在申請中描述的與1.35mM UDP-[14C]GlcUA(1.3×103dpm/nmol)和3.0mMUDP-GlcNAc于37℃進行溫育。這些底物濃度大于15倍的各自Km值。對在0.5、1.0和60分鐘獲取的樣品用SDS進行處理并在聚丙烯酰胺葡聚糖S400HR上進行層析。將柱子的分級分離范圍內的HA(組分12-24)曲線標準化為每一組分中總HA的百分數。在頂部圖中箭頭上面的值是用Dawn多角激光散射儀器(Wyatt Technology Corp.)在分離實驗中直接確定的HA的MW(百萬)。由seHAS(●、■、▲)和spHAS(○、□、△)在0.5分鐘(○、●)、1.0分鐘(□、■)和60分鐘(△、▲)合成的HA的大小分布如圖所示。分析顯示seHAS和spHAS在它們合成的HA鏈的大小分布中是基本相同的(圖10)。在制備HA的能力上seHAS是spHAS的兩倍快。
C.1細菌菌株和載體粘液樣C組菌株D181(類馬鏈球菌)是從RockefellerUniversity Collection獲得的.大腸桿菌宿主菌株Sure和XL1-BlueMRF’購自Stratagene，且Top10 F’購自Invitrogen。除非另外注明，鏈球菌生長于THY中，且大腸桿菌菌株生長于LB培養基中。pKK-223表達載體購自Pharmacia，PCR 2.1克隆載體購自Invitrogen，且預消化的λZap Expression TM BamH I/CIAP載體購自Stratagene。
C.2重組DNA和克隆將用Caparon和Scott方法(如本領域的技術人員公知的)從類馬鏈球菌分離的高分子量基因組DNA用Sau3A1進行部分消化為平均大小為2-12 kb。消化的DNA用乙醇進行沉淀、洗滌并連接到BamHI/CIAPλZAP Expression載體上。將連接的DNA用購自Promega的PackageneTM提取物包裝入噬菌體中。包裝的噬菌體文庫的滴度是用XL1-Blue MRF’大腸桿菌作為宿主進行檢查的。
C.3簡并PCR擴增簡并寡核苷酸是基于spHAS(釀膿鏈球菌)、DG42(非洲爪蟾HAS；19)和nodC(苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)結瘤因子；20)中的保守序列設計的，并用于用D181基因組DNA作為模板的PCR擴增。擴增條件為于94℃1分鐘、44℃1分鐘、72℃1.5分鐘進行34個循環，隨后于72℃最后延伸10分鐘。寡核苷酸HADRF15’-GAY MGA YRT YTXACX AAT TAY GCT ATH GAY TTR GG-3’(有義鏈)相應于序列D259RCLTNYAIDL(spHAS)。寡核苷酸HACTR15’-ACG WGT WCC CCA NTCXGY ATT TTT NAD XGT RCA-3’(反義鏈)相應于區域C404TIKNTEWGTR(spHAS)。一些位置的堿基的簡并性由IUPAC采用的命名法以其列于表VI中的簡并堿基編碼代表。
表VI 這兩個寡核苷酸得到了459bp的PCR產物，該產物是在瓊脂糖凝膠上進行分離的并用BI0-101 Geneclean試劑盒進行純化。然后根據生產商的說明書用TOP 10F’細胞作為宿主將該片段克隆入PCR2.1載體中。雙鏈質粒DNA是用QIAfilter Plasmid Midi Kit(Qiagen)從大腸桿菌(TOP 10F’)中純化的。也合成了兩個其他的簡并的有義引物HAVAF1 5’-GTN GCT GCT GTW RTX CCW WSX TWTAAY GAR GA-3’(相應于spHAS的區域V66AAVIPSYNE)和HAVDF1 5’-GTXRWT GAY GGN WSX WSN RAX GAT GAX GC-3’(基于spHAS的V100DDGSSNTD)。基于459bp長的PCR產物序列合成了兩個唯一的反義引物。它們是D181.2 5’-GAA GGA CTT GTT CCA GCG GT-3’和D181.4 5’-TGA ATGTTC CGA CAC AGG GC-3’。當與D181.2或D181.4一起用于擴增D181基因組DNA時，兩個簡并有義引物的每一個都可以得到預期大小的PCR產物。將4個PCR產物用與上文相同的策略進行克隆和測序。對于每一個PCR產物，對從6個不同克隆中獲得的序列進行比較以得到一致序列。因而我們獲得了與spHAS具有高度同源性的具有連續ORF的1042 bp長的序列。
C.4文庫篩選將兩個分子探針用于篩選文庫克隆的459bp長的PCR產物和寡核苷酸D181.5(源自1042bp長序列的5’-GCTTGATAGGTCACCAGTGTCACG-3’)。將459 bp長的PCR產物根據生產商的說明書用Prime-It 11隨機引物標記試劑盒(Stratagene)進行放射性標記。寡核苷酸是通過Kinace-It Kinasing Kit(Stratagene)用[λ32P]ATP進行標記的。將放射性標記的產物在NucTrap Push柱(Stratagene)上從非標記材料中分離。寡探針特異性地與D181基因組消化物在DNA印跡中進行雜交。為了篩選λ噬菌體文庫，將XLBLUE MRF’用作含有吸附的噬菌體的硝酸纖維素膜上的宿主(3000噬斑/平板)，于60℃進行預雜交，并根據說明書于80℃在QuikHyb雜交溶液(Stratagene)中與5’-末端標記的寡核苷酸D181.5進行雜交。然后將膜于室溫用2×SSC緩沖液和0.1％(w/v)的SDS洗滌15分鐘，于60℃用0.1×SSC緩沖液和0.1％的SDS(w/v)洗滌30分鐘，干燥并然后于-70℃對Bio-Max MS膜曝光過夜。將陽性噬斑再次平板培養并再篩選兩次。純的陽性噬菌體保存于具有氯仿的SM緩沖液中。用載體引物在這些噬菌體上的PCR揭示了3個不同大小的插入體。用載體引物和來自克隆的1042bp長的序列的不同區域的引物組合揭示3個不同的噬菌體中只有一個具有完整的HA基因。該噬菌體中的插入體大小為6.5kb。通過來自選擇的噬菌體文庫克隆的自身切除將插入物亞克隆入質粒形式的嘗試失敗了。因此，在純的陽性噬菌體DNA上再次采用PCR策略以獲得ORF的5’和3’末端。寡核苷酸引物D181.3(5’-GCCCTGTGTCGGAACATTCA-3’)和T3(載體引物)擴增了3kb長的產物，且寡核苷酸D181.5和T7(載體引物)擴增了2.5kb長的產物。ORF的5’和3’末端序列是通過對上述這兩個產物的測序獲得的。對所有PCR產物序列的分析使得我們能夠重構1254bp長的seHAS基因的ORF。
C.5seHAS的表達克隆引物是在seHAS的起始和終止密碼子區域進行設計的，從而在有義寡核苷酸(5’-AGGATCCGAATTCATGAGAACATTAAAAAACCTC-3’)中含有EcoR I限制位點而在反義寡核苷酸(5’-AGAATTCTGCAGTTATAATAATTTTTTACGTGT-3’)中含有Pst I位點。這些引物從D181基因組DNA以及純的雜交陽性噬菌體中擴增了1.2kb長的PCR產物。將該1.2kb長的產物用瓊脂糖凝膠電泳進行純化，用Pst I和EcoR I進行消化并定向克隆入Pst I-和EcoR I-消化的pKK223載體中。將連接的載體轉化入大腸桿菌SURE細胞中，然后使該細胞在30℃進行生長。該步驟實際上是重要的，這是因為其他宿主細胞或高溫導致克隆的插入物的缺失。將菌落分離并純化其pDNA。在6個菌落中(名為a、b、c、d、e和f)，5個具有正確大小的插入物，而1個無插入物。
C.6HA合成酶活性HA合成酶活性是在從5個上述克隆制備的膜上進行測定的。將新鮮的對數期細胞于3000g收獲、于4℃用PBS洗滌，且將膜通過本領域的技術人員公知的原生質體方法的修改方法進行分離。來自釀膿鏈球菌和類馬鏈球菌的膜制劑也通過不同原生質體方法的修改方法而獲得。將膜于37℃在50mM pH7.0的磷酸鈉和鉀中與20mMMgCl2、1mM DTE、120μM UDP-GlcUA和300μM UDP-GlcNAc進行溫育。糖的整合是用UDP-[14C]GlcUA(318mCi/mmol；ICN)和/或UDP-[3H]GlcNAc(29.2Ci/mmol NEN)進行監控的。反應是通過加入SDS至終濃度為2％(w/v)而終止的。產物HA是通過下行紙層析從前體分離的并通過在起始時確定整合的放射性而測量。
C.7凝膠過濾分析用含有重組seHAS或spHAS的膜在體外生產的放射性標記的HA是通過在聚丙烯酰胺葡聚糖S500 HR(Pharmacia Biotech Inc.)的柱(0.9×40cm)上的層析進行分析的。樣品(0.4ml于200mM NaCl、5mM pH8.0的Tris-HCl加0.5％SDS中)是用200mM NaCl、5mM的Tris-HCl進行洗脫的，并將pH8.0的0.5ml級分進行14C和/或3H放射性的測定。HA多糖的真實性是通過用 Streptomyceshyalurolyticus的HA-特異性透明質酸裂解酶(EC 4.2.2.1)于37℃對獨立的相同樣品處理3個小時而測定的。然后將消化物進行凝膠過濾。
C.8 SDS-PAGE和蛋白質印跡SDS-PAGE是根據Laemmli方法進行的。向硝酸纖維素的電轉移是用Bio-Rad mini Transblot儀器用20％的甲醇在標準印跡緩沖液中進行的。該印跡用TBS中的2％BSA進行封閉。將蛋白質A/G堿性磷酸酶綴合物(Pierce)和對氮藍四唑/5-溴-4-氯-3吲哚磷酸對甲苯胺用于探測。
C.9 DNA測序和分析質粒是用熒光標記的載體引物在兩條鏈上進行測序的。測序反應是用熒光標記的引物(用7-脫氮G)的ThermosequenaseTM試劑盒進行的。樣品在Pharmacia ALF Express DNA Sequencer上進行電泳，且數據用ALF Manager軟件v3.02進行分析。插入物的內部區域是用ABI Prism 377以內部引物進行測序的(軟件版本2.1.1)。不明確的區域是用SequenaseTM7-脫氮-DNA聚合酶、7-脫氮GTP mastermix(USB)和[α-35S]dATP(Amersham Life Sciences)進行人工測序的。將獲得的序列用DNASIS v2.1(Hitachi Software EngineeringCo.，Ltd.)進行匯編和分析。將核苷酸和氨基酸序列與Genbank和其他的數據庫中的其他序列進行比較。
C.10seHAS的鑒定seHAS的鑒定是用PCR方法實現的，該PCR方法具有基于spHAS、DG42(現在已知為發育調節的非洲爪蟾HAS并命名為xlHAS)和NodC(根瘤菌β-GlcNAc轉移酶)中高度一致性的幾個區域的寡核苷酸引物。XlHAS和NodC蛋白質分別與spHAS具有～50％和～10％的一致性。該策略得到了459 bp長的PCR產物，其序列與spHAS具有66.4％的一致性，顯示已鑒定了A組(spHAS)HA合成酶基因的C組同系物(seHAS)。然后將該基因的完整編碼區用相似的基于PCR的策略進行重構。然后將最終一套PCR引物用于從基因組DNA中擴增完整的ORF。當將1.2kb長的PCR片段插入到表達載體pKK223中并轉化入大腸桿菌SURE細胞中時，在來自5個檢驗的菌落中的分離膜中證實了HA合成活性。重構的基因的ORF編碼417個氨基酸的預測的新蛋白質，該蛋白質未在數據庫中且比spHAS短2個氨基酸。兩個細菌蛋白質具有72％的一致性，且核酸序列具有70％的一致性。seHAS蛋白質的預測分子量是47,778，且預測的等電點為pH9.1。最近鑒定的哺乳動物HAS如小鼠和人同工酶(在圖2中分別為mHAS1、2、3和hHAS1、2、3)與細菌蛋白質相似。兩組之間的總一致性為～28-31％，且此外seHAS中的許多氨基酸與那些真核的HAS是高度保守的(如K/R或D/E替代)。PBCY-1 HAS即A98R與哺乳動物HAS具有28-33％的一致性，并預測在脂質膜上具有相似的拓撲學。在哺乳動物物種中，相同科的成員是幾乎完全相同的(如muHAS1和huHAS1是95％相同的；muHAS2和huHAS2是98％相同的)。然而，如圖3所示，即使在相同的物種中，不同的HAS家族成員也是相當不同的(如muHAS1和muHAS2是53％相同的；muHAS1和muHAS3是57％相同的；muHAS2和muHAS3是71％相同的)。圖11顯示seHAS的親水性圖和預測的膜拓撲學。鏈球菌C組HAS的親水性圖是由Kyte和Doolittle的方法(J.Mol.Biol.157，105，1982)用DNASIS生成的。該蛋白質據預測為整合膜蛋白質。圖12顯示膜中seHAS的拓撲學組織的模型。所提出的蛋白質拓撲學遵守進料(charge-in)規則，并使大的中央結構域置于內部。該結構域可能含有酶的大多數底物結合和催化功能。在所有HAS家族成員中保守的seHAS中的Cys226以及其他3個半胱氨酸顯示于中央結構域中。Cys281是關鍵的殘基，其改變可巨大地改變由酶合成的HA產物的大小分布。對seHAS預測的總體膜拓撲學與迄今報道的對spHAS和真核HAS預測的相同。該蛋白質在氨基末端具有兩個推定的跨膜結構域，且在羧基末端具有2-3個膜結合或跨膜結構域。兩個鏈球菌酶的親水性圖幾乎是相同的，并闡明了在預測seHAS中K313-R406(spHAS中K313-K405)的～90個殘基的極度疏水區域的拓撲學中的困難。seHAS在大腸桿菌細胞中是有效表達的。如由SDS-PAGE凝膠染色測定的，大約10％的總膜蛋白質是seHAS(圖5)。42kD的顯著的seHAS條帶在僅有載體的對照泳道中是基本缺失的。在SURE細胞中用相同的載體，對于spHAS也發現膜蛋白質這一異常高水平的表達。大腸桿菌SURE細胞中約8％的膜蛋白質是spHAS。相反地，C組膜中seHAS的量不超過總膜蛋白質的1％。A組膜中的spHAS幾乎不能被探測到。在大腸桿菌SURE細胞中表達的重組seHAS在體內不合成HA，這是因為這些細胞缺失必需底物之一UDP-GlcUA。然而，含有重組seHAS蛋白質的膜在提供底物UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA時合成HA(圖13)。圖13表示由重組seHAS對真實HA的合成。將從含有重組seHAS或單獨載體的細胞制備的大腸桿菌膜(69μg)于37℃與700μMUDP-[3H]GlcNAc(2.78×103dpm/nmol；□、■) 和300μMUDP-[14C]GlcUA(3.83×103dpm/nmol；○、●)在此處描述的200μl終體積中溫育1個小時。酶反應是通過加入EDTA至25mM的終濃度而終止。將反應混合物的一半用鏈霉菌透明質酸酶于37℃處理3小時。將SDS(2％，w/v)加入到透明質酸酶處理的(○、□)和未處理的(●、■)樣品中，該樣品于90℃加熱1分鐘。將該樣品用柱緩沖液(5mMTris、0.2M NaCl，pH8.0)稀釋到500μl，用離心使其澄清并將200μl注射入聚丙烯酰胺葡聚糖S-500HR柱中。收集級分(1ml)并確定放射性。BD是藍色葡聚糖(～2×106DA；Pharmacia)的峰值洗脫位置。V0標記孔隙體積，且V1標記內體積(included volume)。整合到柱中分級分離的HA的總量中的[14C]GlcUA[3H]GlcNAc比例是1.4，該比例與兩種底物的特異性活性比例相同。因此，整合到產物中的糖的摩爾比例是如對真實的HA預測的1∶1。來自用單獨載體轉化的細胞的膜不合成HA。使用120μM UDP-GlcUA和300μM UDP-GlcNAc，HA合成相對于膜蛋白質是線性的(在≤0.2μg時)且這種線性維持至少1個小時。同樣地，從未轉化的細胞或用載體單獨轉化的細胞制備的膜不具有可探測的HAS活性。如果Mg+2與EDTA螯合(＜對照的5％)或如果缺失了兩種底物之一(對照的～2％)，那么HA合成是沒有的。重組seHAS也顯示對糖核苷酸底物的預期的特異性，不能夠使UDP-GalA、UDP-Glc或UDP-GalNAc之一與兩種正常底物之一共聚合(表II)。根據凝膠過濾分析，在分離的膜中由seHAS合成的HA的平均質量為5-10×106Da。基于兩種糖的等摩爾整合及其對特定的鏈霉菌透明質酸酶降解的敏感性，可以斷定重組seHAS的產物是真實的HA(圖13)。盡管對于總體HA合成的條件不是最適的(因為一種底物的～90％整合到產物中)，但該酶產生了HA鏈長度的廣泛分布。峰值級分相應于7.5×106Da的HA物質，該HA物質是含有約36,000個單聚糖的多聚體。在該柱子上分解的HA大小的分布范圍為2-20×106Da。推定的seHAS的蛋白質序列是通過spHAS蛋白質的抗體與C組蛋白質的交叉作用的能力證實的(圖9)。全長spHAS蛋白質或僅僅spHAS的中央結構域的多克隆抗體也與seHAS蛋白質相互作用。針對spHAS的C-末端的抗肽的抗體不與seHAS蛋白質中這一有些趨異的區域相互作用。然而，抗spHAS序列E147-T161的抗肽抗體識別seHAS中相同的預測序列。該抗肽抗體也與鏈球菌膜中的天然seHAS和spHAS蛋白質反應，并證實來自兩個物種的天然和重組酶具有相同的大小。如同spHAS蛋白質，seHAS在SDS-PAGE上遷移異常地快。盡管計算質量為47,778Da，由SDS-PAGE所得的Mr一致地為～42kDa。由于其中央結構域區域中的序列一致性和對兩種細菌酶預測的總體一致的結構，抗區域E147-T161的肽特異性抗體可用于在膜中使HAS蛋白質的表達標準化，該膜從用兩種不同酶的基因進行轉化的細胞制備。利用這種方法，將具有基本相同量的重組spHAS或seHAS的膜進行關于HA合成的起始速率和HA產物的大小分布的比較。如對于spHAS所顯示的，HA鏈由HAS的合成是持續的。該酶表現為與生長的HA鏈結合，直到該鏈作為終產物釋放。因此，可能的是在第一輪HA鏈合成中，通過監控在早期生產的HA鏈的大小分布而比較由seHAS和spHAS使HA延伸的速率。基于不同時間對HA產物大小的凝膠過濾分析，我們估計由seHAS延伸的平均速率在37℃為約9,000個單糖/分鐘(圖10)。在5分鐘內，該酶可聚合5-10×106Da的HA鏈。因此在60分鐘的溫育中，每一個酶分子能夠起始、完成并釋放5-8個這樣的大HA分子。在早期(如≤1分鐘時)，作為第一條HA鏈延伸的反映，由seHAS合成的HA的大小與spHAS相比更大。在60分鐘時，HA產物大小的兩種分布不可區別。克隆的seHAS代表真實的C組HA合成酶。因此前面報道的或公開的℃組”蛋白質不是真正的C組HAS。seHAS蛋白質與來自細菌、脊椎動物和病毒的9種目前已知的HA合成酶同源，這些合成酶組成該快速增長的HA合成酶家族。該同源性特別地顯示于圖2中。在哺乳動物中，3個命名為HAS1、HAS2和HAS3的基因已得到鑒定并定位到人和小鼠的3個不同的染色體上。在兩棲動物中，迄今鑒定的唯一的HAS蛋白質是發育調節的DG42，該蛋白質于1988年克隆且現在通過在酵母膜中重組蛋白質的分析已知其編碼HA合成酶活性。可能其他非洲爪蟾的HAS基因將很快被鑒定。趨異的進化模型表明原始的細菌HAS前體可能在脊椎動物發育的早期被侵占了，或者當原始細菌捕獲了原始的HAS時細菌制備HA被膜的致病策略得到發展。細菌和真核HAS酶向共同結構的趨同進化似乎是不可能的，但也許已發生。至少10個鑒定的HAS蛋白質預測為具有相似拓撲學的膜蛋白質。HA合成發生于質膜上，且HA或者釋放入培養基中或者保持與細胞結合以形成細菌被膜或真核細胞外周被膜。胞質中的糖核苷酸底物用于組裝HA鏈，該HA鏈通過膜伸出到外周空間。HAS蛋白質的極其疏水的羧基部分的蛋白質拓撲學在理解該酶如何同時在生長的HA鏈從膜伸出時使其延伸中是關鍵的。例如，空前的酶活性可能需要蛋白質與脂雙層的異常且復雜的相互作用。基于spHAS-堿性磷酸酶融合蛋白質分析的初步結果顯示氨基和羧基末端及大的中央結構域均為細胞內的，如圖11和12所示。seHAS蛋白質也含有大的中央結構域(為總蛋白質的～63％)，該結構域似乎含有兩個底物結合位點和HA合成所需的兩種糖基轉移酶活性。盡管目前的軟件程序不能可靠地預測長的C-末端疏水區段中的膜結合結構域的數目和特性，但所提出的拓撲學組織與目前的證據一致，且也適用于真核的酶，該真核的酶主要由于蛋白質的C-末端2個預測的額外跨膜結構域的延伸而大～40％。spHAS中6個Cys殘基的4個是與seHAS保守的。僅有spHAS中的Cys225和seHAS中的Cys224是在HAS家族的所有成員中保守的。由于巰基反應試劑如對苯甲酸汞(p-mercurobenzoate)或NEM極大地抑制HAS活性，可能的是該保守的Cys是酶活性必需或重要的。然而，來自定點誘變研究的最初結果顯示spHAS的C225S突變體不是無活性的，它保持了野生型活性的5-10％。用特異性的寡核苷酸對僅編碼seHAS、僅編碼spHAS或編碼seHAS和spHAS兩者的核酸序列的識別顯示于圖14中。基于SEQ IDNO1的序列和spHAS的編碼序列設計了3對有義-反義寡核苷酸。基于seHAS的核酸區段(分別為se1-se2和sesp1-sesp2，SEQ ID NOS3-6)顯示于圖15中。使這3個寡核苷酸對在一般的PCR反應條件下與基因組DNA進行雜交，該基因組DNA來自C組(seHAS)(泳道2、4和6)或A組(spHAS)(泳道3、5和7)鏈球菌。泳道1和8以kb(千堿基)顯示MW標準的位置。PCR反應用Taq DNA聚合酶(來自Promega)進行如下25個循環94攝氏度1分鐘以實現DNA變性、48攝氏度(對于較小的通用sesp引物為42攝氏度)1分鐘以使得能夠雜交、72攝氏度1.5分鐘以進行DNA合成。然后將PCR反應混合物通過在1％瓊脂糖凝膠上的電泳而進行分離。se1-se2引物對設計為對C組HAS(seHAS)具有唯一的特異性。sp1-sp2引物對設計為對A組HAS(spHAS)具有唯一的特異性。sesp1-sesp2引物對設計為可與A組和C組HAS核酸序列兩者進行雜交的。所有3個引物對均如預期地起作用，從而顯示相互雜交及支持特異性的和/或唯一的PCR產物生成的適當能力。用于特異性PCR或雜交的寡核苷酸顯示于圖15中。對于SEQ ID NOS3、4、5和6的合成寡核苷酸的每一個均顯示了SEQ ID NO1的相應區域。該4個寡核苷酸的每一個均將特異性地與seHAS序列雜交，且適當的有義/反義引物對適合用于如在圖14中所示的聚合酶鏈反應。在枯草芽孢桿菌中seHAS的表達圖16A和16B證明來自枯草芽孢桿菌菌株枯草芽孢桿菌168中的seHAS的重組HA生產，如由凝膠過濾層析所證實的。圖1 6A是用單獨的pSM143載體轉化的枯草芽孢桿菌168中HA生產與用含有seHAS的pSM143轉化的枯草芽孢桿菌168進行比較的圖。HA的生產可通過約13.5分鐘～約16分鐘之間的峰值來顯現。圖16B是該峰值的放大以忽略由未整合到HA中的放射性標記的蛋白質和糖導致的大峰值，該峰值可在圖16A中于約16.5分鐘～約20分鐘之間看到。在枯草芽孢桿菌中對由spHAS的重組HA生產的凝膠過濾分析圖17A證明枯草芽孢桿菌中由spHAS生產的重組HA大小分布的營養控制。編碼spHAS酶的枯草芽孢桿菌168(pPD41Δ5)培養于Luria Bertani液體培養基(LB)中，其生產的HA在比培養于Spizzizens培養基(Sp)中的相同菌株(峰值在約14.43分鐘)更早的時間點(峰值在13.48分鐘)從凝膠過濾柱上洗脫。這兩種培養物是平行生長的，但更大的HA是由生長于LB中的細菌生產的。含氚的HA的放射性是由每秒的裂變(DPS)來定量的。陰性對照顯示枯草芽孢桿菌通常不生產HA。由用spHAS轉化的枯草芽孢桿菌得到的HA峰值對特異性的HA裂解酶敏感但不對蛋白酶敏感。因此，人們可通過改變宿主細胞所生長的培養基而改變在重組宿主細胞中生產的HA的分子量。例如，與在化學確定成分培養基如Spizzizens培養基或M9基本培養基中生長的重組宿主細胞生產的HA相比，通過使重組宿主細胞在復合培養基中生長可生產更大分子量的HA分子，如LB(Luria Bertani)、Terrific Broth、NZCYM、SOB、SOC或2xYT培養基。HA的大小也可通過提供的碳源如葡萄糖而改變。圖17B顯示當利用含有spHAs的枯草芽孢桿菌168和含有單獨載體的枯草芽孢桿菌時在峰值中的差異。將在用3H葡糖胺對枯草芽孢桿菌進行體內標記之后獲得的培養基樣品通過凝膠過濾進行分析。通過利用該方法，可能確定由細菌生產的透明質酸(HA)的相對大小和量。所有樣品在進行凝膠過濾之前通過16,000×g離心5分鐘而澄清。放射性成分是用LB508Radioflow Detector(EG & G Berthold)和Zinsser cocktail(1.8ml/min)探測的。多聚物的大小是通過在Phenomenex PolySep-GFC-P 5000或6000柱(300×7.8mm)上的層析進行分析的，該柱在Waters 600E系統上以0.2M硝酸鈉在0.6ml/min進行洗脫。該柱是用各種大小的葡聚糖(580、145、50和20kDa)或具有平均分子量為600和80kDa的MANT-標記的HA(DeAngelis，2001)通過MALLS進行標準化。對于MALLS，首先將HA多聚物(100μg)加載到兩個串聯Toso BiosepTSK-GEL柱(6000PWXL伴隨4000PWXL；每一個7.8mm’30cm；日本)上并在pH7的50mM磷酸鈉、150mM NaCl中于0.5ml/min進行洗脫。使洗脫液以多角度的模式流經Optilab DSP干涉度量折光計，然后流經Dawn DSF激光光度計(632.8nm；Wyatt Technology，SantaBarbara，CA)。生產商的軟件包用于用0.153的dn/dC系數確定絕對平均分子量。HA標準是通過用N-methylisatonic anhydride對鏈球菌HA多糖上的羥基基團進行亞化學計量標記(1MANT/～50個單糖)而制備的。600kDa的標準是通過用制備級HPLC通過對大批HA的分級分離而獲得的。對大批HA用具有microtip的HeatSystems-Ultrasonic W-380超聲波儀(電源設置4)進行延長的超聲處理(總時間30分鐘，2分鐘間隔時間，1％丙酮水溶液，冰溶)以生產80kDa的標準。多殺巴斯德氏桿菌HAS的異源表達pPm7A插入物中的PmHAS ORF是用Taq聚合酶(Fisher)和引物的13個循環的PCR進行擴增的，該引物相應于靠近推定的氨基和羧基末端的序列(密碼子為大寫有義的，5’-gcgaattcaaaggacagaaaATGAAcACATTATCACAAG-3’，和反義的，5’-gggaattctgcagttaTAGAGTTATACTATTAATAATGAAC-3’；起始和終止密碼子分別為粗體)。對密碼子2(T到C)進行了改變(斜體小寫字母)以增加大腸桿菌中蛋白質的生產。該引物也含有FcoR I和PstI限制位點(下劃線的)以促進向表達質粒pKK223-3中(tac啟動子，Pharmacia)的克隆。將結果所得的重組構建體pPmHAS轉化入大腸桿菌SURE細胞(Stratagene)中，并將該菌株用作體外HAS測定的膜制劑的來源。將對數期培養物(LB液體培養基，30℃)在收獲前用0.5mM的異丙基硫代半乳糖苷誘導3個小時。將該質粒也轉化入大腸桿菌K5中；對結果所得的菌株用光學顯微鏡和浮力密度離心進行被膜存在是否的鑒定。K5細菌培養物常規地不受誘導，這是因為IPTG的加入不顯著地增加LB或確定成分培養基中HA的水平。K5細菌是有用的外源宿主，這是因為它們含有在HA合成中與pmHAS相互作用的多糖轉運蛋白質和機制；這些蛋白質促進HA向細胞外的轉運。源自含有pPmHAS質粒的大腸桿菌SURE細胞的膜而不是源自僅單獨具有載體pKK223-3的細胞的樣品，當提供了兩種UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc時可在體外合成HA(分別為25vs.*1.5pMol GlcUA轉移[mg蛋白質]-1[小時]-1)。如果省略了UDP-GlcNAc或如果二價金屬離子用EDTA螯合時，觀察不到[14C]GlcA的整合。源自重組HAS的HAS活性與從野生型多殺巴斯德氏桿菌膜中獲得的酶相似，這是由于Mn2+比Mg2+刺激了至少多10倍的活性。利用標記的HA結合蛋白質也對重組大腸桿菌培養物用放射分析測定進行了HA多糖存在性的檢驗。具有pPmHAS的大腸桿菌K5產生了每A600為460μg/ml的HA)。具有單獨的pKK223-3載體的K5細胞不產生HA(*每A600為0.01μg/ml的HA)。作為比較地，生長于相同培養基上的野生型多殺巴斯德氏桿菌P-1059產生了每A600為1,100μg/ml的HA。具有pPmHAs的大腸桿菌K5產生了這樣高水平的HA從而細胞變成被囊化的了(圖18A)。重組菌株的被膜的半徑為～0.2-0.5μm(假設細菌細胞的寬度為0.5μm)。該被膜可通過用綿羊睪丸透明質酸酶或鏈霉菌HA裂解酶進行處理而去除(圖18B)。天然的K5宿主菌株或含有pKK223-3載體的轉化體均不具有由光學顯微鏡確定的易于觀察的被膜。通過浮力密度離心也相信具有pPmHAS的K5細胞是被囊化的。重組細胞浮在58％的Precoll墊層的頂部，而載體對照細胞或透明質酸酶處理的重組細胞經過Percoll墊層而沉淀(未顯示)。被膜生物合成過程中糖基轉移酶在轉運中的作用糖基轉移酶催化重復的GAG主鏈的形成，但是在某些情況中，這些相同的多肽也可在多聚物經過細胞膜的轉運中起作用。革蘭氏陽性的A和C組鏈球菌僅具有一層脂膜，且被膜操縱子編碼合成酶和UDP-GlcUA生產的兩種酶UDP-葡萄糖脫氫酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(～4千堿基的DNA；Crater和van de Rijn，1995)。對一系列含有報道酶的鏈球菌spHAS融合蛋白質的拓撲學分析顯示該合成酶至少跨過雙分子層4次且密切地與膜相聯(Heldermon等人，2001)(圖19)。根據生物化學和生物物理學分析，由spHAS或seHAS多肽單體和～16個脂質分子組成的復合物可催化兩種UDP-糖向新生的HA鏈的轉移(Tlapak-Simmons等人，1998)。人們推測小的膜內在多肽spHAS或seHAS需要脂質的輔助以促進生長的HA多聚物鏈通過生成蛋白質/脂質核心而跨過疏水核心的轉運。另一方面，能夠進行GAG生物合成的革蘭氏陰性細菌大腸桿菌和多殺巴斯德氏桿菌具有兩層脂膜，且其被膜座位編碼除糖基轉移酶和UDP-GlcUA形成酶之外的許多轉運相關蛋白質(～10-18千堿基；Roberts，1996；Townsend等人，2001)。盡管許多細節尚未完全理解，但在最充分研究的模型大腸桿菌II組被膜系統中，看來新生多聚物鏈的轉運需要由至少7個不同的多肽種類組成的裝置(Whitfield和Roberts，1999；Silver等人，2001)。簡單地說，含有KpsC、M、S、T的復合物在內膜進行裝配并與KfiA、B、C催化復合物相互作用。KpsM和T形成ATP-結合型盒式(ABC)轉運蛋白。周質蛋白質KpsD和另一種膜蛋白質KpsE的二聚體有助于將多聚體轉運過周質間隙(Arrecubieta，2001)。在外膜上招募了孔蛋白復合物以將生長的多糖鏈轉運出細胞。某些Kps突變體使被膜多糖鏈多聚化，但具有錯誤的轉位，結果導致胞質或周質中多聚體的積聚。基于其推定的轉運蛋白質與大腸桿菌蛋白質的序列相似性和基因組織，同樣認為多殺巴斯德氏桿菌具有類似II組的轉運系統。在pmHAS和pmCS的情況中，羧基末端尾巴可能含有與轉運機制相互作用的停靠(docking)區段(Jing和DeAngelis，2000)(圖19)，在此處明確地整體引入作為參考。乳房鏈球菌HAS圖21闡明來自乳房鏈球菌的4個獨立的粘液樣菌落的HAS基因的PCR擴增。對于每一個樣品，在約1.25kb長的預期大小處有明顯的條帶，該條帶相應于suHAS的完整讀框加通過PCR擴增加入的限制位點。圖22闡明來自釀膿鏈球菌、類馬鏈球菌和乳房鏈球菌的HA合成酶活性。其他鑒定的HAS序列除已在此處公開的且在圖2中的比對中闡明的HAS序列之外，也鑒定了其他HAS序列，該序列可用于在本發明的芽孢桿菌物種中生產HA的方法。例如，SEQ ID NOS15和16分別公開了在古細菌硫磺礦硫化葉菌中發現的HA合成酶的核苷酸和氨基酸序列。由于其在高溫下即約75℃發揮功能的能力，該HA合成酶從嗜極端菌中(extremophile)的分離提供了具有比在此處前文中描述的HA合成酶更好的穩定性和更快的動力學的HAS。與鏈球菌hasABC操縱子相似的一組基因已在炭疽芽孢桿菌質粒pXO1中鑒定，該質粒含有炭疽毒素基因。然而，pXO1中基因的順序為A、C、B。pXO1質粒的完整序列在訪問號No.AF065404下，且與hasA相似的序列是該序列的ORF 93，其起始于111374而終止于112474。SEQ ID NOS17和18分別代表與在炭疽芽孢桿菌pXO1中鑒定的hasA相似的基因的核苷酸和氨基酸序列。在炭疽芽孢桿菌中沒有多糖被膜的報道，因此，鑒定這些基因的研究小組Okinaka等人相信pOX1 ORF 93、94和95是仍然必須被拋棄的無功能基因的例子(J.Bacteriol.1816509(1999))。在可感染褐藻Ectocarpus siliculosus的病毒中已鑒定了第三個推定的HAS。氨基酸和核苷酸序列分別列于SEQ ID NOS19和20中。該情況可能與PBCV-1病毒的cvHAS相似。一個證明任何推定的HA合成酶的HA合成酶活性(天然的或重組的)的方法包括使細菌生長于液體培養基中、提取多糖級分(即陽離子去污劑沉淀/高鹽提取/醇沉淀/再溶解于水中/溶劑提取/醇沉淀)及在酸水解之后進行單糖成分的分析。進一步的分析包括完整多聚物和酶(HA裂解酶、軟骨素酶(chondroitinase)等)處理的樣品的瓊脂糖凝膠電泳。同樣地，在ELISA或競爭形式用特異性HA結合蛋白質的生物學測定是有用的。為對酶進行檢驗，從細胞中制備了膜，提供了各種UDP-糖，然后分析了向多聚物的整合，隨后進行層析和/或電泳。通過用PCR和引物與基因組DNA制備使得能夠將ORF克隆入表達載體的基因盒，觀察到了異源表達。各種宿主均可用這種載體進行轉化，且可對結果所得的重組細胞進行在此處前文描述的多糖和/或酶的分析。因而應該明顯的是已經根據本發明提供了重組宿主細胞，該細胞具有在其中引入的編碼酶活性HAS的編碼區的純化核酸區段，以及從重組宿主細胞生產透明質酸的方法，該方法完全滿足在上面提出的目的和優點。盡管本發明已與其特定的實施方案一起進行了描述，但明顯的是許多改變、修飾和變化對于本領域的技術人員將是明顯的。因此，在附加的權利要求中想要包含所有這些在附加的權利要求的精神和廣泛范圍內的改變、修飾和變化。
在本申請中提出的所有數字和數量測量(包括在實施例和權利要求中的)均為近似值。
在此處說明性地公開和申請專利的本發明可適當地在不存在任何沒有在此處特定地公開或申請專利的元件時進行實踐。因而，本發明可包含在此處公開或申請專利的元件、由其組成或基本由其組成。
下面的權利要求在符合本申請的情況下具有盡可能寬的范圍。該權利要求不必限于優選的實施方案或在實施例中顯示的實施方案。
序列表<110>Weigel，Paul HKumari，KshamaDeAngelis，Paul<120>透明質素合成酶基因及其在枯草芽孢桿菌中的表達<130>3554.078wo<150>60/297,744<151>2001-06-13<150>60/297,788<151>2001-06-13<150>09/469,200<151>1999-12-21<150>09/178,851<151>1998-10-26<160>20<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1254<212>DNA<213>類馬鏈球菌<400>1atgagaacat taaaaaacct cataactgtt gtggccttta gtattttttg ggtactgttg60atttacgtca atgtttatct ctttggtgct aaaggaagct tgtcaattta tggctttttg120ctgatagctt acctattagt caaaatgtcc ttatcctttt tttacaagcc atttaaggga180agggctgggc aatataaggt tgcagccatt attccctctt ataacgaaga tgctgagtca240ttgctagaga ccttaaaaag tgttcagcag caaacctatc ccctagcaga aatttatgtt300
gttgacgatg gaagtgctga tgagacaggt attaagcgca ttgaagacta tgtgcgtgac360actggtgacc tatcaagcaa tgtcattgtt catcggtcag agaaaaatca aggaaagcgt420catgcacagg cctgggcctt tgaaagatca gacgctgatg tctttttgac cgttgactca480gatacttata tctaccctga tgctttagag gagttgttaa aaacctttaa tgacccaact540gtttttgctg cgacgggtca ccttaatgtc agaaatagac aaaccaatct cttaacacgc600ttgacagata ttcgctatga taatgctttt ggcgttgaac gagctgccca atccgttaca660ggtaatatcc ttgtttgctc aggtccgctt agcgtttaca gacgcgaggt ggttgttcct720aacatagata gatacatcaa ccagaccttc ctgggtattc ctgtaagtat tggtgatgac780aggtgcttga ccaactatgc aactgattta ggaaagactg tttatcaatc cactgctaaa840tgtattacag atgttcctga caagatgtct acttacttga agcagcaaaa ccgctggaac900aagtccttct ttagagagtc cattatttct gttaagaaaa tcatgaacaa tccttttgta960gccctatgga ccatacttga ggtgtctatg tttatgatgc ttgtttattc tgtggtggat1020ttctttgtag gcaatgtcag agaatttgat tggctcaggg ttttagcctt tctggtgatt1080atcttcattg ttgccctgtg tcggaacatt cattacatgc ttaagcaccc gctgtccttc1140ttgttatctc cgttttatgg ggtgctgcat ttgtttgtcc tacagccctt gaaattatat1200tctcttttta ctattagaaa tgctgactgg ggaacacgta aaaaattatt ataa1254
<210>2<211>417<212>PRT<213>類馬鏈球菌<400>2Met Arg Thr Leu Lys Asn Leu Ile Thr Val Val Ala Phe Ser Ile Phe1 5 10 15Trp Val Leu Leu Ile Tyr Val Asn Val Tyr Leu Phe Gly Ala Lys Gly20 25 30Ser Leu Ser Ile Tyr Gly Phe Leu Leu Ile Ala Tyr Leu Leu Val Lys35 40 45Met Ser Leu Ser Phe Phe Tyr Lys Pro Phe Lys Gly Arg Ala Gly Gln50 55 60Tyr Lys Val Ala Ala Ile Ile Pro Ser Tyr Asn Glu Asp Ala Glu Ser65 70 75 80Leu Leu Glu Thr Leu Lys Ser Val Gln Gln Gln Thr Tyr Pro Leu Ala85 90 95Glu Ile Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Ala Asp Glu Thr Gly Ile Lys100 105 110Arg Ile Glu Asp Tyr Val Arg Asp Thr Gly Asp Leu Ser Ser Asn Val115 120 125Ile Val His Arg Ser Glu Lys Asn Gln Gly Lys Arg His Ala Gln Ala130 135 140Trp Ala Phe Glu Arg Ser Asp Ala Asp Val Phe Leu Thr Val Asp Ser145 150 155 160
Asp Thr Tyr Ile Tyr Pro Asp Ala Leu Glu Glu Leu Leu Lys Thr Phe165 170 175Asn Asp Pro Thr Val Phe Ala Ala Thr Gly His Leu Asn Val Arg Asn180 185 190Arg Gln Thr Asn Leu Leu Thr Arg Leu Thr Asp Ile Arg Tyr Asp Asn195 200 205Ala Phe Gly Val Glu Arg Ala Ala Gln Ser Val Thr Gly Asn Ile Leu210 215 220Val Cys Ser Gly Pro Leu Ser Val Tyr Arg Arg Glu Val Val Val pro225 230 235 240Asn Ile Asp Arg Tyr Ile Asn Gln Thr Phe Leu Gly Ile Pro Val Ser245 250 255Ile Gly Asp Asp Arg Cys Leu Thr Asn Tyr Ala Thr Asp Leu Gly Lys260 265 270Thr Val Tyr Gln Ser Thr Ala Lys Cys Ile Thr Asp Val Pro Asp Lys275 280 285Met Ser Thr Tyr Leu Lys Gln Gln Asn Arg Trp Asn Lys Ser Phe Phe290 295 300Arg Glu Ser Ile Ile Ser Val Lys Lys Ile Met Asn Asn Pro Phe Val305 310 315 320Ala Leu Trp Thr Ile Leu Glu Val Ser Met Phe Met Met Leu Val Tyr325 330 335Ser Val Val Asp Phe Phe Val Gly Asn Val Arg Glu Phe Asp Trp Leu340 345 350
Arg Val Leu Ala Phe Leu Val Ile Ile Phe Ile Val Ala Leu Cys Arg355 360 365Asn Ile His Tyr Met Leu Lys His Pro Leu Ser Phe Leu Leu Ser Pro370 375 380Phe Tyr Gly Val Leu His Leu Phe Val Leu Gln Pro Leu Lys Leu Tyr385 390 395 400Ser Leu Phe Thr Ile Arg Asn Ala Asp Trp Gly Thr Arg Lys Lys Leu405 410 415Leu<210>3<211>22<212>DNA<213>類馬鏈球菌<400>3gctgatgaga caggtattaa gc22<210>4<211>20<212>DNA<213>類馬鏈球菌<400>4atcaaattct ctgacattgc20<210>5<211>20<212>DNA<213>類馬鏈球菌<400>5gactcagata cttatatcta20
<210>6<211>17<212>DNA<213>類馬鏈球菌<400>6tttttacgtg ttcccca17<210>7<211>567<212>PRT<213>小球藻病毒PBCV-1<400>7Met Gly Lys Asn Ile Ile Ile Met Val Ser Trp Tyr Thr Ile Ile Thr1 5 10 15Ser Asn Leu Ile Ala Val Gly Gly Ala Ser Leu Ile Leu Ala Pro Ala20 25 30Ile Thr Gly Tyr Val Leu His Trp Asn Ile Ala Leu Ser Thr Ile Trp35 40 45Gly Val Ser Ala Tyr Gly Ile Phe Val Phe Gly Phe Phe Leu Ala Gln50 55 60Val Leu Phe Ser Glu Leu Asn Arg Lys Arg Leu Arg Lys Trp Ile Ser65 70 75 80Leu Arg Pro Lys Gly Trp Asn Asp Val Arg Leu Ala Val Ile Ile Ala85 90 95Gly Tyr Arg Glu Asp Pro Tyr Met Phe Gln Lys Cys Leu Glu Ser Val100 105 110Arg Asp Ser Asp Tyr Gly Asn Val Ala Arg Leu Ile Cys Val Ile Asp
115 120 125Gly Asp Glu Asp Asp Asp Met Arg Met Ala Ala Val Tyr Lys Ala Ile130 135 140Tyr Asn Asp Asn Ile Lys Lys Pro Glu Phe Val Leu Cys Glu Ser Asp145 150 155 160Asp Lys Glu Gly Glu Arg Ile Asp Ser Asp Phe Ser Arg Asp Ile Cys165 170 175Val Leu Gln Pro His Arg Gly Lys Arg Glu Cys Leu Tyr Thr Gly Phe180 185 190Gln Leu Ala Lys Met Asp Pro Ser Val Asn Ala Val Val Leu Ile Asp195 200 205Ser Asp Thr Val Leu Glu Lys Asp Ala Ile Leu Glu Val Val Tyr Pro210 215 220Leu Ala Cys Asp Pro Glu Ile Gln Ala Val Ala Gly Glu Cys Lys Ile225 230 235 240Trp Asn Thr Asp Thr Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Trp Arg Tyr Tyr245 250 255Ser Ala Phe Cys Val Glu Arg Ser Ala Gln Ser Phe Phe Arg Thr Val260 265 270Gln cys Val Gly Gly Pro Ieu Gly Ala Tyr Lys Asp Ile Ile Lys Glu275 280 285Ile Lys Asp Pro Trp Ile Ser Gln Arg Phe Leu Gly Gln Lys Cys Thr290 295 300Tyr Gly Asp Asp Arg Arg Leu Thr Asn Glu Ile Leu Met Arg Gly Lys
305 310 315 320Lys Val Val Phe Thr Pro Phe Ala Val Gly Trp Ser Asp Ser Pro Thr325 330 335Asn Val Phe Arg Tyr Ile Val Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser Trp340 345 350Cys Arg Glu Ile Trp Tyr Thr Leu Phe Ala Ala Trp Lys His Gly Leu355 360 365Ser Gly Ile Trp Leu Ala Phe Glu Cys Leu Tyr Gln Ile Thr Tyr Phe370 375 380Phe Leu Val Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Leu Ala Val Glu Ala Asp Pro385 390 395 400Arg Ala Gln Thr Ala Thr Val Ile Val Ser Thr Thr Val Ala Leu Ile405 410 415Lys Cys Gly Tyr Phe Ser Phe Arg Ala Lys Asp Ile Arg Ala Phe Tyr420 425 430Phe Val Leu Tyr Thr Phe Val Tyr Phe Phe Cys Met Ile Pro Ala Arg435 440 445Ile Thr Ala Met Met Thr Leu Trp Asp Ile Gly Trp Asp Thr Arg Gly450 455 460Gly Asn Glu Lys Pro Ser Val Gly Thr Arg Val Ala Leu Trp Ala Lys465 470 475 480Gln Tyr Leu Ile Ala Tyr Met Trp Trp Ala Ala Val Val Gly Ala Gly485 490 495Val Tyr Ser Ile Val His Asn Trp Met Phe Asp Trp Asn Ser Leu Ser
500 505 510Tyr Arg Phe Ala Leu Val Gly Ile Cys Ser Tyr Ile Val Phe Ile Val515 520 525Ile Val Leu Val Val Tyr Phe Thr Gly Lys Ile Thr Thr Trp Asn Phe530 535 540Thr Lys Leu Gln Lys Glu Leu Ile Glu Asp Arg Val Leu Tyr Asp Ala545 550 555 560Thr Thr Asn Ala Gln Ser Val565<210>8<211>1740<212>DNA<213>小球藻病毒PBCV-1<400>8aagacttctt gaaagttaca atgggtaaaa atataatcat aatggtttcg tggtacacca60tcataacttc aaatctaatc gcggttggag gagcctctct aatcttggct ccggcaatta120ctgggtatgt tctacattgg aatattgctc tctcgacaat ctggggagta tcagcttatg180gtattttcgt ttttgggttt ttccttgcac aagttttatt ttcagaactg aacaggaaac240gtcttcgcaa gtggatttct ctcagaccta agggttggaa tgatgttcgt ttggctgtga300tcattgctgg atatcgcgag gatccttata tgttccagaa gtgcctcgag tctgtacgtg360actctgatta tggcaacgtt gcccgtctga tttgtgtgat tgacggtgat gaggacgatg420atatgaggat ggctgccgtt tacaaggcga tctacaatga taatatcaag aagcccgagt480
ttgttctgtg tgagtcagac gacaaggaag gtgaacgcat cgactctgat ttctctcgcg540acatttgtgt cctccagcct catcgtggaa aacgggagtg tctttatact gggtttcaac600ttgcaaagat ggaccccagt gtcaatgctg tcgttctgat tgacagcgat accgttctcg660agaaggatgc tattctggaa gttgtatacc cacttgcatg cgatcccgag atccaagccg720ttgcaggtga gtgtaagatt tggaacacag acactctttt gagtcttctc gtcgcttggc780ggtactattc tgcgttttgt gtggagagga gtgcccagtc ttttttcagg actgttcagt840gcgttggggg gccactgggt gcctacaaga ttgatatcat taaggagatt aaggacccct900ggatttccca gcgctttctt ggtcagaagt gtacttacgg tgacgaccgc cggctaacca960acgagatett gatgcgtggt aaaaaggttg tgttcactcc atttgctgtt ggttggtctg1020acagtccgac caatgtgttt cggtacatcg ttcagcagac ccgctggagt aagtcgtggt1080gccgcgaaat ttggtacacc ctcttcgccg cgtggaagca cggtttgtct ggaatttggc1140tggcctttga atgtttgtat caaattacat acttcttcct cgtgatttac ctcttttctc1200gcctagccgt tgaggccgac cctcgcgccc agacagccac ggtgattgtg agcaccacgg1260ttgcattgat taagtgtggg tatttttcat tccgagccaa ggatattcgg gcgttttact1320ttgtgcttta tacatttgtt tactttttct gtatgattcc ggccaggatt actgcaatga1380tgacgctttg ggacattggc tgggatactc gcggtggaaa cgagaagcct tccgttggca1440
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權利要求
1.一種重組宿主細胞，其中該重組宿主細胞是包含重組載體的芽孢桿菌細胞，所述重組載體包含具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段，其中編碼區在啟動子的控制之下。
2.權利要求1的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細胞。
3.權利要求1的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO13的核苷酸序列。
4.權利要求3的重組宿主細胞，其中宿主細胞生產透明質酸。
5.權利要求1的重組宿主細胞，其中純化核酸區段的編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區處于革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的控制之下。
6.權利要求5的重組宿主細胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。
7.權利要求1的重組宿主細胞，其中枯草芽孢桿菌進一步包含重組載體，該重組載體包含具有編碼酶活性UDP-GlcUA生物合成途徑的酶的編碼區的純化核酸區段，其中酶活性UDP-GlcUA生物合成途徑的酶選自UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶及其組合。
8.權利要求1的重組宿主細胞，其中重組載體進一步包含具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區的純化核酸區段。
9.權利要求8的重組宿主細胞，其中編碼酶活性HAS的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在至少一個啟動子的至少一個拷貝的控制之下的。
10.權利要求8的重組宿主細胞，其中編碼酶活性HAS的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在不同啟動子的控制之下的。
11.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區是在啟動子的控制之下的；使宿主在培養基上生長以分泌透明質酸；和回收分泌的透明質酸。
12.權利要求11的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
13.根據權利要求11的方法，其中回收透明質酸的步驟包含從培養基中提取分泌的透明質酸。
14.根據權利要求13的方法，該方法進一步包含純化提取的透明質酸的步驟。
15.權利要求11的方法，該方法進一步包含引入純化的核酸區段的步驟，該核酸區段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
16.權利要求11的方法，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在相同的啟動子控制之下的。
17.權利要求11的方法，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在不同的啟動子控制之下的。
18.權利要求11的方法，其中在引入具有編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段的步驟中，該純化核酸區段包含根據SEQ ID NO13的核苷酸序列。
19.權利要求11的方法，其中在將具有編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區段的編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區是在革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的控制之下的。
20.權利要求19的方法，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。
21.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區是在啟動子的控制之下的；將具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中；使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸；和回收分泌的透明質酸。
22.權利要求21的方法，其中在引入具有編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段的步驟中，該純化核酸區段包含根據SEQ ID NO13的核苷酸序列。
23.權利要求21的方法，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在相同啟動子的控制之下的。
24.權利要求21的方法，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在不同啟動子的控制之下的。
25.權利要求21的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
26.根據權利要求21的方法，其中回收透明質酸的步驟包含從培養基中提取分泌的透明質酸。
27.根據權利要求26的方法，該方法進一步包含對提取的透明質酸進行純化的步驟。
28.權利要求21的方法，其中在將具有編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區段的編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區是在革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的控制之下的。
29.權利要求28的方法，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。
30.一種重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是芽孢桿菌細胞，其包含一種包含純化的核酸區段的重組載體，該純化的核酸區段具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區；和一種包含純化的核酸區段的重組載體，該純化的核酸區段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
31.權利要求30的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細胞。
32.權利要求30的重組宿主細胞，其中宿主細胞生產透明質酸。
33.權利要求30的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段的編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區是在革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的控制之下的。
34.權利要求33的重組宿主細胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。
35.權利要求30的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO13的核苷酸序列。
36.一種重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是在其中引入了重組載體的芽孢桿菌細胞，該重組載體包含一種純化的核酸區段，該純化的核酸區段具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區；和一種編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
37.權利要求36的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO13的核苷酸序列。
38.權利要求36的重組宿主細胞，其中編碼酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在相同啟動子的控制之下的。
39.權利要求36的重組宿主細胞，其中編碼酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在不同啟動子的控制之下的。
40.權利要求36的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細胞。
41.權利要求36的重組宿主細胞，其中宿主細胞生產透明質酸。
42.權利要求36的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段的編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區是在革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的控制之下的。
43.權利要求42的重組宿主細胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。
44.由包含下面步驟的方法制備的透明質酸將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區是在啟動子的控制之下的；使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸；和回收分泌的透明質酸。
45.由權利要求44的方法制備的透明質酸，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO3的核苷酸序列。
46.由根據權利要求44的方法制備的透明質酸，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
47.由根據權利要求44的方法制備的透明質酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸的步驟進一步限定為使芽孢桿菌宿主于約25℃～約42℃在化學成分確定的培養基上生長以分泌透明質酸。
48.由根據權利要求44的方法制備的透明質酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸的步驟進一步限定為使芽孢桿菌宿主于約25℃～約42℃在復合培養基上生長以分泌透明質酸。
49.由根據權利要求44的方法制備的透明質酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸的步驟進一步限定為使芽孢桿菌宿主在含有葡萄糖以及N-乙酰葡糖胺和葡糖胺兩者中至少一種的培養基上生長以分泌透明質酸。
50.由根據權利要求44的方法制備的透明質酸，其中回收分泌的透明質酸的步驟進一步限定為--通過過濾、離心和絮凝作用中至少一種方法從細胞和殘渣中分離透明質酸；--濃縮分離的透明質酸；和--通過至少一種選自沉淀、超濾和透析的方法從培養基中分離濃縮的透明質酸。
51.由根據權利要求50的方法制備的透明質酸，其中通過過濾、離心和絮凝作用中至少一種方法從細胞和殘渣中分離透明質酸的步驟進一步包括添加三氯乙酸，這促進細胞和殘渣與透明質酸的分離。
52.由根據權利要求50的方法制備的透明質酸，其中沉淀劑是醇、有機溶劑或化合物及脂族帶正電荷的鹽中的至少一種。
53.由根據權利要求52的方法制備的透明質酸，其中沉淀劑選自乙醇、異丙醇、丙酮、鯨蠟基溴化三銨或鯨蠟基氯化吡啶鎓。
54.由根據權利要求44的方法制備的透明質酸，該方法進一步包含對提取的透明質酸進行純化的步驟。
55.由根據權利要求44的方法制備的透明質酸，其中該方法進一步包括引入純化的核酸區段的步驟，其中該純化的核酸區段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
56.由根據權利要求55的方法制備的透明質酸，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在相同啟動子的控制之下的。
57.由根據權利要求55的方法制備的透明質酸，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在不同啟動子的控制之下的。
58.由根據權利要求44的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區段的編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區是在來自革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的啟動子控制之下的。
59.由根據權利要求44的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區段是通過轉化、轉染、轉導和電穿孔的至少一種引入到芽孢桿菌宿主的。
60.一種重組宿主細胞，其中該重組宿主細胞是具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產的芽孢桿菌細胞，該重組宿主細胞進一步具有包含純化的核酸區段的重組載體，該純化的核酸區段具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區。
61.權利要求60的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO13的核苷酸序列。
62.權利要求60的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細胞。
63.權利要求60的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括至少一種修飾的RNA聚合酶啟動子，其中當修飾的RNA聚合酶啟動子被RNA聚合酶識別時，該RNA聚合酶能夠以比結合內源RNA聚合酶啟動子時更大的量表達RNA。
64.權利要求63的重組宿主細胞，其中所述修飾是突變。
65.權利要求63的重組宿主細胞，其中所述修飾是串聯啟動子元件。
66.權利要求60的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是用包含純化的核酸區段的重組載體進行轉化的，該純化的核酸載體具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區。
67.權利要求66的重組宿主細胞，其中UDP-糖前體生物合成途徑中的酶是UDP-葡萄糖脫氫酶。
68.權利要求66的重組宿主細胞，其中UDP-糖前體生物合成途徑中的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。
69.權利要求60的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括比在天然芽孢桿菌細胞中發現的至少多一個的信使RNA穩定元件。
70.權利要求60的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括比在天然芽孢桿菌細胞中發現的至少少一個的信使RNA去穩定元件。
71.權利要求60的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括至少一種核酸區段，該核酸區段具有編碼在UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區，從而該重組宿主細胞比表達內源UDP-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細胞具有更大的活性。
72.權利要求60的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，其中突變的UDP-糖前體基因增加轉錄的信使RNA的半衰期。
73.權利要求60的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。
74.權利要求60的重組宿主細胞，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結合位點上發生的，從而核糖體對核糖體結合位點具有增加的結合親和力。
75.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中，其中芽孢桿菌宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產；使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸；和回收分泌的透明質酸。
76.權利要求75的方法，其中在引入具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段的步驟中，該純化核酸區段包含根據SEQ ID NO13的核苷酸序列。
77.權利要求75的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
78.根據權利要求75的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括至少一種具有增加的啟動子活性的修飾的RNA聚合酶啟動子。
79.權利要求78的方法，其中RNA聚合酶啟動子的所述修飾是突變。
80.權利要求78的方法，其中RNA聚合酶啟動子的所述修飾是串聯啟動子元件。
81.根據權利要求75的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主是用包含純化的核酸區段的載體進行轉化的，該純化的核酸區段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區。
82.根據權利要求81的方法，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖脫氫酶。
83.根據權利要求81的方法，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。
84.根據權利要求75的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括比在天然芽孢桿菌宿主中發現的至少多一個的信使RNA穩定元件。
85.根據權利要求75的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括比在天然芽孢桿菌宿主中發現的至少少一個的信使RNA去穩定元件。
86.根據權利要求75的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括至少一種核酸區段，該核酸區段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區，從而該重組宿主細胞比表達內源UDP-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細胞具有更大的活性。
87.根據權利要求75的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括至少一種突變的內源UDP-糖前體生物合成基因，其中該突變導致從突變的UDP-糖前體基因轉錄的信使RNA的半衰期的增加。
88.根據權利要求75的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。
89.根據權利要求88的方法，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結合位點上發生的，從而核糖體對核糖體結合位點具有增加的結合親和力。
90.由下面方法制備的透明質酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中，其中芽孢桿菌宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產；使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸；和回收分泌的透明質酸。
91.由權利要求90的方法制備的透明質酸，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO13的核苷酸序列。
92.由根據權利要求90的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括至少一種比內源RNA聚合酶啟動子具有更大啟動子活性的修飾的RNA聚合酶啟動子。
93.由根據權利要求92的方法制備的透明質酸，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是突變。
94.由根據權利要求92的方法制備的透明質酸，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是串聯啟動子元件。
95.由根據權利要求92的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主是用包含純化的核酸區段的重組載體進行轉化的，該純化的核酸區段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區。
96.由根據權利要求95的方法制備的透明質酸，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖脫氫酶。
97.由根據權利要求95的方法制備的透明質酸，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。
98.由根據權利要求90的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括比在用于形成重組宿主細胞的芽孢桿菌宿主細胞中發現的至少多一個的信使RNA穩定元件。
99.由根據權利要求90的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括比在用于形成重組宿主細胞的芽孢桿菌宿主細胞中發現的至少少一個的信使RNA去穩定元件。
100.由根據權利要求90的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括至少一種核酸區段，該核酸區段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區，從而該重組宿主細胞比表達內源UDP-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細胞具有更大的活性。
101.由根據權利要求90的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該枯草芽孢桿菌菌株包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，其中該突變導致從突變的UDP-糖前體基因轉錄的信使RNA的半衰期的增加。
102.由根據權利要求90的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO14所示酶活性釀膿鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該枯草芽孢桿菌菌株包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。
103.由根據權利要求102的方法制備的透明質酸，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結合位點上發生的，從而核糖體對核糖體結合位點具有增加的結合親和力。
104.一種重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是包含重組載體的芽孢桿菌細胞，該重組載體包含具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段，其中編碼區是在啟動子的控制之下的。
105.權利要求104的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細胞。
106.權利要求104的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO9的核苷酸序列。
107.權利要求106的重組宿主細胞，其中宿主細胞生產透明質酸。
108.權利要求104的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段的編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區是在革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的控制之下的。
109.權利要求108的重組宿主細胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。
110.權利要求104的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞，且其中宿主細胞進一步包含重組載體，該重組載體包含具有編碼酶活性UDP-GlcUA生物合成途徑的酶的編碼區的純化核酸區段，其中酶活性UDP-GlcUA生物合成途徑的酶選自UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶及其組合。
111.權利要求104的重組宿主細胞，其中重組載體進一步包含具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區的純化核酸區段。
112.權利要求111的重組宿主細胞，其中編碼酶活性HAS的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在至少一個啟動子的至少一個拷貝的控制之下的。
113.權利要求111的重組宿主細胞，其中編碼酶活性HAS的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在不同啟動子的控制之下的。
114.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區是在啟動子的控制之下的；使宿主在培養基上生長以分泌透明質酸；和回收分泌的透明質酸。
115.權利要求114的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
116.根據權利要求114的方法，其中回收透明質酸的步驟包含從培養基中提取分泌的透明質酸。
117.根據權利要求116的方法，該方法進一步包含對提取的透明質酸進行純化的步驟。
118.根據權利要求114的方法，該方法進一步包含引入純化的核酸區段的步驟，其中該純化的核酸區段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
119.權利要求114的方法，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在相同啟動子的控制之下的。
120.根據權利要求114的方法，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在不同啟動子的控制之下的。
121.根據權利要求114的方法，其中在引入具有編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段的步驟中，該純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO9的核苷酸序列。
122.根據權利要求114的方法，其中在將具有編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區段的編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區是在革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的控制之下的。
123.根據權利要求122的方法，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。
124.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區是在啟動子的控制之下的；將具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中；使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸；和回收分泌的透明質酸。
125.權利要求124的方法，其中在引入具有編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段的步驟中，該純化核酸區段包含根據SEQ ID NO9的核苷酸序列。
126.權利要求124的方法，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在相同啟動子的控制之下的。
127.權利要求124的方法，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在不同啟動子的控制之下的。
128.權利要求124的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
129.根據權利要求124的方法，其中回收透明質酸的步驟包含從培養基中提取分泌的透明質酸。
130.根據權利要求129的方法，該方法進一步包含對提取的透明質酸進行純化的步驟。
131.權利要求124的方法，其中在將具有編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區段的編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區是在革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的控制之下的。
132.權利要求131的方法，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。
133.一種重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是芽孢桿菌細胞，該細胞包含一種包含純化的核酸區段的重組載體，該純化的核酸區段具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區；和一種包含純化的核酸區段的重組載體，該純化的核酸區段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
134.權利要求133的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細胞。
135.權利要求133的重組宿主細胞，其中宿主細胞生產透明質酸。
136.權利要求133的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段的編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區是在革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的控制之下的。
137.權利要求136的重組宿主細胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。
138.權利要求133的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO9的核苷酸序列。
139.一種重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是在其中引入了重組載體的芽孢桿菌細胞，該重組載體包含一種純化的核酸區段，該純化的核酸區段具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區；和一種編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
140.權利要求139的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO9的核苷酸序列。
141.權利要求139的重組宿主細胞，其中編碼酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在相同啟動子的控制之下的。
142.權利要求139的重組宿主細胞，其中編碼酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在不同啟動子的控制之下的。
143.權利要求139的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細胞。
144.權利要求139的重組宿主細胞，其中宿主細胞生產透明質酸。
145.權利要求139的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段的編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區是在革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的控制之下的。
146.權利要求145的重組宿主細胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。
147.由包含下面步驟的方法制備的透明質酸將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區是在啟動子的控制之下的；使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸；和回收分泌的透明質酸。
148.由權利要求147的方法制備的透明質酸，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO3的核苷酸序列。
149.由根據權利要求147的方法制備的透明質酸，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
150.由根據權利要求147的方法制備的透明質酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸的步驟進一步限定為使芽孢桿菌宿主于約25℃～約42℃在化學成分確定的培養基上生長以分泌透明質酸。
151.由根據權利要求147的方法制備的透明質酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸的步驟進一步限定為使芽孢桿菌宿主于約25℃～約42℃在復合培養基上生長以分泌透明質酸。
152.由根據權利要求147的方法制備的透明質酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸的步驟進一步限定為使芽孢桿菌宿主在含有葡萄糖和至少N-乙酰葡糖胺和葡糖胺之一的培養基上生長以分泌透明質酸。
153.由根據權利要求147的方法制備的透明質酸，其中回收分泌的透明質酸的步驟進一步限定為--通過過濾、離心和絮凝作用中至少一種方法從細胞和殘渣中分離透明質酸；--濃縮分離的透明質酸；和--通過至少一種選自沉淀、超濾和透析的方法從培養基中分離濃縮的透明質酸。
154.由根據權利要求153的方法制備的透明質酸，其中通過過濾、離心和絮凝作用中至少一種方法從細胞和殘渣中分離透明質酸的步驟進一步包括添加三氯乙酸，這促進細胞和殘渣與透明質酸的分離。
155.由根據權利要求153的方法制備的透明質酸，其中沉淀劑是醇、有機溶劑或化合物及脂族帶正電荷的鹽中的至少一種。
156.由根據權利要求155的方法制備的透明質酸，其中沉淀劑選自乙醇、異丙醇、丙酮、鯨蠟基溴化三銨或鯨蠟基氯化吡啶鎓。
157.由根據權利要求147的方法制備的透明質酸，該方法進一步包含對提取的透明質酸進行純化的步驟。
158.由根據權利要求147的方法制備的透明質酸，其中該方法進一步包括引入純化的核酸區段的步驟，該純化的核酸區段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
159.由根據權利要求158的方法制備的透明質酸，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在相同啟動子的控制之下的。
160.由根據權利要求158的方法制備的透明質酸，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在不同啟動子的控制之下的。
161.由根據權利要求147的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區段的編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區是在來自革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的啟動子控制之下的。
162.由根據權利要求147的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區段是通過轉化、轉染、轉導和電穿孔的至少一種引入到芽孢桿菌宿主的。
163.一種重組宿主細胞，其中該重組宿主細胞是具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產的芽孢桿菌細胞，該重組宿主細胞進一步具有包含純化的核酸區段的重組載體，該純化的核酸區段具有經引入的編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區。
164.權利要求163的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO9的核苷酸序列。
165.權利要求163的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細胞。
166.權利要求163的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括至少一種修飾的RNA聚合酶啟動子，其中當修飾的RNA聚合酶啟動子被RNA聚合酶識別時，該RNA聚合酶能夠以比結合內源RNA聚合酶啟動子時更大的量表達RNA。
167.權利要求166的重組宿主細胞，其中所述修飾是突變。
168.權利要求166的重組宿主細胞，其中所述修飾是串聯啟動子元件。
169.權利要求163的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是用包含純化的核酸區段的重組載體進行轉化的，該純化的核酸載體具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區。
170.權利要求169的重組宿主細胞，其中UDP-糖前體生物合成途徑中的酶是UDP-葡萄糖脫氫酶。
171.權利要求169的重組宿主細胞，其中UDP-糖前體生物合成途徑中的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。
172.權利要求163的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括比在天然芽孢桿菌細胞中發現的至少多一個的信使RNA穩定元件。
173.權利要求163的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括比在天然芽孢桿菌細胞中發現的至少少一個的信使RNA去穩定元件。
174.權利要求163的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括至少一種核酸區段，該核酸區段具有編碼在UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區，從而該重組宿主細胞比表達內源UDP-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細胞具有更大的活性。
175.權利要求163的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，其中突變的UDP-糖前體基因增加轉錄的信使RNA的半衰期。
176.權利要求163的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。
177.權利要求163的重組宿主細胞，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結合位點上發生的，從而核糖體對核糖體結合位點具有增加的結合親和力。
178.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中，其中芽孢桿菌宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產；使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸；和回收分泌的透明質酸。
179.權利要求178的方法，其中在引入具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段的步驟中，該純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO9的核苷酸序列。
180.權利要求178的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
181.根據權利要求178的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括至少一種具有增加的啟動子活性的修飾的RNA聚合酶啟動子。
182.權利要求181的方法，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是突變。
183.權利要求181的方法，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是串聯啟動子元件。
184.根據權利要求178的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主是用包含純化的核酸區段的載體進行轉化的，該純化的核酸區段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區。
185.根據權利要求184的方法，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖脫氫酶。
186.根據權利要求184的方法，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。
187.根據權利要求178的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括比在天然芽孢桿菌宿主中發現的至少多一個的信使RNA穩定元件。
188.根據權利要求178的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括比在天然芽孢桿菌宿主中發現的至少少一個的信使RNA去穩定元件。
189.根據權利要求178的方法，其中在將具有編碼酶SEQ ID NO10所示活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括至少一種核酸區段，該核酸區段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區，從而該重組宿主細胞比表達內源UDP-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細胞具有更大的活性。
190.根據權利要求178的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，其中該突變導致從突變的UDP-糖前體基因轉錄的信使RNA的半衰期的增加。
191.根據權利要求178的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。
192.根據權利要求191的方法，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結合位點上發生的，從而核糖體對核糖體結合位點具有增加的結合親和力。
193.由下面方法制備的透明質酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中，其中芽孢桿菌宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產；使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸；和回收分泌的透明質酸。
194.由權利要求193的方法制備的透明質酸，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO9的核苷酸序列。
195.由根據權利要求193的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括至少一種比內源RNA聚合酶啟動子具有更大啟動子活性的修飾的RNA聚合酶啟動子。
196.由根據權利要求195的方法制備的透明質酸，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是突變。
197.由根據權利要求195的方法制備的透明質酸，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是串聯啟動子元件。
198.由根據權利要求195的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主是用包含純化的核酸區段的重組載體進行轉化的，該純化的核酸區段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區。
199.由根據權利要求198的方法制備的透明質酸，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖脫氫酶。
200.由根據權利要求198的方法制備的透明質酸，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。
201.由根據權利要求193的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括比在用于形成重組宿主細胞的芽孢桿菌宿主細胞中發現的至少多一個的信使RNA穩定元件。
202.由根據權利要求193的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括比在用于形成重組宿主細胞的芽孢桿菌宿主細胞中發現的至少少一個的信使RNA去穩定元件。
203.由根據權利要求193的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括至少一種核酸區段，該核酸區段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區，從而該重組宿主細胞比表達內源UDP-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細胞具有更大的活性。
204.由根據權利要求193的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該枯草芽孢桿菌菌株包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，其中該突變導致從突變的UDP-糖前體基因轉錄的信使RNA的半衰期的增加。
205.由根據權利要求193的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO10所示酶活性多殺巴斯德氏桿菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該枯草芽孢桿菌菌株包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。
206.由根據權利要求205的方法制備的透明質酸，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結合位點上發生的，從而核糖體對核糖體結合位點具有增加的結合親和力。
207.一種重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是包含重組載體的芽孢桿菌細胞，該重組載體包含具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段，其中編碼區是在啟動子的控制之下的。
208.權利要求207的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細胞。
209.權利要求207的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO11的核苷酸序列。
210.權利要求209的重組宿主細胞，其中宿主細胞生產透明質酸。
211.權利要求207的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段的編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區是在革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的控制之下的。
212.權利要求211的重組宿主細胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。
213.權利要求207的重組宿主細胞，其中枯草芽孢桿菌細胞進一步包含重組載體，該重組載體包含具有編碼酶活性UDP-GlcUA生物合成途徑的酶的編碼區的純化核酸區段，其中酶活性UDP-GlcUA生物合成途徑的酶選自UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶及其組合。
214.權利要求207的重組宿主細胞，其中重組載體進一步包含具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區的純化核酸區段。
215.權利要求214的重組宿主細胞，其中編碼酶活性HAS的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在至少一個啟動子的至少一個拷貝的控制之下的。
216.權利要求214的重組宿主細胞，其中編碼酶活性HAS的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在不同啟動子的控制之下的。
217.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區是在啟動子的控制之下的；使宿主在培養基上生長以分泌透明質酸；和回收分泌的透明質酸。
218.權利要求217的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
219.根據權利要求217的方法，其中回收透明質酸的步驟包含從培養基中提取分泌的透明質酸。
220.根據權利要求219的方法，該方法進一步包含對提取的透明質酸進行純化的步驟。
221.根據權利要求217的方法，該方法進一步包含引入純化的核酸區段的步驟，該純化的核酸區段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
222.根據權利要求217的方法，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在相同啟動子的控制之下的。
223.根據權利要求217的方法，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在不同啟動子的控制之下的。
224.根據權利要求217的方法，其中在引入具有編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段的步驟中，該純化核酸區段包含根據SEQ ID NO11的核苷酸序列。
225.根據權利要求217的方法，其中在將具有編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區段的編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區是在革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的控制之下的。
226.根據權利要求225的方法，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。
227.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區是在啟動子的控制之下的；將具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中；使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸；和回收分泌的透明質酸。
228.權利要求227的方法，其中在引入具有編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段的步驟中，該純化核酸區段包含根據SEQ ID NO11的核苷酸序列。
229.權利要求227的方法，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在相同啟動子的控制之下的。
230.權利要求227的方法，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在不同啟動子的控制之下的。
231.權利要求227的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
232.根據權利要求227的方法，其中回收透明質酸的步驟包含從培養基中提取分泌的透明質酸。
233.根據權利要求232的方法，該方法進一步包含對提取的透明質酸進行純化的步驟。
234.權利要求227的方法，其中在將具有編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區段的編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區是在革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的控制之下的。
235.權利要求234的方法，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。
236.一種重組宿主細胞，其中該重組宿主細胞是芽孢桿菌細胞，該細胞包含一種包含純化的核酸區段的重組載體，該純化的核酸區段具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區；和一種包含純化的核酸區段的重組載體，該純化的核酸區段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
237.權利要求236的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細胞。
238.權利要求236的重組宿主細胞，其中宿主細胞生產透明質酸。
239.權利要求236的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段的編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區是在革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的控制之下的。
240.權利要求239的重組宿主細胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。
241.權利要求236的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO11的核苷酸序列。
242.一種重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是在其中引入了重組載體的芽孢桿菌細胞，該重組載體包含一種純化的核酸區段，該純化的核酸區段具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區；和一種編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
243.權利要求242的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO.11的核苷酸序列。
244.權利要求242的重組宿主細胞，其中編碼酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在相同啟動子的控制之下的。
245.權利要求242的重組宿主細胞，其中編碼酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在不同啟動子的控制之下的。
246.權利要求242的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細胞。
247.權利要求242的重組宿主細胞，其中宿主細胞生產透明質酸。
248.權利要求242的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段的編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區是在革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的控制之下的。
249.權利要求248的重組宿主細胞，其中啟動子是芽孢桿菌相容性啟動子。
250.由包含下面步驟的方法制備的透明質酸將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中，其中編碼區是在啟動子的控制之下的；使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸；和回收分泌的透明質酸。
251.由權利要求250的方法制備的透明質酸，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO3的核苷酸序列。
252.由根據權利要求250的方法制備的透明質酸，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
253.由根據權利要求250的方法制備的透明質酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸的步驟進一步限定為使芽孢桿菌宿主于約25℃～約42℃在化學成分確定的培養基上生長以分泌透明質酸。
254.由根據權利要求250的方法制備的透明質酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸的步驟進一步限定為使芽孢桿菌宿主于約25℃～約42℃在復合培養基上生長以分泌透明質酸。
255.由根據權利要求250的方法制備的透明質酸，其中使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸的步驟進一步限定為使芽孢桿菌宿主在含有葡萄糖以及N-乙酰葡糖胺和葡糖胺兩者中至少一種的培養基上生長以分泌透明質酸。
256.由根據權利要求250的方法制備的透明質酸，其中回收分泌的透明質酸的步驟進一步限定為--通過過濾、離心和絮凝作用中至少一種方法從細胞和殘渣中分離透明質酸；--濃縮分離的透明質酸；和--通過至少一種選自沉淀、超濾和透析的方法從培養基中分離濃縮的透明質酸。
257.由根據權利要求256的方法制備的透明質酸，其中通過過濾、離心和絮凝作用中至少一種方法從細胞和殘渣中分離透明質酸的步驟進一步包括添加三氯乙酸，這促進細胞和殘渣與透明質酸的分離。
258.由根據權利要求256的方法制備的透明質酸，其中沉淀劑是醇、有機溶劑或化合物及脂族帶正電荷的鹽中的至少一種。
259.由根據權利要求258的方法制備的透明質酸，其中沉淀劑選自乙醇、異丙醇、丙酮、鯨蠟基溴化三銨或鯨蠟基氯化吡啶鎓。
260.由根據權利要求250的方法制備的透明質酸，該方法進一步包含對提取的透明質酸進行純化的步驟。
261.由根據權利要求250的方法制備的透明質酸，其中該方法進一步包括引入純化的核酸區段的步驟，該純化的核酸區段具有編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
262.由根據權利要求261的方法制備的透明質酸，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在相同啟動子的控制之下的。
263.由根據權利要求261的方法制備的透明質酸，其中編碼酶活性透明質素合成酶的編碼區和編碼酶活性UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區是在不同啟動子的控制之下的。
264.由根據權利要求250的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區段的編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區是在來自革蘭氏陽性細菌相容性啟動子的啟動子控制之下的。
265.由根據權利要求250的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該純化核酸區段是通過轉化、轉染、轉導和電穿孔的至少一種引入到芽孢桿菌宿主的。
266.一種重組宿主細胞，其中該重組宿主細胞是具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產的芽孢桿菌細胞，該重組宿主細胞進一步具有包含純化的核酸區段的重組載體，該純化的核酸區段具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區。
267.權利要求266的重組宿主細胞，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO11的核苷酸序列。
268.權利要求266的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細胞。
269.權利要求266的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括至少一種修飾的RNA聚合酶啟動子，其中當修飾的RNA聚合酶啟動子被RNA聚合酶識別時，該RNA聚合酶能夠以比結合內源RNA聚合酶啟動子時更大的量表達RNA。
270.權利要求269的重組宿主細胞，其中所述修飾是突變。
271.權利要求269的重組宿主細胞，其中所述修飾是串聯啟動子元件。
272.權利要求266的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞是用包含純化的核酸區段的重組載體進行轉化的，該純化的核酸區段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區。
273.權利要求272的重組宿主細胞，其中UDP-糖前體生物合成途徑中的酶是UDP-葡萄糖脫氫酶。
274.權利要求272的重組宿主細胞，其中UDP-糖前體生物合成途徑中的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。
275.權利要求266的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括比在天然芽孢桿菌細胞中發現的至少多一個的信使RNA穩定元件。
276.權利要求266的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括比在天然芽孢桿菌細胞中發現的至少少一個的信使RNA去穩定元件。
277.權利要求266的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括至少一種核酸區段，該核酸區段具有編碼在UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區，從而該重組宿主細胞比表達內源UDP-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細胞具有更大的活性。
278.權利要求266的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，其中突變的UDP-糖前體基因增加轉錄的信使RNA的半衰期。
279.權利要求266的重組宿主細胞，其中重組宿主細胞進一步包括至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。
280.權利要求266的重組宿主細胞，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結合位點上發生的，從而核糖體對核糖體結合位點具有增加的結合親和力。
281.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中，其中芽孢桿菌宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產；使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸；和回收分泌的透明質酸。
282.權利要求281的方法，其中在引入具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段的步驟中，該純化核酸區段包含根據SEQ ID NO11的核苷酸序列。
283.權利要求281的方法，其中芽孢桿菌宿主是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
284.根據權利要求281的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括至少一種具有增加的啟動子活性的修飾的RNA聚合酶啟動子。
285.權利要求284的方法，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是突變。
286.權利要求284的方法，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是串聯啟動子元件。
287.根據權利要求281的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主是用包含純化的核酸區段的載體進行轉化的，該純化的核酸區段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區。
288.根據權利要求287的方法，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖脫氫酶。
289.根據權利要求287的方法，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。
290.根據權利要求281的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括比在天然芽孢桿菌宿主中發現的至少多一個的信使RNA穩定元件。
291.根據權利要求281的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括比在天然芽孢桿菌宿主中發現的至少少一個的信使RNA去穩定元件。
292.根據權利要求281的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括至少一種核酸區段，該核酸區段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區，從而該重組宿主細胞比表達內源UDP-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細胞具有更大的活性。
293.根據權利要求281的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主包括至少一種突變的內源UDP-糖前體生物合成基因，其中該突變導致從突變的UDP-糖前體基因轉錄的信使RNA的半衰期的增加。
294.根據權利要求281的方法，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。
295.根據權利要求294的方法，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結合位點上發生的，從而核糖體對核糖體結合位點具有增加的結合親和力。
296.由下面方法制備的透明質酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入芽孢桿菌宿主中，其中芽孢桿菌宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產；使芽孢桿菌宿主在培養基上生長以分泌透明質酸；和回收分泌的透明質酸。
297.由權利要求296的方法制備的透明質酸，其中純化的核酸區段包含根據SEQ ID NO11的核苷酸序列。
298.由根據權利要求296的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括至少一種比內源RNA聚合酶啟動子具有更大啟動子活性的修飾的RNA聚合酶啟動子。
299.由根據權利要求298的方法制備的透明質酸，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是突變。
300.由根據權利要求298的方法制備的透明質酸，其中所述RNA聚合酶啟動子的修飾是串聯啟動子元件。
301.由根據權利要求298的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主是用包含純化的核酸區段的重組載體進行轉化的，該純化的核酸區段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑的酶的編碼區。
302.由根據權利要求300的方法制備的透明質酸，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖脫氫酶。
303.由根據權利要求300的方法制備的透明質酸，其中UDP-糖前體生物合成途徑的酶是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。
304.由根據權利要求296的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括比在用于形成重組宿主細胞的芽孢桿菌宿主細胞中發現的至少多一個的信使RNA穩定元件。
305.由根據權利要求296的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括比在用于形成重組宿主細胞的芽孢桿菌宿主細胞中發現的至少少一個的信使RNA去穩定元件。
306.由根據權利要求296的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該芽孢桿菌宿主進一步包括至少一種核酸區段，該核酸區段具有編碼UDP-糖前體生物合成途徑中有功能活性的酶的編碼區，從而該重組宿主細胞比表達內源UDP-糖前體生物合成途徑的酶的天然宿主細胞具有更大的活性。
307.由根據權利要求296的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該枯草芽孢桿菌菌株包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，其中該突變導致從突變的UDP-糖前體基因轉錄的信使RNA的半衰期的增加。
308.由根據權利要求296的方法制備的透明質酸，其中在將具有編碼SEQ ID NO12所示酶活性乳房鏈球菌透明質素合成酶的編碼區的純化核酸區段引入到芽孢桿菌宿主的步驟中，該枯草芽孢桿菌菌株包含至少一種突變的UDP-糖前體生物合成基因，該基因編碼具有增加的翻譯效率的信使RNA。
309.由根據權利要求307的方法制備的透明質酸，其中UDP-糖前體生物合成基因中的突變是在UDP-糖前體生物合成基因的核糖體結合位點上發生的，從而核糖體對核糖體結合位點具有增加的結合親和力。
310.一種宿主細胞，其中宿主細胞包含載體，該載體包含具有編碼SEQ ID NO14所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段。
311.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO14所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段引入宿主生物中；和使宿主生物生長以分泌透明質酸。
312.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO14所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段引入宿主中；將具有編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區的核酸區段引入到宿主中；和使宿主生長以分泌透明質酸。
313.一種宿主細胞，其中宿主細胞包含一種包含核酸區段的載體，該核酸區段具有編碼SEQ ID NO14所示透明質素合成酶的編碼區；和一種包含核酸區段的載體，該核酸區段具有編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
314.一種宿主細胞，其中宿主細胞具有引入的載體，該載體包含一種具有編碼SEQ ID NO14所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段；和一種編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
315.由下面方法制備的透明質酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO14所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段引入宿主中；使宿主生長以分泌透明質酸。
316.一種宿主細胞，其中該宿主細胞具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產，該重組宿主細胞進一步具有包含核酸區段的載體，該核酸區段具有經引入的編碼SEQ ID NO14所示透明質素合成酶的編碼區。
317.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO14所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段引入宿主中，其中宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產；和使宿主生長以分泌透明質酸。
318.由下面方法制備的透明質酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO14所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段引入宿主中，其中宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產；和使宿主生長以分泌透明質酸。
319.一種宿主細胞，其中宿主細胞包含載體，該載體包含具有編碼SEQ ID NO10所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段。
320.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO10所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段引入宿主生物中；和使宿主生物生長以分泌透明質酸。
321.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO10所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段引入宿主中；將具有編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區的核酸區段引入到宿主中；和使宿主生長以分泌透明質酸。
322.一種宿主細胞，其中宿主細胞包含一種包含核酸區段的載體，該核酸區段具有編碼SEQ ID NO10所示透明質素合成酶的編碼區；和一種包含核酸區段的載體，該核酸區段具有編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
323.一種宿主細胞，其中宿主細胞具有引入的載體，該載體包含一種具有編碼SEQ ID NO10所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段；和一種編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
324.由下面方法制備的透明質酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO10所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段引入宿主中；和使宿主生長以分泌透明質酸。
325.一種宿主細胞，其中該宿主細胞具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產，該重組宿主細胞進一步具有包含核酸區段的載體，該核酸區段具有經引入的編碼SEQ ID NO10所示透明質素合成酶的編碼區。
326.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO10所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段引入宿主中，其中宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產；和使宿主生長以分泌透明質酸。
327.由下面方法制備的透明質酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO10所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段引入宿主中，其中宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產；和使宿主生長以分泌透明質酸。
328.一種宿主細胞，其中宿主細胞包含載體，該載體包含具有編碼SEQ ID NO12所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段。
329.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO12所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段引入宿主生物中；和使宿主生物生長以分泌透明質酸。
330.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO12所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段引入宿主中；將具有編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區的核酸區段引入到宿主中；和使宿主生長以分泌透明質酸。
331.一種宿主細胞，其中宿主細胞包含一種包含核酸區段的載體，該核酸區段具有編碼SEQ ID NO12所示透明質素合成酶的編碼區；和一種包含核酸區段的載體，該核酸區段具有編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
332.一種宿主細胞，其中宿主細胞具有引入的載體，該載體包含一種具有編碼SEQ ID NO12所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段；和一種編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的編碼區。
333.由下面方法制備的透明質酸，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO12所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段引入宿主中；和使宿主生長以分泌透明質酸。
334.一種宿主細胞，其中該宿主細胞具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產，該重組宿主細胞進一步具有包含核酸區段的載體，該核酸區段具有經引入的編碼SEQ ID NO12所示透明質素合成酶的編碼區。
335.一種生產透明質酸的方法，該方法包含以下步驟將具有編碼SEQ ID NO12所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段引入宿主中，其中宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產；和使宿主生長以分泌透明質酸。
336.由含有以下步驟的方法制備的透明質酸將具有編碼SEQ ID NO12所示透明質素合成酶的編碼區的核酸區段引入宿主中，其中宿主具有UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc中至少一種的增強的生產；和使宿主生長以分泌透明質酸。
全文摘要
本發明涉及含有重組載體的重組芽孢桿菌屬(Bacillus)宿主細胞，該重組載體包括具有編碼酶活性的透明質素合成酶(HAS)的編碼區區段的核酸區段。該重組芽孢桿菌屬宿主細胞用于生產透明質酸(HA)的方法中。
文檔編號C12N1/21GK1620511SQ02813370
公開日2005年5月25日 申請日期2002年6月13日 優先權日2001年6月13日
發明者P·L·德安格里斯, P·H·威格爾, K·庫馬里 申請人:俄克拉何馬大學董事會